UA73718C2 - Therapeutic vector expressing foreign dna, coding cat's cd80, cat's cd86, cat's cd28 or cat's ctla-4 and use thereof - Google Patents

Description

Опис винаходу

Інтерферон-у та його використання 9 У цій заявці запитується пріоритет заявки США реєстр. Мо09/071711, поданої 1 травня 1998р., зміст якої вводиться у даний опис за допомогою посилання. У даній заявці посилання на різні публікації наведені в дужках. Усі посилання на ці публікації можна знайти наприкінці опису безпосередньо перед списком послідовностей. Для більш повного опису попереднього рівня техніки в галузі, до якої відноситься даний винахід, зазначені публікації у всій своїй повноті вводяться у даний опис за допомогою посилання.

Припускається, що стимуляція активації і проліферації Т-клітин у відповідь на захворювання хазяїна залежить від двох типів взаємодії: розпізнавання Т-клітинного рецептора (ТСК) імуногенними пептидами в присутності молекул МНС класу І, і вторинної взаємодії додаткових лігандів, таких як СЮО8О і СО86 з їхніми корецепторами СО-28 і/або СТІ А-4 на Т-клітинах. Ефективна взаємодія за цими двома шляхами каскадів реакцій" призводить до активації і проліферації як СО47-Т-, так і СО8"-Т-клітин і до підвищеного продукування то регулюючих імунну відповідь цитокінів типу ТН1 і ТА2. При відсутності адекватної ко-стимуляції Т-клітин може розвиватися алергічний стан, у результаті чого буде відсутньою проліферація Т-клітин ісекреція цитокінів. За останні кілька років було виявлено, що головними регуляторами Т-клітинної відповіді є дві молекули, СО28 та його ліганди, СО8О ії СО86. СО28 являє собою головний ко-стимулюючий Т-клітинний рецептор, і після взаємодії з СО80 ї СО86 він підсилює проліферацію Т-клітин і синтез цитокінів, попереджаючи загибель Т-клітин. СТІ А-4 720 (який також називають СО 152), гомолог СО-28, також відіграє важливу роль у ко-стимуляції. Очевидно, хоча це точно не відомо, він інгібує Т-клітинні ко-стимулюючі відповіді. Взаємодія і взаємозв'язок між СО28, СТІ А-4 та їх лігандами СО8О і СО86б у процесах ко-стимуляції відіграють ключову роль у загальному індукуванні і супресії імунних реакцій у відповідь на захворювання хазяїна (І іпзіеу еї аї, 1991а; 1993а).

У теперішній час не існує ефективних вакцин для попередження стану імунодефіциту у котів та інфекційного см 25 перитоніту у котів. У теперішній час існують вакцини проти вірусу котячого лейкозу, але рівень їхньої (о) ефективності залишається проблематичним, а у деяких випадках вони можуть навіть викликати дане захворювання. Було показано, що експериментальні вакцини проти інфекційного перитоніту у котів не володіють протективною дією, або навіть викликають передчасну загибель тварини внаслідок антитіло-опосередкованого со загострення захворювання. Тому необхідно одержати лікарські засоби і композиції, що забезпечували б захист 30 від цих та інших захворювань, проти яких ще не існує вакцин, або які підвищували б ефективність існуючих та - широко застосовуваних вакцин. Крім того, необхідно одержати вакцини і лікарські засоби, які індукували б м клітинно-опосередковану відповідь при відсутності антитіл, що сприяють загостренню захворювання. І, нарешті, вакцинація кошенят становить певні труднощі внаслідок неможливості пригнічувати у них продукування (зе) материнських антитіл. Отже, необхідно одержати безпечні та ефективні засоби, які дозволяли б вирішити ці м 35 проблеми.

У даному винаході для продукування потрібної імунної відповіді на конкретний котячий патоген або патологічний стан у котів можна регулювати Т-клітинні відповіді за допомогою модифікації експресії котячого

СО28, котячого СТІ А-4 та їх лігандів, і ко-стимулюючих молекул котячого СО8О та котячого СО86 шляхом « підсилення, супресії або переорієнтації цієї експресії. Зокрема, зазначені ко-стимулюючі молекули можуть бути з використані для вакцинації проти інфекційних хвороб, лікування інфекційних хвороб і лікування пухлинних, с дегенеративних, аутоїмунних та імунодефіцитних станів у котів. Даний винахід дозволяє вирішити проблеми, :з» пов'язані з відсутністю ефективності та дієвості сучасних котячих вакцин, описаних вище.

Даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу, який містить принаймні одну чужорідну нуклеїнову кислоту, вбудовану до не-основної ділянки вірусного геному, де кожна така чужорідна нуклеїнова кислота кодує -1 що білок.

Цей кодований білок вибирають із групи, що складається з білка котячого СО28 або його імуногенної (95) частини, білка котячого СЮО8О або його імуногенної частини, білка котячого СО86 або його імуногенної частини, -1 або білка котячого СТІ А-4 або його імуногенної частини. Ця частина може бути експресована при введенні зазначеного рекомбінантного вірусу до відповідного хазяїна. - 70 Даний винахід також відноситься до рекомбінантного вірусу, який, крім того, містить чужорідну нуклеїнову со кислоту, що кодує імуноген, який походить від патогену. Даний винахід також відноситься до рекомбінантних вірусів, які здатні підсилювати імунну відповідь у котів. Даний винахід також відноситься до рекомбінантних вірусів, здатних пригнічувати імунну відповідь у котів.

Короткий опис креслень

Фігура 1А: ДНК і амінокислотна послідовність котячого СОВО (87-1) (ТАМ) (ЗЕО ІЮ МО. 1 і 2).

ГФ) Фігура ІВ: Крива гідрофобності амінокислотної послідовності котячого СОВО (В7-1) (ТАМ).

ГФ Фігура 2А: ДНК і амінокислотна послідовність котячого СОВ8О (р7-1) (ЗУМТКО) (ЗЕО ІЮ МО. З і 4).

Фігура 28: Крива гідрофобності амінокислотної послідовності котячого СО 80 (В 7-1) (ЗММТКО).

Фігура ЗА: ДНК і амінокислотна послідовність котячого СО86 (87-2 ХЗЕО ІЮО МО. 5 і 6). 60 й й й й . й й

Фігура ЗВ: Крива гідрофобності амінокислотної послідовності котячого СО86 (87-2).

Фігура 4А: ДНК і амінокислотна послідовність котячого СО28 (ЗЕО І МО. 7 і 8).

Фігура 48: Крива гідрофобності амінокислотної послідовності котячого СО28.

Фігура БА: ДНК і амінокислотна послідовність котячого СТІ А-4 (СО 152) (ЗЕО ІЮ МО. 9 і 10).

Фігура 58: Крива гідрофобності амінокислотної послідовності котячого СТІ А-4 (СО 152). 65 Даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу, що містить принаймні одну чужорідну нуклеїнову кислоту, вбудовану до не-основної ділянки вірусного геному, де кожна така чужорідна нуклеїнова кислота (а) кодує білок, вибраний із групи, що складається з білка котячого СЮО28 або його імуногенної частини, білка котячого СЮО8О або його імуногенної частини, білка котячого СО86 або його імуногенної частини, білка котячого

СТІ А-4 або його імуногенної частини; і (5) здатна експресуватися при введенні зазначеного рекомбінантного вірусу до відповідного хазяїна.

В одному з варіантів здійснення вищеописаного винаходу зазначений рекомбінантний вірус містить принаймні дві чужорідні нуклеїнові кислоти, кожна з яких вбудована до не-основної ділянки вірусного геному.

В іншому варіанті здійснення винаходу зазначений рекомбінантний вірус містить принаймні три чужорідні 7/о Нуклеїнові кислоти, кожна з яких вбудована до не-основної ділянки вірусного геному.

В іншому варіанті здійснення винаходу зазначений рекомбінантний вірус містить чотири чужорідні нуклеїнові кислоти, кожна з яких вбудована до не-основної ділянки вірусного геному.

В іншому варіанті здійснення винаходу зазначеним рекомбінантним вірусом є, але не обмежується ними, вірус віспи єнотів, вірус віспи свиней або вірус герпесу котів.

В іншому варіанті здійснення вищеописаного винаходу зазначений рекомбінантний вірус містить більш ніж одну чужорідну нуклеїнову кислоту, і кожна з цих чужорідних нуклеїнових кислот вбудована до тієї ж самої не-основної ділянки. В іншому варіанті здійснення даного винаходу будь-який із зазначених рекомбінантних вірусів містить більш ніж одну чужорідну нуклеїнову кислоту, де всі зазначені чужорідні нуклеїнові кислоти не є вбудованими до тієї ж самої не-основної ділянки.

В одному з варіантів здійснення винаходу будь-який із зазначених рекомбінантних вірусів містить чужорідну нуклеїнову кислоту, що кодує імуноген, який походить від патогену. У ще одному варіанті здійснення винаходу рекомбінантний вірус кодує котячий патоген, рабівірусний патоген, патоген, що походить від хламідій, патоген

Тохоріазтовів допаїй, патоген Оігойага іттійв, патоген, що походить від бліх, або бактеріальний патоген.

В іншому варіанті здійснення винаходу рекомбінантний вірус містить кодуючу послідовність вірусу імунодефіциту сч ов Котів (ГРІМ), вірусу лейкозу котів (Бе! М), вірусу інфекційного перитоніту котів (ГІР), вірусу панлейкопенії котів, котячого каліцивірусу, котячого реовірусу типу З, котячого ротавірусу, котячого коронавірусу, і) синцитіального вірусу котів, вірусу саркоми котів, вірусу герпесу котів, вірусу хвороби Борна котів або котячих паразитів.

В іншому варіанті здійснення винаходу зазначений рекомбінантний вірус містить принаймні одну чужорідну со

Зо Нуклеїнову кислоту, яка включає промотор для експресії чужорідної нуклеїнової кислоти. В іншому варіанті здійснення винаходу зазначений рекомбінантний вірус експресує принаймні одну чужорідну нуклеїнову кислоту, -- що знаходиться під контролем промотору, який є ендогенним для цього вірусу. ї-

В одному з варіантів здійснення винаходу будь-який із зазначених рекомбінантних вірусів містить чужорідну нуклеїнову кислоту, яка кодує детектований маркер. В іншому варіанті здійснення винаходу зазначеним ме) з5 детектованим маркером є бета-галактозидаза Е. сої. ча

Даний винахід також відноситься до рекомбінантного вірусу, який кодує імуногени, що походять від дад-протеази ЕМ, білка оболонки РМ, дад-протеази Ре! М або білка оболонки Ре! М.

Даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу, який, крім того, містить нуклеїнову кислоту, що включає геном вірусу імунодефіциту котів або його частину. Даний винахід відноситься до рекомбінантного «

Вірусу, який, крім того, містить нуклеїнову кислоту, що включає геном вірусу лейкозу котів або його частина. з с Даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу, який, крім того, містить нуклеїнову кислоту, що кодує . котячий 11/12, ЗМ-С5Е, р35 або р40. Даний винахід також відноситься до вакцини, яка включає ефективну и?» імунізуючу кількість такого рекомбінантного вірусу і відповідний носій.

Даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу герпесу котів, що містить не-основну ділянку, якою є

Ген глікопротеїну С вірусу герпесу котів. Даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу герпесу котів -І за п.12 формули винаходу, позначеного З-ЕНМ-031 (АТСС, номер доступу МК-2604). Цей вірус був депонований 1 травня 1998 р. в Американській колекції типових культур (АТСС), 10801 Опімегзйу Вошціемага, Мапаззаз, МА і 20108-0971, Ш.5.А. у рамках Будапештського договору у відповідності до Міжнародної угоди по депонуванню -І мікроорганізмів для проведення патентної експертизи.

Даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу віспи свиней, що має не-основну ділянку у більш - великому НіпаП-ВоП-субфрагменті НіпапІ-фрагмента М вірусу віспи свиней. Даний винахід відноситься до с рекомбінантного вірусу віспи свиней за п. 14 формули винаходу, позначеного 5-5Р-246 (АТСС, номер доступу

МУк-2603). Цей вірус був депонований 1 травня 1998 р. в Американській колекції типових культур (АТСС), 10801

Опімегейу Вошемага, Мапаззаз, МА 20108, О.5.А. у рамках Будапештського договору у відповідності до дв Міжнародної угоди по депонуванню мікроорганізмів для проведення патентної експертизи.

В одному з варіантів свого здійснення вищеописаний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу, де (Ф) частина білка СО28, СО8О або СО86 є розчинною частиною білка. В іншому варіанті свого здійснення даний ка винахід відноситься до рекомбінантного вірусу, який містить чужорідну нуклеїнову кислоту, що кодує білок

СТ А-4 кюотів. во Вищеописаний винахід відноситься до вакцини, яка містить ефективну імунізуючу кількість рекомбінантного вірусу і підходящий носій. В одному з варіантів здійснення даного винаходу вакцина містить ефективну імунізуючу кількість рекомбінантного вірусу, що складає від близько 1х1096.у.о./мл до близько 1х1096.у.0./мл і близько 7?б.у.о/мл. В іншому варіанті даного винаходу вакцина, крім того, включає суміш, що містить рекомбінантний вірус і ефективну імунізуючу кількість другого імуногена. 65 Даний винахід відноситься до способу підсилення імунної відповіді у котів, що передбачає введення цим котам ефективної імунізуючої кількості будь-якого з вищеідентифікованих рекомбінантних вірусів. Даний винахід, крім того, відноситься до способу імунізації котів, що передбачає введення цим котам ефективної імунізуючої кількості будь-якого з вищеідентифікованих рекомбінантних вірусів.

Даний винахід відноситься до способу супресії (пригнічення) імунної відповіді у котів, який передбачає введення цим котам ефективної супресуючої кількості рекомбінантного вірусу, що містить розчинний СО28, СО8О або СО86. Даний винахід відноситься до способу супресії імунної відповіді у котів шляхом введення цим котам будь-якої ефективної супресуючої кількості рекомбінантного вірусу, що містить білок котячого СТІ А-4.

Даний винахід відноситься до внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньом'язового, черезм'язового, місцевого, перорального або внутрішньочеревного введення вищеописаного рекомбінантного вірусу. 70 В одному з варіантів свого здійснення даний винахід відноситься до способу супресії імунної відповіді у кота, де цей кіт є реципієнтом трансплантованого органа або тканини або зазнає імунної реакції.

В іншому варіанті свого здійснення даний винахід відноситься до способу супресії імунної відповіді у котів, який передбачає введення цим котам антисмислової нуклеїнової кислоти, здатної гібридизуватися: (а) із

МРНК-транскриптом котячого СО28, (Б) із транскриптом котячого СОВ8О або (с) із мРНК-транскриптом котячого /5 СОВ86, або інгібувати їхню трансляцію, де зазначена антисмислова нуклеїнова кислота присутня у кількості, ефективній для інгібування трансляції, і тим самим пригнічує імунну відповідь у котів.

В одному з варіантів свого здійснення вищеописаний винахід відноситься до способу зменшення або знищення пухлини у кота, який передбачає введення в пухлину цього кота рекомбінантного вірусу, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує білок котячого СЮО8О, білок котячого СО8б або їхню комбінацію в кількості, ефективній .для зменшення і знищення цієї пухлини.

В одному з варіантів свого здійснення даний винахід відноситься до способу зменшення або знищення пухлини у котів, де зазначений рекомбінантний вірус, крім того, містить і здатний експресувати пухлиноасоційований антиген котів, Її де зазначений спосіб здійснюють шляхом системного введення цього рекомбінантного вірусу. сч

Даний винахід відноситься до виділеної і очищеної ДНК, що кодує ліганд котячого СО8О (87-11) або ліганд котячого СО86б (87-2), або рецептор СО28 котів або рецептор СТІ А-4 котів (СО152), а також до клонуючих і і) експресуючих векторів, що містять СО8О або СО86, або СО28 або СТІ А-4, або РНК, частково або повністю, і до клітин, трансформованих СО80-кодуючими векторами або СО86б-кодуючими векторами, або СО28-кодуючими векторами, або СТІ А-4-кодуючими векторами. Тварин родини котячих, від яких походить СО8О, СО86, СО28 або со зо СТІ А-4, вибирають із групи, що включає, але не обмежується ними: домашні коти, леви, пуми, рисі і гепарди.

Даний винахід відноситься до виділеної і очищеної КкДНК котячого СОВ8О (В7-1), яка містить приблизно 941 - нуклеотид. Даний винахід також відноситься до виділеного й очищеного поліпептиду котячого СО8О, який містить М приблизно 292 амінокислоти, у нативній мембраноасоційованій або зрілій формі, і має молекулярну масу близько 33485 кДа, ізоелектричну точку близько 9,1, і загальний заряд при рН 7,0, що дорівнює 10. ме)

Ко-експресія СО8О, разом з ко-слимулюючою молекулою СО28 і пухлинним антигеном або антигеном від ї- патогенного організму, сприяє активації або посиленню активації Т-лімфоцитів, що призводить до продукування цитокіну, який стимулює імунну відповідь, а також сприяє регуляції росту клітин інших типів. Ко-експресія

СОВ80, разом з ко-стимулюючою молекулою СТІ А-4, сприяє регуляції активації Т-лімфоцитів.

Даний винахід відноситься до виділеної і очищеної кКДНК котячого СО86 (В7-2), яка містить приблизно 1176 « нуклеотидів. Даний винахід також відноситься до виділеного і очищеного поліпептиду котячого СО86, який з с містить приблизно 320 амінокислот, у нативній мембраноасоційованій або зрілій формі, і має молекулярну масу . приблизно 36394кДа, ізоелектричну точку близько 9,19, і загальний заряд при рН 7,0, що дорівнює 11,27. и?» Ко-експресія СО8б6, разом з ко-слимулюючою молекулою СО28 і пухлинним антигеном або антигеном від патогенного мікроорганізму, сприяє активації або посиленню активації Т-лімфоцитів, що призводить до продукування цитокінів, які стимулюють імунну відповідь, а також сприяє регуляції росту клітин інших типів. -І Ко-експресія СО86, разом з ко-стимулюючою молекулою СТІ А-4, сприяє регуляції активації Т-лімфоцитів.

Відповідно до даного винаходу, котячий СО8О або котячий СО86 одержують із природних або рекомбінантних і джерел. Відповідно до даного винаходу, котячі СО8О або СО86б мають нативну або мембранозв'язану форму, -І абосекретовану форму, у. якій відсутній трансмембранний домен.

Даний винахід відноситься до виділеної і очищеної КДНК котячого СО28, яка містить близько 689 - нуклеотидів. Даний винахід також відноситься до виділеного й очищеного поліпептиду котячого СО28, який с містить приблизно 221 амінокислоту, у нативній мембранозв'язаній або зрілій формі, і має молекулярну масу близько 25319 кДа, ізоелектричну точку близько 9,17, і загальний заряд при рН 7,0, що дорівнює 9,58.

Даний винахід відноситься до виділеної і очищеної КДНК котячого СТІ А-4, яка містить близько 749 нуклеотидів. Даний винахід також відноситься до виділених і очищених поліпептидів котячого СТІ А-4, які містять приблизно 223 амінокислоти, у нативній мембраноасоційованій або зрілій формі, і мають молекулярну

Ф) масу близько 24381 кДа, ізоелектричну точку близько 6,34, і загальний заряд при рН 7,0, що дорівнює -0,99. ка Даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу віспи свиней, який експресує чужорідну ДНК, де зазначена чужорідна ДНК кодує кДНК і поліпептиди котячого СЮО8О, котячого СО86, котячого СО28 і котячого бо СтІА-4.

Даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу віспи єнотів, який експресує чужорідну ДНК, де зазначена чужорідна ДНК кодує кДНК і поліпептиди котячого СЮО8О, котячого СО86, котячого СО28 і котячого

СТІ А-4.

Даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу герпесу котів, який експресує чужорідну ДНК, де 65 Зазначена чужорідна ДНК кодує кДНК і поліпептиди котячого СЮО8О, котячого СО86б, котячого СО28 і котячого

СТІ А-4.

В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до способу підсилення імунної відповіді у котів на імуноген, що досягається введенням цього імуногена до, після, чи, в основному, одночасно з введенням котячого

СОр80 або котячого СО86 разом з котячим СО28 або котячим СТІ А-4 або без них у рекомбінантному векторі на основі вірусу віспи свиней, у рекомбінантному векторі на основі вірусу віспи єнотів, або у рекомбінантному векторі на основі вірусу герпесу котів, у кількості, ефективній для підсилення імунної відповіді.

В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до способу пригнічення імунної відповіді у котів на імуноген, що досягається введенням цього імуногена до, після, чи, в основному, одночасно з введенням котячого

СО80 або котячого СО86 разом з котячим СО28 або котячим СТІ А-4 або без них, або разом з антисмисловою 70 РНК або ДНК, яка частково або повністю кодує котячий СО80О, котячий СО86, котячий СО28 або котячий СТІ А-4, у рекомбінантному векторі на основі вірусу віспи свиней, у рекомбінантному векторі на основі вірусу віспи єнотів або у рекомбінантному векторі на основі вірусу герпесу котів, у кількості, ефективній для пригнічення імунної відповіді.

В іншому своєму аспекті, даний винахід відноситься до вакцини для індукування імунної відповіді у котів /5 на імуноген, яка містить імуноген і ефективну кількість котячого СОВО у рекомбінантному векторі на основі вірусу віспи свиней, у рекомбінантному векторі на основі вірусу віспи єнотів або у рекомбінантному векторі на основі вірусу герпесу котів, для підсилення імунної відповіді. Цей імуноген походить, наприклад, від котячих патогенів, таких, як вірус імунодефіциту котів, вірус лейкозу котів, парвовірус котів, коронавірус котів, лептовірус котів і т.п.

В іншому своєму аспекті, даний винахід відноситься до вакцини для індукування імунної відповіді у котів на імуноген, яке досягається шляхом введення рекомбінантного вектора на основі вірусу віспи свиней, рекомбінантного вектора на основі вірусу віспи єнотів або рекомбінантного вектора на основі вірусу герпесу котів, що експресує ДНК або РНК імуногена і ДНК або РНК додаткових молекул котячих СО80, СО86, СО28 у будь-якій комбінації, які кодують білки або фрагмент білків у кількості, ефективній для модуляції імунної відповіді. с

Білок котячого СО8О має амінокислотну послідовність, яка на 5995 і 4695 ідентична послідовностям білків людини і миші, відповідно. Білок котячого СО86 має амінокислотну послідовність, яка на 6895 і 6495 ідентична о послідовностям білків людини і кроля, відповідно. Білок котячого СО28 має амінокислотну послідовність, яка на 8295 і 7495 ідентична послідовностям білків людини і миші, відповідно. Білки котячого СТІ А-4 мають амінокислотну послідовність, яка на 8895 і 7895 ідентична послідовностям білків людини і миші, відповідно. со з0 Людські або мишачі біли СОВО або СО86 не можуть функціонально заміняти білки котячого СОВО або СОВб6.

Тому котячий СО80О, котячий СО86, котячий СО28 і котячий СТІ А-4 являють собою нові реагенти, необхідні для - регуляції імунітету у котів. М

Даний винахід відноситься до додаткових Т-клітинних регуляторних молекул, СО8О (87-1) або СО86 (87-2) або СО28 або СТІ А-4 (СО 152), які походять від тварин родини котячих. Даний винахід відноситься до виділених і) і очищених нуклеїнових кислот, які кодують, частково або повністю, котячий СО80О, котячий СО86, котячий СЮО28 ї- або котячий СТІ А-4, а також до поліпептидів СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, виділених або з нативних, або з рекомбінантних джерел. Котячий СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, який продукується відповідно до даного винаходу, може бути використаний для підсилення ефективності котячих вакцин проти пухлин і патогенних мікроорганізмів, а також як терапевтичний засіб для лікування вірусних і бактеріальних хвороб котів. Котячий « сорво, сОр86, С028 або СТІ А-4, який продукується відповідно до даного винаходу, може бути також з с використаний для ослаблення захворювання, обумовленого високоактивною, надактивною або неправильно спрямованою імунною відповіддю. ;» Нуклеїнові кислоти, вектори, трансформанти

Послідовності кКДНК, які кодують котячий СО8О (5ЕО ІЮО МО: 1, 3), котячий СО86 (ЗЕО ІЮО МО: 5), котячий СО28

ЗЕ ІО МО: 7) або котячий СТІА-4 (ЗЕСО І МО: 9) показані на Фіг.1-5, а передбачені амінокислотні -І послідовності котячого СО8О (ЗЕО ІЮ МО: 2, 4), котячого СО86 (5ЕО ІЮО МО: 6), котячого СО28 (5ЕО ІЮО МО: 8) або котячого СТІ А-4 (5ЕО ІО МО: 10) показані на Фіг.1-5. Конструювання цих котячих поліпептидів, таких як СО8О, і со86, СО028 або СТІ А-4 основано на частковій гомології амінокислотних послідовностей з людським, мишачим -І або кролячим гомологом цих поліпептидів, і здатності поліпептидів СО8О або СО86 зв'язуватися з рецептором 5р Котячого СО28 (див. нижче) або СТІ А-4 і активувати або стимулювати, або регулювати активацію Т-лімфоцитів - яким-небудь іншим чином. Крім того, не претендуючи на яку-небудь конкретну теорію, можна припустити, що с поліпептиди котячого СО8О або котячого СО86 також володіють однією або більше біологічними активностями: активацією клітин-кілерів (природних кілерів), стимуляцією дозрівання В-клітин, активацією МНСОС-рестриктованих цитотоксичних Т-лімфоцитів, проліферацією тучних клітин, взаємодією з рецепторами цитокінів та індукуванням дв цитокінів, які регулюють імунну відповідь.

Внаслідок виродженості генетичного коду (тобто, коли множина кодонів кодує певні амінокислоти) (Ф) ДНК-послідовності, які відрізняються від послідовностей, показаних на Фіг.1-5, можуть також кодувати ка амінокислотні послідовності котячого СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, показані на Фіг.1-5. Такими іншими ДНК є послідовності, які містять "консервативні у відношенні послідовності" варіанти, у яких модифікація в одному во або декількох нуклеотидах у даному кодоні не призводить до зміни амінокислоти, кодованої у цьому положенні.

Крім того, даний амінокислотний залишок у поліпептиді часто може бути замінений без зміни всієї конформації і функції нативного поліпептиду. Такими "функціонально консервативними" варіантами є, але не обмежуються ними, заміна амінокислоти іншою амінокислотою, яка має аналогічні фізико-хімічні властивості, такі як, наприклад, кислотні, основні, гідрофобні, гідрофільні, ароматичні властивості і т.п. (наприклад, заміна 65 лізину на аргінін, аспартату на глутамат або гліцину на аланін). Крім того, амінокислотні послідовності можуть бути додані або делетовані без порушення біологічної активності молекули. Так, наприклад, до аміно-

або до карбокси-кінців можуть бути додані додаткові амінокислотні послідовності, які служать в якості міток для очищення, таких як гістидинові мітки (тобто, для забезпечення одностадійного очищення білка, після якого їх видаляють хімічним або ферментативним методом). Альтернативно, ці додаткові послідовності вносять додаткові сайти зв'язування на клітинній поверхні, або яким-небудь іншим способом змінюють специфічність котячих СО8О, СО86, 2028 або СТІ А-4 у відношенні клітини-мішені, так щоб у результаті додавався антигензв'язуючий сайт для антитіл.

КДНК котячого СО8О, котячого СО86, котячого СЮО28 або котячого СТІ А-4, які входять до обсягу даного винаходу, являють собою послідовності, показані на Фіг.1-5; консервативні у відношенні послідовності /о варіантні ДНК; ДНК-послідовності, які кодують функціонально консервативні варіантні поліпептиди; і їхні комбінації. Даний винахід відноситься до фрагментів котячих СО8О, СО86, СО28 і СТІ А-4, які, взяті окремо або в комбінації з іншими послідовностями або компонентами, володіють потрібним ступенем біологічної активності..Як буде пояснено нижче, кожен фахівець може самостійно здійснювати прогнозовані маніпуляції з послідовностями СО8О5 СО86, СО28 або СТІ А-4 і встановити, чи володіє даний варіант котячого СО8О, СО86,

СсОр28 або СТІ А-4 відповідною стабільністю і біологічною активністю для даного застосування, або встановити, чи призводять зміни, які впливають на активності зв'язування цих молекул, до підвищеної ефективності. Кожний з котячих СО8О і СО86 зв'язується з ко-рецептором СО28 або з ко-рецептором СТІ А-4. Це може бути досягнуте шляхом експресії й очищення варіантних поліпептидів СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 у рекомбінантній системі шляхом аналізу їхньої Т-клітинної стимулюючої активності /або стимулюючої ріст активності в клітинній

Культурі й в організмі тварин з наступним тестуванням на придатність для даного застосування. Варіант СО8О тестують на біологічну активність за функціональним зв'язуванням з рецепторами СО28 або СТІ А-4. Варіант

СОр86 тестують на біологічну активність за функціональним зв'язуванням з рецепторами СО28 або СТІ А-4.

Аналогічним чином, варіант СО28 або СТІ А-4 тестують на біологічну активність.

Даний винахід також відноситься до ДНК котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 (їі до поліпептидів), які сч г походять від тварин родини котячих, таких як, але не обмежуючись ними, домашні коти, леви, тигри, гепарди, рисі і т.п. Гомологи послідовностей котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, показані на Фіг.1-5, були легко (8) ідентифіковані шляхом скринінгу КДНК або геномних бібліотек для ідентифікації клонів, які гібридизуються із зондами, що містять всю або частину послідовності, показаної на Фіг.1-5. Альтернативно, бібліотеки експресованих послідовностей скринують з використанням антитіл, які розпізнають котячі СО8О, СО86, СО28 або со

СТІ А-4. Не претендуючи на конкретну теорію, можна припустити, що гени СО8О або СО86 від інших котячих мають гомологію з генами котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 принаймні приблизно на 7095. До обсягу - даного винаходу також входять ДНК, які кодують гомолог СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, визначений як ДНК, що М кодує поліпептиди, які мають ідентичність амінокислот з котячими СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 принаймні приблизно на 2596. о

В основному, для маніпуляцій з нуклеїновими кислотами відповідно до даного винаходу використовуються ї- методи, добре відомі фахівцям, такі, які були описані, наприклад, у МоЇесшіаг СіІопіпд: А І арогаїогу МапиаїЇ, (2п4 Е4Я., ЗатргооК Егіївспй 8: Мапіаїйв, Со Зргіпд Нагрог Іарогаїгу, Соїй Зргіпд Нагрог), або Ситепі

Ргоїосоїв іп МоїЇесцшаг Віоіоду, (Едв. А!зибеї, Вгепі, Кіповіоп, Моге, Реідтап, Зтій 5 БІШНІ, Сгеепе Рибі. Авзвос.

УМіеу Іпіегесіепсе, МУ, МУ, 1992). «

Даний винахід відноситься до кДНК- і РНК-послідовностей і досмислових та антисмислових послідовностей. з с Даний винахід також відноситься до геномних ДНК-послідовностей котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 і до фланкуючих послідовностей, включаючи регуляторні послідовності, але не обмежуючись ними. Послідовності з нуклеїнових кислот, які кодують поліпептид(и) котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, також асоціюються з гетерологічними послідовностями, включаючи промотори, енхансери, елементи імунної відповіді, сигнальні послідовності, послідовності поліаденілювання, інтрони, 5- і З-некодуючі ділянки, і т.п. Елементами -І регуляції транскрипції, які функціонально приєднані до кДНК-послідовності(ей) котячих СО8О, СО86, 2028 або

СТІ А-4, є, але не обмежуються ними, послідовності, які здатні регулювати експресію генів, що походять від о прокаріотичних клітин, еукаріотичних клітин, вірусів прокаріотичних клітин, вірусів еукаріотичних клітин і -І будь-яких їхніх комбінацій. Фахівцям відомі й інші підходящі гетерологічні регуляторні послідовності.

Нуклеїнові кислоти даного винаходу були модифіковані методами, відомими фахівцям, з метою зміни їхньої - стабільності, розчинності, афінності зв'язування і специфічності. Так, наприклад, ці послідовності були с селективно метильовані. Послідовності нуклеїнових кислот даного винаходу були також модифіковані міткою, здатною прямо або опосередковано продукувати детектований сигнал. Прикладами міток є радіоізотопи, флуоресцентні молекули, біотин і т.п.

Даний винахід також відноситься до векторів, які включають нуклеїнові кислоти, що частково або повністю кодують поліпептиди СО80, СО86, СО28 або СТІ А-4. Такими векторами є, наприклад, плазмідні вектори для

Ф) експресії в різних еукаріотичних і прокаріотичних хазяях. Ці вектори, переважно, також містять промотор, ка функціонально приєднаний до частини, яка кодує поліпептид котячого СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4. Кодовані поліпептиди котячого СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 були експресовані з використанням будь-яких підходящих бо векторів і клітин-хазяїнів, описаних у даній заявці або відомих фахівцям з інших джерел.

Даний винахід також відноситься до векторів, які включають нуклеїнові кислоти, що кодують поліпетиди котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 частково або повністю. Такими векторами є, наприклад, вектори на основі "живого" вірусу для експресії в різних еукаріотичних хазяях або для експресії ДНК- чи РНК-вакцин. В одному з варіантів здійснення винаходу цей вектор на основі живого вірусу є атенуйованим (ослабленим). В 65 іншому варіанті даного винаходу цей вектор на основі живого вірусу був атенуйований за допомогою делеції генів. В іншому варіанті даного винаходу, цей вірусний вектор був інактивований шляхом хімічної обробки або термообробки. Цей вектор одержують на основі живого вірусу, вибраного з групи, яка включає, але не обмежується ними, вірус герпесу, поксвірус, аденовірус, адено-асоційований вірус, ретровірус, бакуловірус, альфавірус, рабдовірус, пікорнавірусє. Цей вектор одержують на основі живого вірусу, вибраного з групи, яка

Включає, але не обмежується ними, котячий вірус герпесу, собачий вірус герпесу, пташиний вірус герпесу, бичачий вірус герпесу, кінський вірус герпесу, псевдорабівірус, вірус віспи свиней, вірус віспи птахів, вірус віспи свійської птиці, вірус віспи єнотів, вірус віспи канарок, вірус коров'ячої віспи, вірус мишачого лейкозу Молоні, вірус Сіндбіс і вірус Семліки-Форест.

Вектор на основі живого вірусу являє собою рекомбінантний вірусний вектор, що експресує чужорідну ДНК, 7/0 якою є частина або вся кКДНК котячого СЮО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4. Чужорідною ДНК є також кДНК для антигену від патогенного організму. Рекомбінантний вірусний вектор конструюють методами гомологічного рекомбінантного або космідного реконструювання, відомими фахівцям. Краще, щоб ці вектори також включали промотор, функціонально приєднаний до частини, яка кодує поліпептид котячого СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4.

Цей промотор вибирають із групи, яка включає, але не обмежується ними, промотор вірусу герпесу ОЕ котів, синтетичний ранній/пізній промотор поксвірусу, передранній промотор цитомегаловірусу людини, промотор псевдорабівірусу ОХ. Стимуляція експресії генів також передбачає експресію КДНК СО80, СО86, СО28 або

СТІ А-4, яка походить від елемента внутрішнього сайта зв'язування з рибосомою (ІКЕ5), що є присутнім у кластері (вектор рСІТЕ, Момадеп, Мадівоп, МІ). Клітинними лініями для культивування вірусних векторів є, але не обмежуються ними, клітини котячої нирки СтапаеїІ! (СКЕК), фібробласти курячого ембріона, клітини нирки свинячого ембріона (ЕБК-4), клітини свинячої нирки (РК). Кодований(і) поліпептид(и) котячого СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 експресували з використанням підходящих векторів і клітин-хазяїнів, описаних у даній заявці або відомих фахівцям з інших джерел.

У кращому варіанті здійснення винаходу гени, які кодують котячі СО8О і 2028, СО80 і СТІ А-4, СО86 і СО28 або СО86 і СТІ А-4 у комбінації з генами для імуногена, що походить від котячого патогену, вводять в один сч рекомбінантний вірусний вектор, а потім на основі цього вектора одержують живу вакцину. Гени котячих СО8О, соре8б, С028 або СТІ А-4, окремо або в комбінації з генами котів, що походять від котячих патогенів, вводять у (8) рекомбінантний вірус так, щоб експресія цих генів регулювалася відповідним промотором. В іншому варіанті здійснення винаходу гени, що кодують котячі СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, окремо або в комбінації, вбудовують у рекомбінантний вірусний вектор і вводять у вакцину разом із другим рекомбінантним вірусним со зо Вектором, який кодує гени для імуногена(ів), що походить(ять) від котячих патогенів. Ці два варіанти здійснення винаходу дозволяють продукувати потрібні імунні відповіді в тих же клітинах або у клітинах, які - знаходяться у безпосередній близькості від цих клітин, у результаті чого досягається підсилення, супресія або М переорієнтація потрібної імунної відповіді.

Імуноген вибирають із групи, що включає, але не обмежується ними, котячі патогени, такі як вірус о імунодефіциту котів, вірус лейкозу котів, вірус інфекційного перитоніту котів, вірус панлейкопенії котів ї- (парвовірус), котячий каліцивірус, котячий реовірус типу 3, котячий ротавірус, котячий коронавірус (вірус інфекційного перитоніту), рабівірус, синцитіальний вірус котів, вірус саркоми котів, вірус герпесу котів (вірус ринотрахеїту), вірус хвороби Борна котів, хламідії, Тохоріазтозівз допаїй), котячі паразити, Оігойагіа іттійв, блохи, бактеріальні патогени, і т.п. «

Вектори або вектори на основі "живих" вірусів часто включають одну або кілька систем реплікації для з с клонування або експресії, один або кілька маркерів для добору в хазяїні, таких як, наприклад, маркер резистентності до антибіотика, або калориметричні маркери, такі як В-галактозидаза (Іас7) або В-глюкуронідаза ;» (цідА), або флуоресцентні маркери, такі як білок, що флуоресціює у зеленому діапазоні спектра, і один або кілька експресійних кластерів. Вбудовані кодуючі послідовності синтезують, виділяють із природних джерел і одержують у вигляді гібридів або т.п. Лігування кодуючих послідовностей з послідовностями регуляції -І транскрипції здійснюють методами, відомими фахівцям. Підходящі клітини-хазяїни трансформують/трансфекують/нфікують будь-яким придатним методом, включаючи електропорацію, о поглинання ДНК, опосередковане Сасі » або ліпосомою, інфікування грибками, мікроін'єкцію, доставку -І мікрочастинок шляхом бомбардування або т.п.

Підходящими векторами, призначеними для використання в даному винаході, є, але не обмежуються ними, - МЖЕрЗБ52, рсОМАЇ! (Іпийгодеп, Сагізрад, СА), рКкс/СММ (Іпмйго-деп) і рЗЕМІ (СІВСО/ВКІ, Сайпеегериго, МО). с Одним із кращих векторів, призначених для використання в даному винаході, є рЗЕМІ. Придатними клітинами-хазяїнами є Е.соїі, дріжджі, клітини СО5, клітини РС12, клітини СНО, клітини СНАСТІ, клітини ВНК-21 і клітини меланофорів амфібій. Для використання в даному винаході кращою клітинною лінією-хазяїном є клітини

ВНК-21. Векторами, що підходять для конструювання "оголеної" ДНК або для вакцинації генними вакцинами, є, але не обмежуються ними, рТагдеї (Рготеда, Мадізоп, М/І), ро! (Рготеда, Мадізоп, УМІ) Її рсОМА (Іпмйгодеп,

Ф) Сагізрай, СА). ка Нуклеїнові кислоти, які кодують поліпептид(и) котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, були також введені в клітини за допомогою рекомбінантних методик. Так, наприклад, така послідовність може бути введена шляхом бо Мікроїн'єкції в клітину зі здійсненням гомологічної рекомбінації в сайті ендогенного гена, що кодує поліпептид, його аналог або псевдоген, або послідовність зі значною ідентичністю гену, який кодує поліпептид котячого СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4. Можуть бути також використані й інші методи, основані на рекомбінації, такий як негомологічна рекомбінація і делеція ендогенного гена шляхом гомологічної рекомбінації, а зокрема, у поліпотентних клітинах. 65 Даний винахід відноситься до способу підсилення імунної відповіді у котів на імуноген, що досягається введенням цього імуногена до введення, після введення або, в основному, одночасно із введенням котячого

СсО80 або СО86 разом з котячим СО28 або котячим СТІ А-4 або без них у кількості, ефективній для підсилення імунної відповіді.

Даний винахід відноситься до способу підсилення імунної відповіді у котячих на імуноген, що досягається введенням експресуючого вектора, який містить імуноген, що походить від котячого патогену, і додаткові молекули котячого СО8О або СО8б разом з котячим СО28 або котячим СТІ А-4 або без них у кількості, ефективній для підсилення імунної відповіді.

Даний винахід відноситься до способу переорієнтації імунної відповіді у котів на імуноген, що досягається введенням експресуючого вектора, який містить імуноген, що походить від котячого патогену, і додаткові 7/0 Молекули котячого СОВО або СО86б разом з котячим СО28 або котячим СТІ А-4 або без них у кількості, ефективній для підсилення імунної відповіді.

Даний винахід відноситься до способу супресії імунної відповіді у котячих на імуноген, що досягається введенням цього імуногена до введення, після введення або, в основному, одночасно з введенням котячого

СО80 або СО86, разом з котячим СО28 або котячим СТІ А-4 або без них, або разом з антисмисловою РНК або

ДНК, що кодує котячий СО80О, котячий СО86, котячий СО28 або котячий СТІ А-4, у кількості, ефективній для супресії імунної відповіді.

Даний винахід відноситься до вакцини для індукування імунної відповіді у котів на імуноген, яка містить імуноген і ефективну кількість котячого СО8О або котячого СО86 разом з котячим СО28 або котячим СТІ А-4 або без них для підсилення імунної відповіді, або ефективну кількість котячого СО8О або котячого СО86 разом з КотячиМ СТІ А-4 для супресії імунної відповіді. В іншому варіанті свого здійснення даний винахід відноситься до вакцини, яка включає експресуючий вектор, що містить гени, які кодують імуноген(и) для котячих патогенів, і гени, які кодують СО8О, СО86 разом з котячим СО28 або котячим СТІ А-4 або без них для підсилення або супресії імунної відповіді.

Поліпептиди котячого СЮО8О, СО86. СО28 або СТІ А-4 сч

Ген котячого СО8О (ДНК і амінокислотна послідовність якого показані на Фіг.1 і 2) кодує поліпептид приблизно з 292 амінокислот. Ген котячого СО86 (ДНК і амінокислотна послідовність якого показані на Фіг.3) і) кодує поліпептид приблизно з 320 амінокислот. Ген котячого СО28 (ДНК і амінокислотна послідовність якого показані на Фіг.4) кодує поліпептид приблизно з 221 амінокислоти. Ген котячого СТІ А-4 (ДНК і амінокислотна послідовність якого показані на Фіг.5) кодує поліпептид приблизно з 223 амінокислот. со зо Очищення котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 із природних або рекомбінантних джерел здійснюють добре відомими методами, такими як, але не обмежуючись ними, іонообмінна хроматографія, обернено-фазова (87 хроматографія на колонках із С4, гель-фільтрація, ізоелектричне фокусування, афінна хроматографія і т.п. У М кращому варіанті здійснення винаходу великі кількості біологічно активного котячого СО8О, СО86, СО28 або

СТІ А-4 одержують шляхом конструювання рекомбінантної ДНК-послідовності, яка містить ділянку, що кодує ме) котячий СО80. СО86, СО28 або СТІ А-4, лігований зі збереженням рамки зчитування з послідовністю, що кодує 6 ї-

С-кінцевих гістидинових залишків у репліконі Р2ЕМІ (ВІВСО/ВКІ). мРНК, кодовану цією плазмідою, синтезують з використанням техніки, добре відомої фахівцям, і вводять у клітини ВНК-21 шляхом електропорації. Ці клітини синтезують ісекретують зрілі глікозильовані поліпептиди котячого СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, що містять 6

С-кінцевих гістидинових залишків. Модифіковані поліпептиди котячого СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 очищають «

З клітинного супернатанта за допомогою афінної хроматографії з використанням гістидин-зв'язуючого полімеру Ше с (Нівз-ріпа, Момадеп, Мадізоп, УМ).

Поліпептиди котячого СЮО8О або котячого СО86, виділені з будь-якого джерела, модифікують відомими з методами. Так, наприклад, котячі СО80О, СО86, СО28 або СТІ А-4 можуть бути фосфорильовані або дефосфорильовані, глікозильовані або деглікозильовані і т.п. Особливо ефективними є такі модифікації, які призводять до зміни розчинності, стабільності і специфічності й афінності зв'язування котячого СЮО8О, СО86, -І СсО28 або СТІ А-4.

Химерні молекули котячих СО80. СО86. СО28, СТІ А-4 о Даний винахід відноситься до продукування химерних молекул, отриманих із фрагментів котячих СО8О, -І соре8б, С028 і СТІ А-4 у будь-якій комбінації. Так, наприклад, для підвищення афінності зв'язування з СО28 при Підтримці посиленої імунної відповіді замість сайта зв'язування СЮО28 вводять сайт зв'язування СТІ А-4. - В одному з варіантів здійснення винаходу зв'язуючі сайти для СО8О або СО86 на СТІ А-4 і СО28 заміняють с так, щоб ділянка зв'язування на СО28 була замінена на ділянку зв'язування СТІ А-4. Дія химерної молекули СО28 з ділянкою зв'язування з СТІ А-4 повинна сприяти збільшенню афінності СО28 стосовно СО8О або СО86 ізбільшенню ступеня підсилення імунної відповіді. В альтернативному варіанті здійснення винаходу химерні дв Молекули СОВ8О ії С028 або СО 8 6 ії СО28 або їхні фрагменти є мембранозв'язаними і підвищують здатність цих молекул до підсилення імунітету. В альтернативному варіанті здійснення винаходу химерні молекули СО8О і

Ф) СТІ А-4 або СО86 і СТІ А-4 або їхні фрагменти є мембранозв'язаними і підвищують здатність цих молекул до ка пригнічення імунітету. В альтернативному варіанті здійснення винаходу химерні молекули СО8О і СТІ А-4 або сСО86 і СТІ А-4 або їхні фрагменти є мембранозв'язаними і сприяють переорієнтації імунної відповіді для бо досягнення потрібного ефекту.

В альтернативному варіанті здійснення винаходу котячий СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 являє собою гібридний білок з іншим поліпептидом. Таким поліпептидом є, але не обмежується ними, імуноглобулін, антиген, пухлинний антиген, рецептор клітинної поверхні або ліганд клітинної поверхні.

Антитіла проти котячого СО80О. СО86, СО28 або СТІ А-4 65 Даний винахід відноситься до антитіл, які є специфічними для поліпептидів котячого СО8О, СО86, СО28 або

СТІ А-4, ідентифікованих як описано вище. Ці антитіла є поліклональними або моноклональними, і розпізнають котячий СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 різних видів, ідентифікують функціональні домени і т.п. Такі антитіла звичайно продукують із використанням методів і композицій, описаних Нагіож 8 І апе, Апііродіевз. А І арогайгу

МапиаїЇ, Соїй Зргіпд Нагрог І арогаїогу, 1988, а також за допомогою імунологічної і гібридомної технології, відомої фахівцям. Якщо для індукування імунної відповіді, специфічної для котячого СО80, СО86, СО28 або

СТІ А-4, використовуються пептиди, що походять від природного і синтетичного котячого СО8О, СО86, СО28 або

СТІ А-4, то ці пептиди звичайно приєднують до підходящого носія, такого як КІН, і вводять до підходящого ад'юванту, такого як адювант Фрейнда. Вибрані пептиди, переважно, приєднують до носія з лізиновою серцевиною методами, в основному описаними Тап (1988) Ргос. Маїй). Асад. 5сі., ОБА, 85: 5409-5413. Отримані /о антитіла, а зокрема, антиідіотипічні антитіла, які несуть "внутрішній образ", можуть бути також отримані відомими методами.

В одному з варіантів здійснення винаходу очищені котячі СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 використовуються для імунізації мишей, після чого селезінку цих мишей видаляють, а спленоцити використовують для генерування клітинних гібридів з мієломними клітинами з одержанням клонів антитіло-секретуючих клітин методами, які звичайно використовуються фахівцями. Отримані моноклональні антитіла,секретовані зазначеними клітинами, скринують з використанням іп міїго-аналізів на такі активності: зв'язування з котячим СО8О, СО86, 2028 або

СТІА-4, інгібування рецептор-зв'язуючої активності СО80О, СО86, СО028 або СТІА-4, та інгібування

Т-клітинно-стимулюючої активності СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4.

Антитіла проти котячого СО8О, котячого СО86б6, котячого СЮО28 або котячого СТІ А-4 використовують для ідентифікації і кількісної оцінки котячого СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 з використанням імуноаналізів, таких як ЕГПІ5А, РІА і т.п. Антитіла проти котячого СО8О, котячого СО86, котячого СО28 або котячого СТІ А-4 також використовують для імунологічного виснаження екстрактів котячого СО8О, котячого СО86, котячого СЮО28 або котячого СТІ А-4. Крім того, ці антитіла можуть бути використані для ідентифікації, виділення й очищення котячого СЮО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 з різних джерел, і для проведення досліджень з їхньої субклітинної та сч ов Гістохімічної локалізації.

Застосування і)

Ліганд котячого СОВ8О (В7-1), ліганд котячого СО86 (87-2), рецептор котячого СО28 або рецептор котячого

СТІ А-4 (СО 152), які продукуються відповідно до даного винаходу, можуть бути використані переважно як вакцина для попередження інфекційного захворювання або для стимуляції росту у гомологічних або со зо гетерологічних видів котячих. Так, наприклад, може бути здійснена ко-експресія СО8О або СО86 з ко-стимулюючими молекулами СО28 або СТІ А-4 у будь-якій комбінації, і пухлинного антигену або антигенів від (7 патогенного мікроорганізму. Ко-експресія котячого СО8О або СО86б з рецептором котячого СТІ А-4 сприяє М інгібуванню активації Т-лімфоцитів і супресії імунної відповіді. Конкретним прикладом може служити ко-експресія СО8О або СО86 з імуногенами, що походять від ГРІМ, Бе! М або РІР, у вірусному векторі або у ме)

ДНК-експресуючому векторі, які, при введенні їх як вакцини, повинні активувати, підсилювати або регулювати ї- проліферацію СО4"7- і СО8"-Т-лімфоцитів та індукувати цитокіни, що регулюють імунну відповідь, такі як 1-2,

ІЄМ-9, 17-12, ТМРа, 1-6 і т.п. Іншим конкретним прикладом може служити коекспресія СО8О, СО86, СО28 або

СТІ А-4 у вірусному векторі або у ДНК-експресуючому векторі, які, при введенні їх як терапевтичного засобу, « повинні регулювати або переорієнтовувати імунну відповідь.

Підсилення імунітету шляхом взаємодії котячого СО8О або СО86 з СО28 або СТІ А-4 або інгібування імунної - с відповіді шляхом взаємодії котячого СО8О або СО86 з СТІ А-4 дає ту перевагу, що при цьому використовується ц природний спосіб регуляції, а не додавання чужорідних речовин, які навіть можуть виявляти множинну негативну "» дію на здоров'я тварини протягом всього її життя або протягом тривалого часу. Молекули СО80О, СО86, СО28 або

СТІ А-4 вводять разом з іншими рекомбінантними молекулами, такими, які кодують антигени, необхідні для індукування імунітету. Ген котячого СО8О, СО86, СО28 і/або СТІ А-4 вбудовують у експресуючий вектор або -І інфікують або трансфекують у клітину-мішень, і в цій клітині-мішені експресується генний продукт так, що він є заякоренним у плазматичній мембрані цієї клітини-мішені або антиген-презентуючої клітини, або о вінсекретується з цієї клітини-мішені або з антиген-презентуючої клітини. Експресуючий вектор, такий як -І плазміда, вірус Семліки-Форест, поксвірус або вірус герпесу, переносить даний ген до антиген-презентуючої цу 5 клітини. Ген котячого СО8О, СО86, СО28 і/або СТІ А-4 або фрагменти генів у будь-якій комбінації вбудовують до

ДНК- або РНК-експресуючого вектора і вводять з ін'єкцією котам, у результаті чого у цих котів експресується (Че генний продукт у вигляді "оголеної" ДНК/РНК або у вигляді генної вакцини. Така ко-експресія імуногена і СО8О, сор86, С028 і/або СТІ А-4 у клітині-мішені або в організмі котячих сприяє активації, посиленню активації або регуляції Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів та інших клітин. Альтернативно, експресований білок може бути введений

Після експресії в прокаріотичній або еукаріотичній системі, такій як плазміда, вірус Семліки-Форест, поксвірус або вірус герпесу або інший вірусний чи бактеріальний вектор. Білки котячого СО8О, СО86, СО28 або

Ф, СТІ А-4 звичайно функціонують у заякоренному вигляді у клітинній мембрані, як додаткові молекули ко плазматичної мембрани, але вони можуть бути представлені й в інших формах, а зокрема, без мембранних якорів. во В одному з варіантів здійснення винаходу котячий СО8О і котячий СО8б є розчинними, не містять трансмембранного домену або гідрофобної ділянки і взаємодіють з ко-слимулюючими молекулами СО28 або

СТІ А-4 або в мембраноасоційованій, або в розчинній формі. В альтернативному варіанті здійснення винаходу, котячий СОВ8О і котячий СО86 є мембранозв'язаними, а ко-стимулюючі молекули СО28 або СТІ А-4 присутні в розчинній формі і не містять трансмембранного домену або гідрофобної ділянки. Розчинні СО28 і СТІ А-4, краще 65 У димерній формі, можуть бути використані для лікування хвороб, пов'язаних з Т-клітинно-опосередкованою імуносупресією у котів. Розчинний СО28 або СТІ А-4 попереджає відторгнення трансплантованої тканини і може бути використаний для лікування аутоїмунних захворювань. Зокрема, розчинний СО28 або СТІ А-4 може бути використаний для попередження реакції "трансплантат проти хазяїна" при трансплантації кісткового мозку.

Розчинний СО28 або СТІ А-4 попереджає зв'язування клітини, яка містить мембраноасоційований котячий СО8О або СО86.

В іншому варіанті даного винаходу, котячий СТІ А-4 гібридизують з імуноглобуліном (Ід). Гібрид "СТІ А-4-Ід" може бути використаний для пригнічення імунної відповіді або для лікування аутоїмунного захворювання. Такими аутоїмунними захворюваннями є, але не обмежуються ними, артрит, псоріаз, відторгнення трансплантованого органа, реакція "трансплантат проти хазяїна". 70 В одному з варіантів здійснення винаходу, білки котячого СЮО8О і/або СО86, експресовані або в зв'язаній, або в розчинній формі, можуть бути використані для лікування, тобто зменшення або знищення пухлин у котів.

Зокрема, білки котячого СЮО8О і/або СО8б6 можуть бути експресовані з вірусного вектора або "оголеної" ДНК шляхом їхньої прямої ін'єкції в пухлину або системного введення в комбінації з (або без них) котячими пухлиноасоційованими антигенами, які є присутніми у цьому ж векторі.

Консервативні у відношенні послідовності і функціонально консервативні варіанти ДНК і поліпептиди котячого СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 або біологічно активний фрагмент або субфрагмент котячого СО8О, среб, Ср28 або СТІ А-4 лігують зі збереженням рамки зчитування з іншою послідовністю, такою як послідовність цитокіну, інтерлейкіну, інтерферону, колонієстимулюючого фактора, антигену від патогенного мікроорганізму, антитіла, або з послідовністю для очищення, такою як гістидинова мітка або репортерний ген, такий як Іас/

Есої, цідА Е.соїї, або білок, що флуоресціює у зеленій області спектра.

Вакцини

Даний винахід відноситься до способів і до композицій для підсилення ефективності імунної відповіді у котячих. У цьому варіанті здійснення винаходу, котячий СО8О, СО86, 2028 або СТІ А-4 використовують у поєднанні з імуногеном, проти якого необхідно продукувати імунну відповідь. Так, наприклад, для регуляції сч інтенсивності та якості імунної відповіді бажано, щоб у вакцині, яка містить імуногени від патогенів, таких як вірус імунодефіциту котів і вірус лейкозу котів, та інших патогенів, таких як котячий парвовірус, котячий і) лептовірус і котячий коронавірус, був присутній котячий СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4. Для цього, котячі СО8О, сОр86, С028 або СТІ А-4, очищені з нативних або рекомбінантних джерел, описаних вище, включають до вакцинного препарату у концентрації, що знаходиться в межах від близько 0,01 до 100,Омг/вакцину на кота. со зо Альтернативно, рекомбінантний вектор, експресуючий котячі СО8О, СО86, СО28 і/або СТІ А-4, та імуноген від котячого патогену, вводять у зазначений вакцинний препарат у концентрації, що знаходиться в межах від - близько 0,01 до 100,Омг/вакцину на кішку, а краще, у концентрації, що становить від близько 0,25мг/кг/день до М близько 25мг/кг/день.

Котячий СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 вводять у поєднанні з вакциною на основі "живого" (тобто такого, що і) з5 реплікується) вірусу або з вакциною, що не-реплікується. Необмежуючими прикладами вакцин, що реплікуються, ча є вакцини, які містять нативні або рекомбінантні віруси або бактерії, такі як модифікований вірус герпесу котів або модифікований вірус віспи єнотів. Необмежуючими прикладами "живих" вірусних вакцин, що обмежено реплікуються або взагалі не реплікуються в організмі-хазяїні кота, але які експресують чужорідну ДНК (таку, як ДНК котячого СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 або імуноген від котячого патогену) у клітині-хазяїні, є « модифікований вірус віспи свійської птиці, модифікований вірус віспи свиней або вірус Семліки-Форест. пт») с Необмежуючими прикладами вакцин, що не реплікуються, є вакцини, які містять "убиті" або інактивовані віруси або інші мікроорганізми, або неочищені або очищені антигени, що походять від нативних, рекомбінантних або ;» синтетичних джерел, таких як, наприклад, вакцини на основі вірусу лейкозу котів.

Комерційні джерела котячих вакцин відомі кожному фахівцю (Сотрепаїшт ої Меїйегіпагу Рпагтасеціїсаї!в5, 1997), і для одержання більш ефективної вакцини вони можуть бути використані у комбінації з вакцинами даного -І винаходу.

Вакцина для індукування і регуляції імунної відповіді у котячих у відповідь на імуноген складається з о імуногена та ефективної кількості котячого СОВ8О і котячого СО86 разом з котячим СО28 або котячим СТІ А-4, або -І без них, для підсилення імунної відповіді, або котячого СО8О і котячого СО86 разом з котячим СТІ А-4, для пригнічення імунної відповіді. - Цей імуноген вибирають із групи, що включає, але не обмежується ними, котячі патогени, такі як вірус с імунодефіциту котів, вірус лейкозу котів, вірус інфекційного перитоніту котів, вірус панлейкопенії котів (парвовірус), котячий каліцивірус, котячий реовірус типу 3, котячий ротавірус, котячий коронавірус (вірус інфекційного перитоніту), рабівірус, синцитіальний вірус котів, вірус саркоми котів, вірус герпесу котів дв (Вірус ринотрахеїту), вірус хвороби Борна котів, хламідії, Тохоріазтозівз допай), котячі паразити, Оігойагіа іттійв, блохи, бактеріальні патогени і т.п.

Ф) Регуляція росту або регуляція активації клітини певного типу, такої як Т-лімфоцит, свідчить про те, що ка регуляторна відповідь або стимулює, або пригнічує ріст клітини. Регуляція імунної відповіді у котів вказує на те, що ця імунна відповідь або стимулюється, або пригнічується з виліковуванням даної хвороби або усуненням во інфекційного агента у котів.

У кращому варіанті здійснення винаходу, гени, які кодують котячі СЮО8О і 2028, СОВ80 і СТІ А-4, СО86 і СО28, або СО86 і СТІ А-4 у комбінації з генами, які кодують імуноген від котячого патогену, вводять в один рекомбінантний вірусний вектор, а потім одержують "живу" вакцину. Гени котячого СО8О, СО86, СО28 або

СТІ А-4, узяті окремо або в комбінації з генами котячого імуногена, вводять у рекомбінантний вірус так, щоб 65 експресія цих генів знаходилася під контролем відповідного промотору. Введення вакцини призводить до експресії біологічно активних котячих лігандів СО8О або СО86, і рецепторів СО28 або СТІ А-4, і до експресії котячого імуногена(ів) у тій же самій клітині і тим самим сприяє продукуванню первинних і вторинних ко-стимулюючих сигналів, необхідних для підсилення потрібної імунної відповіді. У цьому варіанті свого здійснення, даний винахід відноситься до ранньої локалізованої імунної відповіді на котячий імуноген і до вакцини з підвищеною ефективністю, спрямованої проти хвороб у котів.

В іншому варіанті даного винаходу гени, що кодують котячі СЮО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узяті окремо або в комбінації, вводять у рекомбінантний вірусний вектор, і вводять у вакцину разом із другим рекомбінантним вірусним вектором, який включає гени котячого імуногена(ів), і тим самим сприяє продукуванню потрібної відповіді в тих же самих клітинах або у клітинах, що знаходяться в безпосередній близькості від цих клітин, у /о результаті чого досягається підсилення потрібної імунної відповіді з одержанням вакцини з підвищеною ефективністю, спрямованої проти хвороб у котів.

Нижче наводяться приклади рекомбінантних вірусних векторів, які використовуються для експресії котячих сорво, сОр86, СО28 або СТІ А-4 і для одержання вакцини з метою продукування підвищеної протективної імунної реакції у відповідь на зараження патогенним мікроорганізмом, а саме векторів, які використовуються для: 1. Експресії часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, у рекомбінантному вірусі віспи свиней (вбудованому в будь-який неосновний сайт інсерції). Для вакцинації котів, але не тільки котів, вакцинами, що не реплікуються, які використовуються окремо або в будь-якій комбінації з іншою вакциною або з терапевтичним агентом (рекомбінантним, живим або "убитим"). 2. Експресії часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій

Комбінації, у рекомбінантному вірусі герпесу котів (вбудованому в сайт ЗЕ РНМ або в будь-який не-основний сайт інсерції). Для вакцинації котів, але не тільки котів, вакцинами, що реплікуються, які використовуються окремо або в комбінації з іншою вакциною або з терапевтичним агентом (рекомбінантним, живим або "убитим").

З. Експресії часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, у рекомбінантному вірусі віспи єнотів (вбудованому в будь-який неосновний сайт інсерції). Для с ов вакцинації котів, але не тільки котів, вакцинами, що реплікуються, які використовуються окремо або в комбінації з іншою вакциною або з терапевтичним агентом (рекомбінантним, живим або "Убитим"). і) 4. Експресії часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, у рекомбінантному вірусі віспи свиней, що містить гени для дад-протеази і/або оболонки РМ. 5. Експресії часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій со зо комбінації, у рекомбінантному вірусі герпесу котів, що містить гени для дад-протеази і/або оболонки РМ. 6. Експресії часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій - комбінації, у рекомбінантному вірусі віспи єнотів, що містить гени для дад-протеази і/або оболонки ЕРМ. М 7. Експресії часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, у рекомбінантному вірусі віспи свиней, що містить гени для дад-протеази і/або оболонки Бе М. ме) 8. Експресії, часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій ча комбінації, у рекомбінантному котячому вірусі герпесу, що містить гени для дад-протеази і/або оболонки Ре! М. 9. Експресії часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, у рекомбінантному вірусі віспи єнотів, що містить гени для дад-протеази і/або оболонки Ре М. 10. Експресії часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій « комбінації, у рекомбінантному вірусі віспи свиней, що містить гени для дад-протеази і/або оболонки РеїЇМ і з с гени дад-протеази і/або оболонки РІМ або будь-яку їхню комбінацію. 11. Експресії часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій ;» комбінації, у рекомбінантному котячому вірусі герпесу, що містить гени для дад-протеази і/або оболонки РеїЇМ і гени дад-протеази і/або оболонки РІМ або будь-яку їхню комбінацію. 12. Експресії часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій -І комбінації, у рекомбінантному вірусі віспи єнотів, що містить гени для дад-протеази і/або оболонки РеїМ і гени дад-протеази і/або оболонки РІМ або будь-яку їхню комбінацію. і 13. Експресії часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій -І комбінації, у вірусі віспи свиней або у вірусі віспи єнотів, або в будь-якій іншій експресуючій системі, 5р Включаючи, але не обмежуючись ними, Е.соїї, вірус Семліки-Форест або бакуловіру, з метою генерування - неочищеного або очищеного поліпептиду. Для використання з потрібною метою, включаючи, але не с обмежуючись ними, продукування поліклональних і моноклональних антитіл, і продукування реагентів для розробки функціональних аналізів. 14. Експресії часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, у векторі на основі атенуйованого вірусу ЕМ або Ре! М. В одному з варіантів здійснення винаходу вектор на основі вірусів ГРІМ або Ре! М атенуйований за допомогою делеції гена. (Ф) 15. Експресії часткових або повних котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій ка комбінації, у експресуючому векторі, що містить ген(и) котячих імуногенів, з метою його введення як генної вакцини або вакцини на основі "оголеної" ДНК. Такими векторами є, але не обмежуються ними, рТагдеї бо (Рготеда Согр., Мааізоп, УМ), рсОМА (Іпмігодеп, Сагізрайд, СА). (Ооппепїу .., еї аї, 1997; Наззейн 8. МУ/піноп, 1996). 16. Гени або фрагменти генів СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, узяті окремо або в будь-якій комбінації, частково або повністю, можуть бути введені або трансфековані в хромосоми котів або іншого ссавця. Така інтеграція цих генів або фрагментів цих генів може бути досягнута з використанням ретровірусного вектора і може бути використана в генній терапії. 65 Даний винахід відноситься до способів і композицій, які призначені для підвищення у котячих резистентності до хвороб і використовуються у медичних і/або в комерційних цілях. У цьому варіанті здійснення даного винаходу котячі СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, експресовані окремо або в будь-якій комбінації, частково або повністю, і в комбінації з генами, що кодують котячі імуногени, або без них, вводять котам будь-яким придатним способом введення. Для стимуляції росту або для вироблення резистентності до хвороб, котячі сорво,сО086,с028 або СТІ А-4, експресовані окремо або в будь-якій комбінації, вводять у композицію в концентрації, що становить від близько 0,01 до 100,О0мг на вакцину для одного кота, а краще, у концентрації, що становить від близько 0,25мг/кг/день до близько 25мг/кг/день. Для стимуляції росту або для вироблення резистентності до хвороб рекомбінантний вірусний вектор, що експресує котячі СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, окремо або в будь-якій комбінації, вводять у композицію в концентрації, що становить від близько 0,01 до 70 100,0мг на вакцину для одного кота, а краще, у концентрації, що становить від близько 0,25мг/кг/день до близько 25мг/кг/день. При цьому слід зазначити, що необхідна кількість котячого СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 може бути визначена методом рутинного експериментування, добре відомого фахівцям, наприклад, шляхом установлення матриці доз і частоти введення, і порівняння групи експериментальних одиниць або суб'єктів з кожною точкою в матриці.

Згідно з даним винаходом, нативний або рекомбінантний котячий СО8О, СО86, СО28 і СТІ А-4 вводять у композицію разом з фізіологічно прийнятним носієм, таким як, наприклад, забуферений фосфатом фізіологічний розчин або деіонізована вода. Ця композиція може також містити наповнювачі, включаючи замаслювачії), пластифікатор(и), підсилювачії) абсорбції, бактерицид(и) і т.п., добре відомі фахівцям. Поліпептид котячого срво, сОв86, 2028 і СТІ А-4 даного винаходу вводять будь-яким ефективним способом, включаючи, але не обмежуючись ними, внутрішньовенне, підшкірне, внутрішньом'язове, черезм'язове, місцеве або пероральне введення. Наприклад, для підшкірного введення лікарська форма складається з котячого СО8О, СО86, СО28 або

СТІ А-4 у стерильному фізіологічному розчині. Для перорального введення або введення шляхом інгаляції котячий СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, разом з наповнювачем або без нього, поміщають у мікро- або макрокапсули, наприклад, у ліпосоми і мікросфери. Можуть бути також використані шкірні пластири (або інші сч ов Лікарські форми пролонгованого вивільнення).

Матеріали і методи. (8)

Одержання вихідних зразків вірусу віспи єнотів

Для одержання вихідних зразків вірусу віспи єнотів і геномної ДНК вірусу віспи єнотів використовували ізолят вірусу віспи єнотів (АРМ) АТОСС М-838. Іншим доступним ізолятом КРМ є М71-1І-85А, наявний у Центрі по со

Зо Контролю захворюваності (СОС; АМапіа, СА). Зразки вірусу віспи єнотів (КРУ) одержували шляхом інфікування клітин МЕКО, клітин СВЕК або клітин МОСК при множинності зараження 0,016.у.о./клітину в модифікованому за. 7 способом Дульбекко середовищі Ігла, що містить 2мМ глутаміну, 1О0бод./мл пеніциліну, 100од./мл стрептоміцину М (ці компоненти були отримані від Зідта або аналогічного постачальника) і називається далі дефіцитним середовищем ОМЕМ. Перед інфікуванням клітинні моношари один раз промивали дефіцитним середовищем ме) 35 ОМЕМ для видалення слідових кількостей фетальної бичачої сироватки. Потім ці моношари залишали на дві ї- години, перерозподіляючи їх щопівгодини, для абсорбції в них КРУ, що міститься у вихідному інокуляті (О,5мл на 1Осм-пластинку, 1Омл на 225см?-Т-колбу). Після закінчення цього періоду часу вихідний інокулят доводили до об'єму, що рекомендується, шляхом додавання повного середовища ЮОМЕМ (дефіцитне середовище «

ОМЕМ 595 фетальна бичача сироватка). Ці планшети інкубували при 372С в 595 СОг доти, поки не була 40 завершена цитопатична дія. Це середовище і клітини збирали і заморожували у конічних 5Омл-пробірках із - с кришкою, що загвинчується, при -702С. Після відтавання при 37 «С аліквоти вихідного вірусного матеріалу "» розподіляли по 1,0мл-посудинам і знову заморожували при -702С. Титри складали, в основному, приблизно " 1066.у.о./мл.

Одержання вихідних зразків вірусу віспи свиней 45 Зразки вірусу віспи свиней (ЗРМ) одержували шляхом інфікування клітин нирки свинячого ембріона (ЕМ5К), - клітин ЕЗК-4, клітин РК-15 або клітин МЕКО при множинності зараження 0,016.у.о./клітину в 1:1-суміші в оо модифікованому за способом Дульбекко середовищі Ісков (ІМОМ) і середовищі КРМІ 1640, що містить 2ММ глутаміну, 1Обод./мл пеніциліну, 1Обод./мл стрептоміцину (ці компоненти були отримані від бідта або - аналогічного постачальника, і далі вони будуть називатися дефіцитним середовищем ЕМ5К). Перед -щ 20 інфікуванням клітинні моношари один раз промивали дефіцитним середовищем ЕМ5К для видалення слідових кількостей фетальної бичачої сироватки. Потім ці моношари залишали на дві години, перерозподіляючи їх со щопівгодини, для абсорбції в них ЗРУ, який міститься у вихідному інокуляті (О,5мл на 1Осм-пластинку, 1Омл на 175см2-колбу Т). Після закінчення цього періоду часу вихідний інокулят доводили до об'єму, що рекомендується, шляхом додавання повного середовища ЕМ5К (дефіцитне середовище ЕМЗК59о фетальна бичача сироватка). Ці планшети інкубували при 372С в 5956 СО» доти, поки не була завершена цитопатична дія.

ГФ) Це середовище і клітини збирали і заморожували при -702С в конічних 5Омл-пробірках із кришкою, що 7 загвинчується. Після відтавання при 372 аліквоти вихідної вірусної культури розподіляли по 1,0мл-посудинам і знову заморожували при -702С. Титри складали, в основному, приблизно 1056.у.0./мл. во Одержання ДНК КРМ або 5РУ

Для виділення ДНК вірусу віспи єнотів або вірусу віспи свиней, конфлюентний моношар клітин МЕКО (для

ЕРМ) або клітин ЕМ5К (для ЗРМ) у 225см 2-колбі Т інфікували вірусом віспи єнотів (АТСС МЕ-838) при множинному зараженні 0,1 та інкубували протягом 3-5 днів доти, поки клітини не виявляли 10095 цитопатичний ефект. Потім інфіковані клітини збирали шляхом зскрібання клітин у середовище і центрифугували протягом 5 б5 хвилин при З00боб/хв у лабораторній клінічній центрифузі. Потім середовище декантували, і клітинний осад м'яко ресуспендували в 1,0мл забуференого фосфатом фізіологічного розчину (РВ5: 1,5г Ма 2НРО,, 0,2г

КН2РО4, О8г Масі і 02г КСІ на літр НЬО) (на Т175) і піддавали двом послідовним циклам заморожування-відтавання (від -70 С до 372). Після останнього відтавання ці клітини (на льоду) два рази обробляли ультразвуком, щоразу протягом ЗОсекунд з інтервалами по 45секунд для охолодження. Потім

Клітинний дебрис видаляли шляхом центрифугування (на надшвидкісній центрифузі Зогмаї! КС-58) при

ЗОО0боб/хв протягом 5 хвилин на роторі НВ4 при 4 2С. Потім віріосни КРМ, які присутні у супернатанті, осаджували шляхом центрифугування при 15000об/хв протягом 20 хвилин при 4 С на роторі 5534 (Зогмаї|) і ресуспендували в 10мМ Трисі (рН 7,5). Потім цю фракцію наносили на 3695 градієнт сахарози (мас/об у 10ММ

Трис, рН 7,5) і центрифугували (ультрацентрифуга Весктап І В-7ОМ) при 18000об/хв протягом 60 хвилин на 70 роторі ЗМУ41 (ВесКтап) при 42С. Осад віріону ресуспендували у 1,О0мл 1О0мМ Трис, рН 7,5, і обробляли ультразвуком протягом ЗОсекунд на льоду. Цю фракцію наносили на 2095-5095 неперервний градієнт сахарози і центрифугували при 16000об/хв протягом 60 хвилин на роторі ЗМУ41 при 42С.смугу віріону КРУ, локалізовану приблизно на три чверті нижче градієнта, збирали, розводили 2095 сахарозою й осаджували центрифугуванням при 18000об/хв протягом 60 хвилин на роторі ЗМУ41 при 42С. Потім отриманий осад один раз промивали 10ММ 75 Трисом, рН 7,5, для видалення слідових кількостей сахарози, і, нарешті, ресуспендували в 10мМ Трисі, рН 7,5.

Після цього ДНК КРУ екстрагували з очищених віріонів шляхом лізису (4 години при 602С), індукованого шляхом додавання ЕОТА, ДСН і протеїнази К до одержання кінцевих концентрацій 20мММ, 0,595 і О,5мг/мл, відповідно.

Після гідролізу проводили три екстракції сумішшю фенолу-хлороформу (1:11), їі зразок осаджували шляхом додавання двох об'ємів абсолютного етанолу та інкубували при -2029С протягом ЗО хвилин. Потім зразок центрифугували в мініцентрифузі Еппендорфа протягом 5 хвилин на повній швидкості. Супернатант декантували, і отриманий осад сушили на повітрі і повторно гідратували в 0,01М Трисі, рН 7,5,1мМ ЕОТА при 496.

Одержання зразків вихідного вірусного матеріалу ЕНМ

З-ЕНМ-000 одержували з АТСС (АТСС Моб36), а 5-ЕНМ-001 одержували з ММ5І (ММУ5І -випробовуваний сч штам вірусу ЗСОЕ, Г ої К8). Зразки вихідної вірусної культури ЕНМ одержували шляхом інфікування клітин котячої (У нирки Стапаеі! (СКЕК) при множинності зараження 1,06б.у.о./клітину в модифікованому за способом Дульбекко середовищі Ігла, що містить 2мМ глутаміну, 100од./мл пеніциліну, 1Обод./мл стрептоміцину (ці компоненти були отримані від Ігміпе Зсіепійс або еквівалентного постачальника, і далі вони будуть називатися повним середовищем ЮМЕ)н5ЯО» фетальна бичача сироватка. Після завершення цитопатичної дії це середовище і со 3о клітини збирали, розшаровували і заморожували при -702С. Титри складали, в основному, приблизно від їх до ж: 1х106.у.0./мл. м

Одержання ДНК вірусу герпесу

Конфлюентний моношар клітин СЕЕК у 25см? колбі або в бОмМ-чашці Петрі інфікували 100мл зразка вірусу. і)

Після інкубування протягом ночі або після виявлення клітинами 10095 цитопатичної дії, ці клітини зіскрібали в ча середовище. Ці клітини і середовище центрифугували при З000об/хв протягом 5 хвилин у лабораторній клінічній центрифузі. Це середовище декантували, і клітинний осад злегка ресуспендували в О,5мл розчину, який містить 0,596 МОМІОЕТ Р-40 (конденсат октилфенолетиленоксиду, що містить у середньому 9 моль етиленоксиду на молекулу) (МР-40 був закуплений у Зідта Спетіса! Со., 5. І оціз, МО). Цей зразок інкубували при кімнатній « температурі протягом 10 хвилин. Потім додавали ТОмл маточного розчину РНКази А (Зідта Спетіса! Со., 51. 2 с І оців, МО) (маточний розчин мав концентрацію 1Омг/мл, і був прокип'ячений протягом 10 хвилин для інактивації

ДНкКази). Цей зразок центрифугували для осадження ядер. ДНК-осад видаляли пастерівською піпеткою або з дерев'яною паличкою і відкидали. Рідкий супернатант декантували в 1,5мл-пробірку Еппендорфа, яка містить 25мл 20956 додецилсульфату натрію (Зідта) і 25мл протеїнази К (1Омг/мл; Воейгіпдег Мапппіет Віоспетісаї!в5,

Іпаіапороїїв, ІМ). Цей зразок змішували та інкубували при 372С протягом 30-60 хвилин. Потім додавали рівний -і об'єм насиченого водою фенолу і зразок швидко розмішували. Потім зразок центрифугували в мініцентрифузі

Еппендорфа на повній швидкості протягом 5 хвилин. Верхню водну фазу збирали і поміщали в нову пробірку о Еппендорфа, потім додавали два об'єми абсолютного етанолу, і цю пробірку поміщали на 30 хвилин при -202С -і для осадження нуклеїнової кислоти. Потім зразок центрифугували в мініцентрифузі Еппендорфа протягом 5 хвилин. Супернатант декантували, і осад сушили на повітрі та повторно гідратували в «Ібмл НьО. Для - одержання більших кількостей ДНК цю процедуру проводили в збільшеному масштабі, починаючи з со ролер-флаконів або 175см -колб із клітинами СКЕК. ДНК зберігали в 0,01М Трис, рН 7,5, мМ ЕОТА при 426.

ДНК-трансфекція для генерування рекомбінантного вірусу

Цей метод грунтується на процедурі з використанням фосфату кальцію Сгапйат і Мап дег ер (25) з нижченаведеними модифікаціями. Вірус і/або плазмідну ДНК розводили до 298мл у 0,01М Трис, рН 7,5, мМ

ЕОТА. Потім додавали 40мл 2М СасСі» з наступним додаванням рівного об'єму 2х забуференого НЕРЕЗ і) сольового розчину (10г М-2-гідроксиетилпіперазин-М'-2-етансульфонової кислоти (НЕРЕ5), 16бг Масі, 0,74г КСІ, ко 0,25г МагНРО,, 2Н.О, 2г декстрози на 1 літр НО і забуферений Маон до рн 7,4). Після цього суміш інкубували на льоду протягом 10 хвилин, а потім по краплях додавали до 8096 конфлюентного моношару клітин СКРК, бо культивованих у бОмМ-чашці Петрі в бмл середовища (ОМЕж595 фетальна бичача сироватка). Ці клітини інкубували протягом 4 годин при 372С в інкубаторі з підвищеною вологістю, який містить 595 СО». Середовища на планшетах відсмоктували і клітини обробляли 2095 гліцерином у їх РВЗ (1,15г Ма2НРО», 0,2г КНоРО»Х, 0,8г масі, 0,2г КСІ на 1 літр Н.О) протягом однієї хвилини. Клітини три рази промивали 5мл їх РВ5, а потім додавали бмл середовища (ОМЕ-595 фетальна бичача сироватка). Клітини інкубували при 372С, як описано вище, 65 протягом 3-7 днів, доти, поки цитопатичний ефект вірусу не становив 50-10095. Вірус збирали, як описано вище, для одержання вихідного вірусного матеріалу. Цей вихідний вірусний матеріал називали трансфекційним вихідним вірусним матеріалом, а потім скринували на рекомбінантний вірус, як описано у розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус герпесу, що експресує ферментні маркерні гени".

Одержання інфікованих клітинних лізатів. Для одержання клітинних лізатів використовували безсироваткове

Середовище. Конфлюентний моношар клітин (МЕКО, СЕЕК або МОСК) у 25см?-колбі або бОомМ-чашці Петрі інфікували 100 мкл зразка вірусу. Після забезпечення цитопатичного ефекту середовище і клітини збирали, і ці клітини осаджували при З000об/хв протягом 5 хвилин у лабораторній клінічній центрифузі. Клітинний осад ресуспендували в 250мкл буфера для лізису (296 додецилсульфат натрію, 295 В-меркаптоетанол). Зразки обробляли ультразвуком протягом Збсекунд на льоду і зберігали при -2026. 70 Процедура Вестерн-блоттингу. Зразки стандартних лізатів і білків піддавали електрофорезу в поліакриламідному гелі відповідно до методу Лаемнлі (І аетпії). Після гель-електрофорезу білки переносили і процесували, як описано ЗатьгооК та ін. (1989). "Перше" антитіло розводили 1:100 595 знежиреним сухим молоком у суміші Трису-хлориду натрію та азиду натрію (Т5А: 6,6б1г Трис-НСІ, 0,97г Трис-основи, 9,Ог Масі і 2,0г азиду натрію на 1 літр Н.О). "Друге" антитіло кон'югували з лужною фосфатазою і розводили 1:1000 ТА.

Техніка молекулярної біології. Техніка маніпуляцій з бактеріями і ДНК, включаючи такі процедури, як гідроліз рестриктуючими ендонуклеазами, гель-електрофорез, гель-екстракція ДНК, лігування, фосфорилювання кіназою, обробка фосфатазою, культивування бактеріальних культур, трансформація бактерій з використанням

ДНК та інші методи, які застосовуються в молекулярній біології, описана ЗатбгооК еї аЇ. (1989) й Ситепі

РгоїосоЇїв іп Моїесціаг Віоюду (1992). У особливо обговорених випадках, вони можуть бути використані з незначними змінами.

Секвенування ДНК.секвенування ДНК здійснювали шляхом проведення реакцій дидезокси-секвенування за допомогою флуоресцентної мітки з використанням готового набору для циклічної реакціїсеквенування, який містить барвник для термінації ланцюга АВІ РКІЗМ (ЮОуе Тегтіпайг Сусіе Зедцепсіпд Кеаду Кеасійоп) з використанням ДНК-полімерази Атрійад, Е5 (Регкіп-ЕІтег; відповідно .до інструкцій виробників), і піддавали Ге електрофорезу на автоматичному ДНК-секвенаторі моделі 37ЗА РегКкіп ЕІтег/Арріїей Віозувіетвз відповідно до о інструкцій виробників. Реакції з використанням як сумішей астТР, так і сумішей аІТР, здійснювали для просвітлення ділянок ущільнення. Альтернативно, ущільнені ділянки розділяли у формамідних гелях. Матриці являли собою субклони дволанцюгових плазмід або субклони одноланцюгового М13, а праймери або вбудовували у вектор безпосередньо за вставкою, щосеквенується, або вбудовували у попередньо отриману с послідовність. Отриману послідовність збирали і порівнювали з використанням програмного забезпечення

ОМАЗВІаг. --

Клонування з використанням полімеразної ланцюгової реакції. Для введення рестрикційних сайтів, що їч- підходять для проведення маніпуляції з різними ДНК, використовували полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР).

Процедури, що використовуються, описані Іппіз та ін. (1990). В основному, ампліфіковані фрагменти містили о менше ніж 500 пар основ, і основні ділянки ампліфікованих фрагментів були підтверджені шляхом їч-

ДНК-секвенування. Праймери, які використовувалися в кожному випадку, докладно описані нижче в описі конструювання гомологічних векторів.

Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРМ, 5РМ або ЕНМ. Цей метод « грунтується на гомологічній рекомбінації між ДНК вірусу віспи єнотів і ДНК плазмідного гомологічного вектора, 470 яка відбувається в клітинах культури тканини, що містять як ДНК вірусу віспи єнотів, так і трансфекований - с плазмідний гомологічний вектор. Для здійснення гомологічної рекомбінації моношари клітин (СКРК, МОСК, або ц МЕКО) інфікували 5-КРМ-000 (АТСС МтК-838) або 5-5РМ-001 або 5-ЕНМ-001 при множинності зараження ,» 0,016.у.о./клітину для введення КРМ, що реплікуються (тобто, для синтезу ДНК), у ці клітини. Потім ДНК плазмідного гомологічного вектора трансфекували у ці клітини відповідно до процедури інфікування-трансфекції.

Конструювання гомологічних векторів, що використовуються у цій процедурі, описано нижче. - І Процедура інфікування-трансфекції. бсм-ч-ашки з клітинами (СКЕК, МОСК або МЕКО) з конфлюентністю близько 8095, інфікували 5-КРМУ-000 або 5-5РМ-001 або 5-ЕНМ-001 при множинності зараження 0,016.у.0о./клітину мні в дефіцитному середовищі ОМЕМ та інкубували при 372С в атмосфері 595 СОг з підвищеною вологістю протягом -і 2-3 годин. В основному, використовували процедуру трансфекції, яка рекомендована для реагенту -л 20 ліпофектинутм (ВК). Коротко, для кожної бсм-чашки, 15мкг плазмідної ДНК розводили НО до об'єму 100 мкл.

Окремо, 50 мікрограмів ліпофектинового реагенту розводили НоО до об'єму 100мкл. Потім 100мкл розведеного 42) ліпофектинового реагенту по краплях додавали до розведеної плазмідної ДНК, яка міститься в полістироловій

БбБмл-пробірці з кришкою, що загвинчується, і злегка розмішували. Потім цю суміш інкубували протягом 15-20 хвилин при кімнатній температурі. Протягом цього періоду часу вірусний інокулят видаляли з бсм-чашок і клітинні моношари один раз промивали дефіцитним, середовищем ЮОМЕМ. Потім Змл дефіцитного середовища о ОМЕМ-додавали до суміші плазмідної ДНК/ліпофектину, і вміст наносили піпеткою на клітинний моношар. Ці клітини інкубували протягом ночі (близько 16 годин) при 372С в атмосфері 595 СО» з підвищеною вологістю. о Наступного дня Змл дефіцитного середовища ОМЕМ видаляли і замінювали 5мл повного середовища ОМЕМ. Ці клітини інкубували при 372С в атмосфері 596 СО» з підвищеною вологістю протягом 3-5 днів доти, поки 60 цитопатична дія вірусу не становила 80-10095. Вірус збирали, як описано вище для одержання вихідної вірусної культури. Цю культуру називали трансфекційною вихідною культурою, а потім скринували на рекомбінантний вірус, як описано у розділі "Скринінг методом ВІ ШОСАЇ на рекомбінантний вірус віспи єнотів або скринінг методом СРКО на рекомбінантний вірус віспи єнотів".

Скринінг на рекомбінантний вірус КРМ або ЗРМУ або ЕНУ, який експресує В-галактозидазу (аналізи ВІ ООСАЇ і бо СРВЕО) або В-глюкуронідазу (аналіз Х-СІ ОС)

При введенні маркерного гена В-галактозидази (Іас7) Е.соїї у рекомбінантний вірус, бляшки, що містять рекомбінанти, візуалізували одним із двох простих методів. У першому методі, хімічний Віодаїтм (І Ше Зсіепсез

Тесппоіоду, Ве(пезаа, МО) наносили (200мкг/мл) поверх агарозного шару під час аналізу на бляшко утворення, і бляшки, які експресують активну В-галактозидазу, набували синього забарвлення. Потім сині бляшки висівали на свіжі клітини (МОСК, СКЕК або МЕКО) і очищали шляхом додаткового виділення синіх бляшок. У другому методі,

СРКО (Воепгіпдег Мапппіет) наносили (40Омкг/мл) поверх агарозного шару під час аналізу на утворення бляшок, і бляшки, які експресують активну В-галактозид азу, набували червоного забарвлення. Потім червоні бляшки висівали на свіжі клітини (МОСК, СКЕК або МЕКО) і очищали шляхом додаткового виділення червоних 7/0 бляшок. В обох випадках, віруси звичайно очищали з використанням трьох або чотирьох циклів очищення бляшок.

При введенні маркерного гена В-глюкуронідази (цідА) Е.соїї у рекомбінантний вірус, бляшки, що містять рекомбінанти, візуалізували з використанням хромогенного субстрату, Х-бета-О-діША СНХ (Х-ОБІ ОС; циклогексиламонієва сіль 5-бром-4-хлор-3-індоксил-бета-О-глюкуронової кислоти; Віозупій Ас; Змійгепапа) 75 наносили (200мкг/мл) поверх агарозного шару під час аналізу на утворення бляшок, і бляшки, які експресують активну В-глюкуронідазу, набували синього забарвлення. Потім сині бляшки висівали на свіжі клітини (МОСК,

СКЕК або МЕКО) і очищали шляхом додаткового виділення синіх бляшок.

Скринінг на експресію чужорідного гена в рекомбінантному КРМ з використанням аналізів на утворення чорних бляшок

Для аналізу експресії чужорідних антигенів, експресованих рекомбінантними вірусами віспи єнотів, моношари клітин (МОСК, СКЕК або МЕКО) інфікували рекомбінантними КРУ, 5РМ або ЕНУ, наносили на них живильні агарозні середовища та інкубували протягом 3-5 днів при 372С для утворення бляшок. Верхній агарозний шар видаляли з чашки, клітини фіксували 10095 метанолом «протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, а потім сушили на повітрі. Фіксація клітин дозволяє детектувати цитоплазматичний антиген, а також поверхневий Га гр; антиген, тоді як експресія специфічного поверхневого антигену може бути детектована з використанням нефіксованих клітин. Потім "перше" антитіло розводили до відповідної концентрації Іхреагентом "блотто" (595 о знежирене сухе молоко в Трис-хлориді натрію й азиді натрію (ТА: 6,61г Трис-НСЇІ, 0,97г Трис-основи, 9,Ог Масі і 2,О0г азиду натрію на їл Н.ЬО)) та інкубували на клітинному моношарі протягом 2 годин при кімнатній температурі. Незв'язане антитіло видаляли шляхом триразового промивання клітин буфером Т5 при кімнатній ее температурі. "Друге" антитіло, кон'юговане з лужною фосфатазою, розводили 1:1000 Іхреагентом "блотто" та інкубували з клітинами протягом 2 годин при кімнатній температурі. Потім незв'язане "друге" антитіло видаляли -- шляхом триразового промивання клітин буфером Т5 (6,61г Трис-НСІ, 0,97г Трис-основи, 9,0г Масі на Тл Н 20) ч- при кімнатній температурі. Після цього клітини інкубували 15-30 хвилин при кімнатній температурі зі свіжоприготовленим розчином субстрату (100мММ Трис-НСІ, рН 9,5, 100мМ Масі, 5мМ Мас, 0,Змг/мл о 3з5 Нітротетразолієвого синього і 0,15мг/мл 5-бром-4-хлор-3-індоїлфосфатази). Бляшки, які експресують потрібний ч- антиген, забарвлювалися у чорний колір. Для припинення розвитку колірної реакції використовували розчин-фіксатор (20мМ Трис-НСЇ, рН 2,9 і 1мМ ЕОТА).

Скринінг на експресію котячих СО8О (87-1) і СО086 СВ7-2) М рекомбінантних ЗРУ. КРМ або ЕНМ з « використанням аналізу на утворення чорних бляшок

Для аналізу експресії костимулюючих молекул СО8О або СО86, експресованих рекомбінантними вірусами - с віспи свиней, вірусами віспи єнотів або вірусами герпесу котів на моношарах клітин (МОСК, СКЕК, МЕКО або ц ЕЗК-4), ці клітини інфікували рекомбінантними вірусами КРУ, ЗРМ або ЕНУ, які експресують СО8О або СО86, "» потім на них наносили живильні агарозні середовища та інкубували протягом 3-5 днів при 372С для утворення бляшок. Верхній агарозний шар видаляли з чашки, клітини або фіксували 10095 метанолом протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, а потім клітини сушили на повітрі, або залишали нефіксованими чи залишали -і нефіксованими і відразу обробляли 1хРВ5. Фіксація клітин дозволяє детектувати цитоплазматичний антиген, а с також поверхневий антиген, тоді як експресія специфічного поверхневого антигену може бути детектована з використанням нефіксованих клітин. Потім химеру пиСтІ А-4/Рс (К 0 БЗувіетв, Міпп. ММ, саї. Ж 325-СТ) -| розводили до відповідного розведення Іхреагентом "блотто" (596 знежиреного сухого молока в Трис-хлориді шу 20 натрію (Т5: 6,61г Трис-НСІ, 0,97г Трис-основи, 9У,Ог Масі і 2,0г азиду натрію на Тл Н2О)) та інкубували на клітинному моношарі протягом 2 годин при кімнатній температурі. Незв'язану химеру видаляли шляхом

ІЧ е) триразового промивання клітин буфером Т5 при кімнатній температурі. Антитіло для детекції, моноклональне антитіло проти пишЇдсіІ їс, кон'юговане з лужною фосфатазою (7утей. саї. 05-3322), розводили до відповідної концентрації тІхреагентом "блотто" та інкубували з клітинами протягом 2 годин при кімнатній температурі.

Незв'язане антитіло для детекції видаляли шляхом триразового промивання клітин буфером Т5 (6,61г Трис-НСЇ, 0,97г Трис-основи, 9,0г Масі на Тл Н.О) при кімнатній температурі. Потім клітини інкубували 15-30 хвилин при о кімнатній температурі зі свіжоприготовленим розчином субстрату (100мМ Трис-НСІ, рН 9,5, 100мМ масі, 5ммМ іме) Масі», 0,Змг/мл нітротетразолієвого синього і 0,15мг/мл 5-бром-4-хлор-3-індоїлфосфатази). Бляшки, які експресують СО8О або СО86, забарвлювалися в чорний колір. Для припинення розвитку колірної реакції 60 використовували розчин-фіксатор (20мМ Трис-НСЇ, рН 2,9 і 1МмМ ЕОТА).

Скринінг на біоактивність котячого гамма-інтерферону, експресованого рекомбінантними ЗРМ, КРМ або ЕНМ, з використанням аналізу на зниження числа бляшок, що утворюються під дією УЗМ

СКЕКЗ або підходящу котячу клітинну лінію в 9б6-лункових планшетах обробляли супернатантом від клітин, інфікованих рекомбінантними вірусами, які експресують котячий ІЕМ-гамма та інкубували протягом 6-12 годин 65 при 372С. Потім у відповідні лунки додавали вірус ММ (100-1000 часток/лунку) та інкубували протягом 24 годин або доти, поки контрольні лунки, що містять тільки одні клітини, не були повністю лізовані. Ці лунки три рази промивали 1ХхРВ5, і моношари фіксували 100956 метанолом та сушили на повітрі. У кожну лунку додавали 0,0595 розчин кристалічного фіолетового протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, а потім сушили . на повітрі. Ці лунки оцінювали на наявність пурпурного забарвлення. Моношар здорових інтактних

Клітин буде поглинати кристалічний фіолетовий барвник. Супернатанти з активністю ІРМ-гамма будуть забезпечувати захист СКЕК від У5М-індукованого клітинного лізису й забарвлюватися у пурпурний колір.

Процедура очищення вірусних глікопротеїнів для використання з метою діагностики

Вірусні глікопротеїни очищали з використанням афінних колонок з антитілами. Для продукування моноклональних антитіл, 8-10 тижневих самок мишей ВАЇ В/с внутрішньоочеревинно вакцинували сім разів з 70 інтервалами в 2-4 тижні 107б.у.ою. рекомбінантів вірусу віспи єнотів. Через три тижні після останнього вакцинування мишам внутрішньоочеревинно вводили 40мг відповідного вірусного глікопротеїну. Через три дні після введення останньої дози антигену селезінки мишей видаляли.

Спленоцити зливали з клітинами мишачої плазмацитоми М5І/Аді удосконаленим методом ОЇ і Неггепрега.

Спленоцити і клітини плазмацитоми осаджували разом шляхом центрифугування при ЗООхг протягом 10 хвилин. 75 мл 50956 розчину поліетиленгліколю (мол. маса 1300-1600) додавали до клітинного осаду при перемішуванні протягом однієї хвилини. До цих клітин протягом трьох хвилин додавали модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла (бмл). Клітини осаджували шляхом центрифугування при 300 Хг протягом 10 хвилин і ресуспендували у середовищі, яке містить 1095 фетальну бичачу сироватку, а також містить 100ММ гіпоксантин,

О,4мММ аміноптерин і 16мМ тимідин (НАТ). Клітини (10Омл) додавали в лунки 8-10 96-лункових планшетів для

Культивування тканин, які містять 100мл-шар нормальних клітин-фідерів селезінки та інкубували при 37 ес. Ці клітини підживлювали свіжим середовищем НАТ через кожні три або чотири дні.

Супернатанти гібридомних культур тестували за допомогою аналізу ЕГІЗА у 96-лункових мікротитраційних планшетах, покритих 100 нг вірусного глікопротеїну. Потім супернатанти від реактивних гібридом аналізували за допомогою аналізу на утворення чорних бляшок і за допомогою Вестерн-блоттингу. Відібрані гібридоми два рази Ге клонували шляхом лімітуючого розведення. Асцитичну рідину продукували шляхом внутрішньоочеревинної о ін'єкції мишам ВАЇ В/с 5х105 гібридомних клітин, оброблених пристаном.

Клітинні лізати від рекомбінантів вірусів віспи єнотів одержували, як описано вище в розділі "Одержання інфікованих клітинних лізатів". Глікопротеїн-вмісні клітинні лізати (10Омл) пропускали через 2мл-агарозну афіннусмолу, на якій було іммобілізовано 20мг моноклонального антитіла проти глікопротеїну відповідно до (ее) інструкцій виробників (АЕС Меаіцт, Мем/ Вгипвуліск Зсіепійіс, Едізоп, М.9У.). Колонку промивали 100Омл 0,195 «-

Мопідеї Р-40 у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (РВ5) для видалення неспецифічно зв'язаного матеріалу. Зв'язаний глікопротеїн елюювали 100мММ карбонатним буфером, рН 10,6 (40). Моніторинг на чистоту ї- пре- і пост-елюйованих фракцій проводили шляхом аналізу на реактивність з моноклональними антитілами с проти КРМ у системі ЕГІЗА.

Аналіз Е ІЗА -

Для визначення імунного статусу тварини після вакцинації і контрольного зараження використовували протокол стандартного твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА). Розчин глікопротеїнового антигену (100мл при нг/мл у РВ5) залишали на 18 годин при 42С для абсорбції на лунках мікротитраційних планшетів. «

Покриті лунки один раз промивали РВ5. Ці лунки блокували шляхом додавання 250мл РВ5, що містить 195 ВЗА (Зідта) та інкубували протягом 1 години при 372С. Блоковані лунки один раз промивали РВ5, що містить 0,0290 о, с Твін-20. До цих лунок додавали 50мл тестованої сироватки (попередньо розведеної 1:22 у РВ5, що містить 190 "» ВЗА) та інкубували протягом 1 години при 372С. Антисироватку видаляли і лунки три рази промивали РВ5, що " містить 0,0295 Твін-20. 5БОмл розчину, що містить антитіла проти бичачих до, кон'юговані з пероксидазою хрону (розведеною 1:500 у РВ5, що містить 1956 ВЗА, КігКедаага апа Регїту Іарогафюгіев, Іпс.), додавали для візуалізації лунок, які містять антитіло проти специфічного антигену. Розчин інкубували протягом 1 години при це. 3720. а потім видаляли, і лунки три рази промивали РВ5, що містить 0,0295 Твін-20. У кожну лунку додавали оз 100мл розчину субстрату (АТВ5, Кігкедаага апа Регїту Іарогайогіез, Іпс.) і залишали на 15 хвилин для проявлення забарвлення. Реакцію припиняли шляхом додавання 0,1М щавлевої кислоти. Забарвлення 7 реєстрували при оптичній густині 41Онм на автоматичному планшет-рідері. -к 70 Стратегія конструювання синтетичних поксвірусних промоторів

Для векторів на основі рекомбінантних вірусів віспи. свиней синтетичні гооксвірусні промотори мають деякі со переваги, включаючи їхню здатність регулювати рівень і стадію експресії чужорідного гена. Були сконструйовані три промоторні кластери І РІ, ЕРІ і ГР2 на основі промоторів, які були охарактеризовані у вірусі коров'ячої віспи. Кожний кластер був сконструйований так, щоб він містив ДНК-послідовності, визначені для вірусу коров'ячої віспи і фланковані рестрикційними сайтами, які можуть бути використані для об'єднання цих

ГФ) кластерів у будь-якому порядку або комбінації. У кожний кластер були також введені ініціюючі метіоніни так, щоб лігування зі збереженням рамки зчитування можна було проводити або в ЕсокКіІ-сайті, або в ВатнНі-сайті. по Нижче від сайта лігування зі збереженням рамки зчитування була також сконструйована серія трансляційних стоп-кодонів у всіх трьох рамках зчитування і сигнал ранньої термінації транскрипції. ДНК, що кодує кожний 60 кластер, синтезували стандартними методами і клонували у відповідні гомологічні вектори.

Виділення вихідного фрагмента СЮОВ8О

МРНК екстрагували з мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК), стимульованих протягом 16 годин

Соп А с використанням реагенту для екстракції РНК КМА?г20!ІВ (Віоїехс, Ноивіоп, ТХ). Спочатку з цієї РНК одержували кДНК за допомогою реакції зі зворотною транскриптазою (КТ) з використанням оїїдо ат у якості бо 3-праймера. Коротко, РНК і оїїдо ат нагрівали до 752 протягом З хвилин для видалення вторинної структури.

Потім додавали КТ, аМТР, буфер і дистильовану воду, і суміш інкубували протягом 1 години при 4220. Після цього інкубування зразок нагрівали до 952 протягом 5 хвилин для інактивації КТ. Потім вироджені праймери, отримані від консенсусних ділянок опублікованих послідовностей СО8О людини і миші (СепВапк, СайНегерига,

МА), використовували для початкової ампліфікації 344-нуклеотидного (нкл.) фрагмента, який кодує центральну ділянку константного домену цього гена: 5-праймер В7-2: СОС ССО АСТ А(СТ)А АСА АСС ОбБА С (5ЕО ІЮО МО: 56); 3-праймер В7-3: САС (АТ)ТТ САС САТ С(СТ)Т ОО ААДА (СТ)ТО (5ЕО ІО МО: 57).

Ампліфікацію цього продукту здійснювали за протоколом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з "гарячим 70 стартом" з використанням полімерази Тад. Для запобігання утворення димерів праймерів, реакційну суміш, що не містить ферменту Тад, спочатку нагрівали до 959 протягом 5 хвилин у стадії "гарячого старту". Перед ініціацією проведення температурного циклу додавали фермент. Потім ПЛР-суміш нагрівали до 95923 протягом

ЗОсекунд для розплавлення дволанцюгової ДНК. Після цього реакційну суміш охолоджували до 42 «С протягом

ЗОсекунд для полегшення відпалу вироджених праймерів, Для полегшення зв'язування праймерів, які не є 75 гомологічними на 10095, використовували низьку температуру відпалу. Потім, для подовження праймера і створення копії протилежного ланцюга ДНК, реакційну суміш нагрівали протягом 45секунд до 722С, оптимальної температури для полімерази Тад. Температурний цикл повторювали 30 разів. Після проведення 30 циклів проводили кінцеву стадію подовження при 722С протягом 7 хвилин для полегшення подовження будь-яких неповних продуктів. Після візуалпації на 195 агарозному гелі цей продукт, для йогосеквенування, лігували у 20 вектор для клонування ТА (Іпміїгодеп, Зап Оіедо, СА) протягом ночі при 16 С. 2мл цієї реакційної суміші для лігування використовували для трансформації ІплмаБ-компетентних клітин. Трансформовані бактерії наносили штрихами на І В-планшети (5Омг/мл ампіцилін), покриті 4О0мл 5Омг/мл розчину х-даЇ. Наступного дня білі колонії збирали й інокулювали в 5мл І В-середовища, яке містить 100мг/мл ампіциліну і культивували протягом ночі при 372 зі струшуванням при 225об/хв. с 29 Для визначення клонів, які містять плазміду з правильною вставкою, були отримані мініпрепарати на нічних Ге) культурах. Плазміду екстрагували з цих культур з використанням стандартної процедури лужного лізису, після чого ДНК очищали шляхом екстракції сумішшю фенолу:хлороформу (Мапіаїз еї а!., 1982). Цю ДНК осаджували в 2 об'ємах етанолу, а потім гідролізували ЕсоКіІ. Гідролізати візуалізували на 195 агарозному гелі для визначення колоній П плазмідою, яка містить правильну вставку. Потім плазміду очищали з позитивних клонів со 30 ісеквенували або шляхом дидезокси-секвенування з використанням 5 З5.радіоактивно міченого ж- дидезокси-термінатора ланцюга на основісеквенази (Ш5В, Сіемеіапа, ОН), або шляхом циклічногосеквенування . - методом обриву ланцюга з використанням флуоресцентного барвника (Регкіп-ЕІтег, Могпмаїк, СТ). З послідовності КДНК конструювали специфічні 3'- і 5'-праймери для використання в реакції швидкої ампліфікації (зе) 35 5-кінців КДНК (КАСЕ) і для дериватизації 3'-послідовності в комбінації з виродженими праймерами з м

З'і-сетранслюючої ділянки (ТК).

Виділення 5'-ділянки СО8О

Для дериватизації 5-послідовності гена використовували протокол Магайоп для ампліфікації кКДднкК (Сіопе(есі, Раю А, СА). мРНК продукували з МКПК, стимульованих Соп А протягом 12 годин і одночасно « 20 стимульованих ЛІС протягом 4 годин. Цю мРНК екстрагували з використанням реагенту для екстракції РНК з

ШЦЇ ТКА5БРЕС (Віоїехс, Ноизіоп, ТХ). Для полегшення зв'язування праймера із самою крайньою частиною 5'-кінця с полі-А-хвоста продукували кДНК із використанням якірного праймера оїїдо ат з виродженими нуклеотидами біля :з» 5-кінця. Потім кКДНК транскрибували, як описано вище. Специфічні лінкери лігували з кКДНК за допомогою

ДНЕК-лігази Т4. Потім на цій кКДНК здійснювали короткочасну ПЛР із використанням внутрішнього З3'-праймера, специфічного у відношенні ділянки, ампліфікованої раніше: -1 В7-284: ТТА ТАС ТАС ОА САС ОА до (5ЕО ІЮО МО: 58)

В7-190: АСО СТТ ТО ААА АСС ТСС АС (5ЕО І МО: 59) (95) і якірного праймера, комплементарного лігованій лінкерній послідовності. Короткочасну ПЛР із -1 використанням полімеразної суміші КіепТад (Сіопіесі, Раїо А, СА) проводили при таких умовах: 1 цикл при 9522 протягом 5хв; 5 циклів при 95923 протягом Зб0сек., при 729 протягом ЗОсек. і при 682С протягом 45сек.; 5 - циклів при 9597 протягом ЗОсек., при 6593 протягом ЗОсек. і при 682С протягом 45сек.; і 25 циклів при 9590 со протягом ЗОсек., при 602С протягом ЗОсек. і при 682С протягом 45сек. мл цієї реакційної суміші розводили в

Б5Омл води і 5мл цього розведення потім використовували в "гніздовій" ПЛР -реакції (1 цикл при 95 «С протягом хв; ЗО циклів при 9593 протягом Збсек., при 6523 протягом Збсек. і при 682С протягом 45сек.; з використанням полімеразної суміші КіепТад) і з використанням специфічного якірного праймера і ген-специфічного З3'-праймера, локалізованого з боку 5-кінця вихідного праймера (Фіг.б). о В7-20: ТТО ТТА ТСО СТО АСО ТСА СТО (5ЕО ІЮ МО: 60) іме) В7-135: САА ТАА САТ САС СОА АСТ САС о (5ЕО ІЮ МО: 61) 20О0мл кожної реакційної суміші візуалізували на 1,595 агарозному гелі і потрібний фрагмент вирізували з 60 гелю. кКДНК екстрагували й очищали з агарозного гелю шляхом центрифугування гелевих зрізів за допомогою гелевого розпилювача і 0,22мММ-фільтра для мікроочищення (Атісоп. Вемепу, МА). Потім очищену

ДНКсеквенували прямим методом термінації ланцюга з використанням барвника (Регкіп-ЕІтег, МогмаїкК, СМ).

Виділення 3'-ділянки СО8О 3'-ділянку гена дериватизували шляхом відбору 5 ген-специфічних праймерів з 344-нуклеотидного фрагмента 65 | попередньосеквенованої 5'-ділянки:

В7-5220: ТС АТО ТСТ ОС ААДА ОТА САА о (5ЕО І МО: 62)

В7-50: САС ТОА СОТ САС СОА ТАА ССА С (ЗЕ ІЮ МО: 63)

В7-140: СТО АСТ ТСО СТО АТО ТТА ТТО о (5ЕО ІЮ МО: 64)

В7-550: ОСС АТС ААС АСА АСА СТТ ТСС (5ЕО І МО: 65)

В7-620: ТАТ САС ААА САА ССА ТАС СТТ С (5ЕО ІЮ МО: 66)

Вироджені 3'і-праймери вибирали з консенсусних ділянок 3'-0ТК людського і мишачою СОВ80О.

В7-1281: С(А/С)А АСА (А/Л)ТО ССТ САТ СА(О/Т) СС (5ЕО ІЮ МО: 67)

В7-1260: СА(С/) (А/С)АТ ССА АСА ТАС ОО (ЗЕО ІЮ МО: 68)

КДНК продукували з РНК, екстрагованої з використанням ОЇ ТКАБРЕС (Віоїехс, Ноивіоп, ТХ) із МКПК, 7/0 бтимульованих Соп А и ЛПС, як описано раніше.

Заякорений оліго-4Т використовували в якості вихідного 3'-праймера для транскрипції РНК з утворенням

КДНК. З цієї кДНК здійснювали ПЛР -реакції на основі полімерази Тад з використанням специфічних 5'-праймерів і вироджених 3'-праймерів (1 цикл при 9592С протягом 5 хвилин; ЗО циклів, при 9523 протягом ЗОсекунд, при 4226 протягом ЗОсекунд і при 722С протягом 45секунд; Й нарешті, при 722 протягом 7 хвилин).

Перед продукуванням одного фрагмента потрібного розміру необхідне проведення двох раундів "гніздових" реакцій. Цей продукт вирізували з 1,595 агарозного гелю, очищали, як описано раніше, і піддавали циклічномусеквенуванню з використанням барвника як термінатора ланцюга (Регкіп-ЕІтег, Мопгмаїк, СМ).

На основі даних про послідовність 5- і 3'ділянок були сконструйовані праймери, за допомогою, яких необхідно ампліфікувати ділянку, яка кодує всю відкриту рамку зчитування гена котячого СО8О:

В7-ЗТАКТ: АТО ОСТ САС ОСА ОСА ААС ТО (ЗЕО І МО: 69)

В7-960: ССТ АСТ АСА САА САС СТА ААО дО С (ЗЕО ІЮ МО: 70)

Була використана кДНК МКПК, яка була продукована раніше, і про яку відомо, що вона містить ДНК, що кодує зазначений ген. З метою мінімізації випадкових помилок, часто асоційованих з полімеразою Тад, у цій

ПЛР-реакції (1 цикл, при 9593 протягом 5 хвилин; ЗО циклів, при 959 протягом Збсекунд, при 422 протягом Га

ЗОсекунд і 7222 протягом 45секунд; і при 7292С протягом 7 хвилин) використовували ДНК-полімеразу КіІептТад, о ферментну суміш, яка зберігає певну 5'-екзонуклеазну активність. У цій реакції ампліфікували фрагмент із 960 пар основ (п.о.), який клонували у вектор для клонування ТА (ІпМігодеп, Зап Оіведо, СА) ісеквенували як описано раніше. Кінцева послідовність цього гена включала кДНК від двох окремо взятих тварин. Для зниження імовірності похибок, що виникають у результаті ПЛР-індукованих помилок, кожну пару основ цього гена 00 незалежно перевіряли принаймні у трьох окремих послідовностях, отриманих від окремих ПЛР-реакцій. -

Виділення початкового фрагмента СО28

МРНК екстрагували з лімфоцитів периферичної крові НК5, стимульованих протягом 16 годин Соп А с - використанням реагенту для екстракції РНК КМА?гоІВ (Віоїехс, Ноизвіоп, ТХ). Спочатку з цієї РНК одержували с

КДНК за допомогою реакції за участю зворотної транскриптази (КТ) з використанням оіїдо ат у якості

З-праймера. Для цього РНК і оїїдо ат нагрівали до 752С протягом З хвилин для видалення вторинної структури. -

Потім додавали КТ, аМТР, буфер і дистильовану воду і суміш інкубували протягом 1 години при 42296.

Після цього інкубування зразок нагрівали до 95 «С протягом 5 хвилин для інактивації КТ. Вироджені праймери, отримані від консенсусних ділянок, виявлених в опублікованих послідовностях нуклеїнових кислот « людського, мишачого і кролячого СО28 (СепВапк, Ве(Шезаа, МО), потім використовували для початкової ампліфікації 673-нуклеотидного фрагмента, що кодує більшу частину відкритої рамки зчитування: З с СО28-113: САА ССТ ТАС СТО САА СТА САС (ЗЕО ІЮ МО: 71) "» сСор28-768: ОС ТТ тоб АТА боб АТА о (5ЕО ІО МО: 72). " Для ампліфікації цього продукту використовували протокол полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з "гарячим стартом" (1 цикл, при 959 протягом 5 хвилин; ЗО циклів, при 959 протягом ЗОсекунд, при 482 протягом

ЗОсекунд і 722 протягом 45секунд; і 1 цикл при 722С протягом 7 хвилин). Цей фрагмент візуалізували на 195 - агарозному гелі, лігували у вектор для клонування ТА (ІпМігодеп, Зап Оіедо, СА) ісеквенували, як описано (4) раніше. Виходячи з цієї послідовності КДНК, були виведені і синтезовані специфічні 3З-праймери для використання в 5-КАСЕ-реакціях. ї СсО28-190: СО АСО ТАС ААТ ТОС АСТ ОТО С (5ЕО ІЮ МО. 73) - 70 СсО28-239: АТТ ТО САС дАС ТАА АТА ТСС (ЗЕО ІО МО: 74).

Виділення 5'-ділянки СО28 со Для одержання іншої 5'-послідовності молекули котячого СО28 був використаний модифікований протокол 5-КАСЕ СІВСО (бСірсо ВКІ, Саїйпетгзриго, МО). РНК екстрагували з 16-годинної культури Соп А-стимульованих

МКПК. Для синтезу першого ланцюга кДНК використовували ген-специфічний 3'-праймер. РНК і цей праймер 99 нагрівали до 752С протягом 5 хвилин, а потім додавали інші реагенти КТ. Після денатурації суміш охолоджували

ГФ) до 42С і додавали реакційний буфер, хлорид магнію, ЗМТР, ОТ і КТ Зирегзсгірі (Сірсо ВК, Сайпегзриго, МО).

Ге КТ-суміш інкубували при 422С протягом 30 хвилин, а потім нагрівали до 7029 протягом 15 хвилин для денатурації КТ. Потім додавали суміш РНКаз і реакційну суміш інкубували при 5593 протягом 10 хвилин для бр видалення залишкової РНК і запобігання неправильного кінцевого трансферазного (Тат) подовження. Потім

КДНК очищали на колонці СіаззаМах, що обертається, (Сірсо ВІКІ, Сайпегериго, МО) для видалення невключеного ОМТР і праймера. Очищену кКДНК. елюйовану з колонки, подовжували за допомогою тат. тат використовували для додавання 20-30-нуклеотидного хвоста С до кКДНК. Після денатурації кКДНК при 95 С протягом З хвилин до суміші очищеної КДНК, хлориду магнію, реакційного буфера і СТР додавали фермент. 65 Реакційну суміш інкубували при 372С протягом 10 хвилин, після чого фермент піддавали термоінактивації при 709С ще 10 хвилин. Подовжену кКДНК ампліфікували за допомогою ПЛР із "гарячим стартом" на основі полімерази Таяд (952С протягом 5 хвилин; 35 циклів, при 95923 протягом ЗОсекунд, при 5593 протягом ЗОсекунд і 729б протягом 4Бсекунд; і при 7229С протягом 7 хвилин). Як праймери для цієї реакції використовували

З'-праймер, локалізований з боку 5'-кінця праймера для синтезу кДНК, і якірний праймер, який є специфічним для лінкера аС і складається, головним чином, з доб з кількома залишками ді. їТмл цієї реакційної суміші розводили в 5Омл води, і 5мл цього розведення використовували в гніздовій ПЛР (1 цикл при 9592 протягом бхв.; ЗО циклів, при 959 протягом ЗОсек., при 559; протягом ЗОсек. і при 729 протягом 45сек. із сумішшю полімераз КіепТад) з використанням якірного 5'-праймера з ас/а| і додаткового 3'і--праймера, специфічного до вищерозташованого гена. Потім ЗОмл суміші для гніздової реакції візуалізували на 1,595 агарозному гелі і з 70 Цього гелю екстрагували потрібний фрагмент (Фіг.19). КДНК очищали, як описано раніше, за допомогою гелевого розпилювача Атісоп і фільтра для мікроочищення (Атісоп, Вемегпу, МА). Потім зразок очищеної

КДНКсеквенували шляхом циклічногосеквенування методом термінації ланцюга з використанням барвника (Регкіп-ЕІтег, МогмаїкК, СМ). З усіх цих фрагментів була отримана консенсусна послідовність. Виходячи з цієї послідовності, була синтезована пара праймерів, що охоплює усю відкриту рамку зчитування гена котячого 75 Сра28: їе 2028 5 СОС ОА ТСС АСС ОСТ АОС АСА АТО АТС СТО дО (5ЕО І МО: 75) їе 2028 3: СОС ОА ТСС ТСТ ОА ТАС обо ТОСС АТО ТСА о (5ЕО ІЮО МО: 76)

З використанням цих праймерів кДНК-молекулу, що включає всю. кодуючу ділянку, ампліфікували з кКДНК, яка походить з Соп А-стимульованих МКПК ЕКб і ЕОЗ. Ця кДІЇК МКПК була продукована раніше і було показано, що вона містить РНК, що кодує ген. У цій ПЛР (1 цикл при 952С протягом 5хв.; ЗО циклів, при 9593 протягом Зобсек., при 422С протягом ЗОсек. і при 729 протягом 45сек.; і 1 цикл при 722С протягом 7 хв.), яка проводиться з використанням ДНК-полімерази КіепТад для мінімізації числа випадкових помилок, часто асоційованих з полімеразою Тад, продукували 754 п.о.--фрагмент, який клонували у клонуючий вектор ТА ісеквенували, як описано раніше. Як і у випадку молекули СО80О, кожний нуклеотидний сайт підтверджували з використанням с принаймні трьох незалежно отриманих послідовностей. о

Гомологічний вектор 902-49.46. Плазміду 902-49.46 конструювали з метою вбудовування чужорідної ДНК у

КРМ. Вона включала маркерний ген В-галактозидази (Іас7) Е.соїї, фланкований ДНК КРМ. Вище від цього чужорідного гена знаходився фрагмент ДНК КРУ, що складається приблизно з 906 пар основ. Нижче від цього чужорідного гена знаходився фрагмент ДНК КРУ, що складається приблизно з 895 пар основ. З використанням со плазміди відповідно до процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування «- рекомбінантного КРУ", одержували вірус, який містить ДНК, що кодує ці чужорідні гени. Слід зазначити, що маркерний ген В-галактозидази (Іас7) знаходиться під контролем пізнього промотору (І РІ), а другу чужорідну в.

ДНК вбудовують у ЕсокКІ- або ВатнНі-сайт, де ця друга чужорідна ДНК знаходиться під контролем со пізнього/раннього промотору (І Р2ЕР2). Ця плазміда була сконструйована з використанням стандартної техніки

Зо рекомбінантних ДНК (Затьгоок еї аі.) шляхом приєднання рестрикційних фрагментів з нижчевказаних джерел до в. синтетичних ДНК-послідовностей. Цей плазмідний вектор був отриманий з рестрикційного НіпапПІ-фрагмента плазміди рзРб4, що має приблизно 2999 пар основ (Рготеда). Фрагмент 1 являє собою рестрикційний

Ніпапп-Храї-субфрагмент рестрикційного НіпапПІ-фрагмента 0 КРМ, що має приблизно 906 пар основ (Кпіоні еї « а!). Фрагмент 2 являє собою рестрикційний ВатнНі-РмишІ-фрагмент плазміди рОБ751 (Регїтагі еї аЇ.), що має приблизно 3010 пар основ. Фрагмент З являє собою рестрикційний ХраїІ-НіпаП-субфрагмент НіпапП-фрагмента 0 о) с КРМ, що має приблизно 895 пар основ. Храї-сайти фрагментів 1 і З перетворювали на унікальні Моїйі-сайти з "» використанням МоїІ-лінкерів. " Гомологічний вектор 904-63,87. Гомологічний вектор 904-63.87 використовували для вбудовування чужорідної ДНК у 5РУ. Він включає маркерний ген В-галактозидази (Іас7) Е.соїі і гени дад/протеази та оболонки вірусу імунодефіциту котів (ЕМ), фланковані ДНК 5РУ. З використанням цього гомологічного вектора відповідно - до процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного ЗРУ", со одержували вірус, який містить ДНК, що кодує ці чужорідні гени. Слід зазначити, що маркерний ген

В-галактозидази (Іас/7) знаходиться під контролем синтетичного пізнього промотору поксвірусу (І РІ), а гени БМ - дад/протеази та оболонки знаходяться під контролем окремих, але ідентичних синтетичних пізніх/ранніх -щ 20 промоторів поксвірусу (ГР2ЕР2). Кластери промотору/гена ЕМ дад/протеази та оболонки РІМ орієнтовані у протилежних напрямках так, що транскрипція генів дад/протеази та оболонки проходить у напрямку один до со одного для того, щоб виключити можливість гомологічної рекомбінації між ідентичними промоторами.

Гомологічний вектор був сконструйований з використанням стандартної техніки рекомбінантних ДНК (Затргоок еї ані.) шляхом приєднання рестрикційних фрагментів з нижченаведених джерел до відповідних синтетичних 29 ДНК-послідовностей. Цей плазмідний вектор був отриманий з рестрикційного Ніпапі-ВатНіІ-фрагмента плазміди

ГФ! рЗРб4., що має приблизно 2972 пари основ (Рготеда). Фрагмент 1 являє собою рестрикційний

ВаПП-АссІ-субфрагмент рестрикційного НіпаП-фрагмента М (23) 5РМ, що має приблизно 1484 пари основ. о Фрагмент 2 являє собою ЕсокІ-ВаПІ-фрагмент гена оболонки РІМ, що має приблизно 2580 пар основ і синтезований за допомогою зворотної транскрипції (КТ) і полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (15, 42) з 60 використанням кдДнКк від штаму РРК ЕМ. Зворотний праймер (5-ВСССОБАТССТАТООСАСААСООСТТТОСАСС-3 10/93.21) (5БО ІЮ МО: 77) синтезується з 5-кінця гена оболонки РІМ і вводить ВаяіЇНІ-сайт біля 5-кінця цього гена. Прямий праймер (5-ССОСТОСАТССООСАСТОСАТСАТТССТОСТО-3 10/93.20) (ЗЕБО ІО МО: 78) синтезується з 3-кінця гена оболонки РІМ і вводить ВатнНі-сайт біля 3'-кінця цього гена і використовується для зворотної транскрипції і бо полімеразної ланцюгової реакції. ПЛР-продукт рестриктували ферментом Ватні з одержанням фрагмента довжиною 2580 пар основ, який відповідає гену оболонки ГРІМ. Фрагмент З являє собою рестрикційний

ЕсокІ-Вопі-фрагмент гена дад/протеази РІМ, що має приблизно 1839 пар основ і синтезований за допомогою зворотної транскрипції (КТ) і полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (15, 42) з використанням КДНК від штаму

РРК РМ. Зворотний праймер (5-ССОТОААТТСОООбААТОСАСАСОСОСОАСАТ-3 11/94,9) (5ЕБО ІЮ МО: 79) синтезується з 5-кінця гена дад/протеази РІМ і вводить ЕсоКіІ-сайт біля 5-кінця цього гена. Прямий праймер (5-САВССАСАТСТОСТСТТТТТАСТТТССС-3 11/94.10) (5БО 0 МО: 80) синтезується з 3-кінця гена дад/протеази РІМ, вводить ВаНі-сайт біля 3'-кінця цього гена і використовується для зворотної транскрипції і полімеразної ланцюгової реакції. ПЛР;-продукт рестриктували ферментами Есокі і ВаоїІЇ з одержанням фрагмента довжиною приблизно 1839 пар основ, що відповідає гену дад/протеази РІМ. Фрагмент 4 являє собою 70 рестрикційний ВагпНІ-РушІ-фрагмент плазміди руБ751, що має приблизно ЗОЮ пар основ (Регїтагі еї аї.).

Фрагмент 5 являє собою рестрикційний Ассі-НіпанПІ-субфрагмент рестрикційного Ніпа!Н-фрагмента М ЗРМ, що має приблизно 2149 пар основ. АССІ-сайт гомологічного вектора 5РМ перетворювали на унікальний Мої-сайт із використанням синтетичних лінкерів.

Гомологічний вектор 917-60.89. Плазміду 917-60.89 конструювали з метою вбудовування чужорідної ДНК у 7/5 ЗРМ. Вона включала маркерний ген В-галактозидази (Іас7) Е.соїї і ген котячого ІЄМ-у (Опіопв еї аї., 1996;

Агауїе еї а!., 1995), фланкований ДНК 5РУ. Вище від цих чужорідних генів знаходився фрагмент ДНК 5РУ, що складається приблизно з 1484 пар основ. Нижче від цих чужорідних генів знаходився фрагмент ДНК 5РУ, що складається приблизно - з 2149 пар основ. З використанням плазміди відповідно до процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного 5РУ", одержували вірус, який

Містить ДНК, що кодує ці чужорідні гени.

Слід зазначити, що маркерний ген В-галактозидази (Іас/7) знаходиться під контролем промотору ОЇ! вірусу віспи свиней, а ген котячого СО28 знаходиться під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору поксвірусу (І Р2ЕР2). Ця плазміда може бути сконструйована з використанням стандартної техніки рекомбінантних ДНК (Затргоок еї аІ.) шляхом приєднання рестрикційних фрагментів з нижчевказаних джерел. с

Цей плазмідний вектор був отриманий з рестрикційного НіпаїйП-ВатНіІ фрагмента плазміди реРб4, що має приблизно 2972 пари основ (Рготеда). Фрагмент 1 являє собою рестрикційний ВаППІ-Ассі-субфрагмент о рестрикційного НіпапП-фрагмента М 5РМ, що має приблизно 1484 пари основ. Фрагмент 2 являє собою рестрикційний ЕсокІ-ВатНіІ-фрагмент, синтезований за допомогою зворотної транскрипції і полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням як матриці РНК від Соп А-стимульованих клітин селезінки котів. Для с синтезу котячого ІЕМ-у праймер 5-ТОСАСААТТСООАТОСААТТАСАСААСТТТТАТТТТСО-3"; 1/97.4) (ЗЕО ІЮ МО: 81) синтезувався від 5-кінця гена котячого ІЕМ- у і вводив ЕсоКі-сайт біля 5-кінця цього гена. Праймер -- (5--ЯИСАООАТССТТАТТТСОАТОСТСТАСОСССТО-3"; 1/97.3) (ЗЕО ІЮ МО: 82) був використаний для зворотної /-Їч« транскрипції і ПЛР, синтезувався від 3-кінця гена котячого ІЕМ- у, і вводив ВатНі-сайт біля З3'-кінця цього гена. со

ПЛР-продукт рестриктували ферментами ЕсокіІ та Ватні з одержанням фрагмента довжиною приблизно 504 пари основ, що відповідає гену котячого ІЕМ-у. Фрагмент З являє собою рестрикційний ВатнНі-РушІ-фрагмент - плазміди ругМ751, що має приблизно 3010 пар основ (Реїтагі еї а). Фрагмент 4 являє собою

Ассі-Ніпан-субфрагмент НіпапПІ-фрагмента М 5РУ, що має приблизно 2149 пар основ. АссіІ-сайти фрагментів 1 і 4 перетворювали на унікальні МоїІ-сайти з використанням МоїІ-лінкерів. «

Гомологічний вектор 926-76.07. Гомологічний вектор 926-76.07 конструювали для делетування частини кодуючої ділянки ЗЕ від вірусу герпесу котів і для вбудовування чужорідної ДНК. Він включає ген котячого т с СО80, фланкований ДНК ЕНМ. Ген котячого СЮО8ВО знаходиться під контролем промотору ЗЕ ЕНМ. Він був ч сконструйований із зазначених ДНК-джерел із використанням стандартної техніки рекомбінантних ДНК » (Затьгоок еї а! ). Плазмідний вектор одержували з рестрикційного ендонуклеазного Азр7181-Авр7181-фрагмента плазміди реРІ 8/19, що має приблизно 2958 пар основ. Фрагмент 1 являє собою Азр7181-8таІ-субфрагмент

ЗаїІ-фрагмента В ЕНМ, що має приблизно 1415 пар основ. Фрагмент 2 являє собою ЕсоКІ-ВатнНіІ-фрагмент гена - котячого СЮО8О, що має приблизно 879 пар основ і синтезований відповідно до процедури, описаної в розділі о "Клонування за допомогою полімеразної ланцюгової реакції". Матриця для ПЛР-реакції являла собою РНК від

Соп А-стимульованих клітин селезінки котів. - Зворотний лраймер (Х-ТССАСААТТСОООСТСАСОСАССАДАСТ(ОО-3": 1/97.43) (ЗЕО ІЮ МО: 52) синтезувався - 70 від 5-кінця гена котячого со8о і вводив ЕсокіІ-сайт. Прямий праймер (5-ВОСТАОБАТССААТСТАТОТАСАСАСОСТОАСАТ-3; 1/97.6) (ЗЕБЕО ІО МО: 53) синтезувався від 3-кінця гена со котячого СО8О, вводив ВатнНі-сайт біля З'-кінця цього гена і був використаний для реакції зворотної транскрипції і полімеразної ланцюгової реакції. Фрагмент З являє собою ЗаїІ-Азр718І-субфрагмент

ЕсокІ-фрагмента Е ЕНМ, що має приблизно 2205 пар основ. 22 Гомологічний вектор 930-23.А1. Плазміду 930-23.А1 конструювали для вбудовування чужорідної ДНК у ЗРУ.

Ге! Вона включає маркерний ген В-галактозидази (Іас7) Е.сої| і ген котячого СО8О, фланкований ДНК 5РУ. Вище від цих чужорідних генів знаходиться фрагмент ДНК 5РМУ, що має приблизно 1484 пари основ. Нижче від цих де чужорідних генів знаходиться фрагмент ДНК ЗРМ, що має приблизно 2149 пар основ. З використанням цієї плазміди відповідно до процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування 60 рекомбінантного РУ", одержували вірус, який містить ДНК, що кодує ці чужорідні гени. Слід зазначити, що маркерний ген В-галактозидази (Іас7) знаходиться під контролем синтетичного пізнього промотору поксвірусу (ГРІ), а ген котячого СО8О знаходиться під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору поксвірусу (ГР2ЕРЗ). Цей вектор був сконструйований з використанням стандартної техніки рекомбінантних ДНК (Затргоок еї ані.) шляхом приєднання рестрикційних фрагментів із нижчевказаних джерел. Цей плазмідний вектор був 65 отриманий з рестрикційного НіпаПп-ВатНі-фрагмента плазміди реРб4, що має приблизно 2972 пари основ (Рготеда). Фрагмент 1 являє собою рестрикційний ВаППІ-Ассі-субфрагмент рестрикційного НіпапПІ-фрагмента М

ЗРМ, що має приблизно 1484 пари основ. Фрагмент 2 являє собою рестрикційний ЕсокІ-Ватйі-фрагмент, синтезований за допомогою зворотної транскрипції (КТ) і полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням як матриці РНК від Соп А-стимульованих клітин селезінки котів. Для синтезу котячого СО80О, праймер (5--СВАСААТТСОООСТСАСОСАССАДАСТОО-3" 1/97.43) (5ЕО ІЮ МО: 52) синтезувався з 5-кінця гена котячого

СОВ80 і вводив ЕсокКіІ-сайт біля 5-кінця цього гена. Праймер (Х-ССТАООАТССААТСТАТОТАСАСАСОТОАСАТ-З! 1/97.6) (ЗЕ ІО МО: 53) використовувався для зворотної транскрипції і ПЛР, синтезувався з 3-кінця гена котячого СО8О і вводив ВатнНі-сайт біля 3'-кінця цього гена. ПЛР-продукт рестриктували ферментами Есокі і

Вашні з одержанням фрагмента довжиною приблизно 879 пар основ, що відповідає гену котячого СЮО8О. 7/0 Фрагмент З являє собою рестрикційний ВатНі-РушІ-фрагмент плазміди рОг751, що має приблизно ЗОЮ пар основ (Регїтагі еї а.) Фрагмент 4 являє собою Ассі-НіпанпІ-субфрагмент НіпаПІ-фрагмента М ЗРМ, що має приблизно 2149 пар основ. Ассі-сайти фрагментів 1 і 4 перетворювали на унікальні МоїІ-сайти з використанням

МоїІ-лінкерів.

Гомологічний вектор 930-26.А1. Плазміду 930-26.А1 конструювали з метою вбудовування чужорідної ДНК у 7/5 ЗРМ. Вона включала маркерний ген В-галактозидази (Іас/7) Е.соїї і ген котячого СО28, фланкований ДНК 5РУ.

Вище від цих чужорідних генів знаходився фрагмент ДНК ЗРМУ, що складається приблизно з 1484 пар основ.

Нижче від цих чужорідних генів знаходився фрагмент ДІЖ ЗРУ, що складається приблизно з 2149 пар основ. З використанням плазміди відповідно до процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного 5РМУ", одержували вірус, який містить ДНК, що кодує ці чужорідні гени. Слід го зазначити, що маркерний ген В-галактозидази (Іас7) знаходиться під контролем синтетичного пізнього промотору поксвірусу (ГРІ), а ген котячого СЮО28 знаходиться під контролем синтетичного пізнього/ураннього промотору поксвірусу (ГР2ЕР2). Цей вектор може бути сконструйований з використанням стандартної техніки рекомбінантних ДНК (Затргоок еї аІ.) шляхом приєднання рестрикційних фрагментів з нижчевказаних джерел.

Цей плазмідний вектор був отриманий з рестрикційного НіпапПп-ВатнНі-фрагмента плазміди реРб4, що має с ов приблизно 2972 пари основ (Рготеда). Фрагмент 1 являє собою рестрикційний ВоПІ-Ассі-субфрагмент рестрикційного НіпапП-фрагмента М 5РМ, що має приблизно 1484 пари основ. Фрагмент 2 являє собою і) рестрикційний ЕсокІ-ВатНіІ-фрагмент, синтезований за допомогою зворотної транскрипції і полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням як матриці РНК від Соп А-стимульованих клітин селезінки котів. Для синтезу котячого СО28, від б-кінця гена котячого СО28 синтезувався праймер со зо З-ЗАТОААТТССАТОАТССТСАСОСТОООСТТСТ-3; 7/97.1) (ЗЕО ІО МО: 54), який вводив Есоку)-сайт біля 5-кінця цього гена. Для зворотної транскрипції і ПЛР використовувався праймер -- (5-САТСАСАТСТСАОСААСООСТАТОССОСАА-3; 7/97.2) (ЗБО ІО МО: 55), що синтезувався від 3-кінця гена М котячого СО28 і вводив Ватні-сайт біля 3'-кінця гена. ПЛР-продукт рестриктували ферментами Есокі і Ватні з одержанням фрагмента довжиною приблизно 666 пар основ, що відповідав гену котячого СЮО28. Фрагмент З ме)

Зв ЯВЛЯЄ собою рестрикційний ВатнНі-РмушІ-фрагмент плазміди рОЕ751, що має приблизно 3010 пар основ (Регїтагі еї ї- аІ). Фрагмент 4 являє собою Ассі-НіпанІ-субфрагмент НіпаПІ-фрагмента М ЗРУ, що має приблизно 2149 пар основ. АссіІ-сайти фрагментів 1 і 4 були перетворені на унікальні МоїІ-сайти з використанням МоїІ-лінкерів.

Гомологічний вектор 931-21.А1. Гомологічний вектор 931-21.А1 використовували з метою вбудовування чужорідної ДНК у ЗРМ. Він включає маркерний ген В-глюкуронідази (цідА) Е.соїї і ген котячого СОВ80, « фланкований ДНК 5РУ. За допомогою цього гомологічного вектора відповідно до процедури, описаної в розділі -н-ву с "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного ЗРМУ", одержували вірус, який містить . ДНК, що кодує ці чужорідні гени. Слід зазначити, що маркерний ген В-глюкуронідази (цідА) знаходиться під и?» контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу (ЕР), а ген котячого СЮО8О знаходиться під контролем окремого й унікального синтетичного пізнього/раннього промотору поксвірусу (І Р2ЕРЗ2). Гомологічний вектор був сконструйований з використанням стандартної техніки рекомбінантних ДНК (Затьгоок еї аІ.) шляхом приєднання -І рестрикційних фрагментів з нижчевказаних джерел до відповідних синтетичних ДНК-послідовностей. Цей плазмідний вектор був отриманий з рестрикційного ЮОгаІ-фрагмента плазміди РМЕВ193 (Мем Еподіапа Віоїарв»). що о маг приблизно 2700 пар основ. Фрагмент 1 являє собою рестрикційний ЮОгаІ-ЕсоКІ-субфрагмент -І Ніпапі-фрагмента К РМ, що має приблизно 881 пару основ. Фрагмент 2 являє собою рестрикційний 5р ЕсокІ-ВатнНі-фрагмент гена котячого СО 80, що має приблизно 879 пар основ і синтезований відповідно до - процедури, описаної в розділі "Клонування за допомогою полімеразної ланцюгової реакції". Матриця для с ПЛР-реакції являла собою РНК від Соп А-стимульованих клітин селезінки котів. Зворотний праймер (5--СВСАСААТТСОООСТСАСОСАССАААСТОо-3; 1/97.43) (5БО ІЮО МО: 52) синтезувався від 5-кінця гена котячого СО8О і вводив ЕсоКіІ-сайт. Прямий праймер (5-ССТАООАТССААТСТАТОТАСАСАСОСТОАСАТ-У; дво 197.6) (ЗЕО 1О МО: 53) синтезувався від З-кінця гена котячого СО 80, вводив Ватні-сайт біля 3'-кінця гена, ії був використаний для реакції зворотної транскрипції і полімеразної ланцюгової реакції. Фрагмент З являє

Ф) собою рестрикційний ЕсоКІ-ЗтаіІ-фрагмент плазміди рКА.д260о (СіІопебесі), що має приблизно 1823 пар основ. ка Фрагмент 4 являє собою рестрикційний ЕсокКІ-ОгаІ-субфрагмент рестрикційного НіпаїІІ-фрагмента К 5РУ, що має приблизно 994 пари основ. ЕсоКіІ-сайт у гомологічному векторі ЗРМ перетворювали в унікальний Мої-сайт із бор використанням синтетичних лінкерів.

Гомологічний вектор 931-22.А1. Плазміду 931-22.А1 конструювали з метою вбудовування чужорідної ДНК у

КРУ. Ця плазміда вводила ген котячого СО8О, фланкований ДНК КРУ. Вище від цих чужорідних генів знаходився фрагмент ДНК КРУ, що складається приблизно з 906 пар основ. Нижче від цих чужорідних генів знаходився фрагмент ДНК КРУ, що складається приблизно з 895 пар основ. Із використанням плазміди відповідно до 65 процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРУ", одержували вірус, який містить ДНК, що кодує ці чужорідні гени. Слід зазначити, що ген котячого СО8О знаходиться під контролем пізньогогбраннього промотору (ІР2ЕР2). Цей вектор був сконструйований з використанням стандартної техніки рекомбінантних ДНК (ЗатбгоокК еї а.) шляхом приєднання рестрикційних фрагментів з нижчевказаних джерел до синтетичних ДНК-послідовностей. Цей плазмідний вектор був отриманий

З рестрикційного НіпапІ-фрагмента плазміди реРба4 (Рготеда), що має приблизно 2999 пар основ. Фрагмент 1 являє собото рестрикційний НіпапПІ-ХраІ-субфрагмент рестрикційного Ніпап-фрагмента ОО КРМ (Кпідні еї аї!.), що має приблизно 906 пар основ. Фрагмент 2 являє собою ЕсоКІ-ВатНіІ-фрагмент гена котячого СЮО8О, що має приблизно 879 пар основ і синтезований відповідно до процедури, описаної в розділі "Клонування за допомогою полімеразної ланцюгової реакції". Матриця для ПЛР-реакції являла собою РНК від Соп А-стимульованих клітин /о белезінки котів. Зворотний праймер (5-ТССАСААТТСОООСТСАСОСАССААДАСТ(ОО-3; 1/97.43) (ЗЕО ІЮ МО: 52) синтезувався від 5-кінця гена котячого СО 80 і вводив ЕсоКі-сайт. Прямий праймер (5-ВОСТАОБАТССААТСТАТОТАСАСАООСТОАСАТ 3; 1/97.6) (5БО ІЮ МО: 53) синтезувався від 3-кінця гена котячого СО8О, вводив ВатнНі-сайт біля З'-кінця цього гена і був використаний для реакції зворотної транскрипції і полімеразної ланцюгової реакції Фрагмент З являє собою Хьаї-НіпаПІ-субфрагмент 75. Ніпапі-фрагмента ОО КРУ, що має приблизно 895 пар основ. ХраЇ-сайти у фрагментах 1 і З перетворювали на унікальні МоїЇ-сайти з використанням МоїІ-лінкерів. Синтетична ДНК, розташована між фрагментами 2 і 3, містить промотор І Р2ЕР2, ЕсокіІ-сайт і ВатнНі-сайт для інсерції чужорідної ДНК.

Гомологічний вектор 931-32.А5. Плазміду 931-32.А5 конструювали з метою вбудовування чужорідної ДНК у

КРМ. Вона включала ген котячого СЮО8О і маркерний ген В-галактозидази (Іас/7) Е.соїї, рланкований ДНК КРУ.

Вище від цих чужорідних генів знаходився фрагмент ДНК КРУ, що складається приблизно з 906 пар основ.

Нижче від цих чужорідних генів знаходився фрагмент ДНК КРУ, що складається приблизно з 895 пар основ. З використанням плазміди відповідно до процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРУ", одержували вірус, який містить ДНК, що кодує ці чужорідні гени. Вектор конструювали з використанням стандартної техніки рекомбінантних ДНК (Затргсок еї аІ.) шляхом приєднання сч рестрикційних фрагментів з нижчевказаних джерел до синтетичних ДНК-послідовностей. Цей плазмідний вектор був отриманий з рестрикційного НіпаПП-фрагмента плазміди роеРб4 (Рготеда), що має приблизно 2999 пар основ. і)

Фрагмент 1 являє собою рестрикційний НіпапІ-ХраІ-субфрагмент рестрикційного НіпаПі-фрагмента О КРМ (Кпідні еї аі.). що має приблизно 906 пар основ. Фрагмент 2 являє собою ЕсоКІ-ВатнНіІ-фрагмент гена котячого СО8О, що має приблизно 879 пар основ і синтезований відповідно до процедури, описаної в розділі "Клонування за со зо допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Матриця для ПЛР-реакції являла собою РНК від Соп

А-стимульованих клітин селезінки котів. Зворотний праймер (5-ТССАСААТТСООСТСАСОСАССАДАСсТОоС-3; 07 1/97.43) (ЗЕО ІЮО МО: 52) синтезувався від 3-кінця гена котячого СО8О і вводив ЕсоКіІ-сайт. Прямий праймер ї- (5-ВОСТАОБАТССААТСТАТОТАСАСАСОСТОАСАТ-3; 1/97.6) (ЗЕБЕО ІО МО: 53) синтезувався від 3-кінця гена котячого СО8О, вводив ВатнНі-сайт біля 3-кінця цього гена і був використаний для зворотної транскрипції і ме) полімеразної ланцюгової реакції. Фрагмент З являє собою рестрикційний ВатнНі-РушіІ-фрагмент плазміди ї- рУЄМ751 (Реїтагі е( а), що має приблизно 3010 пар основ. Фрагмент 4 являє собою Хра1І-НіпаПІ-субфрагмент

Ніпапі-фрагмента ОО КРУ, що має приблизно 895 пар основ. ХраЇ-сайти у фрагментах 1 і 4 перетворювали на унікальні МоїІ-сайти з використанням МоїІ-лінкерів.

Гомологічний вектор 931-55.812. Гомологічний вектор 931-55.812 використовували з метою вбудовування « чУужорідної ДНК у ЗРУ. Він включає маркерний ген В-глюкуронідази (цідА) Е сой і ген котячого ІЕМ-у (Опіопв ей пт) с а!., 1996; Агауїе еї аі., 1995), рланкований ДНК 5РУ. З використанням цього гомологічного вектора відповідно й до процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного ЗРУ", «» одержували вірус, який містить ДНК, що кодує ці чужорідні гени. Слід зазначити, що .маркерний ген

В-глюкуронідази (цідА) знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу (ЕР), а ген

КОотячого ІЄМ-у знаходиться під контролем окремого й унікального синтетичного пізнього/раннього промотору -І поксвірусу (І Р2ЕР2). Гомологічний вектор був сконструйований з використанням стандартної техніки рекомбінантних ДНК (Затьгоок еї аІ.) шляхом приєднання рестрикційних фрагментів з нижчевказаних джерел до

Мн відповідних синтетичних ДНК-послідовностей. Цей плазмідний вектор був отриманий з рестрикційного -І ОгаІ-фрагмента плазміди РМЕВ193 (Мем Епдіапа Віоіарз), що має приблизно 2700 пар основ. Фрагмент 1 являє цу собою рестрикційний ОгаІ-ЕсоКІ-субфрагмент НіпаП-фрагмента К 5РМ, що має приблизно 881 пару основ.

Фрагмент 2 являє собою рестрикційний ЕсокІ-ВатНі-фрагмент, синтезований за допомогою зворотної с транскрипції і полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням в якості матриці РНК від Соп

А-стимульованих клітин селезінки котів. Для синтезу котячого ІЕМ- у від 5-кінця гена котячого ІРЕМ-Г синтезували праймер 5-ТССАСААТТСОАТОААТТАСАСААСТТТТАТТТТСО-3; 1/97.4) (5ЕБО ІО МО: 81), що вводив ЕсоКі-сайт біля 5-кінця цього гена. Для використання в реакції зворотної транскрипції і ПЛР, від 3-кінця гена котячого ІЕМ-Г синтезували праймер (Х-ТССАООАТССТТАТТТСОАТОСТСТАСООССТО-3"; 1/97.3) о (ЗЕО І МО: 82), що вводив ВатнНі-сайт біля 3-кінця цього гена. ПЛР;-продукт рестриктували ферментами Есокі і іме) Ватні з одержанням фрагмента довжиною приблизно 504 пари основ, що відповідає гену котячого ІЕМ- у.

Фрагмент З являє собою рестрикційний ЕсоКІ-ЗтаіІ-фрагмент плазміди рКА.2б0 (Сіопейесі), що має приблизно бо 1823 п.о. Фрагмент 4 являє собою рестрикційний ЕсокІ-ОгаІ-субфрагмент рестрикційного НіпапПІ-фрагмента К

ЗРМ, що має приблизно 994 пари основ. ЕсоКіІ-сайт у цьому гомологічному векторі ЗРМ перетворювали на унікальний МоїІ-сайт із використанням синтетичних лінкерів.

Гомологічний вектор 846-88.817. Плазміду 846-88.817 конструювали для делетування всієї кодуючої ділянки

ОЕ з вірусу герпесу котів і для вбудовування чужорідної ДНК. Вона включала маркерний ген В-галактозидази 65 (Іас/) Е.соїї, вбудований у сайт делегованої ділянки ЗЕ ЕНМ, фланкований ДНК НУ. Плазміда 846-88.817 містить делецію у 1638 пар основ гена ЗЕ від Зтаї!-сайта в Заїйї-фрагменті В ЕНМ до Заї-сайта в ЕсоКІ-фрагменті Е ЕНМ.

Зтаї!-сайт у Заїй-фрагменті В ЕНМ і Заї-сайт у ЕсоКІ-фрагменті Е ЕНМ визначає кінцеві точки делеції гена 9Е.

Вище від цих чужорідних генів знаходився Авр718-8ша!І-субфрагмент Зай-фрагмента В ЕНМ, що складається приблизно з 1415 пар основ і містить повну кодуючу послідовність гена ді (370 амінокислот). Нижче від цих чужорідних генів знаходився 8а11-Авр718-субфрагмент ЕсоКіІ-фрагмента Е ДНК ЕНМ, що складається приблизно з 2205 пар основ і містить унікальні короткі кінцеві повторювані послідовності. З використанням плазміди відповідно до процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРУ, РМ або ЕНУ", одержували вірус, який містить ДНК, що кодує цей чужорідний ген. Слід зазначити, .що ген Іас7 Е соїї знаходиться під контролем конститутивного промотору ЗЕ ЕНУ. Ця плазміда була 70 сконструйована з використанням стандартної техніки рекомбінантних ДНК (Затьгоок еї а)/.).

Гомологічний вектор 921-65.85. Гомологічний вектор 921-65.85 конструювали для делетування гена 15І ЗРМ (приблизно 237 п.о.) і для вбудовування чужорідної ДНК у ЗРУ. Він включає маркерний ген В-галактозидази (іас7) ЕЕ. соїї і гени дад/протеази та оболонки вірусу лейкозу котів (Бе! М), фланковані ДНК 5РМ. З використанням цього гомологічного вектора відповідно до процедури, описаної в розділі "Процедура 7/5 Гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРУ, 5РМ або ЕНУ", одержували різні віруси, які містять ДНК, що кодують ці чужорідні гени. Цей вектор був сконструйований з використанням стандартної техніки рекомбінантних ДНК (Затьгоок еї а1І.). Слід зазначити, що маркерний ген В-галактозидази (Іас7) знаходиться під контролем конститутивного пізнього промотору поксвірусу (151), а гени дад/протеази Бе! М і оболонки Бе М знаходяться під контролем окремих синтетичних ранніх промоторів поксвірусу ЕР2 і ЕР, відповідно.

Послідовність РМ, що фланкує інсертовані чужорідні гени, походила від геномного 3,2 т.п.о. Ніпапі-фрагмента

М. Вище від послідовності чужорідних генів знаходиться 903 п.о.-фрагмент, що містить частину гена 14! 5РМ, а нижче від послідовності чужорідних генів знаходиться 966 п.о.-фрагмент, що містить частину гена 16Ї ЗРУ. Ген

Іас/ Е. соїї і відкриті рамки зчитування оболонки Ре! М і дад/протеази Бе! М знаходяться в тій же самій орієнтації стосовно генів 16! ЗРМ і 14! 5РУ. сч

Гомологічний вектор 942-03.26. Плазміду 942-03.26 конструювали для делетування частини кодуючої ділянки ЗЕ з вірусу герпесу котів і для вбудовування трьох чужорідних генів у сайт делетованого ЗЕ. Вона і) включає ген котячого СО8О (-879п.0.), ген дад/протеази РІМ (-1800 п.о.) і ген оболонки РІМ (-2600 п.о.), фланковані ДНК ЕНМ. Ген котячого СЮОВ8О знаходиться під контролем промотору ЗЕ ЕНУ, ген дад/протеази БМ знаходиться під контролем промотору 9Х псевдорабівірусу, а ген оболонки РІМ знаходиться під контролем со зо передраннього промотору гена цитомегаловірусу. Вище від цих чужорідних генів знаходиться

Азвр718-Зта!-субфрагмент ЗаІ-фрагмента В ЕНМ, що складається приблизно з 1415 пар основ. Нижче від цих (87 чужорідних генів знаходиться ЗаіІ-Азр718-субфрагмент ЕсоКІ-фрагмента Е ЕНМ, що складається приблизно з М 2205 пар основ і містить унікальні короткі кінцеві повторювані послідовності. З використанням плазміди відповідно до процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування ме) рекомбінантного КРМ, 5РМ або ЕНУ", одержували вірус, який містить ДНК, що кодує цей чужорідний ген. Ця ча плазміда з гомологічною послідовністю, 942-03.С6, була сконструйована з використанням стандартної техніки рекомбінантних ДНК (Затьгоок еї а)/.).

Приклад ЛА

Клонування кКДНК котячих СОВ8О (87-1)-ТАМИ, СО8О (87-1)-ЗРАН, СО86 (87-2), СО28 і СТІ А-4: «

КДНК. котячих СОв8О (87-1), СО86 (87-2), СО28 і СТІ А-4 -клонували за допомогою першої реакції КТ-ПЛР з с (полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою), що ампліфікує ділянку між двома

Й послідовностями, які були досить консервативними для того, щоб можна було сконструювати вироджені и?» праймери, що взаємодіяли б з котячою мРНК. Джерелом мРНК були мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК), або спленоцити, стимульовані Соп А принаймні протягом 16 годин. Цей ПЛР-продуктсеквенували. Дана послідовність була використана для конструювання праймерів для КАСЕ (швидка ампліфікація -І КДНК-кінців)-ПЛР. 5'-кінець амплифікували спочатку шляхом одержання кДНК із нижчерозташованим праймером, комплементарним до тільки щосеквенованої консервативної ділянки. Олігонуклеотид лігували з 3-кінцем кКДНК о (комплементарним до 5'-кінця МРНК). Ця послідовність виступала як сайт зв'язування для зворотного праймера, -І що є ПЛР-сумісним із прямим ПЛР-праймером, який відповідає іншій ділянці в тільки щосеквенованій ділянці. Вироджені праймери були використані у безлічі циклів "гніздових" реакцій з одержанням 3-кінця. Цей зворотний - праймер для ПЛР конструювали таким чином, що він реагував з послідовністю в тільки щосеквенованій ділянці. с Продуктисеквенували або прямим методом, або вони були клоновані в клонуючий вектор ТА ісеквеновані із плазміди. Усю відкриту рамку зчитування у всій своїй повноті клонували шляхом ампліфікації за допомогою ПЛР із використанням праймерів, сконструйованих з відомих послідовностей. Ці ВРЗ були клоновані ісеквеновані дво тричі. ВРЗ В7-1 субклонували в плазміду ро з використанням промотору 5М40 і в плазміду ЗЕМ. Плазміду разі використовували для встановлення функціональної взаємодії В7-1 з котячим СО28.

Ф) Для КТ/ПЛР кДНК котячого СО8О ГВ7-П використовували ДНК-праймери: ка 5-праймер: 5-СОСОСАТССОСАССАТОООСТСАСОСАССААДАСТОСААААС-3 (ЗЕО ІЮ МО:11) 3-праймер: 5-ССТАСТАСАСААСАССТАААСАСОС-3 (ЕС ІЮО МО: 12) (див. вище повний список праймерів бо для КДНК котячого СОВ8О).

Для КТ/ПЛР кКДНК котячого СЮО28 використовували ДНК-праймери: 5-праймер: 5-СВСОСАТССАССОСТАССАСААТОАТССТСАСО-3 (5ЕБО ІЮ МО:13) 3-праймер: 5-СВСОСАТССТСТОСАТАсОООТССАТОТСАС-3 (ЗЕО ІЮ МО: 14) (див. вище повний список праймерів для кКДНК котячого СЮ28). 65 Для КТ/ПЛР кДНК котячого СТІ А-4 використовували ДНК-праймери: 1. Вироджені праймери для першого ПЛР-продукту (672 п.о.)

Вир.5і--праймер: 5-АТООСТТ(С)ОССТТОБАТТТ(С)САСС(А)ОО-3"; (ЕС ІЮ МО: 15)

Вир.3'і-праймер: 5-ТСААТТО(АХЗАТО(А)ССААТААААТААСОСТО-3 (5ЕО ІЮ МО: 16). 2. 5-кінець СТІ А-4 (455 п.о.): Вироджені ген-специфічні (З5Р) і "гніздові" ген-специфічні (МОР) праймери:

Перший раунд ПЛР:

Вир. 5.-праймер: 5-ТОТТОООТТТО()О(АХСТСТО(АСТТСССТО-3 (5БЕО ІЮ МО: 17) 3-о5Р-праймер: 5-ССАТАСТАСОСТООСТОООТАСАТО-3 (5ЕО ІЮ МО. 18). "Гніздова" ПЛР із використанням ПЛР-продукту першого раунду:

Вир. 5-праймер: 5-ТОТТОСОТТТО()С(АХСТСТО(АСТТОССТО 3" (5БЕО ІЮОМО: 19) 70 3-МОоЗР-прайМер: 5-АСАТОАОСТССАССТТОСАС-3 (ЗЕ ІЮО МО: 20).

З. З3-кінець СТІ А-4: адапторний праймер 1 (АРІ, Сіопіесп, ар. Іпс., Раю АЮ, СА); "гніздовий" адапторний праймер (АР2, Сіопіесп, Іаб.), ген-специфічний праймер (СР) і "гніздовий" ген-специфічний праймер (МОР): 3-КАСЕ-пР:

АРІ: 5-ССАТССТААТАСОСАСТСАСТАТАЄООС-3 (5ЕО ІОМО: 21) 5-о5Р: 5-СТОААТАТООСТСТТСАСОСААТО-5" (5ЕО ІОМО: 22)

З гніздова КАСЕ-ПЛР із використанням продукту 3-КАСЕ-ПЛР:

АР2: 5-АСТСАСТАТАССОСТСОАССООС-3 (ЕС ІЮО МО: 23) 5-МОЗР: 5-САААТССОАСТОАСТОТОСТОАдО-3 (5ЕО ІЮ МО: 24) 4. Праймери для цілого гена СТІ А-4 кот. СТІ А-4 5і-праймер: 5-ААССТОААСАСТОСТОССАТАААО-3 (5ЕО ІЮ МО: 25) кот. СТІ А-4 3'-праймер: 5-СССТСАОСТСТТАСАААТТОСАСАС-3 (5ЕО ІЮ МО: 26).

Для КТ/ПЛР кКДНК котячого СО86 (87-2) використовували ДНК-праймери: 1. Вироджені праймери для першого ПЛР-продукту (423 п.о.) сч

Вир. 5'і-праймер: 5-ТАСТАТТТТОССАССАССАСО-3 (5ЕБО ІЮ МО: 27)

Вир. 3і--праймер: 5-СТОТОАСАТТАТСТТОАСАТТТО-3 (ЗЕО ІОМО: 28). і) 2. Вироджені праймери для другого ПЛР-продукту (574 п.о.)

Вир. 5'-праймер: 5-СА(0)СА(Т)ОСАСТ(А)ХЗАТООСАСТОАО-3 (5ЕБО ІЮ МО: 29)

Вир. 3і--праймер: 5-СТОТОАСАТТАТСТТОАСАТТТО-3 (ЗЕО ІО МО: 30). со зо З. Б5-кінесь СО86: АРІ, АР2 (Сіопіесй, Іа.) вироджені 3'-ген-специфічний (С5Р) і 3-гніздовий ген-специфічний (МО5Р) праймери: -- 5-КАСЕ-ПЛР: ї-

АРІ: 5-ССАТССТААТАСОАСТСАСТАТАСООС-3 (5ЕО ІЮ МО: 31) 3-О5Р: 5-ТООСТААССТТОТАТАСАТОАОСАСОСТО-57 (5ЕБЕО ІОМО: 32) о "Гніздова" 5-ПАСЕ-ПЛР із використанням ПЛР-продукту 5-КАСЕ: АР2: ї- 5-АСТСАСТАТАОСОСТСОАССООС-3 (5ЕО ІЮ МО: 33) 3-МОЗР: 5-САОСТТОАСТОААСТТАССААССАС-3 (5ЕО ІЮ МО: 34). 4. 3і-кінець В7-2: АРІ, АР2, 5-О5Р і 5-МОЗР: 3-КАСЕ-ПЛР: «

АРІ: 5-ССАТССТААТАСОАСТСАСТАТАСООС-3 (5ЕО ІЮО МО: 35) в с 5-О5Р: 5-ВССАСААДОООСАСАТАТСАСТОТТТО-3 (5ЕО ІЮ МО: 36) - . Гніздова З3-КАСЕ-ПЛР із використанням ПЛР-продукту 3-КАСЕ: и?» АР2: У-АСТСАСТАТАВООСТООСАССОСС-3 (5ЕО І МО: 37) 5-МОЗР: 5-САСТОСТТОСТААСТТСАСТСААСС-3 (5ЕО ІЮО МО: 38).

Весь ген СОае6: -І кот. В72 (1) 5і-праймер: 5-СООСААТОТСАСТОАОСТТАТАО-3' (5ЕО ІЮ МО: 39) кот. В72 (1176) 3--праймер: 5-ЗАТСТТТТТСАООТТАССАСОоОО-3 (ЗЕО І МО: 40). і Приклад 18 -І Клонування СОВ8О (8В7-1)-5упіго/5РАН; Плазміда 917-19-8/16

У котів виділяли клітини селезінки і культивували з конканаваліном А протягом 5 годин. Клітини - осаджували, промивали РВ5 і використовували для виділення повнорозмірної РНК (Оіадеп КМеазу Тоїва! КМА с Зувіет). Усю РНК обробляли ДНКазою 1 (Воепгіпдег Мапппіет) для видалення ДНК-домішок із РНК-препаратів.

Потім із цих препаратів екстрагували інформаційну РНК із використанням сфер з оліготексу Оіадеп (Запіа Сіага,

СА) і швидких колонок. Із мРНК продукували копію ДНК у присутності рандомізованих гексамерів, амМтТР, дв РНкКазину, зворотної транскриптази (Рготеоа) і буфера для зворотної транскриптази (Рготеда) та інкубували протягом ЗО хвилин при 42 С. Потім проводили ПЛР для генерування дволанцюгового повнорозмірного іФ) КДНК-клону відкритої рамки зчитування (ВРЗ) котячого В7-1 з використаннямсмислового праймера 5/97.50 км (5-АТООТСАСОСАССАААСТО-3! (ЗЕО ІО МО: (41) і антисмислового праймера 5/97.51 (5-СТАТОТАСАСАОСОСТОАСАТОС-3) (5ЕО ІО МО: 42), аМмТР, КДНК В7-1 (1-й ланцюг), МоО4, полімерази Мепі во ВК) і буфера для полімерази Мепі (ВК). ПЛР проводили при таких умовах: 1 цикл при 9429, 15сек., 35 циклів при 942С, ЗОсек., при 482С, 2 хв., при 729С, 2хв.; 1 цикл при 722С, 10хв. ПЛР-суміш піддавали електрофорезу на 195 низькоплавкому агарозному гелі, Її ДНК-фрагменти, що відповідали очікуваному розміру

ВРЗ В7-1, виділяли, піддавали гель-очистці з використанням набору для гель-очистки (Оіадеп'з Се! Ригійсавноп

Кії, Запіа Сіага, СА) і клонували у плазмідний вектор рРСК-ВГОМТ з використанням реагентів з набору для 65 ПЛР-клонування (Іпмйгодеп'з 7его Вішпі РСК Сіопіпд КИ, Зап Оіедо, СА). ДНК, екстраговану з бактеріальних колоній, резистентних до канаміцину, попередньо скринували на присутність унікального МПпеїІ-сайту (що міститься в котячому СОВО (87-1)-ТАМУ). Вставки, що мали розмір 800-900 п.о. і містили Мпе!-сайт,секвенували з використанням протоколів і устаткування для автоматичного флуоресцентногосеквенування АВІ (Регкіп-ЕІтег-Сефив; Арріїей Віозупіетв, Іпс.). Для генерування ДНК-послідовності праймерів рСК-Вішпі були використані ген-специфічні праймери для плазмідного вектора і В7-1, що походять від попередньо клонованого гена В7-1, а саме: 1/97.36 (5-САССАААСАССТАТОАС-3); (5БО ІО МО: 43) і 1/97.37 (5-ААТАСОСАСТСАСТАТАСО-3); (ЗЕО І МО: 44). Праймерами, специфічними для гена В7-1, є: 12/96.22 5-ААСАССАТТТСАТСАТССТТТ-3 (5ЕО ІЮ МО: 45); 1/97.33 У-АТАСААСТОТАТТТОССАТТОТО-3 (5ЕО ІЮ МО: 46); 70 12/96.20 5-АСВСТСТОАССААТААСАТСА-3' (5ЕО І МО: 47); 12/96.21 У-АТТАСАААТССАСТТСАСТОСТ-3 (ЗЕО ІО МО: 48); 1/97.32 5-ТСАТОТСТООССААДАСТАСААДО-3 (5ЕО ІЮ МО: 49); 11/96.32 5-АТТСАСТОАСОТСАССОА-3 (5ЕО ІЮ МО: 50); 11/96.31 5-ААСОСТОТООСТСТОА-3 (5ЕО І МО: 51).

Було визначено, що два клони містять повнорозмірну послідовність СО8О, що відповідає вихідній послідовності СО8О, за винятком 2 точкових мутацій ДНК. Одна така точкова мутація не впливала на амінокислотну послідовність. Друга мутація призводила до заміни амінокислоти лейцину на ізолейцин.

Отриманий клон котячого СО8О позначали 917-19.8/16. (СО80-Зупіго/ЗРАН).

Приклад 2 5-5РМУ-229

З-ЗРМ-229 являє собою вірус віспи свиней, що експресує принаймні два чужорідних гени. Ген

В-галактозидази Е.соїї (їас/) і ген котячого СО8О вбудовували в Ассі-сайт ЗРМ у більш великий

Вап-НтанНІ-субфрагмент геномного Ніпап-фрагмента М ЗРМ (унікальний рестрикційний МоїІ-сайт був замінений на унікальний рестрикційний Ассі-сайт). Ген ас перебуває під контролем синтетичного пізнього промотору (ГРІ), а ген котячого СО8О перебуває під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору (І Р2ЕРЗ). сч 5-ЗРМ-229 отримували з 5-ЗРМ-001 (штам Казлга) Цю процедуру здійснювали із застосуванням гомологічного вектора 930-23.А1 (див. "Матеріали і методи") і вірусу 5-5РМ-001, як описано в розділі і) "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного 5РМУ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус ЗРМ, що експресує

В-галактозидазу (аналізи ВІООСАЇ і СРКО). В результаті очищення червоних бляшок отримували со зо рекомбінантний вірус, позначений 5-5РМ-229. Цей вірус аналізували на експресію В-галактозидази, чистоту і стабільність вставки шляхом багаторазових пересівань, що просліджувалися за допомогою аналізу наутворення (7-7 синіх бляшок і аналізу на утворення чорних бляшок, як описано в розділі "Матеріали і методи". Після перших М трьох циклів очищення усі бляшки, що спостерігалися, мали синє забарвлення, що вказувало на те, що цей вірус був чистим, стабільним і експресував В-галактозидазу (патент СІЛА 5382425, що вводиться в даний опис ме)

З5 Шляхом посилання). ча

З-ЗРМ-229 аналізували на експресію антигенів, специфічних для В-галактозидази із застосуванням процедури, описаної в розділі "Скринінг чорних бляшок на експресію чужорідного гена в рекомбінантному ЗРУ".

Було показано, що моноклональне антитіло проти В-галактозидази специфічно реагує із бляшками 5-5РМ-229 і не реагує з негативними контрольними бляшками 5-5РМ-001. Усі бляшки 5-5РМ-229, які спостерігалися, « реагували з моноклональним антитілом проти В-галактозидази, що вказує на те, що цей вірус стабільно- 7-3) с експресує чужорідний ген В-галактозидази. Описані тут аналізи здійснювали на клітинах ЕЗК-4, що вказує на те, . що клітини ЕЗК-4 мають бути придатним субстратом для продукування рекомбінантних ЗРМ-вакцин. и?» З-ЗРМУ-229 аналізували на експресію антигенів, специфічних для котячого СОВ8О із застосуванням процедури, описаної в розділі "Скринінг на експресію котячого СОВ8О (87-1) ії СО86 (87-2) в рекомбінантних ЗРМ, КРМ або

РНМ з використанням аналізів на утворення чорних бляшок". Було показано, що химерне антитіло проти -І СТІ А-4/Рс людини специфічно реагує з бляшками 5-5РМ-229 (що експресують котячий СО80) і не реагує з негативними контрольними бляшками 5-5РМ-001. Було показано, що всі бляшки 5-ЗРМ-229, що спостерігалися, о реагували з химерним антитілом проти СТІ А-4/Ес людини, що вказує на те, що цей вірус стабільно експресує -І чужорідний ген котячого СЮОВ8О.

Для підтвердження експресії продукту гена котячого СО8О клітини інфікували 5-5РМ-229, і зразки - інфікованих клітинних лізатів піддавали електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН. Цей гель блотували й с аналізували, як описано в розділі "Процедура Вестерн-блоттингу". 5-ВРМ-229 використовували як вакцини проти хвороб у котів. 5-ЗРМ-229, при його використанні окремо або в комбінації з РІМ-, Бе М-, РІР-вакцинами або з іншими в Котячими вакцинами, сприяє підвищенню ефективності вакцин проти РІМ, РеїМ, РІР або інших хвороб котів. 5-ЗРМ-229 може бути також використаний для експресії поліпептиду котячого СО8О. Клітинний лізат

Ф) 5-ВРМ-229-інфікованих клітин вводили шляхом ін'єкції мишам або кролям для виробки у них поліклональних ка моноспецифічних антитіл проти котячого СЮОВ8О.

Приклад З 60 5-ЗРМ-230

З-ЗРМ-230 являє собою вірус віспи свиней, що експресує принаймні два чужорідних гени. Ген

В-галактозидази Е.соїї (Гас7) і ген котячого СО28 вбудовували в Ассі-сайт ЗРМ у більш великому

Вап-Ніпані-субфрагменті геномного НіпапП-фрагменту М ЗРМ (унікальний рестрикційний Моїй-сайт був замінений на унікальний рестрикційний Ассі-сайт). Ген ас перебуває під контролем синтетичного пізнього 65 промотору (ГРІ), а ген котячого СЮО28 знаходиться під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору (ГР2ЕРЗ).

З-ВРМ-230 отримували з 5-5РМУ-001 (штам Казлга). Цю процедуру здійснювали з використанням гомологічного вектора 930-26.А1 (див. "Матеріали і методи") і вірусу 5-5РМ-001, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного РМ". Вихідний матеріал для трансфекції сСкринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус РУ, що експресує В-галактозидазу (аналізи

ВІООБАЇ і СРО)". В результаті очищення червоних бляшок одержували рекомбінантний вірус, позначений 5-ЗРМ-230. Цей вірус аналізували на експресію В-галактозидази, чистоту і стабільність вставки шляхом множинних пересівань, що просліджувалися за допомогою аналізу на утворення синіх бляшок, як описано в розділі "Матеріали і методи". Після перших трьох циклів очищення усі бляшки, що спостерігалися, мали синє /о забарвлення, що вказувало на те, що цей вірус був чистим, стабільним і експресував чужорідний ген.

З-З5РМ-23О аналізували на експресію антигенів, специфічних для котячого СО28, із застосуванням процедури, описаної в розділі "Скринінг чорних бляшок на експресію чужорідного гена в рекомбінантному ЗРУ".

Описані тут аналізи здійснювали на клітинах ЕЗК-4, що вказувало на те, що клітини Е5ЗК-4 мають бути придатним субстратом для продукування рекомбінантних ЗРМ-вакцин.

Для підтвердження експресії продукту гена котячого СО28 клітини інфікували 5-5РМ-230, і зразки інфікованих клітинних лізатів піддавали електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН. Цей гель блотували й аналізували, як описано в розділі "Процедура Вестерн-блоттингу". 5-ВРМ-230 використовували як вакцини проти хвороб у котів. З-ВРМ-230, при його використанні окремо або в комбінації з РІМ-, Ге! М-, ЕІР-вакцинами або з іншими котячими вакцинами, сприяє підвищенню ефективності 2о вакцин проти РІМ, РеїМ, РІР або інших хвороб котів. 5-ЗРМ-230 може бути також використаний для експресії поліпептиду котячого СО28. Клітинний лізат 5-5РМ-229-інфікованих клітин вводили шляхом ін'єкції мишам або кролям для виробки в них поліклональних, моноспецифічних антитіл проти котячого СО28. Приклад 4 5-5РМУ-225 5-ЗРМ-225 являє собою вірус віспи свиней, який експресує принаймні два чужорідних гени. Ген

В-галактозидази Ес.соїї (Іас7) і ген котячого інтерферону-Г (котячого ІЕМ-Г) вбудовували в Ассі-сайт ЗРМ у сч більш великому ВоїП-Нпапі-субфрагменті геномного НіпаП-фрагменту М ЗРМ (унікальний рестрикційний

МоїІ-сайт був замінений на унікальний рестрикційний Ассі-сайт). Ген І ас7 перебуває під контролем промотору і) вірусу віспи свиней (ОЇ), а ген котячого ІЕМ-Г перебуває під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору (І Р2ЕРЗ). 5-ЗРМ-225 одержували з 5-5РМ-001 (штам Казла). Цю процедуру здійснювали з використанням со зо Гомологічного вектора 917-60.89 (див. "Матеріали і методи") і вірусу З-ЗРМ-001, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного 5РМУ". Вихідний матеріал для -- трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус 5РМ, який експресує М

В-галактозид азу (аналізи ВІШОСАЇ і СРКОС). В результаті очищення червоних бляшок отримували рекомбінантний вірус, позначений 5-5РМ-225. Цей вірус аналізували на експресію В-галактозидази, чистоту і ме) з5 стабільність вставки шляхом множинних пересівань, що просліджувалися за допомогою аналізу на утворення ча синіх бляшок, як описано в розділі "Матеріали і методи". Після початкових трьох циклів очищення усі бляшки, що спостерігалися, мали синє забарвлення, що вказувало на те, що цей вірус був чистим, стабільним і експресував чужорідний ген.

З-ЗРМУ-225 аналізували на експресію антигенів, специфічних для котячого ІЕМ-Г, із застосуванням процедури, « описаної в розділі "Скринінг чорних бляшок на експресію чужорідного гена в рекомбінантному 5РМ". Описані тут ще) с аналізи здійснювали на клітинах Е5К-4, що вказувало на те, що клітини ЕЗК-4 мають бути придатним субстратом для продукування рекомбінантних ЗРМУ-вакцин. ;» Для підтвердження експресії продукту гена котячого ІРЕМ-Г клітини інфікували 5-5РМ-225, і зразки інфікованих клітинних лізатів піддавали електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН. Цей гель блотували й аналізували, як описано в розділі "Процедура Вестерн-блоттингу". -І 5-ЗРМ-225 аналізували на експресію біологічно активного котячого ІЕМ-Г з використанням процедури, описаної в розділі "Скринінг на біологічну активність котячого інтерферону-гамма, експресованого з і рекомбінантних 5РМУ, КРМ або ЕНУ, з використанням аналізів на зниження числа бляшок, утворених під дією -І УМ". 5-ВРМ-225 використовували як вакцини проти хвороб у котів. З-ВРМ-225, при його використанні окремо або в - комбінації з РІМ-, Ге! М-, ЕІР-вакцинами або з іншими котячими вакцинами, сприяє підвищенню ефективності с вакцин проти РМ, РеїМ, РІР або інших хвороб котів.

Приклад 5 5-ЗРМ-200 5-ЗРМ-200 являє собою вірус віспи свиней, що експресує три чужорідних гени. Ген дад/протеази вірусу імунодефіциту котів (РМ), ген оболонки РІМ (повнорозмірний) і ген В-галактозидази Е.соїї (І ас7) вбудовували

Ф) в унікальний рестрикційний МоїІ-сайт (МоїйІ-лінкери, вбудовані в унікальний рестрикційний Ассі-сайт ЗРМ в ОРС ка ОЇ Ніпапі-фрагменту М 5РМ). Гени дад/протеази і оболонки РІМ знаходяться під контролем окремого, але ідентичного синтетичного пізньогограннього промотору (ІР2ЕР2). Ген ас знаходиться під контролем бо синтетичного пізнього промотору (І-Р1). 5-ЗРМ-200 одержували з 5-5РМ-001 (штам Казла). Цю процедуру здійснювали з використанням гомологічного вектора 904-63.87 і вірусу 5-ВРМ-001, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного 5РУ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус РУ, що експресує В-галактозидазу (аналізи ВІ ООСАЇ і СРКО і скринінг на 65 рекомбінантний вірус герпесу, що експресує ферментні маркерні гени)". В результаті очищення червоних бляшок отримували рекомбінантний вірус, позначений 5-5РМ-157. Цей вірус аналізували на експресію В-галактозидази за допомогою аналізу, описаного в розділі "Матеріали і методи". Аналіз на чистоту і на стабільність вставки після 5 пересівань здійснювали шляхом детекції дад ГРІМ і В-галактозидази в аналізі на утворення чорних бляшок і детекції дад і оболонки РІМ у Вестерн-блотт-аналізі. 8-ВРМ-200 являє собою рекомбінантний вірус віспи свиней,, що експресує білки дад/протеази РІМ і оболонки

ЕМ, може бути використаний як вакцина проти РІМ-інфекцій у котів. 5-ВРМ-200 може бути також використаний для експресії білків дад/протеази й оболонки ЕМ.

Приклад 6 5-ЗРМ-233 70 8-ВРМ-233 являє собою вірус віспи свиней, що експресує п'ять чужорідних генів: зад РІМ, епм РІМ, котячого

СО80, Іасл ЄЕ.соїї і цідА Е.соїї. Повнорозмірний ген котячого СО8О і ген В-глюкуронідази Е.соїї (цідА) вбудовували в унікальний рестрикційний Мої-сайт (МоїІ-лінкери, вбудовані в унікальний рестрикційний

Есок.-сайт приблизно в 3,2 т.п.о.-ділянці (ЗЕО ІЮ МО) 6,7-Т.п.о.-НіпаП-фрагмента К ЗРМ). Гени дад/протеази вірусу імунодефіциту котів (ГРІМ) і оболонки РІМ (повнорозмірний) і ген В-галактозид ази Е.соїї вбудовували в /5 унікальний рестрикційний МоїІ-сайт (МойІ-лінкери, вбудовані в унікальний рестрикційний Ассі-сайт ЗРМ в ОРС

ОЇ Ніпап-фрагменту М 5РМ). Ген СО80 знаходиться під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору (І Р2ЕРЗ), а ген цідА знаходиться під контролем окремого унікального синтетичного раннього промотору (ЕРЗ).

Гени дад/протеази й оболонки РІМ знаходяться під контролем окремого, але ідентичного синтетичного пізнього/раннього- промотору (ГР2ЕРЗ). Ген Іас/ знаходиться під контролем синтетичного пізнього промотору (РІ). (Міжнародна заявка РСТ УУО 96/22363, яка вводиться в даний опис шляхом посилання).

З-ЗРМ-233 отримували з 5-5РМ-200 (що містить дад РМ, оболонки РІМ і Іас7 Е.соїї). Цю процедуру здійснювали із застосуванням гомологічного вектора 931-21.А71 і вірусу 5-5РМ-200, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного 5РМУ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус ЗРМ, що експресує сч ов В-глюкуронідазу (Х-9(ШС і скринінг на рекомбінантний вірус герпесу, що експресує ферментні маркерні гени)". В результаті кінцевого очищення синіх/зелених бляшок отримували рекомбінантний вірус, позначений 5-5РМ-233. і)

З-ЗРМУ-233 аналізували на експресію антигенів, специфічних для дад ГРІМ, епм ГРІМ і котячого СО8О, з використанням процедури, описаної в розділі "Скринінг чорних бляшок на експресію чужорідного гена в рекомбінантному ЗРУ". Описані тут аналізи здійснювали на клітинах ЕЗК-4, що вказує на те, що клітини ЕЗК-4 со зо мають бути придатним субстратом для продукування рекомбінантних ЗРМ-вакцин. 5-ЗРМУ-233 аналізували на експресію антигенів, специфічних для котячого СОВ8О із використанням процедури, -- описаної в розділі "Скринінг на експресію котячого СОВ8О (В7-1) і котячого СО86 (87-2) в рекомбінантних ЗРМ, М

КРМ або ЕНМ з використанням аналізів на утворення чорних бляшок". Було показано, що химерне антитіло проти

СТІ А-4/Рс людини специфічно реагує із бляшками 5-5РМ-233 (що експресують котячий СОВ80) і не реагує з ме)

Зз5 негативними контрольними бляшками 5-5РМ-001. Було показано, що всі бляшки 5-5РМ-233, що спостерігалися, ї- реагували з химерним антитілом проти СТІ А-4/Ес людини, що вказує на те, що цей вірус стабільно експресує чужорідний ген котячого СЮОВ8О.

Для підтвердження експресії продукту генів дад РІМ, епм ГРІМ і котячого СО 80 клітини інфікували

З-ВРМ-233, і зразки інфікованих клітинних лізатів піддавали електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН. Цей « тель блотували й аналізували, як описано в розділі "Процедура Вестерн-блоттингу". з с З-ВРМ-233 являє собою вірус віспи свиней, що експресує білки дад/протеази РМ і оболонки РМ, і може бути . використаний як вакцина проти ЕРІМ-інфекцій у котів. 5-5РМ-233 може бути також використаний для експресії и?» білків дад/протеази й оболонки ЕРМ.

Приклад 7 5-ЗРМ-235 -І 8-ВРМ-235 являє собою вірус віспи свиней, що експресує п'ять чужорідних генів: зад РІМ, епм РІМ, котячого

ІРМ-Г, Іасй Е.соїї і цідА Е.соїї. Повнорозмірний ген котячого ІЕМ-Г і ген В-глюкуронідази Е.соїї (цідА) о вбудовували в унікальний рестрикційний Мої-сайт (МоїІ-лінкери, вбудовані в унікальний рестрикційний -І ЕсокКіІ-сайт приблизно в 3,2 т.п.о.-ділянці (ЗЕО ІЮ МО) 6,7-Т.п.о.-НіпанІ-фрагмента К ЗРМ). Гени дад/протеази 5о Вірусу імунодефіциту котів (РМ) і оболонки БМ (повнорозмірний) і ген В-галактозидази Е.соїї (Іас/7) - вбудовували в унікальний рестрикційний Мої-сайт (МоїІ-лінкери, вбудовані в унікальний рестрикційний с АссІі-сайт 5РМ в ОРОС ОЇ Ніпай-фрагмента М РМ). Ген ІРМ-Г перебуває під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору (І Р2ЕРЗ), а ген цідА перебуває під контролем окремого унікального синтетичного раннього промотору (ЕР2). Гени дад/протеази й оболонки РЕМ знаходяться під контролем окремого, але дв їдентичного синтетичного пізнього/раннього промотору (ГР2ЕР2). Ген Іасй знаходиться під контролем синтетичного пізнього промотору (І Р1).

Ф) З-ВРМ-235 одержували з 5-5РМ-200 (що містить гени дад ГРІМ, оболонки РІМ і Іас7 Е.соїї). Цю процедуру ка здійснювали із використанням гомологічного вектора 931-55.812 і вірусу 5-5РМ-200, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного 5РМУ". Вихідний матеріал для бо трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус ЗРМ, що експресує

В-глюкуронідазу (Х-СІ ОС і скринінг на рекомбінантний вірус герпесу, що експресує ферментні маркерні гени)". В результаті очищення синіх/зелених бляшок отримували рекомбінантний вірус, позначений 5-5Р-235.

З-ЗРМ-235 аналізували на експресію антигенів, специфічних для дад РІМ, епм РІМ і котячого ІБЄМ- у з використанням процедури, описаної в розділі "Скринінг чорних бляшок на експресію чужорідного гена в б5 рекомбінантному ЗРУ". Описані тут аналізи здійснювали на клітинах ЕЗК-4, що вказує на те, що клітини ЕЗК-4 мають бути придатним субстратом для продукування рекомбінантних ЗРМУ-вакцин.

З-ЗРМ-235 аналізували на експресію біологічно активного.котячого ІЕМ- у із застосуванням процедури, описаної в розділі "Скринінг на експресію біологічної активності котячого інтерферону-гамма, експресованого із рекомбінантних 5РМУ, КРМ або ЕНМ з використанням аналізів на зниження числа бляшок, що утворюються під дією МУ".

Для підтвердження експресії продукту генів дад РІМ, епм РІМ і котячого ІРМ-у клітини інфікували 5-5РМ-235, і зразки інфікованих клітинних лізатів піддавали електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН. Цей гель блотували й аналізували, як описано в розділі "Процедура Вестерн-блоттингу". 5-ЗРМ-235 являє собою рекомбінантний вірус віспи свиней, що експресує білки дад/протеази РМ і білки 70 оболонки РІМ, і може бути використаний як вакцина проти РІМ-інфекцій у котів. 5-ЗРУ-235 може бути також використаний для експресії білків дад/протеази та оболонки РМ.

Приклад 8 5-ЗРМ-224 5-ЗРМ-224 являє собою вірус віспи свиней, що експресує три чужорідних гени. Ген дад/протеази вірусу 75 лейкозу котів (Ге М), ген оболонки Бе! М (повнорозмірний) і ген Іас7 Е.соїї вбудовували в сайт делегованого 151 РМ, що походить від неповного геномного 1869 п.о.-НіпаПІ-фрагмента М. Ген дад/протеази Ре! М знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу (ЕР2). Ген оболонки Ре! М знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу (ЕР1). Ген Іас/ знаходиться під контролем конститутивного пізнього промотору 15І Р ЗРУ. 5-ЗРМ-224 одержували з 5-5РМ-001 (штам Казла). Цю процедуру здійснювали з використанням гомологічного вектора 921-65.85 і вірусу 5-ВРМ-001, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантних КРУ, ЗРМ або ЕНУ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус РУ, що експресує В-галактозидазу (аналізи ВІ ШОСАЇ і СРКС) або

В-глюкуронідазу (аналіз Х-СІ ШС)". В результаті очищення червоних бляшок одержували рекомбінантний вірус, Га ор; позначений 5-5РМ-224. Цей вірус аналізували на експресію В-галактозидази шляхом аналізу синіх бляшок, як описано в розділі "Матеріали і методи". о 5-ВРМУ-224 аналізували на експресію білків дад/протеази Ре! М, епм Ре! М і В-галактозидази з використанням процедури, описаної в розділі "Скринінг чорних бляшок на експресію чужорідного гена в рекомбінантному КРУ,

ЗРМ або ЕНМ з використанням аналізу на утворення чорних бляшок". Описані тут аналізи здійснювали на ее Клітинах ЕЗК-4, що вказує на те, що клітини ЕЗК-4 мають бути придатним субстратом для продукування рекомбінантних ЗРМ-вакцин. 14 серпня 1998. --

Для підтвердження експресії продукту генів дад/протеази Ре! М і епм Ре! М клітини інфікували 5-5РМУ-224, і ч- зразки інфікованих клітинних лізатів піддавали електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН. Цей гель блотували й аналізували, як -описано в розділі "Процедура Вестерн-блоттингу". о 5-ЗРМ-224 являє собою рекомбінантний вірус віспи свиней, що експресує білки дад/протеази Бе! Міоболонки /-з|ча

БеМ, і може бути використаний як вакцина проти РеїЇМ-інфекцій у котів. 5-5РМ-224 може бути також використаний для експресії білків дад/протеази і оболонки Ре! М.

Приклад 9 5-5ЗРМ-246 « 5-ЗРМУ-246 являє собою вірус віспи свиней, що експресує п'ять чужорідних генів: дад/протеази Ре! М, епу - с ЕеїМ, котячого СОВ8О, Іас7 Е.соїї і цідА Е.соїї. Повнорозмірний ген котячого СО8О і ген В-глюкуронідази Е.сої ц (цідА) вбудовували в унікальний рестрикційний МоїІ-сайт (МоїІ-лінкер, вбудований в унікальний рестрикційний "» ЕсокіІ-сайт приблизно в 3,2 Т.П,О.-ділянці 6,7-т.п.о.-НіпаП-фрагмента К 5РМ). Ген СО80 знаходиться під контролем синтетичного пізньогоураннього промотору (ІР2ЕР2), а ген цідА знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу, ЕР2. Ген дад/протеази Ре! М, ген оболонки Ре! М (повнорозмірний) і -І ген В-галактозидази Е.соїї (ас7) вбудовували в сайт делетованого 15І ЗРМ, що походить від неповного геномного 1869 п.о. НіпапІ-фрагмента М. Ген дад/протеази знаходиться під контролем синтетичного раннього

Мн промотору поксвірусу ЕР2. Ген оболонки Ре! М знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору -І поксвірусу ЕРІ. Ген Іас2 знаходиться під контролем конститутивного пізнього промотору поксвірусу 151. шу 20 (Міжнародна заявка РСТ УМ/096/ 22263, що вводиться в даний опис шляхом посилання). 5-ВРМУ-246 одержували з 5-5РМУ-224 (що містить гени дад/протеази Ре! М, оболонки Геї М і Іас7 Е.сої в сайті с делетованого 15Ї геномного неповного 1869 т.п.о.-НіпаП-фрагмента М). Це здійснювали з використанням гомологічного вектора 931-21.А1 і вірусу 5-ЗРМ-224, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРМ, 5РМ або ЕНМ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантні віруси КРМ, ЗРМ або ЕНМ, що експресують В-галактозидазу (аналізи В ЮОСБАЇ і СРКО) або В-глюкуронідазу (аналіз Х-ОІ ШС)". В результаті очищення синіх/зелених бляшок о одержували рекомбінантний вірус, позначений 5-5РМ-246. ко 5-5РМ-246 аналізували на експресію білків дад/протеази Ре! М і оболонки Ре! М з використанням процедури, описаної в розділі "Скринінг чорних бляшок на експресію чужорідного гена в рекомбінантному КРУ, ЗРМ або ЕНМ бо з використанням аналізу на утворення чорних бляшок". Описані тут аналізи здійснювали на клітинах Е5К-4, що вказує на те, що клітини Е5К-4 мають бути придатним субстратом для продукування рекомбінантних

ЗРМУ-вакцин.

З-ЗРМУ-246 аналізували на експресію антигену, специфічного для котячого СО8О з використанням процедури, описаної в розділі "Скринінг на експресію котячого СОВ8О (87-1) ії СО86 (87-2) в рекомбінантних ЗРМ, КРМ або 65 ЕНМ з використанням аналізів на утворення чорних бляшок". Було показано, що химерне антитіло проти

СТІ А-4/Рс людини специфічно реагує з бляшками 5-5Р-246 (що експресують котячий СО80) і не реагує з негативними контрольними бляшками 5-5РМ-001. Було показано, що всі бляшки 5-ЗРМ-246, що спостерігалися, реагують з химерним антитілом проти проти СТІ А-4/Ес людини, що вказує на те, що цей вірус стабільно експресує чужорідний ген котячого СЮОВ8О.

Для підтвердження експресії продукту генів дад/протеази Ре! М, оболонки Бе! М і котячого СОВ8О, клітини інфікували 5-5РУ-246, і зразки інфікованих клітинних лізатів піддавали електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН. Цей гель блотували й аналізували, як описано в розділі "Процедура Вестерн-блоттингу". 5-ВРМУ-246 являє собою рекомбінантний вірус віспи свиней, що експресує білки дад/протеази Ре! М і оболонки

БеМ, і може бути використаний як вакцина проти РеїМ-інфекцій у котів. 5-5РМ-246 може бути також 70 використаний для експресії білків дад/протеази і оболонки Ре! М.

Приклад 10

Додатковими прикладами рекомбінантного вірусу віспи свиней, який може бути використаний як вакцина проти інфікування вірусом імунодефіциту котів (ГРІМ), вірусом лейкозу котів (Ге! М) або вірусом котячого інфекційного перитоніту (РІР), є:

Рекомбінантний вірус віспи свиней, який експресує п'ять чужорідних генів. Ген епм РІМ знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу, ЕРІ, ген дад/протеази РІМ знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу ЕР2, ген Іас/7 Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу віспи свиней 15І, ген котячого СО8О знаходиться під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору

ГР2ЕР2, ген ціаА Е.соїї знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу ЕР2. Гени оболонки РІМ, дад/протеази РМ і Іас7 Е. соїї локалізовані в іншому не-основному інсерційному сайті РМ, що відрізняється від сайтів інсерції гена котячого СОВО і гена цідА Е.соїї.

Рекомбінантний вірус віспи свиней, який експресує п'ять чужорідних генів. Ген епм РІМ знаходиться під контролем раннього промотору поксвірусу, ЕРІ, ген дад/протеази ГРІМ знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу, ЕР2, ген Іас7 Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу віспи свиней сч дво 15, ген котячого СОВ86 знаходиться під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору ГР2ЕР, ген цідА

Е. соїї знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу ЕР2. Гени оболонки РМ, і) дад/протеази ГРІМ і Іас7 Е.соїї локалізовані в іншому не-основному інсерційному сайті РМ, що відрізняється від сайтів інсерції гена котячого СО86 і гена цідА Е. сої.

Рекомбінантний вірус віспи свиней експресує два чужорідних гени. Ген котячого СО86б знаходиться під со

Зо Контролем синтетичного пізнього/раннього промотору поксвірусу ГР2ЕР2; ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу ЕР2. Цей вірус використовується окремо або в - комбінації з іншими - рекомбінантними білками або вакциною. ї-

Іншими прикладами рекомбінантних свинячих поксвірусів, які використовуються для продукування вакцин проти захворювання, викликаного Ре! М, можуть служити віруси, аналогічні описаним вище, за винятком того, що о зв В НИХ Ген ЕМ був замінений на відповідні РеіІ М-специфічні гени. ї-

Іншими прикладами рекомбінантних вірусів віспи свиней, що використовуються" для одержання білків для застосування в якості вакцини для продукування та очищення поліклональних антитіл, є:

Рекомбінантний вірус віспи свиней, який експресує один чужорідний ген. Ген котячого СО80О, у якому відсутній трансмембранний домен, знаходиться під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору « поксвірусу ГР2ЕР2. Альтернативно, ген котячого СОВО, у якому відсутній трансмембранний домен, має гібридну пев) с гістидинову мітку біля карбокси-кінця для забезпечення очищення на нікелевій афінній колонці.

Рекомбінантний вірус віспи свиней, що експресує один чужорідний ген. Ген котячого СО28, у якому відсутній ;» трансмембранний домен, знаходиться під контролем синтетичного пізнього/ораннього промотору поксвірусу

ІГР2ЕР2.. Альтернативно, ген котячого СО28, у якому відсутній трансмембранний домен, має гібридну Пістидинову мітку біля карбокси-кінця для забезпечення очищення на нікелевій афінній колонці. -І Рекомбінантний вірус віспи свиней, що експресує один чужорідний ген. Ген котячого СО86, у якому відсутній трансмембранний домен, знаходиться під контролем синтетичного пізнього/ораннього промотору поксвірусу о ГР2ЕР2. Альтернативно, ген котячого СО86, у якому відсутній трансмембранний домен, має гібридну гістидинову -І мітку біля карбокси-кінця для забезпечення очищення на нікелевій афінній колонці.

Іншими прикладами рекомбінантних вірусів віспи свиней, у яких використовуються як СО8О, так і СО86, і які - можуть бути використані з метою одержання вакцини для лікування хвороб, викликаних вірусами РМ і геї, є: с Рекомбінантний вірус віспи свиней, що експресує п'ять чужорідних генів. Гени котячого СО86 і котячого СЮ 80 експресуються в біцистронному кластері під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору поксвірусу

І РІ, який ініціює транскрипцію СО 80 ії СО 8 6 і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5, що знаходиться між двома ов Відкритими рамками зчитування; ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору

ЕР2. Ген дад/протеази РІМ знаходиться під контролем промотору вірусу віспи свиней ОЇ, а ген Іас/ Е.сої

Ф) знаходиться під контролем синтетичного пізнього промотору поксвірусу ГРІ. Гени СО80/СО86 і цідА Е.соїї ка знаходяться в іншому і не-основному інсерційному сайті 5РМ, що відрізняється від сайтів інсерції гена дад/протеази РМ і гена Іас2 Е.соїї. во Рекомбінантний вірус віспи свиней, що експресує п'ять чужорідних генів. Гени котячого СО86 і котячого

СО8О0 експресуються в біцистронному кластері під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору поксвірусу І РІ, який ініціює транскрипцію СО8О ії СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5, що знаходиться між двома відкритими рамками зчитування; а ген Іас/ Е соїї знаходиться під контролем синтетичного пізнього промотору поксвірусу ГРІ. Ген оболонки РІМ знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору 65 поксвірусу ЕРІ. Ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем синтетичного пізнього промотору І Р1. Гени СО80/СО86 і ціаА Е.соїї локалізовані в іншому і не-основному інсерційному сайті ЗРМ, що відрізняється від сайтів інсерції гена дад/протеази ГРІМ і гена Іас/ Е.соїї.

Рекомбінантний вірус віспи свиней, що експресує шість чужорідних генів. Гени котячого СО86 і котячого СЮ 80 експресуються в біцистронному кластері під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору поксвірусу

ІРІ, який ініціює транскрипцію СО8О і СО86б і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5, що знаходиться між двома відкритими рамками зчитування; ген цідаА Е.соїї знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору

ЕР2. Ген дад/протеази ГРІМ знаходиться під контролем раннього промотору поксвірусу ЕР2. Ген оболонки РІМ знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу ЕРІ, а ген Іас/7 Е.соїї знаходиться під контролем конститутивного промотору поксвірусу 15І. Гени СО80/СО86 і ціаА Е.соїї вбудовують у сайт 5РУ, що 7/о Відрізняється від сайтів інсерції гена оболонки ЕМ, дад/протеази ЕРМ і Іас/ Е. сої.

Інші віруси віспи свиней, що використовуються як Геї М-вакцини для котів, можуть бути сконструйовані як описано вище з заміною генів ГРІМ на сумісні РеїЇ М-генні конструкції.

Приклад 11

Додатковими прикладами рекомбінантного вірусу віспи єнотів, який може бути використаний як вакцина /5 проти хвороб котів, що викликаються вірусом імунодефіциту котів (РІМ), вірусом лейкозу котів (Бе! М) або вірусом котячого інфекційного перитоніту (РІР), є:

Рекомбінантний вірус віспи єнотів, що експресує два чужорідних антигени. Ген котячого СЮО86 знаходиться під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору поксвірусу (ІР2ЕРЗ), а ген І ас Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу віспи єнотів 11.

Додатковими прикладами рекомбінантного вірусу віспи єнотів, який може бути використаний з метою одержання білків, що використовуються як вакцина або для продукування й очищення поліклональних антитіл, є:

Рекомбінантний вірус віспи єнотів, що експресує один чужорідний ген. Ген котячого СО8О, що не має трансмембранного домену, знаходиться під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору поксвірусу

ГР2ЕР2. Альтернативно, ген котячого СО8О, що не має трансмембранного домену, має гібридну гістидинову сч г мітку біля карбокси-кінця для очищення на нікелевій афінній колонці.

Рекомбінантний вірус віспи єнотів, що експресує один чужорідний ген. Ген котячого СО28, що не має і) трансмембранного домену, знаходиться під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору поксвірусу

ГР2ЕР2. Альтернативно, ген котячого СЮО28, що не має трансмембранного домену, має гібридну гістидинову мітку біля карбокси-кінця для очищення на нікелевій афінній колонці. со зо Рекомбінантний вірус віспи єнотів, що експресує один чужорідний ген. Ген котячого СО8б6, що не має трансмембранного домену, знаходиться під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору поксвірусу -

ГР2ЕР2. Альтернативно, ген котячого СО8б, що не має трансмембранного домену, має гібридну гістидинову М мітку біля карбокси-кінця для очищення на нікелевій афінній колонці.

Рекомбінантний вірус віспи єнотів, що експресує чотири чужорідних гени. Ген котячого СО86 і ген котячого ме)

СсОр80, що експресуються в біцистронному кластері, знаходяться під контролем синтетичного пізнього/раннього ї- промотору поксвірусу І Р2ЕР2, який ініціює транскрипцію СО8О і СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5, що знаходиться між двома відкритими рамками зчитування, які ініціюють трансляцію другого, нижчерозташованого гена СО80О; ген дад РІМ знаходиться під контролем промотору вірусу віспи свиней ОЇ; ген ціаА Е(К.сої знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу ЕР2. «

Рекомбінантний вірус віспи єнотів, що експресує чотири чужорідних гени. Ген котячого СО86 і ген котячого з с СсОр80, що експресуються в біцистронному кластері, знаходяться під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору поксвірусу І Р2ЕР2, який ініціює транскрипцію СО8О і СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5, що ;» знаходиться між двома відкритими рамками зчитування та ініціює трансляцію другого нижчерозташованого гена сСОр80; ген оболонки ГРІМ знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу Е1; ген цдаА

Е.соїї знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу Е2. -І Рекомбінантний вірус віспи єнотів, що експресує п'ять чужорідних генів. Гени котячого СО86 і котячого

СО8О0 експресуються в біцистронному кластері під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору о поксвірусу І Р2ЕР, який ініціює транскрипцію СО8О і СО86, і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5, що знаходиться між -І двома відкритими рамками зчитування та ініціює трансляцію другого нижчерозташованого гена СОВ8О; ген дад 5ор РЕМ знаходиться під контролем промотору вірусу віспи свиней ОЇ; ген оболонки РІМ знаходиться під контролем - синтетичного раннього промотору поксвірусу Ет7; ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем синтетичного с раннього промотору поксвірусу Е2.

Додатковими прикладами рекомбінантного вірусу віспи єнотів, який може бути використаний як вакцина проти хвороб котів, що викликаються вірусом імунодефіциту котів (РІМ), вірусом лейкозу котів (Бе! М) або ов Вірусом котячого інфекційного перитоніту (РІР), є:

Рекомбінантний вірус віспи єнотів, що експресує два чужорідних гени. "Ген котячого СЮО86 знаходиться під

Ф) контролем синтетичного пізньогоздраннього промотору ГР2ЕР2, ген Іас2 Е.соїї знаходиться під контролем ка синтетичного пізнього промотору поксвірусу І Р1.

Іншими прикладами рекомбінантних вірусів віспи єнотів, у яких використовуються як СО80О, так і СО86, і які бо Можуть бути використані з метою одержання вакцини для лікування хвороб, що викликаються вірусами ГРІМ і ем, є:

Рекомбінантний вірус віспи єнотів, що експресує чотири чужорідних гени. Ген котячого СО86 і ген котячого срво, що експресуються в біцистронному кластері, знаходяться під контролем синтетичного пізнього промотору поксвірусу І РІ, який ініціює транскрипцію СО8О ії СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5, що знаходиться між 65 двома відкритими рамками зчитування. Ген дад/протеази РІМ знаходиться під контролем синтетичного пізньогозраннього промотору поксвірусу ГР2ЕР2; ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу ЕР2. Гени СО80/СО86, дад/протеази БІМ і ційдА вбудовували в єдиний не-основний сайт КРУ.

Рекомбінантний вірус віспи єнотів, що експресує 4 чужорідних гени. Ген котячого СО86 і ген котячого СОВ8О, що експресуються в біцистронному кластері, знаходяться під контролем синтетичного пізнього/раннього промотору поксвірусу І Р2, який ініціює транскрипцію СО8О і СО8б і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5, що знаходиться між двома відкритими рамками зчитування; ген Іас7 Е.соїї знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу Е1; ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу Е2. Гени СО8О/СО86, оболонки ГРІМ і цідА вбудовували в єдиний не-основний КРМ-сайт. 70 Рекомбінантний вірус віспи єнотів, що експресує шість чужорідних генів. Гени котячого СО86 і гени котячого СО8О експресуються в біцистронному кластері під контролем синтетичного пізнього промотору поксвірусу І Р1, який ініціює транскрипцію СО80О і СО86 і включає елемент ЕМСМІКІ5, що знаходиться між двома відкритими рамками зчитування; ген Іас/7 Е.соїї знаходиться під контролем пізнього промотору поксвірусу. Ген дад/протеази РІМ знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору ЕР2; ген оболонки РМ /5 Знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу ЕР2; ген оболонки РІМ знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу ЕРІ; ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем. Гени

Іас7 Е.соїї вбудовували в сайт, що відрізняється від сайтів інсерції гена оболонки ГРІМ, дад/протеази ЕМ і ціаА Е.соїї.

Інші рекомбінантні віруси віспи єнотів для використання як Ре! М-вакцини для котів, можуть бути сконструйовані як описано вище із заміною генів РІМ на сумісні гени Бе М.

Приклад 12 5-ЕНМ-020

З-ЕНМ-020 являє собою рекомбінантний вірус герпесу котів, що має делецію цілого гена ЗСЕ ЕНМ (1638 п.о.) і вставку гена Іас/7 Е.соїї у сайті делетованого ЗЕ. Ген Іас7 Е.соїї знаходиться під транскрипційним контролем сч ов Конститутивного промотору 9Е ЕНУ.

З-ЕНМ-020 одержували з 5-ЕНМ-001 (штам ММУЗІ). Це було здійснено з використанням гомологічного вектора і) 486-88.817 і вірусу 5-ЕНМ-001, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРМ, 5РМ або ЕНМ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус КРМ, РМ або ЕНМ, що експресує В-галактозидазу (аналізи ВІ ШОСАЇ і СРКО) со зо або В-глюкуронідазу (аналіз Х-СІ ОС)". У результаті очищення синіх бляшок одержували рекомбінантний вірус, позначений 5-Б0М-020. Після 5 пересівань проводили аналіз на чистоту і стабільність вставки за допомогою -- детекції В-галактозидази, як описано в розділі "Скринінг на експресію чужорідного гена в рекомбінантному КРУ, М

ЗРМ або ЕНМ з використанням аналізів на утворення чорних бляшок".

Приклад 13 5-ЕНМ-031 ме)

З-ЕНМ-031 являє собою рекомбінантний вірус герпесу котів, який має делецію цілого гена ЗЕ ЕНМ у 1638 пар ї- основ і вставку трьох чужорідних генів у сайті делетованого СЕ. Ген СО8О знаходиться під транскрипційним контролем конститутивного промотору ЗЕ ЕНМ і орієнтований у тому ж напрямку, що і делегований ген 9Е. Ген дад/протеази ЕРІМ знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу 9Х, а ген оболонки ГРІМ знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу. Гени дад/протеази й оболонки орієнтовані в тому « самому напрямку, але мають протилежну орієнтацію стосовно гена СОВ8О. шщ с З-ЕНМ-031 одержували з 5З-ЕНМ-020 (який містить ген Іас/7 Е.соїї, що знаходиться за промотором 9Е). Це було й здійснено з використанням гомологічного вектора 942-03.С6 (див. "Матеріали і методи") і вірусу З-ЕНМ-020, як «» описано в розділі "Гомологічна рекомбінація КРУ, РМ або ЕНУ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантні віруси КРМ, ЗРМ або ЕНМУ, які експресують В-галактозидазу (аналізи ВІООСАГАМО і СРКО) або В-глюкуронідазу (аналіз Х-5Г ОС)". Рекомбінантні бляшки відбирали й -І очищали шляхом відбору білих бляшок. Цей вірус характеризували шляхом картування рестриктуючою ендонуклеазою і проведення процедури Саузерн-блоттингу ДНК. Цей аналіз підтвердив вставку генів котячого о СО80, дад/протеази ГРІМ і оболонки РМ і делецію в 1638 пар основ гена ЗЕ ЕМ. (Міжнародна заявка РСТ МО -І 96/13575, що вводиться в даний опис за допомогою посилання).

У даному прикладі 5-ЕНМ-031 аналізували на експресію антигенів, специфічних до котячого СО80, - дад/протеази РІМ і до оболонки ГРІМ, з використанням процедури Вестерн-блоттингу. Описані тут аналізи со здійснювали на клітинах СКЕК, що вказувало на те, що клітини СКЕК можуть служити придатним субстратом для продукування рекомбінантних ЕНМ-вакцин. Лізат клітин, інфікованих рекомбінантним котячим вірусом герпесу, виявлявсмугу очікуваного розміру білка котячого СЮО8О, дад/протеази РМ і оболонки РМ.

У даному прикладі 5-ЕНМ-031 аналізували на експресію антигенів, специфічних для котячого СО8О з використанням процедури, описаної в розділі "Скринінг на експресію котячого СО8О (87-1) і СО86 (87-2) у іФ) рекомбінантних ЗРМ, КРМ або ЕНМ з використанням аналізів на утворення чорних бляшок". Було показано, що ко химерне антитіло проти СТІ А-4/Ес людини специфічно реагує з бляшками рекомбінантного вірусу герпесу котів (який експресує котячий СОВ8О) і не реагує з негативними контрольними бляшками 5-ЕНМ-001. Було показано, що бо всі бляшки рекомбінантного вірусу герпесу котів, що спостерігаються, реагували з химерним антитілом проти

СТІ А-4/Рс людини, що вказує на те, що цей вірус стабільно експресує чужорідний ген котячого СО8О.

З-ЕНМ-031 являє собою рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує білки дад/протеази РМ, оболонки

ЕМ Її котячого СОВО, і може бути використаний як вакцина проти РІМ-інфекцій у котів.

Приклад 14 65 Рекомбінантний вірус герпесу котів має делецію гена ЗЕ і вставку принаймні одного чужорідного гена в сайті делетованого ЗЕ. Чужорідний ген являє собою ген котячого СО86 і знаходиться під транскрипційним контролем промотору ЗЕ ЕНМ.

Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує котячий СО86, може бути використаний в якості вакцини проти хвороб у котів. Цей рекомбінантний вірус герпесу котів, при його використанні окремо або в комбінації

З, ЕЇМ-, ге М-, РІР-вакцинами або з іншими котячими вакцинами, сприяє підвищенню ефективності вакцин проти хвороб, що викликаються ГРІМ, Ре! М, РІР, або інших хвороб котів.

Приклад 15

Додатковими прикладами рекомбінантного вірусу герпесу котів, який може бути використаний як вакцина проти вірусу імунодефіциту котів (РМ), вірусу лейкозу котів (Ре! М) або інфекційного перитоніту у котів (РІР), є: 70 Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує три чужорідних гени в сайтах делетованого гена ЗЕ ЕНУМ.

Ген оболонки Ре М знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу 9Х, ген дад РІМ знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; ген котячого СО 80 знаходиться під контролем промотору вірусу герпесу котів ЗЕ. Рекомбінантний вірус герпесу котів експресує три чужорідних гени в сайті делетованого гена ЗЕ ЕНМ. Ген епм Ре! М знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу оЯХ, ген дад РІМ 7/5 знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; ген котячого СО86 знаходиться під контролем промотору вірусу герпесу котів ЗЕ. Рекомбінацтний вірус герпесу котів експресує три чужорідних гени в сайті делетованого гена ЗЕ ЕНУ. Ген епм Ре! М знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу ОХ, ген дад Ре/ М знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; ген котячого СО 8 6 знаходиться під контролем промотору вірусу герпесу котів 9Е.

Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує п'ять чужорідних генів. Гени котячого СО8б6 і ген котячого СО8О оекспресуються в біцистронному кластері під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, який ініціює транскрипцію СО8О і СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5, що знаходиться між двома відкритими рамками зчитування; ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу інфекційного ларинготрахеїту 9. Гени СО80/СО86 і цідА Е.соїї вбудовані в унікальну довгу ділянку геному ЕНМ у сайті, сч ов визначеному як не-основний. Ген дад/протеази ГРІМ, що знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; і ген Іас7 Е.соїї, що знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу ОХ, вбудовані в і) сайт делетованого ЗЕ ЕНУМ.

Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує п'ять чужорідних антигенів. Гени котячого СО86 і ген котячого СО8О оекспресуються в біцистронному кластері під контролем передраннього промотору со

Зо цитомегаловірусу, який ініціює транскрипцію СО8О і СО86 і трансляцію другої нижчерозташованої відкритої рамки зчитування СО80О, що знаходиться під контролем елемента ЕМСМ ІКЕ5. Ген цідА Е.соїї знаходиться під - контролем промотору вірусу інфекційного ларинготрахеїту до. Гени СО80, СО86 і цідА Е.соїї вбудовані в М унікальну довгу ділянку геному ЕНМ у сайті, визначеному як не-основний. Ген оболонки ГРІМ, що знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; і ген Іас2 Е.соїї, що знаходиться під контролем ме) зв промотору псевдорабівірусу ОХ, вбудовані в сайт делетованого ЗЕ ЕНУМ. ї-

Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує шість чужорідних генів. Ген котячого СО86 і ген котячого

СОр8о експресуються в біцистронному кластері під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, що ініціює транскрипцію СО8О ії СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕЗ між двома відкритими рамками зчитування. Ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу інфекційного ларинготрахеїту ді. Гени СО8О, СО86 і «

ЧідА Е.сої вбудовані в унікальну довгу ділянку геному ЕНМ у не-основному сайті. Ген оболонки ГРІМ, що з с знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, ген дад/протеази ГРІМ, що знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу ОХ, і ген Іас/ Е.соїї, що знаходиться під контролем промотору ЗЕ з ЕНМУ, вбудовані в сайт делетованого ЗЕ ЕНМ.

Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує п'ять чужорідних генів. Гени котячого СО86 і котячого СО80 експресуються в біцистронному кластері під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, який -І ініціює транскрипцію СОВ8О і СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5 між двома відкритими рамками зчитування; ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу інфекційного ларинготрахеїту ді. Гени СО8О, СО86 і о цідА Е.соїї вбудовані в унікальну довгу ділянку геному ЕНМ у не-основному сайті. Ген дад/протеази Ре М, що -І знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, і ген Іас7 Е.соїї, що знаходиться під 5р Контролем промотору псевдорабівірусу оХ, вбудовані в сайт делетованого ЗЕ ЕНМ. - Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує п'ять чужорідних генів. Ген котячого СО86 і ген котячого с СсрВо експресуються в біцистронному кластері під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, який ініціює транскрипцію СО8О ії СО86 і трансляцію другої нижчерозташованої відкритої рамки зчитування СО8О, що знаходиться під контролем елемента ЕМСМ ІКЕ5. Ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу інфекційного ларинготрахеїту ді. Гени СО80, СО86 і цідА Е.соїї вбудовані в унікальну ділянку геному ЕНМ у не-основному сайті. Ген оболонки Беі/М, що знаходиться під контролем передраннього промотору

Ф) цитомегаловірусу, і ген Іас7 Е.соїї, що знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу ОХ, вбудовані в ка сайт делетованого ЗЕ ЕНУМ.

Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує шість чужорідних генів. Гени котячого СО86 і котячого бо СО80 експресуються в біцистронному кластері під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, який ініціює транскрипцію СО8О ії СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕЗ між двома відкритими рамками зчитування. Ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу інфекційного ларинготрахеїту ді. Гени СО80,СО86 і ціаА

Е.соїї вбудовані в унікальну довгу ділянку геному ЕНМ у не-основному сайті. Ген оболонки Ре! М, що знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, ген дад/протеази Ре/М, що знаходиться під 65 Контролем промотору псевдорабівірусу ОХ, і ген Іас/7 Е.соїї, що знаходиться під контролем промотору ЗЕ ЕНМ, вбудовані в сайт делетованого ЗЕ ЕНМ.

Приклад 17

Рекомбінантний вірус герпесу котів має делецію гена ЗЕ і вставку принаймні одного чужорідного гена, у сайті делеції ЗЕ. Чужорідний ген являє собою ген котячого СОВ8О і знаходиться під транскрипційним контролем промотору ОЕ ЕНУ.

Цей рекомбінантний вірус герпесу котів одержували з 5-ЕНМ-001 (штам ММ5І). Це було здійснено з використанням гомологічного вектора 926-76.07 (див. "Матеріали і методи") і вірусу 5-ЕНМ-001, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного вірусу герпесу". Вихідний матеріал для трансфекції скринували як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус герпесу, що /о експресує ферментні маркерні гени". Цей вірус характеризували шляхом картування рестриктуючою ендонуклеазою і проведення процедури Саузерн-блоттингу ДНК. Цей аналіз підтвердив вставку гена котячого

СО 80 і делецію в 1638 пар основ гена ЗЕ ЕНМ. (Міжнародна заявка РСТУУО 96/13575, яка вводиться в даний опис за допомогою посилання).

У даному прикладі рекомбінантний вірус герпесу котів аналізували на експресію антигенів, специфічних до 7/5 Котячого СОВО, як описано в розділі "Скринінг чорних бляшок на експресію чужорідного гена в рекомбінантному

ЕНУ". Описані тут аналізи здійснювали на клітинах СКЕК, що вказувало на те, що клітини СКЕК можуть служити придатним субстратом для продукування рекомбінантних КРУ-вакцин.

У даному прикладі рекомбінантний вірус герпесу котів аналізували на експресію антигенів, специфічних до котячого СО8О, з використанням процедури, описаної в розділі "Скринінг на експресію котячого СО8О (В7-1) і 2о СО86 (87-2) У рекомбінантних 5РМУ, КРМ або ЕНМ з використанням аналізів на утворення чорних бляшок". Було показано, що химерне антитіло проти СТІ А-4/Ес людини специфічно реагує з бляшками рекомбінантного вірусу герпесу котів (який експресує котячий СОВ80О) і не реагує з негативними контрольними бляшками 5-ЕНМ-001. Було показано, що всі бляшки рекомбінантного вірусу герпесу котів, що спостерігаються, реагували з химерним антитілом проти СТІ А-4/Ес людини, що вказує на те, що цей вірус стабільно експресує чужорідний ген котячого сч

СОВО.

Для підтвердження експресії продукту гена котячого СО80О, клітини інфікували рекомбінантним котячим і) вірусом герпесу даного прикладу, і зразки інфікованих клітинних лізатів піддавали електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН. Цей гель блотували та аналізували як описано в розділі "Процедура

Вестерн-блоттингу". Лізат клітин, інфікованих рекомбінантним котячим вірусом герпесу, виявлявсмугу со зо очікуваного розміру білка котячого СОВ8О.

Приклад 18 -

Рекомбінантний вірус герпесу котів має делецію д9Е-гена ЕНМ і вставку принаймні одного чужорідного гена в М сайті делеції ЗЕ. Цей чужорідний ген являє собою ген котячого СО86б і знаходиться під транскрипційним контролем промотору ЗЕ ЕНМ. ме)

Даний рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує котячий СО86, може бути використаний у якості ча вакцини проти хвороб у котів. Цей рекомбінантний вірус герпесу котів, при його використанні окремо або в комбінації з РІМ-, Бе! М-, РІР-вакцинами або з іншими котячими вакцинами сприяє підвищенню ефективності вакцин проти хвороб, що викликаються ГРІМ, Ре! М, РІР або інших хвороб котів.

Приклад 19 «

Додатковими прикладами рекомбінантного вірусу герпесу котів, що може бути використаний як вакцина проти пт») с вірусу імунодефіциту котів (РМ), вірусу лейкозу котів (Ре! М) або інфекційного перитоніту у котів (РІР), є:

Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує три чужорідних гени. Ген епм ГРІМ знаходиться під ;» контролем промотору псевдорабівірусу 9Х, ген дад ГРІМ знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; а ген котячого СО 80 знаходиться під контролем промотору вірусу герпесу котів 9Е.

Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує три чужорідних гени. Ген епм Ре! М знаходиться під -І контролем промотору псевдорабівірусу ОХ, ген дад Бе! М знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; а ген котячого СЮО8О знаходиться під контролем промотору вірусу герпесу котів 9Е. о Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує три чужорідних гени. Ген епм ГРІМ знаходиться під -І контролем промотору псевдорабівірусу 9Х, ген дад ГРІМ знаходиться під контролем передраннього промотору 5ор Читомегаловірусу; а ген котячого СО86 знаходиться під контролем промотору вірусу герпесу котів 9Е. - Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує три чужорідних гени. Ген епм Ре! М знаходиться під с контролем промотору псевдорабівірусу ОХ, ген дад Бе! М знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; а ген котячого СЮО86 знаходиться під контролем промотору вірусу герпесу котів 9Е.

Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує п'ять чужорідних генів. Гени котячого СО86 і котячого в СО80 експресуються в біцистронному кластері під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, який ініціює транскрипцію СО8О і СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕЗ між двома відкритими рамками зчитування, що

Ф) ініціює трансляцію другого нижчерозташованого гена СО80О; ген цідаА Е.соїї знаходиться під контролем промотору ка вірусу інфекційного ларинготрахеїту ді; ген дад РІМ знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; а ген Іас/ Е.соїї знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу ОХ. Ці п'ять бо чужорідних генів присутні у двох різних сайтах інсерції вірусу герпесу котів.

Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує п'ять чужорідних генів. Гени котячого СО86 і котячого

СсрВо експресуються в біцистронному кластері під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, який ініціює транскрипцію СО 80 і СО 8 6 і трансляцію другої нижчерозташованої відкритої рамки зчитування СО8О, що знаходиться під контролем елемента ЕМСМ ІКЕ5; ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу 65 інфекційного ларинготрахеїту ді; ген оболонки РІМ знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; ген Іас7 Е.соїї знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу Я9Х. Рекомбінантний вірус герпесу котів експресує шість чужорідних генів. Гени котячого СО86б і котячого СО8О експресуються в біцистронному кластері під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, який ініціює транскрипцію совВо і СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5 між двома відкритими рамками зчитування, що ініціює трансляцію

Другого нижчерозташованого гена СО80; ген ціаА Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу інфекційного ларинготрахеїту ді; ген дад ІМ знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; ген оболонки РІМ знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; а ген Іас7 Е.соїї знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу ОХ.

Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує п'ять чужорідних генів. Гени котячого СО 8 6 і котячого 7/0. СО 8 0 експресуються в біцистронному кластері під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, який ініціює транскрипцію СО8О і СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕЗ між двома відкритими рамками зчитування, що ініціює трансляцію другого нижчерозташованого гена СО80О; ген цідаА Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу інфекційного ларинготрахеїту ді; ген дад Бе М знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; а ген Іас/ Е.соїї знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу ОХ. Ці п'ять /5 чужорідних генів присутні в двох. різних сайтах інсерції вірусу герпесу котів.

Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує п'ять чужорідних генів. Ген котячого СО86 і ген котячого

СОр8о експресуються в біцистронному кластері під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, що ініціює транскрипцію СО8О ії СО86 і трансляцію другої нижчерозташованої відкритої рамки зчитування СО8О, що знаходиться під контролем елемента ЕМСМ ІКЕ5; ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу інфекційного ларинготрахеїту ді; ген оболонки Ре! М знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; а ген Іас7 Е. соїї знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу ЯХ.

Рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує шість чужорідних генів. Ген котячого СО86 і ген котячого

СсрВо експресуються в біцистронному кластері під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, який ініціює транскрипцію СО8О ї СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕЗ між двома відкритими рамками зчитування, що су ініціює трансляцію другого нижчерозташованого гена СОВ80О; ген цідА Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу інфекційного ларинготрахеїту ді; ген дад Бе М знаходиться під контролем передраннього промотору о цитомегаловірусу; ген оболонки Ре! М знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу; а ген Іас7 Е.соїї знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу ОХ.

Приклад 20 с

Характеризапія кКДНК і поліпептидів котячих СО8О (87-1УМТАМИО. СО86 ГВ7-21 СО28. СТІ А-4 ії СО8о0 (87-1)-Зупіго/8РАН: -

Виділена та очищена кДНК котячого СОВО (В7-1), що містить приблизно 941 нуклеотид, кодує відкриту рамку зчитування поліпептиду котячого СО80, що складається приблизно з 292 амінокислот, у нативній мембрано-асоційованій або зрілій формі, і має молекулярну масу близько 33485кДа, ізоелектричну точку близько і. 91, і загальний заряд при рН 7,0, рівний 10,24. Трансмембранний домен білка являє собою ділянку приблизно в че положеннях амінокислот 241-271.

Котячі СО8О-ТАМИ ії СО80-Зупіго/ЗРАН являють собою кДНК і поліпептиди, незалежно виділені з двох різних джерел, і їх ДНК- і амінокислотна послідовність дещо відрізняються. Джерелом мРНК СО80-ТАМИ служили котячі мононуклеарні клітини периферичної крові, стимульовані Соп А, а джерелом РНК СО80-5упіго/5РАН « спужили клітини селезінки котів, стимульовані СопА. Різниця в кДНК-послідовності між СО8О-ТАМИ і шщ с СО80-5упіго/ЗРАН полягає в заміні Т на С в нуклеотиді 351 і в заміні С на А в нуклеотиді 670. В й амінокислотній послідовності, заміна в нуклеотиді 351 є "мовчазною", а заміна в нуклеотиді 670 призводить до «» консервативної заміни нейтральних амінокислот, лейцину на ізолейцин, у положенні амінокислотного залишку 224.

Виділена й очищена кДНК котячого СО86 (87-2), яка містить приблизно 1176 нуклеотидів, кодує відкриту -і рамку зчитування поліпептиду котячого СО8б6, що складається приблизно з 320 амінокислот, у нативній мембрано-зв'язаній або зрілій формі, і має молекулярну масу близько 36394 кДа, ізоелектричну точку близько о 9,19, і загальний заряд при рН 7,0, рівний 11,27. -І Виділена й очищена кДНК котячого СО28, що містить приблизно 689 нуклеотидів, кодує відкриту рамку 5р Зчитування поліпептиду котячого СО28, що складається приблизно з 221 амінокислоти, у нативній - мембрано-зв'язаній або зрілій формі, і має молекулярну масу близько 25319кДа, ізоелектричну точку близько о 9,17 і загальний заряд при рН 7,0, рівний 9,58.

Виділена й очищена кДНК котячого СТІ А-4, що містить приблизно 749 нуклеотидів, кодує відкриту рамку зчитування поліпептиду котячого СТІ А-4, що складається приблизно з 223 амінокислот, у нативній Ммембрано-зв'язаній або зрілій формі, і має молекулярну масу близько 24381кДа, ізоелектричну точку близько 6,34 і загальний заряд при рН 7,0, рівний -0,99. іФ) Ко-експресія СО8О з ко-стимулюючими молекулами СО28 або СТІ А-4 і з пухлинним антигеном або з ко антигеном від патогенного мікроорганізму сприяє активації або посиленню активації Т-лімфоцитів, а більш конкретно, лімфоцитів ТПпе-І, і стимулює ріст клітин інших типів. Ко-експресія СО 80 з ко-стимулюючою бо молекулою СТІ А-4 сприяє супресії активації Т-лімфоцитів, а більш конкретно, лімфоцитів ТНе-І. Ко-експресія

СО86 з ко-слимулюючими молекулами СО28 або СТІ А-4 і з пухлинним антигеном або з антигеном від патогенного мікроорганізму сприяє активації або посиленню активації Т-лімфоцитів, а більш конкретно, лімфоцитів ТПе-ї, і стимулює ріст клітин інших типів. Ко-експресія СО86 з ко-стимулюючою молекулою СТІ А-4 сприяє супресії активації Т-лімфоцитів, а більш конкретно, лімфоцитів ТНе-1. б5 їдентичності їдентичності їдентичності їдентичності їдентичності їдентичності їдентичності

ДНК та гомологічної гомологічної гомологічної гомологічної гомологічної гомологічної амінокислотної |послідовності послідовності мишачої мишачої послідовності кроля (курячої послідовності |людини людини послідовності послідовності (ДнНКЮ/амінокислотної послідовності (ДНК-послідовності) | (амінокислотної (ДНК-послідовності) (амінокислотної |послідовності) (ДНнЮ/амінокислотної послідовності) послідовності) послідовності) зетайсво 00007018

Котчийсовв 72166111 011бия 111 т Котячийстьам! 88117918 1111111

Приклад 21

Використання котячих СОВО (87-1), СО86 (87-2), СО28 і СТІ А-4 у вакцинах

Для оцінки імуностимулюючої активності котячих СО8О, СО86, 2028 і СТІ А-4 у вакцинах проти хвороб котів 12 були проведені такі експерименти.

Котячі СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 вбудовували у вектори на основі рекомбінантного вірусу (що походить від вірусу герпесу котів, вірусу віспи свиней або вірусу віспи єнотів), які використовуються для експресії рекомбінантних білків у котів (див. Міжнародну заявку УУО 96/22363 або УМО 96/13575). Вектори на основі рекомбінантного вірусу, які експресують всі чотири імуностимулюючі молекули, або, альтернативно, які 20 експресують попарні комбінації СО8О і СО28, або СОВО і СТІ А-4, або СО86 і СО28, або СО86 і СТІ А-4, вводили перорально або внутрішньом'язово котам у віці 8 тижнів у дозі від ОД до 10,Омг на кг маси тіла, або в дозі, що складає приблизно 107-109 бляшкоутворюючих одиниць (б.у.о.) або, краще, в дозі, що складає приблизно 1056б.у.о. Субодиничну вакцину для ЕМ або Ге! М або вакцину на основі вірусного вектора для ЕМ або Бе! М ря (див. вище) вводили в мінімальній протективній дозі одночасно з імуностимулюючою вакциною, що містить см вектор на основі СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4. Через 3-4 тижні котам давали другу дозу цієї вакцини. Цих котів (о) піддавали зараженню вірулентним штамом РІМ (РРК або Реїаішта) або штамом Кіскага Бе! М (який вводили з метилпреднізолоном для супресії імунітету у котів) при рівні зараження, що відповідає стандартній дозі ОБОА, і регулярно спостерігали протягом 12 тижнів за розвитком віремії. Групу вакцинованих котів спостерігали аж до со 30 12 місяців у відношенні розвитку пухлин, що викликаються Ре! М. Частоту захворюваності у цих котів порівнювали з контрольною групою котів, яким не була введена вакцина, або з групою котів, яким була введена («-

ЕЇМ- або Ре М-вакцина без імуностимулюючих молекул. Результати цього контрольного зараження показали, що м у більш ніж 6095 котів, яким не була введена вакцина, і які були потім заражені Ре! М або РМ, спостерігалася персистентна віремія; 7595 котів, вакцинованих субодиничною РІМ- або Ре! М-вакциною, яких потім піддали со 35 контрольному зараженню, виявилися захищеними від віреміїї а коти, вакциновані субодиничною РГІМ- або м

ЕРе/ М-вакциною і вакциною, що містить комбінацію імуностимулюючих вакцин на основі СО80О-, СО86-, СО28- або

СТІ А-4-векторів, а потім піддані контрольному зараженню, були на 10095 захищені від віремії. Інші переважні аспекти додавання вакцини, що містить вектори на основі котячих СО8О, СО86, СО28 і СТІ А-4, давали 10090 захист від віремії і/або від утворення пухлин; сприяли більш тривалому імунітету (більше 1 року) і ранньому « 20 виробленню імунітету; або давали можливість проводити первинну вакцинацію котів з використанням лише з однієї дози замість двох доз, що рекомендуються в даний час усіма виробниками. Коти, вакциновані вакцинами, с що містять вектори на основі вірусів ЕМ або Ре! М, були значно більше захищені від зараження, ніж коти, :з» вакциновані субодиничною ЕМ- або Ре! М-вакциною. Коти, яким вводили вакцину, що містить вектори на. основі

ЕМ а.бо геї М, і вакцину, що містить комбінацію векторів на основі імуностимулюючих котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, і яких потім піддавали контрольному зараженню, були на 10095 захищені від віремії. Вакцинування -1 котів вакциною на основі РІМ- або Ре! М-вмісного вектора і вакциною, що містить комбінацію імуностимулюючих сорвго-, СО86-, СО28- або СТІ А-4-векторів, також давало додаткові результати переваги, описані вище. (95) В альтернативній процедурі котам у віці 8 тижнів внутрішньом'язово робили ін'єкцію 10Омкг плазміди, що -1 містить КДНК для молекул котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 у суміші з плазмідою, що містить кДНК для епу і дад ЕМ або епу і дад Ре! М або, альтернативно, котам внутрішньом'язово робили ін'єкцію 10Омкг плазміди, що -- містить КкКДНК, яка експресує попарні комбінації СО8О і СО28, або СОВО і СТІ А-4, або СО86 і СО28, або СО86 і со СТІ А-4 у парі з СО28 або СТІ А-4 у суміші з плазмідою, що містить кКДНК для епу і дад ГРІМ або епму і дад Геї М.

Контрольній групі котів не робили ін'єкції СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4. Котів піддавали зараженню вірулентними Бе/М або РІМ і спостерігали за ознаками захворювань, описаних вище. Результати цього експерименту з контрольного зараження показали, що коти, яким вводили кКДНК-вектор, що містить котячі СО8О, соре8б, сОр28 і СТІ А-4, і кКДНК-вектор, що містить гени РІМ або Ре М, виявляли 10095 захист від хвороби в

ГФ) порівнянні з котами, яким був уведений лише кДНК-вектор, що містить гени ГРІМ або гени РеїМ, і які виявляли г) 7595 захист від хвороби.

В альтернативній процедурі котам у віці 8 тижнів внутрішньом'язово робили ін'єкцію 0,1-100мкг очищених во молекул білка котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4, або, альтернативно, котам робили ін'єкцію попарних комбінацій СО8О і СО86 у парі з білками СО28 або СТІ А-4 з рекомбінантних кДНК-векторів, описаних вище, і внутрішньом'язово робили ін'єкцію 0,1-100мкг субодиничної вакцини, що містить епм і дад РІМ або епм і дад

ЕеіМ. Контрольній групі котів не робили ін'єкції СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4. Котів піддавали зараженню вірулентним штамом ГРІМ або штамом РеїМ, і регулярно спостерігали за розвитком хвороби. Результати цього б експерименту з контрольного зараження показали, що коти, яким вводили очищені молекули білка котячих СОВ8О, сОр86, С028 або СТІ А-4, і субодиничну вакцину, що містить ГРІМ або Ре М, виявляли значне зниження захворюваності в порівнянні з котами, яким була введена лише субодинична вакцина, що містить білки ГРІМ або гемМ.

Приклад 22

Використання котячих СО8О, СО86, СО28 або СТІ А-4 у якості профілактичної вакцини для захисту від хвороб

Котячі СЮО8О, СО86, СО28 і СТІ А-4 у рекомбінантних векторах на основі вірусу віспи свиней, рекомбінантних векторах на основі вірусу віспи єнотів, або рекомбінантних векторах на основі вірусу герпесу котів, при їхньому введенні, як описано в Прикладі 17, але без введення антигенів, що містяться в субодиничних або вірусних векторах і походять від патогенних мікроорганізмів, можуть бути використані для стимуляції імунітету 70 і ТНе-1-відповіді, завдяки якій виробляється протективна імунна відповідь при зараженні вірусними, паразитарними або бактеріальними патогенами. В альтернативній процедурі котячий СО8О або СО86 у комбінації з котячим СТІ А-4 у вірусних векторах, при їхньому введенні, як описано в Прикладі 3, може бути використаний для пригнічення імунної відповіді і для захисту від аутоімунних хвороб у котів.

Приклад 23

Використання котячих СО8О, СО86, СО28 і СТІ А-4 для інгібування і пригнічення росту пухлинних клітин

Пухлинні клітини котів трансфекували рекомбінантним вектором на основі вірусу віспи свиней, рекомбінантним вектором на основі вірусу віспи єнотів або рекомбінантним вектором на основі вірусу герпесу котів, що експресують котячий СО8О або СО86 у комбінації з СО28 або СТІ А-4. Потім котові повторно вводили трансфековані пухлинні клітини, і присутність СО8О, СО86, СО028 і СТІ А-4 на поверхні пухлинної клітини 2о викликала продукування значної імунної відповіді на трансфековані і не-трансфековані пухлинні клітини, що призводило, тим самим, до цитолізу локалізованих і метастатичних пухлинних клітин. В альтернативній процедурі вектори, що експресують котячий СО8О або СО86 у комбінації з СО28 або СТІ А-4, вводили ін'єкцією безпосередньо в пухлину кота, що призводило, тим самим, до вироблення значної імунної відповіді на пухлинні клітини і до цитолізу локалізованих і метастатичних пухлинних клітин. сч

Приклад 24

Використання котячих СО8О, СО86, СО28 і СТІ А-4 як терапевтичних засобів для лікування хвороб котів і)

Котячі СО8О, СО86, СО28 і СТІ А-4 у рекомбінантному векторі на основі вірусу віспи свиней, рекомбінантному векторі на основі вірусу віспи єнотів, або в рекомбінантному векторі на основі вірусу герпесу котів, при їхньому введенні, як описано в Прикладі 17, але без введення антигенів, що містяться в субодиничних або со зо Вірусних векторах і походять від патогенних мікроорганізмів, можуть бути використані для стимуляції імунітету з метою імунного кліренсу або зниження рівня патології захворювання. --

Підтвердження експериментальних даних: 5РМ 246 М

Безпека та ефективність вакцини на основі рекомбінантного вірусного вектора 5РМУ, що містить ген дад і оболонки Реї М і ген котячого СО 80 о

Конструювання рекомбінантного вірусу ЗРМ, ЗРМ 246, описано вище (в основній частині опису даної ї- первинної заявки). ЗРМ 246 містить п'ять чужорідних генів, включаючи гени, що кодують білки дад і оболонки ге М ії котячого СО8О, а також два маркерних гени, В-глюкуронідазу і В-галактозидазу. Експресію гена дад і оболонки Ре! М і СО80 у клітинах, інфікованих ЗРМ 246, підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу смуги, що представляють специфічні білки дад і оболонки Ре!/М, детектували за допомогою козячого « Пполіклонального антитіла проти Рем Р27 (Віодезідп, МЕ) Її моноклонального антитіла проти одр/0 Рем 3 с (Віодезідп, МЕ), відповідно. Очевидно, що білки дад і оболонки Ре! М посттрансляційно процесуються аналогічно нативним вірусним білкам. Аналіз на чистоту, експресію і стабільність проводили за допомогою аналізу на ;» утворення чорних бляшок з використанням антитіл, описаних вище. РМ 246 стабільно пересівався принаймні 5 разів. 10095 бляшок, генерованих із клітин, інфікованих 5РМ 246, були позитивними на білки дад і оболонки ГеїМ, В-галактозидазу і В-глюкуронідазу. -І Експресію котячого СО8О підтверджували у Вестерн-блот-аналізі з використанням поліклонального антитіла проти СО8О людини. Була виявлена велика кількістьсмуг розміром від ЗОкДа до бокДа, специфічних для котячого о СО80. Цісмуги представляли картину глікозилювання, що чергується, і множинного глікозилювання СО80О, -І експресованого і модифікованого в "контексті" РМ у клітинах Е5К-4.

ЗРМ 246 і контрольний вірус, ЗРМ 003, а також інші рекомбінантні віруси ЕНМ і РМ Ре М, що є кандидатами - на вакцину, були протестовані на їхню здатність забезпечувати захист котів від персистентної інфекції Ре! М. с Для цього 8-тижневих кошенят, 10 кошенят на групу, підшкірно вакцинували їмл 5РМУ 246, контрольного вірусу або інших рекомбінантних вірусів (у дозах, що становлять від 7х10 5б.у.о. на кота до 7х10'б.у.о. на кота). Котів вакцинували три рази через інтервали в З тижні. Після вакцинації котів піддавали контрольному ороназальному зараженню стандартним лабораторним штамом Бе! М Кіскага (1092 ТСІОво/мл/кота), після попередньої обробки ацетатом метилпреднізолону (Оеро-Меа гої). о Сироватку, взяту в цих котів, щотижня аналізували на персистентну віремію протягом 15 тижнів після іме) зараження. При тестуванні на персистентну віремію вважалося, що коти мають персистентну віремію, якщо в них безперервно протягом З тижнів виявлялася присутність р27 геіМ. 60 Результати:

Дослідження методом зараження Геї! М показали, що коти, вакциновані ЗРМ 246, були частково захищені від

Ее! М-віремії. Передбачене значення превентивної фракції (РЕ) для котів, оброблених РМ 246, складало 5090 (Таблиця 1). 65 Таблиця 1 превентивна фракція (РЕ)

Мо віремією віремією УС

БА ій іі НБН НИ НИ ШЕ (9Е-СОВО) о вмоесмутямаюнту я тжаств 0000000 " (9Е-СОВО)

Тому Ру вв вові кое морто ЕН ово оре 00601006 ов овемоовувнмоюю 77711166

Приклади додаткових рекомбінантних вірусів, що містять СО8О і СО86

ЗРМ 280

ЗРМ 280 являє собою рекомбінантний вірус віспи свиней, що експресує шість чужорідних генів. Гомологічний 2о вектор, позначений 992-23.6, конструювали в такий спосіб: гени котячого СО86 і котячого СО8О експресували в біцистронному ДНК-кластері під контролем синтетичного пізнього промотору поксвірусу ІР1, який ініціює транскрипцію СО 80 і СО 8 6 і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5 між двома відкритими рамками зчитування; ген

В-глюкуронідазм Е.соїї знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору ЕР2. РМ 280 одержували з

ЗРМ 258, що містить гени дад і оболонки Ре! М і В-галактозидази. БРМ 258 був попередньо сконструйований так, су 285 що він містив ген дад/протеази Ре/М і усічений ген оболонки Ре! М (д9р70) під контролем синтетичних ранніх/пізніх промоторів поксвірусу, ІР2ЕР2; ген В-галактозидази Е.сої знаходиться під контролем і) конститутивного промотору поксвірусу 15І і вбудований у делетований неповний 1869 п.о.-НіпаПІ-фрагмент М.

Гени СО80О/СО86 і В-глюкуронідази Е.соїї клонували в гомологічний вектор 992-23.6 в окремому і не-основному неповному НіпапПІ-фрагменті К 5РМ. ее

ЗРМ 280 одержували з РМ 258. Це було здійснено з використанням гомологічного вектора 992-23.6 і вірусу 5-ВРМУ-258, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРМ, --

ЗРМ або ЕНУ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний ч- вірус РУ, що експресує і. галактозидазу (аналізи В ШОСАЇ і СРКО) або В-глюкуронідазу (аналіз Х-ОІ СУ. У результаті багаторазових циклів очищення синіх/зелених бляшок одержували рекомбінантний вірус ЗРМ 280. о

ЗРМ 280 аналізували на експресію генів дад Ре! М, оболонки Ре! М і маркерних генів, генів В-галактозидази і ч-

В-глюкуронідази за допомогою аналізу на утворення чорних бляшок. З використанням козячого поліклонального антитіла проти дад Ре! М (Віодезідп, МЕ) і мишачого моноклонального антитіла проти білка оболонки адр70 Бе М (Віодезідп, МЕ) було визначено, що 10095 бляшок, генерованих із клітин Е5К-4, інфікованих очищеним 5РМ 280, « експресують ген дад і оболонки Ре! М.

Експресію котячого СО8О і СО86б підтверджували у Вестерн-блот-аналізі використовуючи козячі - с поліклональні антитіла проти СО8О і СО8б6 людини (КО Зувіетв, ММ), відповідно. Була виявлена велика а кількістьсмуг розміром від ЗОкДа до боОкДа, специфічних для котячого СОВ8О, і велика кількістьсмуг розміром від "» 4ОкДа до 7ОкДа, специфічних для котячого СО86б. Цісмуги давали картину глікозилювання, що чергується, і множинного глікозилювання СОВ8О і СО86, експресованих у "контексті" РМ у клітинах ЕБК-4.

ЗРМУ281 -і ЗРМ 281 являє собою рекомбінантний вірус віспи свиней, що експресує шість чужорідних генів. Гомологічний о вектор, позначений 992-23.6, конструювали, як описано вище для ЗРМ 280. ЗРМ 281 був отриманий з 5РМ 228, що містить гени дад/протеази й оболонки ГРІМ і В-галактозидази Е.соїї. Ген дад/протеази ГРІМ знаходиться під - І контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу ЕР2; ген оболонки РІМ знаходиться під контролем шу 20 синтетичного раннього промотору поксвірусу ЕРІ, ген В-галактозидази Е.соїї знаходиться під контролем конститутивного промотору поксвірусу 15І. Гени дад/протеази ГРІМ, оболонки РІМ і В-галактозидази Е.соїї були

ІЧ е) вбудовані в делегований неповний 1869 п.о.-НтаП-фрагмент М ЗРМУ. Гени СО80/СО86 і В-глюкуронідази Е.соїї були вбудовані в окремий і не-основний неповний НіпаПІ-фрагмент К ЗРУ.

ЗРМ 281 одержували з ЗРМ 228. Це було здійснено з використанням гомологічного вектора 992-23.6 і вірусу З-ЗРМУ-228, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРМ,

ЗРМ або ЕНУ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний о вірус ЗРМ, що експресує В-галактозидазу (аналізи ВІ ШОСАЇ і СРКО) або В-глюкуронідазу (аналіз Х-ОІ ОС) У іме) результаті багаторазових циклів очищення синіх/зелених бляшок одержували рекомбінантний вірус ЗРМ 281.

ЗРМ 281 аналізували на експресію генів Чад РІМ, оболонки ГРІМ, маркерних генів, генів В-галактозидази і бо В-глюкуронідази за допомогою аналізу на утворення чорних бляшок. З використанням мишачих моноклональних антитіл проти дад ГРІМ (р27) і оболонки ГРІМ (аріІОО) (Сивіот Мопосіопаі5, СА; Віодевідп Іпіегпайопаї!, МЕ, відповідно), мишачого моноклонального антитіла проти В-галактозидази і кролячого поліклонального антитіла проти В-глюкуронідази (Віодезідп, МЕ 4: МоіІесціаг Ргорез, ОК, відповідно) було визначено, що 10095 бляшок, генерованих із клітин Е5ЗК-4, інфікованих очищеним ЗРМ 280, експресують ген дад ГРІМ, оболонки ЕМ, 65 В-галактозидази і В-глюкуронідази.

Експресію котячого СО8О і СО86б підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу з використанням поліклонального антитіла проти СО8О ії СО86 людини (КО Зувіетв, ММ). Була виявлена велика кількістьсмуг розміром від ЗОкДа до бОкДа, специфічних для котячого СОВ8О, і велика кількістьсмуг розміром від 40кДа до 7ОкДа, специфічних для котячого СО86. Цісмуги представляли картину глікозилювання, що чергується, і

МНОожИННОГгО глікозилювання СО8О і СО86, експресованих у "контексті" РМ і клітинах Е5К-4. Експресію дад ЕМ і оболонки РІМ також підтверджували з використанням Вестерн-блот-аналізу з використанням антитіл, описаних вище. Білки дад РІМ і оболонки ГРІМ, очевидно, процесуються в Ра24 і др100, відповідно.

ЕНМ 043

ЕНМ 043 являє собою рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує п'ять чужорідних генів. Гомологічний /о Вектор, позначений 987-57.А1, конструювали в такий спосіб: гени котячого СО86 і котячого СО8О клонували в біцистронний кластер під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу (СММ ІЕ), який ініціює транскрипцію СО8О ії СО86б. Трансляція другої відкритої рамки зчитування нижчерозташованого СО8О знаходиться під контролем елемента ЕМСМ ІКЕ5. Ген В-глюкуронідази Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу інфекційного ларинготрахеїту ді. Гени СО80, СО86 і В-глюкуронідази Е.соїї вбудовували в 7/5 Унікальну довгу ділянку ЕНМ в унікальному ЕсокіІ-сайті, що походить від неповного Зайїй-фрагмента Н ЕНУ.

Інсерція була введена між геном д/ і суміжним геном активатора транскрипції.

ЕНМ 043 був отриманий з ЕНМ 017, що містить гени оболонки РІМ і В-галактозидази Е.соїї. Ген оболонки ЕЕМ знаходиться під контролем промотору ІЕЕ СМУМ, а ген В-галактозидази Е.соїї знаходиться під контролем промоторного елемента псевдорабівірусу ОХ. Ген оболонки РІМ і В-галактозидази Е. соїї були вбудовані в сайт делегованого 9Е 05 ЕНУМ.

ЕНМ 043 одержували з ЕНМ 017. Це було здійснено з використанням гомологічного вектора 987-51.А1 і вірусу

ЕНМ 017, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРМ, РМ або ЕНМУ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус ЗРМ, що експресує В-галактозидазу (аналізи ВІ ШОСАЇ і СРКО) або В-глюкуронідазу (аналіз Х-ОІ ОС) У сч ов результаті багаторазових циклів очищення синіх/зелених бляшок одержували рекомбінантний вірус ЕНМ 043.

ЕНМ 043 аналізували на експресію маркерних генів, гена В-галактозидази і гена В-глюжуронідази за і) допомогою аналізу на утворення чорних бляшок. З використанням мишачого моноклонального антитіла проти

В-галактозидази (Віодевідп, МЕ) і кролячого поліклонального антитіла проти В-глюкуронідази (МоіІесшіаг Ргобрев,

ОК) було визначено, що 10095 бляшок, генерованих із клітин СКЕК, інфікованих ЕНМ 043, очищеним методом со зо бляшок, експресують В-галактозидазу і В-глюкуронідазу. Було визначено, що цей вірус є стабільним після принаймні 5 пересівань. --

Експресію котячого СО8О і СО86б підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу з використанням М поліклональних антитіл проти СО8О і СО86 людини (КО Зузіетв, ММ). Була виявлена велика кількістьсмуг розміром від ЗОкДа до бОкДа, специфічних для котячого СОВ8О, і велика кількістьсмуг розміром від 40кДа до і) 7ОкДа, специфічних для котячого СО86б. Експресію гена оболонки РІМ (др130) підтверджували за допомогою ї-

Вестерн-блот-аналізу з використанням сироватки котів, що одужують, взятої від РІМ-інфікованих котів.

Гомологічний вектор 1015-18.8А (ГРІ-СЮО8бЛКЕЗ-СОВ80)

Цей гомологічний вектор 1015-18.8А використовували для створення рекомбінантних вірусів КРМ, що експресують СО8О і СО86. Для цього конструювали плазміду, що містить промотор проксвірусу ІГР 1, елемент «

КЕ5З ЕМСМ ї термінатор транскрипції Роїу А поксвірусу. Ген котячого СОВО піддавали ПЛР-ампліфікації з з с використанням праймерів 1/97.6 (5-ВСТАООАТССААТСТАТОТАСАСАСОСТОАСАТ-3) і 3/98.4 . (Е-Т-ТСВСАОБАТССООСТСАСОСАССАААОсТОО-3), кожний з який містив клонуючі ВатНІ-сайти. СО8О клонували и?» за промотором ГРІ. Ген котячого СО8б6 піддавали ПЛР-ампліфікації з використанням праймера 1/98.18 (Е-ТССАСААТТОСАТОООСАТТТОТОАСАС-3) з М'еІ-сайтом клонування і з використанням затупленого по

КінцяХ праймера 8/97.31 (З-СТОБАТССАСОАТССОоСАсСОоо-3). СО86 клонували за елементом ІКЕ5 ЕМСУ. -і Потім кластер рестриктували ферментом Мої! і клонували в НіпаП-фрагмент М КРМ вектора, що містить ген

В-галактозидази Е.соїї під контролем синтетичного пізнього промотору 151. Кінцевий гомологічний вектор о 1015-18.8А використовували для створення вірусів, що містять гени РІМ або Ре! М і гени СО8О і СО86, відповідно -І до процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРУ". 5-КРУ-045 - 5-КРМУ-045 являє собою рекомбінантний вірус віспи єнотів, що експресує три чужорідних гени. З-КРМУ-045 був со отриманий з вірусу віспи єнотів КРУ-000 (АТОС МкК-838). Це було здійснено з використанням гомологічного вектора 1015-18.8А і материнського вірусу 5-КРМ-000, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРМ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували на рекомбінант, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус ЗРМ, що експресує В-галактозидазу (аналізи ВІ ЮШОСАЇ. і скринінг на рекомбінантний КРМ, що експресує ферментні маркерні гени)". Вірус очищали іФ) методом бляшок і пересівали 5 разів. ко КРМ-045 аналізували на експресію В-галактозидази шляхом аналізу на утворення чорних бляшок. З використанням кролячого поліклонального антитіла (ІСМ, ОН) було визначено, що 10095 бляшок, генерованих із бо Клітин МЕКО, інфікованих очищеним КРУ-045, експресували В-галактозидазу.

Експресію котячого СОВ8О ії СО86 підтверджували у Вестерн-блот-аналізі, описаному у відповідному розділі, використовуючи козячі поліклональні антитіла проти СО8О ії СО86 людини (КО Зувзіетв, ММ), відповідно. Була виявлена велика кількістьсмуг розміром від ЗОкДа до бОкДа, специфічних для котячого СЮО80О, і велика кількістьсмуг розміром від 4ОкДа до 7ОкДа, специфічних для котячого СО8б. Цісмуги давали картину 65 глікозилювання, що чергується, і множинного глікозилювання СОВ80О і СО86, експресованих у "контексті" ЕРМ і в клітинах МЕКО.

5-КРУ-046

КРМ-046 являє собою вірус віспи єнотів, що експресує п'ять чужорідних генів. КРУ-046 був отриманий від вірусу віспи єнотів КРУ-036. Цю процедуру здійснювали з використанням гомологічного вектора 1015-18.8А і материнського вірусу КРМ-036, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРМ?". Вихідні матеріали для трансфекції скринували на рекомбінантний вірус, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус КРУ, що експресує В-галактозид азу (аналізи ВІ ШОСАЇ і скринінг на рекомбінантний КРМ, що експресує ферментні маркерні гени)". Вірус очищали методом бляшок і пересівали 5 разів. У результаті багаторазових циклів очищення синіх/зелених бляшок одержували рекомбінантний вірус ЕНМ 7/0 946. КРМ 046 містить ген дад РІМ під контролем синтетичного раннього/пізнього промотору поксвірусу ГР2ЕР; і ген В-глюкуронідази під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу ЕР2. Ці гени знаходяться в окремому і неосновному неповному НіпаїППІ-сайті Ш КРМ. Гени СОВ80 і СО86 і ген В-галактозидази знаходяться в унікальному й окремому не-основному неповному НіпаПІ-сайті М КРУ.

КРМУ-046 аналізували на експресію В-галактозидази і В-глюкуронідази шляхом аналізу на утворення чорних бляшок. Було визначено, що 10095 бляшок, генерованих із клітин МЕКО, інфікованих очищеним КРМУ-046, експресували В-галактозидазу і В-глюкуронідазу.

Експресію СО8О і СО86б підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу, описаного у відповідному розділі, з використанням козячих поліклональних антитіл проти СО8О і СО8б людини (КК «0 Бувіетв, ММ), відповідно. Була виявлена велика кількістьсмуг розміром від ЗОкДа до бОкДа, специфічних для котячого СОВО, і 2о Велика кількістьсмуг розміром від 40кКДа до 7ОкДа, специфічних для котячого СО86. Цісмуги представляли картину глікозилювання, що чергується, і множинного глікозилювання СОВ8О і СО86, експресованих у "контексті"

КРМ у клітинах МЕКО. Експресію дад/протеази РІМ також підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу з використанням мишачих моноклональних антитіл проти дазд РІМ (р27) (Сивіот Мопосіопаї!5, СА). 5-КРМУ-047 с

КРМ-047 являє собою вірус віспи єнотів, що експресує п'ять чужорідних генів. Був сконструйований, як описано вище, гомологічний вектор 1015-18.8А, який містить кластер І РІ-СО8бБЛКЕ5-СОВ80 і ген В-галактозидази (8)

Е.соїї під контролем синтетичного пізнього промотору (151) у НіпапП-фрагменті М. КРМУ-047 був отриманий від

КРМУ-044, що містить гени епм ГРІМ і В-глюкуронідази Е.соїї (В-дінсигопідазе) у Ніпап-фрагменті О КРУ. Ген епм РІМ знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору (ЕРІ). Ген В-глюкуронідази знаходиться під Фу

Зо Контролем синтетичного пізнього промотору (І-Р1).

КРМ-047 одержували з вірусу віспи єнотів КРМ 044. Це було здійснено з використанням гомологічного -- вектора 1015-18.18А і материнського вірусу КРУ-044 як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації М для генерування рекомбінантного КРМ". Вихідні матеріали для трансфекції скринували на рекомбінант як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус КРУ, що експресує В-галактозидазу (аналізи ВІ ШОСАЇ і ме) скринінг на рекомбінантний КРМ, що експресує ферментні маркерні гени)". Вірус очищали методом бляшок і ї- пересівали 5 разів. У результаті багаторазових циклів очищення синіх/зелених бляшок одержували рекомбінантний вірус ЕНМ 047.

КРМ-047 аналізували на експресію В-галактозидази шляхом аналізу на утворення чорних бляшок. З використанням поліклонального кролячого антитіла (ІСМ, ОН) було визначено, що 10095 бляшок, генерованих із «

Клітин МЕКО, інфікованих очищеним КРУ-047, експресують В-галактозидазу. з с Вестерн-аналіз, описаний у відповідному розділі, з використанням козячих поліклональних антитіл проти . сової 2086 людини (КО Зузіетв, ММ), проведений як описано в розділі "Процедура Вестерн-блоттингу", и? підтвердив експресію СО8О і СО86, відповідно. Була виявлена велика кількістьсмуг розміром від ЗОкДа до бокДа, специфічних для котячого СОВ8О, і велика кількістьсмуг розміром від 40кДа до 7ОкДа, специфічних для котячого

СО86. Цісмуги представляли картину глікозилювання, що чергується, і множинного глікозилювання СОВ8О ії СОВ6, -І експресованих у "контексті" КРМ у клітинах МЕКО. Експресію епм ГРІМ також підтверджували за допомогою

Вестерн-блот-аналізу з використанням мишачих моноклональних антитіл проти епм РІМ (др100) (Віобевідп і Іпіегпайопаї, МЕ). -І 5-КРУ-048

КРМ-048 являє собою вірус віспи єнотів, що експресує п'ять чужорідних генів. Був сконструйований, як - описано вище, гомологічний вектор 1015-18.8А, що містить кластер І Р1І-СО8бЛКЕ5-СОВ80 і ген В-галактозидази с Е.соїї під контролем синтетичного пізнього промотору (151) у НіпапПІ-фрагменті М. КРМУ-048 був отриманий з

КРМ-038, що містить гени дад/протеази Ре! М і В-глюкуронідази Е.сої у НіпаП-фрагменті О КРУ. Ген дад/протеази Ре/М знаходиться під контролем синтетичних пізнього/раннього промоторів (ІР2ЕР2). Ген дв В-глюкуронідази знаходиться під контролем синтетичного пізнього промотору (І.-Р 1).

КРМ 048 одержували з рекомбінантного вірусу віспи єнотів КРМ 038. Це було здійснено з використанням

Ф) гомологічного вектора 1015-18.18А і материнського вірусу КРУ-038 як описано в розділі "Процедура гомологічної ка рекомбінації для генерування рекомбінантного КРМ". Вихідні матеріали для трансфекції скринували на рекомбінантний вірус, як описано у розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус КРМ, що експресує бо В-галактозидазу (аналізи ВІ ООБАЇГ. і скринінг на рекомбінантний КРУ, що експресує ферментні маркерні гени)".

Вірус очищали методом бляшок і пересівали 5 разів. У результаті багаторазових циклів очищення синіх/зелених бляшок одержували рекомбінантний вірус ЕНМ 048.

КРМ-048 аналізували на експресію В-галактозидази шляхом аналізу на утворення чорних бляшок. З використанням поліклонального кролячого антитіла (ІСМ, ОН) було визначено, що 10095 бляшок, генерованих із 65 клітин МЕКО, інфікованих очищеним КРУ-046, експресували В-галактозидазу.

Експресію СО8О і СО86 підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу, проведеного як описано в розділі "Процедура Вестерн-блоттингу", з використанням козячих поліклональних антитіл проти СО80О і СО86 людини (КО бувіетв, ММ), відповідно. Була виявлена велика кількістьсмуг розміром від ЗОкДа до бокдДа, специфічних для котячого СОВ8О, і велика кількістьсмуг розміром від 40кДа до 7ОкДа, специфічних для котячого

СОв86. Цісмуги представляли картину глікозилювання, що чергується, і множинного глікозилювання СО8О і СО86, експресованих у "контексті" КРМ у клітинах МЕКО. Експресію дад/протеази Ре! М також підтверджували шляхом

Вестерн-блоттингу з використанням кролячих поліклональних антитіл проти дад Ре! М (р27) (Віобезідп

Іпіегпайопаї, МЕ). 5-КРМУ-052 70 КРМ-052 являє собою вірус віспи єнотів, що експресує шість чужорідних генів. Був сконструйований, як описано вище, гомологічний вектор 1015-18.8А, що містить кластер І Р1І-СО8бЛКЕ5-СОВ80 і ген В-галактозидази

Е.соїї під контролем синтетичного пізнього промотору (151) у НіпапПІ-фрагменті М. КРМ-052 був отриманий з

КРМ-030, що містить гени дад/протеази Ре! М, епм Ре! М і В-глюкуронідази Е.соїї у НіпапІ-фрагменті О КРУ. Ген дад/протеази Ре/М знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору (ЕР2). Ген епм Ре М /5 Знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору (ЕРІ). Ген В-глюкуронідази знаходиться під контролем синтетичного пізнього промотору (І Р1).

КРМ 052 одержували з вірусу віспи єнотів КРМ 030. Це було здійснено з використанням гомологічного вектора 1015-18.8А і материнського вірусу КРМУ-030, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРУ". Вихідні матеріали для трансфекції скринували на рекомбінантний вірус, 2о як описано у розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус КРУ, що експресує В-галактозидазу (аналізи ВІ ООБАЇ і скринінг на рекомбінантний КРМ, що експресує ферментні маркерні гени)". Вірус очищали методом бляшок і пересівали 5 разів. У результаті багаторазових циклів очищення синіх/зелених бляшок одержували рекомбінантний вірус ЕНМ 052.

КРМ-052 аналізували на експресію В-галактозидази, В-глюкуронідази, зад Бе! М і оболонки Бе М шляхом сч ов аналізу на утворення чорних бляшок. Експресію СО80 і СО8б підтверджували за допомогою

Вестерн-блот-аналізу, проведеного як описано в розділі "Процедура Вестерн-блоттингу", з використанням і) козячих поліклональних антитіл проти СО8О і СО8б людини (К 50 Зузвіетв, ММ), відповідно. Експресію дад/протеази Ре! М і оболонки Ре! М також підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу з використанням кролячих поліклональних антитіл проти дад Ре! М (р27) (Віобевідп Іпіегпакопа!, МЕ) Її мишачих моноклональних (ду зо антитіл проти епм РГе/ М (др100) (Віобезідп, МЕ). 5-КРМУ-0О53 -

КРМ-053 являє собою вірус віспи єнотів, що експресує шість чужорідних генів. Був сконструйований, як М описано вище, гомологічний вектор 1015-18.8А, що містить кластер І Р1І-СО8бЛКЕ5-СОВ80 і ген В-галактозидази

Е.соїї під контролем синтетичного пізнього промотору (151) у НіпапПІ-фрагменті М. КРМ-053 був отриманий з ме)

КРМУ-034, що містить гени дад/протеази РІМ, епм РІМ і В-глюкуронідази Е.соїї у НіпапПІ-фрагменті О КРУ. Ген ї- дад/протеази ГРІМ знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору (ЕР2). Ген епм ГРІМ знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору (ЕРІ). Ген В-глюкуронідази знаходиться під контролем синтетичного пізнього промотору (І Р1).

КРМ-053 одержували з вірусу віспи єнотів КРМ-034. Це було здійснено з використанням гомологічного « вектора 1015-18.8А і материнського вірусу КРУ-034, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації пт) с для генерування рекомбінантного КРУ". Вихідні матеріали для трансфекції скринували на рекомбінантний вірус, . як описано у розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус КРУ, що експресує В-галактозидазу (аналізи ВІ ООБАЇ і и?» скринінг на рекомбінантний КРМ, що експресує ферментні маркерні гени)". Вірус очищали методом бляшок і пересівали 5 разів. У результаті багаторазових циклів очищення синіх/зелених бляшок одержували рекомбінантний вірус ЕНМ 053. -І 5-ЗРМ 275 5-ЗРМ 275 являє собою рекомбінантний вірус віспи свиней, що експресує п'ять чужорідних генів. о Гомологічний вектор, позначений 992-23.6, конструювали в такий спосіб: гени котячих СО86б і СО80 були -І експресовані в біцистронному ДНК-кластері під контролем синтетичного пізнього промотору поксвірусу І Р1, який бор ніціює транскрипцію СО8О ї СО86 ї включає елемент ЕМСМ ІКЕЗ між двома відкритими рамками зчитування. Ген - В-глюкуронідази Е.соїї знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору поксвірусу ЕР2. Як с материнський вірус використовували 5-ЗРМ 046, що містить ген дад/протеази РІМ, який стимулюється синтетичним пізнім/раннім промотором поксвірусу І Р2ЕР, і ген В-галактозидази, що знаходиться під контролем конститутивного промотору поксвірусу ОЇ. Ген дад/протеази РМ і ген В-галактозидази вбудовували в неповний дво Ніпапі-фрагмент М ЗРУ, а гени СО86/СО80 і В-глюкуронідази вбудовували в неповний НіпаПІ-фрагмент К ЗРУ. 5-ВРМ 275 одержували з 5-5Р-046. Це було здійснено з використанням гомологічного вектора 992-23.6 і

Ф) вірусу 5-ЗРМ-046, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного ка ЗРУ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус

ЗРМ, що експресує В-глюкуронідазу (аналіз Х-5ІШ0С31. У результаті багаторазових циклів очищення бо Ззелених/синіх бляшок одержували рекомбінантний вірус ЗРМ 275.

З-ЗРМ 275 аналізували на експресію генів дад ГРІМ, маркерних генів і генів В-глюкуронідази за допомогою аналізу на утворення чорних бляшок. З використанням мишачого моноклонального антитіла проти дад РІМ (Сивіот Мопосіопаіз, СА) було визначено, що 10095 бляшок, генерованих у клітинах ЕЗК-4, інфікованих очищеним 5-5РМ 275, експресують ген дад ГРІМ і залишаються стабільним після 5 пересівань. 65 Експресію дад ГРІМ, СО86 ії СО80 підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу з використанням мишачого моноклонального антитіла проти дад ГРІМ, і з використанням козячих поліклональних антитіл проти сО86 і СО80 людини (КО Зувіетв, ММ) для котячих СО86б і СО80. Були виявлені дві окремісмуги розміром 5ОкДа і 27кДа, специфічні для дад ГРІМ. Була виявлена велика кількістьсмуг розміром від 4О0кДа до 7ОкДа, специфічних для котячого СО86б, а такожсмуги розміром від ЗОкДа до бОкДа, специфічні для котячого СЮО8О. 5-ЕНМ 040

З-ЕНМ 040 являє собою рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує п'ять чужорідних генів.

Гомологічний вектор, позначений 957-87.А1, конструювали в такий спосіб: гени котячих СО8б і СО8О0 експресували в біцистронному ДНК-кластері під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу (СММ

ІЄ), який ініціює транскрипцію СО8О і СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5, що знаходиться між двома відкритими /о рамками зчитування. Ген В-глюкуронідази Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу інфекційного ларинготрахеїту ді. Гени СО80О, СО86 і В-глюкуронідази Е.сої вбудовували в унікальну довгу ділянку ЕНМ в унікальному ЕсоКіІ-сайті, що походить від неповного Зайїй-фрагмента Н ЕНМ, між геном ад! і суміжним геном активатора транскрипції. Як материнський вірус використовували 5-ЕНМ-019, що містить ген дад БеїМ, стимульований ІЕ СМУ, і ген В-галактозидази Е.соїї, що знаходиться під контролем промоторного елемента псевдорабівірусу ОХ; обидва ці гени локалізовані в унікальному короткому сайті (05) делеції ЗЕ ЕНМ.

З-ЕНМ 040 одержували з 5-ЕНМ 019. Це було здійснено з використанням гомологічного вектора 987-57.А1 і вірусу З-ЕНМ 019, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного

ЕНУ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус

ЕНМ, що експресує В-глюкуронідазу (аналіз Х-5І ОС). У результаті багаторазових циклів очищення Ззелених/синіх бляшок одержували рекомбінантний вірус 5-ЕНМ 040.

З-ЕНМ 040 аналізували на експресію дад Ре! М, маркерних генів В-глюкуронідази і В-галактозидази за допомогою аналізу на утворення чорних бляшок. Було визначено, що 10095 бляшок, генерованих у клітинах

СКЕК, експресували В-глюкуронідазу і В-галактозидазу. Експресія дад Ре М була також підтверджена за допомогою аналізу на утворення чорних бляшок з використанням козячого поліклонального антитіла проти др27 с ов ГеїМ (Віодезідп, МЕ). Цей вірус виявляв стабільність після п'яти пересівань.

Експресію котячих СО8О і СО86 і дад Ре! М підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу. Для котячих і) сорв8о ї СО86 використовували козячі поліклональні антитіла проти СО8О і СО86 людини (КО БЗузіетв, ММ).

Була виявлена велика кількістьсмуг розміром від ЗОкДа до бОкДа, специфічних для котячого СО8О, ісмуги розміром від 40кДа до 7ОкДа, специфічні для котячого СО8б6. Експресію Ре! М підтверджували з використанням со

Зо козячого поліклонального антитіла проти др27 Ре! М (Віодезідп, МЕ). 5-ЕНМ 042 -

З-ЕНМ 042 являє собою рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує п'ять чужорідних генів. М

Гомологічний вектор, позначений 957-87.А1, конструювали в такий спосіб: гени котячих СО8О і СО86 експресували в біцистронному ДНК-кластері під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу (СММ ме)

ІЄ), який ініціює транскрипцію СО8О і СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5, що знаходиться між двома відкритими ї- рамками зчитування. Ген В-глюкуронідази Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу інфекційного ларинготрахеїту ді. Гени СО 80, СО 8 6 і В-глюкуронідази вбудовували в унікальну довгу ділянку ЕНМ в унікальному ЕсокКіІ-сайті, що походить від неповного Заї-фрагмента Н ЕНУ, між генами ад! і суміжними генами активатора транскрипції. Як материнський вірус використовували 5-ЕНМ-018, який містить ген оболонки РеїМ, « стимульований ІЕ СМУ, і ген В-галактозидази Е.соїї, що знаходиться під контролем промоторного елемента з с псевдорабівірусу ОХ; обидва ці гени локалізовані в унікальному короткому сайті (05) делеції ЗЕ ЕНМ. . З-ЕНМ 042 був отриманий з 5-ЕНМ 018. Це було здійснено з використанням гомологічного вектора 987-57.А1 і и?» вірусу З-ЕНМ 018, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного

ЕНУ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус

ЗРМ, що експресує В-глюкуронідазу (аналіз Х-5І( ОС). У результаті багаторазових циклів очищення -І зелених/синіх бляшок одержували рекомбінантний вірус 5-ЕНМ 042. 5-ЕНМ 042 аналізували на експресію епу геїМ, маркерних генів В-глюкуронідази і В-галактозидази за допомогою аналізу на утворення чорних бляшок. о Було визначено, що 10095 бляшок, генерованих у клітинах СКЕК, експресували В-глюкуронідазу і -І В-галактозидазу. Експресія епм Ре! М була також підтверджена за допомогою аналізу на утворення чорних бляшок з використанням мишачого моноклонального антитіла проти др70 Ре! М (Віодезідп, МЕ). Цей вірус був - стабільним після п'яти пересівань. с Експресію котячих СО8О і СО86 і епм Ре! М підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу. Для котячих сорв8о ї СО86 використовували козячі поліклональні антитіла проти СО8О і СО86 людини (КО БЗузіетв, ММ).

Була виявлена велика кількістьсмуг розміром від ЗОкДа до бОкДа, специфічних для котячого СО8О, ісмуг ов розміром від 40кДа до 7ОкДа, специфічних для котячого СО86. З використанням мишачого моноклонального антитіла проти др70 (Віодезідп, МЕ) була виявленасмуга 100кДа епум Ре М. іФ) 8-ЕНМ 044 ка З-ЕНМ 044 являє собою рекомбінантний вірус герпесу котів, що експресує п'ять чужорідних генів.

Гомологічний вектор, позначений 957-87.А1, конструювали в такий спосіб: гени котячого СОВ8О і котячого СО86б бо експресували в біцистронному ДНК-кластері під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу (СММ

ІЄ), який ініціює транскрипцію СО8О і СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕ5, що знаходиться між двома відкритими рамками зчитування. Ген В-глюкуронідази Е.соїї знаходиться під контролем промотору вірусу інфекційного ларинготрахеїту ді. Гени СО80, СО86 і В-глюкуронідази вбудовували в унікальну довгу ділянку ЕНМ в унікальному ЕсоКіІ-сайті, що походить від неповного Зайїй-фрагмента Н ЕНМ, між геном ад! і суміжним геном 65 активатора транскрипції. Як материнський вірус використовували 5-ЕНМ-016, який містить ген дад/протеази РМ, стимульований ІЕЕ СММ (з делецією у дев'ять амінокислот у 5-кінці гена протеази), і ген В-галактозид ази

Е.сої, який знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу 9Х; де обидва ці гени локалізовані в унікальному короткому сайті (05) делеції ЗЕ ЕНМ.

З-ЕНМ 044 був отриманий з 5-ЕНМ 016. Це було здійснено з використанням гомологічного вектора 987-57.А1 і вірусу З-ЕНМ 016, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного

ЕНУ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус

ЕНМ, що експресує В-глюкуронідазу (аналіз Х-5І ОС). У результаті багаторазових циклів очищення зелених/синіх бляшок одержували рекомбінантний вірус 5-ЕНМ 044. 5-ЕНМ 044 аналізували на експресію дад БМ і маркерних генів В-глюкуронідази і В-галактозидази за допомогою аналізу на утворення чорних бляшок. З 7/0 використанням мишачих моноклональних антитіл (Віодевідп, МЕ) було визначено, що 10095 бляшок, генерованих у клітинах СКЕК, експресували обидва маркерні гени. Експресія дад ГРІМ була також підтверджена за допомогою аналізу на утворення чорних бляшок з використанням мишачого моноклонального антитіла проти дад РМ (Сивіот Мопосіопа!5, СА). Цей вірус був стабільним після п'яти пересівань.

Експресію котячих СО8О і СО86 і епм Ре! М підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу. Для котячих 7/5 СО80 ї СО86 використовували козячі поліклональні антитіла проти СО8О ї СО86 людини. (К50 Зувіетз, ММ).

Була виявлена велика кількістьсмуг розміром від ЗОкДа до бОкДа, специфічних для котячого СО8О, ісмуг розміром від 4О0кДа до 7ОкДа, специфічних для котячого СЮО8б6. З використанням мишачого моноклонального антитіла проти дад ЕМ були виявлені дві окремісмуги розміром 5ОкДа і 27кДа, специфічні для дад ЕМ.

Таблиця 2

Рекомбінантні віруси ЗРУ, що містять гени, які кодують СОВО і/або СО86б або СО28

Вірус Опис вставок чужорідного гена Оцінка експресії за допомогою

Мо Вестерн-блот-аналізу або аналізу на утворення чорних бляшок

ЗРМ (|ЕР2-дад РІМ/ЕРІ-епу. РІМ/15І-і(ас Гомологічний вектор-926-45.А17 Материнський Ж Ж Ж Ге) 228 вірус-ЗРМ 001

ЗРМ261 ЕРО-дад БІМ/ЕРІі-епм./ ЕІМ/15І -Іасг/Л. 2Е2-СОВО/Е2-Ш1ОА. Гомологічний х х х х х вектор-931-21.АІ! Материнський вірус-ЗРМ 228

ЗРМ | Г2Е2-дадзгрІм/011-Іас/Л І-СО8бАКЕЗ-СО8О/Е2-ШІОА Гомологічний вектор-992-23.6 і Ж Ж Ж Ж Ж Ге зо 215 992.23.2 Материнський вірус-ЗРМ 046

ЗРМ | ІГ2Е2-дадге! М/. 2Е2-Ге МАТМепулЛ І-і(ас7 Гомологічний вектор-954-44.1 Ж Ж Ж ьо 258 Материнський вірус-ЗРМ 001 м

ЗРМ |ЕР2-ЕІМдад/ЕРІ-РІМепу/15Пас?/Л І-СОВбАКЕВ-СОВО/Е2-ШІОА Гомологічний х х х х х х 281 вектор-992-23.6 Материнський вірус-ЗРМ 228 со

ЗРМ (|ЕР2-Геі Мдад/БІі-ге Мо епм/15І-іас7/Л. 2Е2-СО8О/Е2-ШІОА / Гомологічний Ж Ж Ж Ж Ж

ЗБ 246 вектор-931-21.А 1 Материнський вірус-ЗРМ 224 у

ЗРМ | ІГ2Е2-Геі Маад/ І--ас/Л/ |. -СОВбЛКЕЗ-СОВ8О/Е2-ІОА Гомологічний вектор-992-23.6 Ж Ж Ж Ж Ж 216 Материнський вірус-ЗРМ 089

ЗРМ (|БЕІ-ГРеі Мепу/Л І-І(ас7/Л І-СОВбАКЕЗ-СО8О/Е2-ОІОА Гомологічний вектор-992-23.6 Ж Ж Ж Ж Ж 213 Материнський вірус-ЗРМ 195 « 20 ЗРМ | 2Е2-Реі Мдад/і 2Е2-Ееі МАТМепул І-аслг/Л І-СОВ6АКЕЗ-СОВО/Е2-ШІОА 0 Гомологічний) х х х х х -о 280 вектор-992-23.6 Материнський вірус-ЗРМУ258 с ЗРМ (|Е2-РеіІ Мдад/ЕІ-РеІ Мепм/15І-Іас7/Л І-СОВОЛКЕВ/СОВ86/9І-ІОА / Гомологічний Ж Ж Ж Ж Ж Ж "з 285 вектор-992-23.6 Материнський вірус-ЗРУ224 " ЗРМ | ГЕ-СОВОАТМ/НІБЗ/Е2-цідДА Гомологічний вектор-961-27.4 Материнський Ж Ж 270 вірус-ЗРМОО1

ЗРМ | ГЕ-СОВбАТМ/НІБЗ/Е2-ціад( 19-2) Гомологічний вектор-969-20.9 Материнський Ж Ж -І 272 |вірус-ЗРМ 001

ЗРМ273 І Е-СО28АТМ/НІВ/Е2-цідА Гомологічний вектор-930-91.2 Материнський вірус-ЗРУ к (95) 001 -І ЗРМ |ГЕ-СО86(Е УЕР2-ШІОА Гомологічний вектор 977-40.1 Материнський вірус-ЗРМ 001 Ж Ж 274 -й 20 ЗРМ |ГРІ-СОВбЛКЕЗ-СО8О/Е2-Ш1ОА Гомологічний вектор-992-23.6 Материнський Ж Ж Ж Ж Ж 282 вірус-ЗРМ 001 с

Таблиця З

Рекомбінантні віруси КРУ, що містять гени, які кодують СОВ8О і/або СО86 або СО28

Вірус Опис вставок чужорідного гена Оцінка експресії за допомогою

Ф) Мо Вестерн-блот-аналізу або аналізу на утворення чорних бляшок о в

КРМО46 (І 2Е2-РІМдад/Е2-ШІОА/Л Р. 1-СОВ6ЛКЕ8-СОВО/15І-Іас? / Гомологічний х х х х х 6о вектор-1015-18.8А Материнський вірус-КРМ 036

ВРМО47 |ЕІ-РІМепм/Е2-ШІОДА/Л РІ1-СОВ6ЛКЕ8-СОВО/15І-їас7 Гомологічний вектор-1015-18.8А х х х х

Материнський вірус-КРМ 037/04А

КРМО48 | 2Е2-Реї Маад/Е?2-ШОА/Л РІ-В7ТЛВЕВ-СОВО/15І-іас7 / Гомологічний х х х х х вектор-1015-18.8А Материнський вірус-КРМ ОЗ8 б5 -дА-

"М"-15І-І(ас2/ І-гесов8б/ЛкКЕВ/РеСОВ8О Гомологічний вектор-1015-18.8А

Материнський вірус-КРМ 030

І РІі-ціад/НЗ"М"-15І -гася// І-Бесорвб/ВКЕВ/БесоОВО Гомологічний вектор-1015-18.8А

Материнський вірус-КРМ 034

ВРУЮг» ОБО СОво вся Гомологчний векторсяяи Зо Матриновкий ввус-кР 00601011 ре знннонінннівонн БА БА НО НО БАН вірус-КРМ 000

Мо або аналізу на утворення чорних бляшок р 11111111111срво | совє сло ММ вол во пеня

ОА вектор-987-58.АІ! Материнський вірус-ЕНМ 016

Бі- і с 1 інки вини ни 047 вектор-994-68.4 Материнський вірус-ЕНМ 016

ШЕ іно нннівникн ШИ БІ НИ БА НБИ Б 048 |Материнський вірус-ЕНМ 017

Бас тс олія БИ БІ НИ БАНЯ БІ 042 вектор-987-57.А1ї Материнський вірус-ЕНМ 018

Бе с ет війн БИ БИ НИВІ БИ 040 |вектор-987-57.А1ї Материнський вірус-ЕНМ 019

Ши г с іній НИ БИ НИ БА БІБ Що вектор-994-68.4 Материнський вірус-ЕНМ 018

Бі хост зів ШИ БИ ШІ БІ НІЙ 050 |вектор-994-68.4 Материнський вірус-ЕНМ 019 т 111 030 вірус-ЕНМ 020 «-

Додаткові приклади створення ко-векторів. які включають котячі СО8О і СО86, і т.п., з неповними або рч- повнорозмірними геномами ГРІМ або Ре! М

Примітка: Рекомбінантні вірусні вектори, що містять СО8О, СО86, СТІ А-4 або СО28 у рекомбінантному вірусі о

З неповним або повнорозмірним геномним поліпептидом РІМ і/або Геї М, і з генами котячих 1І-12, рЗ5 і р40 або - без них. Ці рекомбінантні віруси можуть бути використані як вакцини проти хвороб, що викликаються РІМ і Ге М у котів. 1. Експресія котячих СО80, СО86, С028 і СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, у « рекомбінантному вірусі віспи свиней, що містить повний або неповний геном РМ. 2. Експресія котячих СО80, СО86, С028 і СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, у - с рекомбінантному котячому вірусі герпесу, що містить повний або неповний геном РМ. й З. Експресія котячих СО8О, СО86, СО028 і СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, У "» рекомбінантному вірусі віспи єнотів, що містить повний або неповний геном ГРІМ. 4. Експресія котячих СО80, СО86, С028 і СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, у 5 рекомбінантному вірусі віспи свиней, що містить повний або неповний геном Реї М. -І 5. Експресія котячих СО 80, СО 8 6, сС028 і СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, у рекомбінантному котячому вірусі герпесу, що містить повний або неповний геном Ре М. о б. Експресія котячих СО8О, СО86, СО028 і СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, У -І рекомбінантному вірусі віспи єнотів, що містить повний або неповний геном Ре М. цу 5 7. Експресія котячих СО8О, СО86, СО028 і СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, У рекомбінантному вірусі віспи свиней, що містить повний або неповний геном РМ і гени котячих 1-12, ЗМ-С5Е, (Че рзб і р40. 8. Експресія котячих СО8О, СО86, СО028 і СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, У рекомбінантному котячому вірусі герпесу, що містить повний або неповний геном ГРІМ і гени котячих 1-12, "ЗМ-С5РЕ, рз5 і р40. 9. Експресія котячих СО8О, СО86, СО028 і СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, У

Ф, рекомбінантному вірусі віспи єнотів, що містить повний або неповний геном РІМ і гени котячих 1-12, (ЗМ-С5Е, іме) рі і раб. 10. Експресія котячих СО8О, СО86, СО28 і СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, у бо рекомбінантному вірусі віспи свиней, що містить повний або неповний геном РеїЇМ і гени котячих 1-12, М-С5БЕ, рзб і р40. 11. Експресія котячих СО8О, СО86, СО28 і СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, у рекомбінантному котячому вірусі герпесу, що містить повний або неповний геном Реї!М і гени котячих 1І-12,

СМ-С5БЕ, рз5 і р40. 65 12. Експресія котячих СО8О, СО86, СО28 і СТІ А-4, узятих окремо або в будь-якій комбінації, у рекомбінантному вірусі віспи єнотів, що містить повний або неповний геном РеїМ і гени котячих 1-12, СМ-С5Е,

рзб і р40. або аналізу на утворення чорних бляшок 1111оово|(оовводо вк |вом (во, поши п о54 Материнський вірус-ЕНМ 030

ШЕ ек іван НО БА БІ БАБИН о55 Материнський вірус-ЕНМ 041 вектор-1005-95.1 Материнський вірус-КРМ 045 288 вектор-1007-70.А2 Материнський вірус-КРМ 045

Приклади

Гомологічний вектор 1007-70.А2 (5РМ М/СММ-геном ЕгУМУАЇ ТКУуїБбІ-Іас2М Гомологічний вектор 1007.70.А2 використовували для вбудовування чужорідної ДНК у інсерційний НіпапПі-сайт М ЗРУ. Він включає маркерний ген

В-галактозидази Е.сої і повнорозмірний геном РГІМ (8,5 т.п.о.) без фланкуючих елементів довгих кінцевих повторів (ІТК). Цей кластер був фланкований ДНК 5РУ, гомологічною не-основному сайту в НіпапПІ-фрагменті М

ЗРМ. З використанням цього гомологічного вектора відповідно до процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного РУ", одержували вірус, який містить ДНК, що кодує ці чужорідні гени. Слід зазначити, що маркерний ген В-галактозидази знаходиться під контролем конститутивного ря промотору поксвірусу 15, а геном РМ (АЇТК) знаходиться під контролем передраннього промотору см цитомегаловірусу (ІЕ СММ). Цей гомологічний вектор був сконструйований з використанням стандартної техніки (о) рекомбінантних ДНК (ЗатьгоокК еї аіІ.). Геном ГРІМ (АЇТК) синтезували шляхом клонування з використанням полімеразної ланцюгової реакції. Матрицею для ПЛР служила провірусна ДНК від плазміди, що містить повнорозмірний вірус РРК РМ. Зворотний праймер (5-АСОСОТСОАССАОСТААСААООСТАООАСАСАСТСТ-3 со 11/23.988МУУ/3) синтезувався з 5-кінця геному РІМ вище від (зад-кодуючої ділянки, і вводив унікальний

ЗаїІ-сайт. Прямий праймер (5-ТССАСТСОАСТТОТОАСАСТТСТТАСТССАТААСС-3" 11/11/988МУ.1) синтезувався ж з 3-кінця геному ГРІМ нижче другого Кеу-екзону і вводив унікальний Заїй-сайт. Кінцевий гомологічний вектор, м 1007.70.А2, використовували для створення рекомбінантних вірусів, що містять геном ГРІМ (без І ТК) і котячі сової СО86, або що містять геном ГРІМ (мінус ГТК) і гени котячих СО8О і СО86 і котячого 1І-12, рЗ35 і раб, (зе) відповідно до процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування м рекомбінантних 5РУ, КРМ і ЕНУ".

Гомологічний вектор 1005-95.1 (КРМ П/СММ-геном РІМТАЇТЕМІБІ-Іас7| Плазміду 1005-95.1 конструювали з метою вбудовування чужорідної ДНК у КРУ. Ця плазміда вводить геном-АЇ ТК РІМ і ген В-глюкуронідази Е.соїї, фланкований ДНК КРМ. Вище від цих чужорідних генів знаходився фрагмент ДНК КРУ, що складається « 20 приблизно з 906 пар основ. Нижче від цих чужорідних генів знаходився фрагмент ДНК КРУ, що складається з приблизно з 895 пар основ. З використанням плазміди відповідно до процедури, описаної в розділі "Процедура с гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРУ", одержували вірус, що містить ДНК, яка кодує :з» ці чужорідні гени. Слід зазначити, що геном-АЇТК РМ знаходиться під контролем передраннього промотору цитомегаловірусу, а ген В-глюкуронідази знаходиться під контролем синтетичного раннього промотору 15 поксвірусу ЕР2. Цей гомологічний вектор був сконструйований з використанням стандартної техніки -1 рекомбінантних ДНК (Затьгосок еї а.) шляхом приєднання рестрикційних фрагментів з нижченаведених джерел до синтетичних ДНК-послідовностей. Цей плазмідний вектор був отриманий з рестрикційного НіпапПІ-фрагмента (95) плазміди раРб4 (Рготеда), що має приблизно 2999 пар основ. Фрагмент 1 являє собою рестрикційний -1 Ніпапп-Храї-субфрагмент рестрикційного НіпапПІ-фрагмента 0 КРМ, що має приблизно 906 пар основ (Кпіоні еї аІ.). Фрагмент 2 являє собою 8,5 Т.п.о.-ЗаіІ-фрагмент геному ЕМ без елементів І ТК, і був синтезований шляхом - клонування за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Матрицею для ПЛР служила провірусна ДНК со від плазміди, що містить повнорозмірний вірус РРК ЕМ. Зворотний праймер (5-АСССОСТСОАССАССТААСААООТАООАСАСАСТСТ-3 11/23.988МУ/3) синтезувався з 5-кінця геному БМ вище від Сад-кодуючої ділянки, і вводив унікальний Заї-сайт. Прямий праймер (5--ССАСТСОАСТТОТОАСАСТТСТТАСТССАТААСС-3" 11/11/988МУ.1) синтезувався з 3-кінця геному ГРІМ нижче другого Кеу-екзону і вводив унікальний ЗаїЇ-сайт. Фрагмент З являє собою фрагмент розміром приблизно 2,0 т.

ГФ) п. о., що містить ген В-глюкуронідази Е.соїї. Фрагмент 4 являє собою рестрикційний НіпапІ-ХраІ-субфрагмент з рестрикційного НіпапП-фрагмента ОО КРМ, що має приблизно 895 пар основ. Кінцевий гомологічний вектор 1005.95.1 використовували для створення рекомбінантних вірусів, що містять геном РІМ (АГ ТК) і гени котячих во сової СО86, або для створення рекомбінантних вірусів, що містять геном (АГ! ТК) ГРІМ і гени котячих СО8О і СО86 і котячого ІІ-12, рЗ35 і р40, відповідно до процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантних ЗРМ, КРМ і ЕНМ".

Гомологічний вектор 1016-74.-А6 СЕНМАЯЕ/СММ-геном РІМ-АГТР/ЯХ-Іас7). Гомологічний вектор 1016-74.Аб6 конструювали для делетування частини 9Е-кодуючої ділянки вірусу герпесу котів і вбудовування чужорідної ДНК. б Він включає геном ГРІМ (мінус ГТК) і ген В-галактозидази Е.сої, фланкований ДНК ЕНМ. ТеномМ-АЇТК РМ знаходиться під контролем промотору цитомегаловірусу ІЕ, а ген В-галактозидази знаходиться під контролем -4в-

промотору псевдорабівірусу ЯХ. Він був сконструйований із зазначених ДНК-джерел з використанням стандартної техніки рекомбінантних ДНК (Затргоок еї аіІ.). Плазмідний вектор був отриманий з рестрикційного ендонуклеазного Азр7181-Азр7181-фрагмента плазміди реР18/19, що має приблизно 2958 пар основ. Фрагмент 1 являє собою Авр7181-5/та!І-субфрагмент Заїйї-фрагмента В ЕНУ, що має приблизно 1415 пар основ. Фрагмент 2 являє собою ЗаїІ-фрагмент (розміром приблизно 8,5 т.п.о.) геному ГРІМ без елементів І ТК і був синтезований шляхом клонування за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Матрицею для ПЛР служила провірусна ДНК від плазміди, що містить повнорозмірний вірус РРК ЕМ. Зворотний праймер (5-АСВССТСОАССАССТААСААООТАСОАСАСАСТСТ-3 11/23.988МУ.3) синтезувався з 5-кінця геному ГБІМ /у/о0 Вище від Сад-кодуючої ділянки, і вводив унікальний Заї-сайт. Прямий праймер (5--ССАСТСОАСТТОТОАСАСТТСТТАСТССАТААСС-3! 11/11/988МУ.1) синтезувався з 3-кінця геному ГРІМ нижче другого Кеу-екзону і вводив унікальний ЗаїЇ-сайт. Фрагмент З являє собою фрагмент гена В-галактозидази розміром приблизно 3,5 т.п.о. Фрагмент 4 являє собою ЗаїІ-Азр7181-субфрагмент ЕсоКІ-фрагмента Е ЕНМ, що має приблизно 2205 пар основ. Кінцевий гомологічний вектор 1016.74.А6 використовували для створення рекомбінантних вірусів, що містять геном (АЇТК) РІМ і гени котячих СО8О і СО86, або для створення рекомбінантних вірусів, що містять геном (А ТК) ГРІМ і гени котячих СО8О і СО86 і котячого 1-12, р35 і р40 відповідно до процедури, описаної в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантних 5РУ, КРМ і ЕНУ".

РМ 288

ЗРМ 288 являє собою рекомбінантний вірус віспи свиней, що експресує повнорозмірний комплемент ВРЗ, що містяться в геномі РМ, і чотири додаткових чужорідних гени. РМ 288 був отриманий з РМ 282. РМ 282 містить ген котячого СО86 і котячого СО8О, експресовані в біцистронному ДНК-кластері під контролем синтетичного пізнього промотору поксвірусу І Р1, який ініціює транскрипцію СО8О і СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕЗ між двома відкритими рамками зчитування; і ген В-глюкуронідази Е.соїї, що знаходиться під контролем синтетичного сч ов раннього промотору ЕР2 у геномному Ніпапі-фрагменті К ЗРУ. Гомологічний вектор 992-23.6 використовували для конструювання ЗРМ 282, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування і) рекомбінантних ЗРМ, КРМ і ЕНМ". Гени СО80 ії СО86 і ген В-глюкуронідази Е.сої вбудовували в окремий і не-основний неповний НіпапП-фрагмент К РМ. Геном СММУ-РІМ і гени В-галактозидази вбудовували в окремий і не-основний неповний НіпаПІ-фрагмент М ЗРУ. со зо ЗРМ 288 одержували з ЗРМ 282. Це було здійснено з використанням гомологічного вектора 1007-70.А2 (див.вище) і вірусу 5РМУ-282, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування -- рекомбінантного КРМ, 5РМ або ЕНМ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували, як описано в розділі М "Скринінг на рекомбінантний вірус ЗРМ, що експресує В-галактозидазу (аналізи ВІШОСАЇ і СРО) або

В-глюкуронідазу (аналіз Х-ЗІ 0С)3. У результаті багаторазових циклів очищення синіх/зелених бляшок ме) з5 одержували рекомбінантний вірус 5РМ 288. ча

ЗРМ 288 аналізували на експресію гена дад Ре! М, гена оболонки Бе! М з геному РІМ і маркерних генів

В-галактозидази і В-глюкуронідази за допомогою аналізу на утворення чорних бляшок. З використанням козячого поліклонального антитіла проти дад Ре! М (Віобезідп, МЕ) і мишачого моноклонального антитіла проти оболонки

ЕеІМ, др70 (Віобезідп, МЕ), було визначено, що 10095 бляшок, генерованих у клітинах ЕЗК-4, інфікованих « очищеним ЗРМ 280, експресували ген дад РеїЇМ і ген оболонки РеїіМ. з с Експресію котячих СО8О і СО86 підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу з використанням козячих . поліклональних антитіл проти СО8О і СО86 людини (КО Зузіетв, ММ), відповідно. Була виявлена велика и?» кількістьсмуг розміром від ЗОкДа до боОкДа, специфічних для котячого СОВ8О, і велика кількістьсмуг розміром від 4ОкДа до 7ОкДа, специфічних для котячого СО86. Ці смуги представляли картину глікозилювання, що чергується, | множинного глікозилювання СОВО ії СО86, експресованих у "контексті" ЗРМ у клітинах ЕЗК-4. Експресію білків, -І кодованих у геномі ЕРІМ, підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу з використанням котячої сироватки від ГІМ-інфікованих котів. о ЕНМ 054 -І ЕНМ 054 являє собою рекомбінантний вірус герпесу котів, який експресує повнорозмірний комплемент ВРЗ, 5о що містяться в геномі ГРІМ, і 2 додаткових чужорідних гени. Гомологічний вектор, позначений 1016-75.81 - конструювали з метою вбудовування геному (А! ТК) РМ і гена В-галактозидази в унікальний довгий неповний с Заї-фрагмент Н ЕНМ. Вставку вбудовували між геном ад і суміжним геном активатора транскрипції. Геном РІМ знаходиться під контролем промотору ІЕЕ СМУМ, а ген В-галактозидази Е.соїї знаходиться під контролем промоторного елемента псевдорабівірусу ОХ.

ЕНМ 054 був отриманий з ЕНМ 30, що містить ген котячого СО8О у сайті делетованого ЗЕ ЕНМ. Це було здійснено з використанням гомологічного вектора 1016-75.81 і вірусу ЕНМ 030, як описано в розділі "Процедура

Ф) гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРМ, 5РМ або ЕНМ". Вихідний матеріал для ка трансфекції скринували, як описано в розділі "Методи скринінгу на рекомбінантний вірус ЕНМ, що експресує

В-галактозидазу (аналізи ВІ ШОСАЇ і СРС) або В-глюкуронідазу (аналіз Х-І ОС)". У результаті багаторазових бо циклів очищення синіх/зелених бляшок одержували рекомбінантний вірус ЕНМ 054.

ЕНМ 054 аналізували на експресію гена В-галактозидази за допомогою аналізу на утворення чорних бляшок.

З використанням мишачого моноклонального антитіла (Віодезідп, МЕ) було визначено, що 10095 бляшок, генерованих у клітинах СКЕК, інфікованих вірусом ЕНМ 054, очищеним методом бляшок, експресували ген

В-галактозидази. Було визначено, що цей вірус є стабільним принаймні після 5 пересівань. 65 Експресію котячих СО8О, дад ГРІМ і оболонки ГРІМ підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу з використанням поліклональних антитіл проти СО8О людини (КО бувіетв, ММ), мишачих моноклональних антитіл проти дад ГРІМ (Сивіот Мопосіопаіїз, СА), мишачих моноклональних антитіл проти оболонки РБІМ (Віодезідп). Експресію повнорозмірних комплементів генів РІМ, що присутні у геномі, підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу з використанням сироватки від РІМ-інфікованих котів, що одужують.

ЕНМ О55

ЕНМ 055 являє собою рекомбінантний вірус герпесу котів, який експресує повнорозмірний комплемент ВРЗ, що містяться в геномі РІМ і З додаткових чужорідних гени. Гомологічний вектор, позначений 1016-75.81, конструювали з метою вбудовування геному (А! ТК) РМ і гена В-галактозидази в унікальний довгий неповний

Заї-фрагмент Н ЕМ. Вставку вбудовували між геном ад! і суміжним геном активатора транскрипції. Геном РІМ /о знаходиться під контролем промотору ІЕ СМУМ, а ген В-галактозидази Е.соїї знаходиться під контролем промоторного елемента псевдорабівірусу ОХ.

ЕНМ 055 був отриманий з ЕНМ 041, що містить ген котячого СО86 і ген В-глюкуронідази в сайті делегованого

ОЕ ЕНМ. Ген котячого СЮО86 знаходиться під контролем промотору ЗЕ ЕНМ, а ген В-глюкуронідази знаходиться під контролем промотору псевдорабівірусу ОХ. Це було здійснено з використанням гомологічного вектора 7/5 1016-75.81 і вірусу ЕНМ 041, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного КРМ, 5РМ або ЕНМ". Вихідні матеріали для трансфекції скринували, як описано в розділі "Методи скринінгу на рекомбінантний вірус ЕНМ, що експресує В-галактозидазу (аналізи Х-ВІ ШОБАЇ і СРКСО) або

В-глюкуронідазу (аналіз Х-ЗІ 0С)3. У результаті багаторазових циклів очищення синіх/зелених бляшок одержували рекомбінантний вірус ЕНМ 055.

ЕНМ 055 аналізували на експресію В-галактозидази і В-глюкуронідази за допомогою аналізу на утворення чорних бляшок. З використанням мишачого моноклонального антитіла (Віобезідп, МЕ) і кролячого поліклонального антитіла (МоіІесціаг Ргорез, ОК) було визначено, що 10095 бляшок від клітин СКЕК, інфікованих вірусом ЕНМ 055, очищеним методом бляшок, експресували В-галактозидазу і В-глюкуронідазу, відповідно. Було визначено, що цей вірус є стабільним принаймні після 5 пересівань. сч

Експресію котячих СО8О, дад ГРІМ і оболонки ГРІМ підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу з використанням поліклональних антитіл проти СО8б людини (КО бувіетв, ММ), мишачих моноклональних і) антитіл проти дад ГРІМ (Сивіот Мопосіопаів, СА) і мишачого моноклонального антитіла проти оболонки БМ (Віобевідп). Експресію повнорозмірного комплементу генів РІМ, що присутні у геномі, підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу з використанням сироватки від РІМ-інфікованих котів, які одужують. со зо КРМУ-О55

ЕРМ-055 являє собою рекомбінантний вірус віспи єнотів, що експресує повнорозмірний комплемент ВРЗ, що (87 містяться в геномі РІМ, і 4 додаткових чужорідних гени. КРМ 055 був отриманий з КРМ 045, що містить ген М котячого СО86 і ген котячого СО8О, експресовані в біцистронному ДНК-кластері під контролем синтетичного пізнього промотору поксвірусу І Р1, який ініціює транскрипцію СО8О і СО86 і включає елемент ЕМСМ ІКЕЗ між ме)

Зз5 двома відкритими рамками зчитування; і ген В-глюкуронідази Е.соїї, що знаходиться під контролем синтетичного ї- раннього промотору ЕР2 у геномному неповному НіпапПІ-фрагменті М КРМ. Гомологічний вектор 1005-95.1 використовували для конструювання КРМ 055, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантних ЗРМ, КРМ і ЕНМ". Гени СО8О ії СО86 і ген В-галактозидази Е.соїї вбудовували в окремий і не-основний неповний НіпаП-фрагмент М КРМ. Геном СММ-РІМ і ген В-глюкуронідази вбудовували в « окремий і неосновний неповний НтаПі-фрагмент 0 КРУ. в с КРМ 055 був отриманий з КРМ 045. Це було здійснено з використанням гомологічного вектора 1005-95.1 і . вірусу КРМ 045, як описано в розділі "Процедура гомологічної рекомбінації для генерування рекомбінантного и?» КРМ, ЗРМ або ЕНМ". Вихідний матеріал для трансфекції скринували, як описано в розділі "Скринінг на рекомбінантний вірус ЗРМ, що експресує В-галактозидазу (аналізи ВІШОСАЇ і СРКО) або В-глюкуронідазу (аналіз Х-5ІЦОСУ. У результаті багаторазових циклів очищення синіх/зелених бляшок одержували -І рекомбінантний вірус КРМ 055.

КРМ 055 аналізували на експресію генів дад Ре/М, оболонки Ре! М з геному РІМ і маркерних генів о В-галактозидази і В-глюкуронідази за допомогою аналізу на утворення чорних бляшок. З використанням козячого -І поліклонального антитіла проти дад Ре! М (Віобезідп, МЕ) і мишачого моноклонального антитіла проти оболонки 5о ГеїМ, ор70, (Віобезідп, МЕ) було визначено, що 10095 бляшок, генерованих із клітин МЕКО, інфікованих - очищеним вірусом КРМ 055, експресували ген дад Реї/ М і оболонки Ре! М (Віобевзідп, МЕ). с Експресію котячого СО8О і котячого СО8б підтверджували за допомогою Вестерн-блот-аналізу з використанням козячих поліклональних антитіл проти СО 80 і СО 8 б людини (К 50 БЗувіетв, ММ), відповідно.

Була виявлена велика кількістьсмуг розміром від ЗОкДа до боОкДа, специфічних для котячого СЮО8О, і велика дв Кількістьсмуг розміром від 40кДа до 7/ОкДа, специфічних для котячого СО86. Цісмуги представляли картину глікозилювання, що чергується, і множинного глікозилювання СО8О і СО86б, експресованих у "контексті" КРМ у (Ф) клітинах МЕКО. Експресія білків, кодованих в геномі РМ, була підтверджена за допомогою Вестерн-блот-аналізу ка з використанням котячої сироватки від РІМ-інфікованих котів.

БІБЛІОГРАФІЯ

60 1. Агауе, еї аіІ., ОМА зЗеа. 5, 169-171 (1995). 2. Агуита, М., еї аї., 9. Іттипоіоду 149,1115-1123 (1992).

З. А2гита, М., еї аї., Майиге 366, 76-79 (1993). 4. Спатрегв, еї аі., Ситепі Оріпіоп іп Іттипоїіоду 9, 396-404. (1997). 5. Спеп, еї аї., У. Іттипоіоду 148,2617-2621 (1992). 65 6. Спеп, еїг аІ., Се) 71, 1093-1102 (1992). 7. Воппеїйу 9, еї аі,, Аппи Кем Іттипої! 1997; 15: 617-648.

8. Егеетап, еї аї., У. Іттипоіоду 143, 2714-2722 (1989). 9. Егеетап, еї аї, У). Ехр. Меа. 174, 625-631 (1991). 10. бітті, еї аі!., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 88, 6575-6579 (1991). 11. Ннайсоск, еї аї., 9. ої Ехр. Мед. 180, 631-640 (1994). 12. Наззей апа Му/нпіноп, Тгепаз Місгобіо! 1996; 4: 307-312. 13. Іпвіеу, еї аі, Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОЗА 87, 5031-5035 (1990). 14. депкіпв, еї аї, 9. Іттипоіоду 147,2461-2466 (1991). 15. Опіопз еї а), РСТ Іпії. Арріїсабйоп УУО 96/03435, О-Опе Віоїесі, 8 Рергоагу 1996. 70 16. Кіїеу, еї аї, 9. Іттипоіоду 158, 5545-5553 (1997). 17. Твції, егаії, Єиг ) Іттипоїіоду 27(3), 782-787 (1997). 18. РСТ Іпіегпайопаї Арріїсайоп УУО 92/00092, Вгівіо! Муегз Запірр. 19. РСТ Іпіегпайопаї! Арріїсайоп У/О 92/15671, Суютаейд, Іпс. 17 Зеріетрег 1992. 20. РСТ Іпіегпайопаї Арріїсайоп УУО 93/00431, Вгівіо! Муеге Запціврь, 7 дапиагу 1993. 21. АКевзоп, А.Ї. апа МУооадз, С.МУ. (1993). А Ппоготеїйгіс азвзау їог (Ше диапійаєцоп ої сеї адпегепсе Юю епаоіпегїаї! сеїІв. У. Іттипої. Мей. 163, 181-185. 22. Айвоп, 9.Р, апа Іапіег Її. (1987). Тпе звігисіцге, вегоїоду, апа їпсіоп ої (Ше Т-сеї| апідеп гесеріог. Аппи. Кеу. Іттипої. 5, 503-540. 23. Айівоп, 9.Р. (1994). СО28-87 іпіегасіоп іп Т-сеїЇ асіїмайоп, Сшитепі Оріпіоп Іттипо)ї. 6, 414-419. 24. Апдегзоп, Р, Могітоїо, С, Вгейтеуег, У.В, Зспіоззтап, 5.Е. (1988). Кедшайгу іпіегасіопз Бейуееп тетрбегз ої (Пе іттиподіорийїп зирепатіу. Іттипої! Тодау 9,199-203. 25. Апіопіа, 5.), Мипог2-Апіопіа, Т, Зоідеміа, С, МіМПег, 9, Ріамеїї, К.А. (1995). В7-1 ехргеззіоп ру а поп-апіїдеп ргезепіїпу сеїІ-дегімей Штог. Сап. Кев. 55, 2253-2256. 26. Агіта, Т, Кептап, А, НісКкеу, МУ, Біуе, М. (1996). Іппібйоп Бу СТІ А-4Ід ої ехрегітепіа! аїйПегадіс сч ов епсерпаютуеїйів. у. Іттипої. 156,4917-4924. 27. АгиМо, А. апа Зеей, В. (1987). МоЇІесшаг сіопіпд ої а СО28 сОМА Бу а СО5 сеї ехргезвіоп вувіет. і)

Ргос. Маї. Асад. 5сі. ОБА 84, 8573-8577. 28. Авіо, В, Сеїаії, Ю, Оербге, Р, Юиадоїй, М, Ацшігап, В. (1993). А помеІ! тоде ої питап іптіоподеїйсіепсу мігиз буре 1 (НІМ-1) асімайоп: Пдайоп ої СО28.аюпе іпайсев.НІМ-1 геріїсайоп іп пайгайу іпїєсвй (3 зо Утрпосуіезв. .). Міго!. 67, 4395-4398. 29. Агуита, М., Сауабуар. М., Виск, М.. Рййрв, У.Н., Гапіег, С.Г. (1992). Іпмоїметепі ої СО28 іп МНС -7- упгевігіссіей суфоіохісігуу теадіаєей Бу а питап КіПег Іенкаетіс сеї! Іїпе. 9. Іттипої. 149, 1115-1123. М

ЗО. Аита, М., МУМезе!ї, Н., РпНйірв, 9.Н., зЗріїв, Н., Іапієг, Г.Ї., (19935) Рипсіопа! ехргевзвіоп ої

В7/ВВ1 оп асіїмаєедй Т-ІУутрпосуїез. 9). Ехр. Мед. 177, 845-850. ме)

З1. Агита, М., Сауаруаб, М., РАйірв, 9.Н., Іапіег, Г.Г. (1993с). Кедшцігетепів ог СО28-дерепдапі Т ї- сеїІ-тедіаєед суюіохісйцу. У. Іттипої. 150, 2091-2101. 32. Ва|огаф, 9., еЗ(епкатр, К., Агийо, А. (1993). КпоулЛедде бразей ргоївеіп тодеїїпд: сопсерів апа ехатріев. Ргої. 5сі. 2798-1810. 33. Ваїйогафй, 9., Реаси, К., І іпвієу, Р.5. (1994). Іттиподіоришійй той сНагасіегівісв ої В7-1 (СО80) апа «

ВТ-2 ГСРВБ1 Ріої. збі. 3. 2148-2150. в с 34. Ваїалапо, С, Виопамівіа, М., Коишміег, Е., Соїівівій, Р. (1992) СТІА-4 апа СО28: вітійаг ргоїеїіпв, . пеідпбБогіпу депез. Іпі. У. Сап. Зиррі. 7, 28-32. и? З5. Вагсу, 5., МУецЦепаоп, М., Їео, О., Ограїп, 9., Кгидег, М., Сепррепв, 9.Ї., де Воеге, М. (1995). БСК сгозвіїпкіпд оп топосуїез гезиї5 іп ітраїгей Т сеї! зітшиїаюгу сарасіку. Іпї. Іттипо). 7, 179-189.

Зб. Веаіє, ОО. (1985). А сотрагізоп ої (Ше атіпо асій зедуепсез ої (Ше ехігасейШаг дотаійпв ої (пе -І іттиподіориййп зирепатіу. Розвіріе согеїайопе Бейуееп сопзегуапсу апа сопіогтайоп. Сотр Віоспет РпНмзвіої. 80, 181-194. і 37. ВейЙопе, М., Іеллі, (., Мапітеді, А.А. Ргоці, М.Р., ЮОеПаропа, Р., Савзогаїй, О., Кидагі, с. -І (1994). п мйго ргітіпуд ої суїїохіс Т Іутрпосуїевз адаїпві роогіу іттиподепіс еріборез ру епдіпеегей апіїдеп 5о ргезепнпа сеїїв. Ешг. у. Іпттип. 24, 2691-2698. - 38. Вегке, с. (1993). Те їопсіопз апа теспапізтев ої асіоп ої суюїуйіс ІуУтрпосуфев. Іп "Рипдатепіа! с Іттипоїіоду", (МУ. Раці), рр. 965-1014. Мем Могк: Камеп Рибі. Зга ед. 39. Вептке, с. (1994). Тпе бБіпаіпд апа увів ої іагдеТ-сейв Бу суюіїохіс ІУтрпосуїез. Аппи. Кем, ої

Іттипої. 12, 735-773. 40. Воіве, ІЇ.Н., Міпп, А.)., МоеїЇ, Р.)., дипе, С.Н., Ассаміці, М., Ііпавівій, Т., Тпотрзоп, С.В. (1993).

СО28 совійтшиавоп сап ргоотоїе Т сеї| зигміма! Бу еппапсіпд пе ехргезвіоп ої Всі-ХІ. Іттипіу З, 87-89. (Ф) 41. Вгіпсптапи, У.Е., ЮОобБішпд, 9.Н., Недег, В.Н., Наапеійт, 1/.Ї., Заппез, М., Едеїапа, Т. (1994). ка Ехргевзвіоп ої совійтиціайогу тоІесше СО28 оп Т-сейв іп питап іттиподеїісіепсу мігив їуре 1 іптесіоп:

Топсіопаї апа сіїпіса! соогеІайопв. У. Іпї Рів. 169, 730-738. во 42. Вгомуп, МУ.С., Вівзеу, Ї., Годап, К.5., Редегзеп, М.С., ЕІдеге, 9У.Н., Соїйвзвзоп, Е.МУ. (1991). Реїїпе іттиподеїісіепсу мігиз іпїесів броїй СО4" апа СО8" Т-Іюутрпосугезв. 4). ої Міго!. 62, 3359-3364. 43. Виск, С А. (1992). Іттиподіориійп Зирепатіу: вігисіге їТпсіоп апа геіайопепір о оїйпег гесеріог тоіесціез. Зетіп. Сеї! Віої. 3, 179-188. 44. Виеїепз, С, ММШетве, РЕ., ЮОеїмаих, А., Ріегага, с., ОеїміМе, 9У.Р., Меїш, Т., Соідтап, М. (1995). 65 Іпіегеикіп 10 айегепіанНу гедшаєев В7-1 (СО80) апа 87-2 (СО86) ехргезвіоп оп Ппитап регірпега! ріоса депагтйіс сеї. Еиг. У. Іттипої. 25, 2668-2675.

45. Сагизо, А., Сапіаіїатевзза, А., іісепліайй, 5., Регопі, Ї., РгаїЇ, Е., Мапіпеїййї, Р., Сапагів, А.О.,

Еоїднега, 5З., Согіа, К., Ваївагі, А. (1994). Ехргезвіоп ої СО28 оп СО8' апа СО4" Іутрпосуїев дигіпд НІМ іптесіоп. Зсап. 9. Іттипої!. 40,485-490. 46. Сегдап, С, Мапіп, М., ВгайшШу, Н., Соигсоці, М., Ріамеца, 5., Совіейо, К., Мамжаз, С, Віго, Е.,

Оїїме, ОЮ. (1991). 1-1 ів ргодисей Бу Т Іутрпосуїез асіїмаге(й міа (Ше СО2 різ СО28 раїймжаув. 9. Іттипої. 146, 560-564. 47. Спеп, Г., іпвієу, Р.5., НеїЇвігот, К.Е. (1993). Совійтиайоп ої ТТ сеїв бог йШштог іттипку.

Іттипої. Тодау 14,483-486. 70 48. Спезпції, К.МУ. апа ОСгеу, Н.М. (1986). Апіїдеп ргезепіайоп ру В сеїв апа йв відпійсапсе іп Т-В іпіегасіопе. Адм. Іттипої. 39, 51-59, 49. Сіагк, 5.3., Завад М.5., ЮОесКег, МУ.О., Сатрбреїї, Н.5., Кобрегвоп, 9У.Ї., МеїдКатр, Ру. (1991). Нідн

ШШегз ої суораїйПіс мігив іп ріазта ої райепів м/йй зутріоптв ої ргітагу НІМ-1 іптесіоп. М. Епа. У). Мед. 324, 954-960. 50. СіІаурегдег, С, Гу, 5.С., ЮОеКгиуй, К., Рагпат, Р., КтгепезКу, А.М. (1994). Реріідез соітезропаіїд ю 75 Ше СО8 апа С04 Бріпаіпуд дотаїпз ої НІГ А тоїіесціез Біоск Т-Іутрпосуїе іттипе гезропзез іп міїго. 5). Іттипої. 153, 946-951. 51. СіІемегв, Н., АІагсоп, В., М/Петап, Т., Тегпогвії, С (1988). Те Т-сеїЇ гесеріог-СОЗ сотріех: А аупатіс ргоївіп епзетбріе. Аппи. Кеум. Іттипої. 6, 629-662. 52. Соппог, К.І., Мопйгі, Н., Сао, М., Но, 0.0. (1993). Іпсгеавей міга! ригдеп апа суюраїНісйу соггеїайе їетрогайу мйй СО4-Т- ІУтрпосуїе адесііпе апа сіїпісаї ргодгеввіоп іп питап іттиподеїїсіепсу мігиз (уре 1-іптесієй іпаїмідцаїв. О Мігої. 67, 1772-1777. 53. Соорег, О.А., Тіпаай, В., ММУйвоп, Е.дУ., Ітгеїе, А.А. Реппу, КК. (1988). СПагасіегігайоп ої

Т-Іутрпосуїе гезропвез дигіпд ргітагу іптесіоп мйй питап іттиподеїйсіепсу мігив. .). Іпї. Рів. 157, 889-896. 54. Оатіе, М.К., Ооуїе, І.М., ОСговзтаїге, 1!.5., ІеареКег, У.А. (1988). ОйШегепіна! гедціайгу зідпаїв с деїмегед ру апіїбоду ріпайпуд юю (Ше СО28 тоїіесціе ашгіпд (Ше асіїмайоп ої питап Т Іутрросуїев. 4). Іттипої. 140, 1753-1761. і) 55. ЮОатіє, М.К., Кіиввзтап, К., Іеуїге, (., МапіаІ, 5., Агтийо, А., Іедрецег, .А., ІіпвІеу, Р.5. (1994). Совійтиіайоп ої Іутрпосуїез м/йй іпіедгіп Ідапаз ІСАМ-1 ог МСАМ-1 іпацсез Тисіопа! ехргевзвіоп ої

СТІ А-4 а зесопа гесеріог їог В7. 9. Іттипої. 152, 2686-2697. ее) 56. Юамі5, М.М. апа Віогктап, Р.К. (1988). Т-сеї| апіїдеп гесеріог депез апа Т-сеіЇ гесодпійоп. Майшге 334, 395-402. - 57. де. Воег, М., Казгап, А., Кмжеккероот, .)., УУаМег, Н., Мападепрегопе., Р., Сецррепв, 4... (1993). рч-

Підайоп ої В7 мій СО28/СТІА-4 опо Т-сеїв гезий5 іп СО40 Іїдапа ехргезвіоп, іпіегеиКіп-4 зесгейоп апа ейісіепі пер тог апіїроду ргодисіоп Бу В сеїІв. Еишг. 9). Іттипої. 23, 3120-3125. о 58. деМУааі Маїегуї, К., Мезеї, Н., де Мгіев, 9У.Е. (1993). Оігесі еПесів ої 1-10 оп звирзеїв ої питап -

СО4.- Т сей сіопез апа гевіпуд Т сеїїв. Зресійс іппірйоп ої 11-2 ргодис(іоп апа ргоїїегайоп. 9, Іттипої. 150, 4754-4765. 59. Оіпд, Г., Сіпвієу, Р.5., Ниапо, І.М., Сегптаїп, К.М., Зпемаси, Е.М. (1993). 1-10 іппірі5 тасгорпаде « совіїтиагу асіїмну Бу зеіІесіїме|у іппірйіпуд пр гедшайоп ої В7 ехргезвіоп. У). ІтТттипоЇї. 151, 1224-1234. 60. Огівсоїї, Р.С., Сузвіег, ., Сатрреїї, 1, УМіШатв, А. (1991). Зігисіште ої дотай 1 ої гаї ЩО с Т-Іутрпосуїе СО2 апіїдеп. Майте 353,1'62-765. ц 61. ЕйШв, 9У.Н., Вигдеп, М., Міподгадом, О., Гіпде, С, Стомжме, 9. (1996). Іпіегасіопев ої СО8О апа СОр86 "» мій СО28 апа СТІ А-4. 3). Іттипої. 155,2700-2709. 62. Епаіенага, М.Н. (1994). Бігисіцге ої рерііїдез аззосіаїеай мййп МНС сіазв | тоіесціев. Сит. Ор. |Іттипої. 6, 13-21. -І 63. Епоіїви, МК.М., Меївоп, Р., доппвоп,см., Мавіззе, М., ТотрКіп5, МУ.А., ТотрКіпз, М.В. (1994).

Оемеіюортепі ої сіїпісаї дізвеазе іп саїв ехрегітепіаПу іпїесіей м/йй Тейпе іттиподеїйїїсіепсу міги8. 3. ІА. о Рів. 170, 543-552. -І б4. Рацйсі, А.5. апа Оаїе, О.С. (1975). Тпе ейПесі ої Ппуйдгосопізопе оп і(йе Кіпейсв ої погтаі! питап цу Іутрпосуїевз. Віоса 46,235-243. 65. Рацйсі, А., Маспег, А., Гопдо, О., Іапе, Н., КооК, А., Мазиг, Н., Сеітапп, Е. (1984). Адцігей (Че іттиподеїїсіепсу зупаготе: ерідетіоіодіса!, сіїпісаІ, ітптипоіодісаї апа (Негарецііїс сопвзідегайопе. Апп. Іпі.

Меа. 100, 92-106. 66. Р.А. ГРегїтагі, еї а), дошигпаї ої Васіегіоіоду (1985) 161, 556-562. 67. Ропд, Т.А. апа Мозтапп, Т.К. (1990). АПогеасіїме тигіпе СО8- Т сеї сіопез зесгефе (пе ТР рацегп ої суюкКіпев. ) Іттипої. 144, 1744-1752. іФ) 68. Рошиспієг, К.А., Меуаага, Ї., Вгоцуег, М., Номепкатр, Е., Зспціетакег, Н. (1996). Вгоадег (горізт апа іме) піднег суїораїйісйу ог СО4" Т-сеїЇв ої азупсуйит-іпаисіпд сотрагейд йо а поп-зупсуйит-іпайсіпу НІМ-1 ізоїіаіе аз а теспапізт (ог ассеіегаїей СО4" Т сеї! десіїпе іп мімо. Мігоїюду 219, 87-95. 60 69. Ргеедтап, А.5., Егеетап, О., Ногом/й2, 9.С., МОаїєу, 9., Мадіег, І.М. (1987). А В-сеї| гевзігісіей апіїдеп (йаї ідепійіез ргеасіїмавеа В сеїІв. У). Іттипої. 139, 3260-3267. 70. БРгеетап 0.)., Вогаеїйо, Е., Ноде5, МК.)., Кеїзег, Н., НаїйсоскК, К.5., Іавзло, О., МеКпідні А.).,

Кіт, 9., Ои, Г., Готбрага, О.В., Сгау, (0.5., Майдіег, Ї.М., Зпагре, А.Н. (1993). Опсомегіпд а псііопаї! аКегпайме СТІ А-4 сошпіег гесеріог іп В7-1 аеїтісіепі тісе. Зсіепсе 262, 907-909. 65 71. Са|емуеКі, Т. Р. Зспеї, 5Б.К., Мац, (., БЕйси, Р. МУ. (1989). Кедшайоп ої Т-сеї! асіїмайоп: ріпегепсез атопад Т-сеї! вирзеїв. Іттипої! Кем. ПІ, 79-110. -БО0-

72. Септаїп, К.М. (1993). Те Віоспетівігу апа сеї! Бріоїосду ої апіїдеп ргосеззіпд апа ргезепіайоп. Аппи.

Кем. Іттипо)ї. 11, 403-450. 73. Найпаг, О.К., БЗтійодай, М.О., Вгаазпамж, ., Вгаду, МУ, Оатіе, М.К., І іпвієу, Р.5. (1993).

Совійтшайоп ої Т-сеї! асіїмайоп апа міг ргодисіоп ру В7 апіїдеп оп асімаєй СО4" Т-сев їйПот Ппитап іттиподеїїсіепсу мігиз (уре 1-іптесіей допогв. Іттипоіоду 90, 11094-11098. 74. Напап, О.М., Абе, К., ее, К.Р., дипе, С.Н. (1995). Роїепійіа гоїев ої (Ше В7 апа СО28 гесеріог

Татіїйез іп ашоіїттипку апа іттипе емавіоп. Сіїп. Іттипої. Іттипораїйй. 75, 99-111. 75. Нодде, 9ОУМУ., Абргаті, 5., Зспіот, .., Капіог, 9У.А. (1994). Іпдис(іоп ої апійштог іттипйу Бу 70 тесотріпапі массіпіа мігизез ехргезвіпуд В7-1 ог В7-2 совіїтшцІайгу тоіесціев. Сап. Кев. 54, 5552-5555. 76. Ниїспсгой, У.Е. апа Віегег, В.Е. (1996). Зідпайпод (гоцдй СО28/СТІ А-4 Тату гесеріогв. 9, Іттипої. 155,4071-4074. 77. М.А. Іппів, еї аі, РСК Ргоїосоіїв: А Сціде о Меїйодз апа Арріїсайоп5з, Асадетіс Ргевзв5, Іпс., Зап

Оіедо (1990). 78. ЧепКкіпв, М.К., РагаоїІ, О.М., Мігидисні, 9., ОЦ, Н., Зспуагіг, К.Н. (1987). Т сеїЇ гезропзімепез5 іп омімо апа іп мйго: Ріпе взресійснцу ої іпаис(іоп апа тоїесціаг спагасіегізайоп ої (Ше цпгезропзіме звіаїйе.

Іттипої Кем. 95, 113-135. 79. Одупе, С.Н., ІеарецЧег, 9У.Н., І іпвіеу, Р. 5., Тпотрзоп, С.В. (1990). Коіе ої Ше СО28 тоїесше іп

Т-сеїЇ асіїмайоп. Іттипої. Тодау 11, 211-216. 80. дипе, С.Н., ВіІсевіопе, 9У.А., Мадіег, Ї.М., Тпотрзоп, С.В. (1994). Тие В7 апа СО28 гесеріог Татіїев.

Іттипої. Тодау 12, 321-333. 81. Кпіднії, 9.С., еї аі., (1992), Мігоїоду 190,423-433. 82. Когрег, О., Могеца, А., Меззпег, Н.А., Могеца, Ї., Стосе, СМ. (1987). Тр44 тоїІесшев іпмоїмейд іп апіідеп-іпаерепаепі Т сеї асіїмайоп аге ехргеззед оп питап ріазта сеїІв. У . Іттипої. 138,4128-4132. Га 83. Киріег, А. апа Зіпдег, 5.3). (1989). Се Біоїоду ої суйоїохіс апа Пеїрег Т-сеїЇ Топсіопв. Аппи. Кему.

Іттипо)ї. 7, 309-337. о 84. І апдаау, А.Ї., МасКеміс:, С.Е., ему, 9У.А. (1993). Ап асіїмаєєей СО8- Т сеї рпепоїуре соогеїагев м/п ап апіі-НІМ асіїміу апа аззупріотаїйс сіїпіса! віайв. Сіїп Іттип. ІІптипораїйй. 69, 106-116. 85. Іапе, Р., Вигаеї, С, Нибеїєе, 5., Зспеідеддег, О., МиПег, Ш., МеСоппеїІЇ, Р., Ковзсо-Міроїв, М. ее) (1994). В сеї! Топсіоп іп тісе ігапздепіс ог тСТІГА4-Н датта 1: ІасКк ої дептіпа! сепіеге соїтеїаїей мйн роог апіпіу тайшгайоп апа сіазв зм/йспіпу дезріге погтаї ргітіпд ої СО4-- Т-сеїІв. У Ехр. Меа. 179,819-830. -- 86. Іапіег, .Ї., О'Раїйоп, 5., Ботога, С, РПййїрв, 9У.Н., Гіпвієу, Р.5., ОКитига, К., Що, О., Агита, М. рч- (19953. СО8О (87) апа СО86 (870) ргоміде вітійаг совійтиціайогу відпав їог Т сеї! ргоїїМегайоп, суюкКіпе ргодисіп, апа депегайоп ої СТІ. У. Іттипої. 154, 97-105. і. 87. Іагвгеп, СР., Кіїспіве, 5.С., Реагвоп, Т.С., І іпвіеу, Р.5., Гомгу, К.Р. (1992). Рипсіопа! ехргезвіоп - ої (пе созіїтиціафгу тоіесцше В7/ВВ1 іп тигіпе депагікіс сеїЇ роршіайопв. У. Ехр. Мед. 176, 1215-1220. 88. Іеапу, О., Ахеї, К., Непагісквоп, МУ. (1992). Стувіа! вігисішге ої а воЇШріе їогт ої питап Т сеї соцпіег гесеріог СЮОВ8 аї 2.8 гезоЇІшіоп. СеїІ 68, 1145-1162. « 89. Іеспіег, К.І., Готбрага!, с., Ваїспеіюог 9У.К., Кеіпетоеп М., Вас, Р.Н. (1990). Те тоїіесцшіаг равів ої 70 айогеасіїмійу. Аппи. Кем. Іттипої. 10, 83-88. - с 90. Іепеспом, 0.3., ЗИ, О.Н-Т., йисКептапп, Г.А., Мабрамі, М., ев, С.Ї., Огау, 0.5., МіШег, 5. ц ВіІсевіопе, УА. (1993). Ехргезвзіоп апа їпсіопа! зідп'їісапсе ої ап адайіопа! ІЙдапа бог СТІ А-4. Ргос. Маї. "» Асаай. Зсі. ОБА. 90, 11054-11058. 91. Гепезспому, О.9., ММаішпавз, Т.Ї., Вісевіопе, УА. (1996). СО28/87 вувіет ої Т сеї! совітшайоп. Аппи.

Кем. Іттипої. 14 233- 258. -І 92. Ї енпо, Н.Т. апа І іпвІеу, Р.5. (1994). Тне СО28 совіїтиіаюгу раїйпжау. ТНегар. Іттипої! 1, 217-228. 93. Гемів, О.Е., Мо Тапо, О0.5., Ади-Орропо, А., Зспобег, МУ., Коддегв, У. (1994). Апегду апа ароріовоїв іп о Сов Т-сеїІв їот НІМ іпгесієйд регзопв. 9. Іттипої. 153. 412-420. -І 94. |, М. Мсбомжап, Р., Неївігот, !., Неїйвігот, К.Е., Спеп, І.(1994). Совіійтицайоп ої Штог геасіїме 5о СОа4 апа СО5 Т-мутрпосуїез Бу В7 а пайшгаї Ідапа г СО28 сап ре изей Юю ігеаї евіаріїзней тоизе теїЇапота. .). -

Іттипої. 153, 421-428. (Че 95. Ііпавієеп, Т., ее, К.Р., Наїтів, Е.5., Рейгупіак, В., СтаідпеайЯ, М., Кеупоїдв, Р.)., Готбага, О.8.,

Егеетап, 0.)., Мадіег, Ї.М., ОСгау, 5.5. (1993). Спагасіегігайоп ої СТІ А-4 вігисішге апа ехргезвіоп оп питап

Т-сеїІв. 9). Іттипої. 151, 3489-3499. 96. Ііпвіеу, Р.5., Вгаду, МУ., Огпев, М, Огозтаїіге, І.5., Юапіе, М.К., І едреЦег, УА. (1991а).. Віпаїпд ої (Ве В-сеї| асіїмайоп оапідеп 87 (о СО28 совійтшШагев Т-сеї! ргоїйегайоп апа ІпіепеишКіп-2 теМА іФ) асситиіайоп. ). Ехр. Меа. 173, 721-730. ко 97. Іпвієу, Р.5., Вгаду, МУ., Огпевз, М., ОСгозтаіге, Ї. 5., Юатіе, М. К., І едреЦег, У. А. (19915). СТІ А-4 ів а зесопа гесеріог Тог пе В-сеї| асіїмайноп апіїдеп В7. 9У. Ехр. Мед. 174, 561-569. во 98. Ііпвієу, Р. 5., УММУаМасе, Р.М., доппзоп, 9., Сірвоп, М.б., ОСгеепе, 9У.Ї., ІедрецЧег, 9. А., зіпуй, С,

Террег, М.А. (1992а). Іттипозирргеввіоп іп мімо Бу а зоЇШбіе їТогт ої (Ше СТІ А-4 Т сеї| асіїмайоп тоїіесціе.

Зсіепсе 257, 792-795, 99. пвіеу, Р.5., Огеепе, ..1Ї., Тап, Р., Вгадзпаму, .)., ІедреЦег, 9У.А.,, Апазеці, С, ЮОатіє, М.К. (19925). Соехргезвіоп апа їопсіопа! соорегайоп ої СТІ А-4 апа СО28 оп асіїмаїей Т-Іутрпосуїевз. У. Ехр. Меа. 65 176, 1595-1604. 100. Ііпвіеу, Р. 5. апа Іедрецег, У. А. (1993а). Те гоїе ої СО28 гесеріог дигіпуд Т сеї! гезропзев (0 апіїдеп. Апп. Кеум. Іттипої. 11, 191-212. 101. МпвІеу, Р.5., Вгадзпаму, 9У., Огпе5з, М., Сгозтаїге, Ї., Тпотрзоп, С.В. (199385). СО28 епдадетепі, Бу

В7/88-1 іпдисевз (гапвзіепі домп-гедшайоп ої. СО28 звупіпезіз апа ргоїопде4й пгезропзімепезв о СО28 зідпаїїпд. 9. Іттипої. 150, 3161-3169. 102. ІіпвіІеу, Р.5., Огеепе, 9У.Ї., Вгаду, МУ., Ва|огаєф, 9., І едбецег, 9У.А., Реасп, К. (1994а8). Нитап В7-1 (СО80) апа 87-2 (СО8б) ріпа м/йп вітйаг амідйев риє аївіпсі Кіпейсв юю СО28 апа СТІ А- 4 гесеріогв.

Іттипйу 1, 793-801. 103. ІпвІеу, Р.5., Реасі, К., ОСіІадзіопе, Р., Ва|огаф, 9. (19945). Ехіепаіпда Ше В7(СО80) депе Татіу. 7/0. Ртої. зоі. З,1341-1343. 104. | іпвіеу, Р.5., Іедрецег, у. Реасп, К., Ваїйогафй, 9. (1995824). С028/СТІА-4 гесеріог звігисійге,

Біпаїіпу віоіспіотейу апа аддгедайоп адигіпу Т сеї асіїмайоп. Кев. Іттипої!. 146, 130-140. 105. іпвіеу, Р.5., Мадіег, 5.0., Вайфогафй, .У., Реасп, К., Іецпо, Н.Т., Кодегв, .)., Вгаазпамж, ».., еерріп5, М., І еуїле, О., Вгаду, МУ., Маїаско, А.К., Магацчагає Н., 5памж, 5. (199565). Віпаїпуд вісіспіотейгу ої 7/5 Ше суююхіс ТУтрпосу(е-аззосіаїей тоіесціе-4 (СТІ А-4). 3. Віої. Спет. 270, 15417-15424. 106. І Ктап, О.К. (1987). Тне вігисішге ої (пе СО4 апа СО8 депевз. Аппи. Кему. Іттипої. 5, 561-584. 107. Ми, С.С., М/еІзН,см., Хоцпо, 9. О-Е. (1995). Репогт: Бігисішге апа Типсійоп. Іттипої!. Тодау 16. 194-201. 108. іш, М., допез, В., Вгаду, МУ., Чхапемжау, С.А., Гіпвієу, Р. (1992). Мигіпе СО4 Т сеїЇ дгоули: В7 апа

Неаї зіаріеє апіїдеп рої рагісірайе іп со-віітиайоп. Еиг. У. Іттипої. 115, 1905-1912. 109. ГотрБбагаї, 5., СаггеїЇ, С, Рівіейо, М., Мазвгі, С, Майеийссі, ОЮ., Ваїаіїпоці, Е., Саттагоїа, б., Ба

Рга, |., Вапаесспі, Р., Тогліпі, Е., Вепаїпеїїї, М. (1994). А пецігаїїгіпд апііїроду-іпдисіпуд рерііїде ої (пе

МЗ дотаіїп ої Тейпе іттиподаеїїсіепсу мігиз епмеіоре діусоргоївіп доев пої іпдисе ргофесіме ітпттипйу. ..

Міго!. 68, 8374-8379. 110. Гу, М., Огапей-Рірегпо, А., Віогпдапі, 9.М., РПййрз, С.А. ТгемШуап ..М. (1992). СО28-іпдисей сч ов т сеї асімайцоп. Емідепсе гог а ргоїевіп-іугозіпе Кіпазе відпа! (гапзаисіоп раїймау. У Іттипої. 149,24-29. 111. Гога, 5.Е. апа Оагпеї, У.Е. (1968). "Сепега! Мігоїоду." Мем Жогк: допп У/ПШеу апа зопв, Іпс. і) 112. мої, А. (1957). Тпе сопсері ої мігив. У. (зеп. Місгобіої. 17, 239-253. 113. Мапіаїйів, Т., Егйвсп, Е.Р., апа бЗатргооК, У. (1982). "МоіІесшаг Сіопіпд:. А Іарогаїгу МапиаІ" Мем

Хогк: Соїа Зргіпд Нагрог Ргезв. со зо 114. Мапіп, Р.)., ІедреЦег, 9.А., Могізпйа, М., Одипе, С.Н., Веацу, Р.)., Напзеп, 9.А. (1986).ї А 44

Ккподаноп сеї зипасе Потодітег гедціайев іпіепецйкіп 2 ргодисіоп Бу асімаєай питап Т Іутрпосуїев. у. 07

Іттипої. 136, 3282-3287. ї- 115, Маїйазитига, М., Егетопі, О.Н., Рефеггоп, Р. А., ММУївоп, ГА. (1992). Етегдіпуд ргіпсіріев Тог (Ше гесодпійоп ої реріїде апіїдепз Бу МНС сіазз | тоЇІесцев. Зсіепсе 257, 927-934. ме) 116. Мевзспег, М.Р. (1992). ЗиТупасе сопіасі гедцігетепів їог асіїмайоп ої суфіхіс Т-ІМутрпосу(ев. .. ї-

Іттипої. 49, 2402-2405. 117. Міпу, А., Спаоп, Р., ЮОегоса, 9У.М., Юитопі, Х., СиШетої, 9У.С., Кадпад, М., арії, С, І еріаюів,

Р., МПаигоп, Р., Міїсих, В., Міпгу, С, СавейПавз, Р., Іоівоп, О., І орКег, 9., ЗПіге, О., Регтага, Р., Сарцїі,

О., (1993). ІпіегпециКіп 13 ів а пем питап ІУтрроКіпе гедшіайпо іпПйаттайгу апа іттипе гезропвзевз. Майшге « 362, 248-250. в с 118. Мопйен, С.МУ. апа Радеп. СМ. (1994). Місгодііа іп ї(Ше гаї пешгопурорпузів іпсгеазе ехргевзвіоп ої . сіазз І тадог півіосотраїйріїйу апіїдепз оПоміпу сепіга! пегмоиз зузіет іпішгу. У Меигоїттипої. 50,139-51. и?» 119, Мовзтапп, Т. апа Сойтап, К.Г. (1989). ТНІ апа ТнН2 сеїївє: ОйШегепі рацегпз ої ІМутрпоКіпе зесгейоп

Івад ю аїйбегепі Типсііопа! ргорегііев. Аппи. Кеу. Іттипо). 7, 145-173. 120. Мабрамі, М., ЕРгеетап, б,9., баці О., Содіттеу, С.М., МадіІег, Г.М., Оійпспег, Г.М. (1992). Зідпаїпу -І Ігоцой (Ше МЬІС СП суюоріазтіс дотаїіп із гедцігед Тог апіїдеп ргезепіайоп апа іпдисез В7 ехргезвіоп. Майте 360, 266-268. о 121. Мадаїйа, 5. апа Соівіеїп. Р. (1995). Тпе Раз деайй Гасіог. Зсіепсе 267, 1449-1465. -І 122. Міскоой, В.)., Міга, К.5., ее, К., Тигка, Г.А., ОСгеет, .)., Ппотрзвоп, С, ЗПітіги, М. (1993). Рівсогаапі ехргезвіоп ої СО28 ІПдапаз ВВ-1 апа В7 оп Кегайпосуїез іп мйго апа рзогіайс сеїв іп мімо. Ат - У. Ра. 142, 1029-1040. с 123. Момоїпеу, С, Епоіїви, К., Ноизтап, .у., ЮОамідзоп, М., Мазіззе, М., Уепд, С.К. (1990). Гутрпосуїе роршайоп спапдез іп саїз пайгаїу іптесівд м/йй Тейпе іттиподеїйсіепсу мігив. АІЮЗ 4, 1213-1218. 124. ОСбопепу, О., 5іеіптап, К.М., Репо, М., Сатегоп, Р.О., СегеЦег, 5., Кореїоїй, І., Зміддага, МУ.)., ов Роре, М., Впагама), М. (1993). Оепагійс сеїв їтезпу івоїайей їот Нпитап Біоой ехргезз СО4 апа тайшге іпо їуріса! іттиповіїтиагу депагікс сеїз апйег сийиге іп топосу(е-сопайіопеа теадіа. 9. Ехр. Мед. 178, 1067-1076. (Ф) 125. Огажша, Н., Аіра, 5., МаКадажа, 5., Тадаті, Н. (1995). Іпіепегоп датта апа іпіегпециКіп 10 іппіріє ка апіїдеп ргезепіайоп бу іІапдегпап'є осейв бог їТ Пеірег їуре 1 сеїйв Бу зирргеззіпд (Шеійг СО80 (В7-1) ехргезвіоп. Еишг. у). Іттипої. 26 648-652. во 126. Раде, С, Тпотрзоп, С, Масоцор, М., Козе, М. (1994). Нитап епадоїПеїйаі! в(тшиаййоп ої аїПодепіс

Т-сеїЇв міа а СТІ А-4 іпдерепаапі раїпугау. Тгапв. Іттипо). 2, 342-347. 127. Реасп, К., Вайогаєй, .-., Вгаду, МУ., Іеуїге, б., Огеепе, у9)., Маетига, 9У., І іпвІіеу, Р.5. (1994). СОМК1 апа СОкКЗ-апаіодоиз гедіопз іп СТІ А-4 апа СО28 де(егтіпе (пе Бріпаїпд ю В7-1. 9). Ехр. Меа. 180, 2049-2058. 128. Реасп, К., Ваіогакф, 9., Маетига, 9У., І еуїге, б., Огеепе, .)., Агийо, А., І іпвіеу, Р.5. (1995). Воїй 65 ехігасеїІшШіаг іттиподіориїййп-іКе дотаїйз ої СО8О сопіаійп гезідцев сгйса! бог о Біпаіпд Т-се| зипасе гесеріоге СТІ А-4 апа СО28. у. Віої. Спет. 270, 21181-21187.

129. Редегзеп, М.С., Але, Е., Вгом/п, М.Г., Мататоїйю, У.К. (1987). ІзоЇїайоп ої а Т Іутрпоїсгорніс мігив їот дотевзвіїс саїв м/йй ап іттиподеїйсіепсу ІКе зупаготе. 5сіепсе 235, 790-793. 130. Ргазад, К.М., Саії М.С., Каар, М, ОисКмопй, 5., СапЦеу, Ї., Зпоеівоп, 5.Е., Киаа, С.Е. (1994).

Т-се о апідеп СО28 іпіегасів м/йй о їШфе рій Кіпазе рпозрпайауйповійо! З-Кіпазе бу а суюріазтіс

ТукР)-Меї-Хаа-Меї тоїїї. Ргос Маї! Асай 5сі ОБА. 91,2834-2838. 131. Каймапуї, Г.0., Зі, М., Ма?ії, Н., ЗНнагпта, А., Оаїа, К., Міїїв, с.В., МіПег, К.С. (1996). СО28 совійтиаїсіоп іппіріїв ТСк-іпдисед ароріовів дигіпд а ргітагу Т сеїЇ гезропзе. .). Іттипої!. 158, 1788-1798. 132. Каппейт, Е.А. апа Кіррв, Т.). (1995). Титог песговів Тасіог-аїрпа "Тасіїйаєсев іпдисіоп ої СО8О0 7/0 ХВ7-1) оп питап В сеїз ру асіїмаєєй Т-сейв: сотріех гедшацоп ру 1-4, 11-10, апа СО40І-СеїІ. Іттипої. 161,226-235. 133. Каі-УМоМй, 2., Егеетап, с., Саїміп, Р., Вепасегтаї, В., МадіІег, Ї., Кеїізег, Н. (1992). Ехргезвіоп апа їопсіоп ої Ше тигіпе В7 апіїдеп апа (Ше тайог совійтціайогу тоіесціе ехргеззей Бу регіопеа! ехидайе сеї. Ргос. Маї. Асай. 5сі. БА. 89, 4210-4214. 134. Копспезе, Г., Найзтапп, В., Нибреїе, 5., Гапе, Р. (1994). Місе (гапздепіс їТог а зоЇШбБіе їогт ої тигіпе СТІ А-4 зпом/ еппапсед ехрапзвіоп ої апіїдеп-зресіїс СО4- Т-сев апа дегесіїме апіроду ргодисіоп іп мімо. У. Ехр Мед. 179, 809-817. 135. КоїгесикКе, ОО. апа Рак, К. (1994). Огідіп вігисішге апа птоїйїв ої паїйшгайу ргосеззейа МНС сіазв ЇЇ

Ідапав. Си. Ор Іттипо). 6, 45-51. 136. Кивзеї, 9У.Н. (1983). Іпіегпа! аїівіпіедгайоп тоде! ої суїюіїохіс ІУтрпосуїе іпдисей (агдеї датаде.

Іттипої. Кем. 72, 97-118. 137. ЗатрбгоокК, еї аїЇ., МоІесшаг Сіопіпд: А. І арогаїогу Мапиа!Ї, бесопа Еайіоп. Соїй Зргіпд Нагрог Ргезв,

Соа 5ргіпд Нагбог, М.У. (1989). 138. Ситепі Ргоїосоіїв іп Моїіесшаг Віооду (Едз. Ашибреї, Вгепі, Кіпувіоп, Моге, Реідтап, Зтйй апа сч

ЗШ, Сгеепе Рибі. Аззос, УМіеу-Іпіегесіепсе, МУ, МУ, 1992). 139. Зашккопеп, .)., КопійєїЯ4, Н., Вегтап, уУ.5. (1993). Ехрапвіоп ої а СО8"СО28" сеї роршіайоп іп (Ше о ріоса апа Ішпо ої НІМ-розіййме райепів. УАЗ 11, 1194-1199, 140. Зспацпег, Е. апа І ашгепсе, -). (1У94). НІМ іпдисеа Т-Іутрпосуїе деріейоп. Сіїп. І ар. Меа. 14,221-227. 141. ЗсптіцеІ, А., ЗсПпеіїрепродеп, С, Кеїйпої2, ШО. (1995). іророїузасспагіде ейПесіїмему ир-гедціаїєв о

В7-1 (СО80) ехргезвіоп апа совіїтиіаюгу Типсійоп ої пПитап топосуїев. зсап. У. Іттипої. 42,7 01.-704. 142. Зспмжмайпл, К.Н. (1992). Совійтшайоп ої Т-Мтрпосуїев: Ше гоїе ої СО28, СТІ А-4 апа Вв7/ВВ1 іп -- іпєтепеикіп-2 ргодисіоп апа іттипоїПпегару. Сеї! 71,1065-1068. рч- 143. бедег, К.А., Септаїп, К.М., І іпвіеу, Р.5., Раш, МУ.Е. (1994). СО28 теадіацеа со-вітшиіаєцоп ої 1-2 ргодисіоп ріауз а стііса! гоЇіеє іп Т сеї! ргітіпоу ог ІІ -4 апа-ІРМа ргодисііоп, У. Ехр Мед. 179, 299-304. о 144. Зпнапіпіап, А., РтТеМег, К., ее, К.Р., Кипаїд,Т.М.5 Кізпінага, К., МУаКенат, А., Камаї, К., ОНавнпі, Р.з., -

Тпотрзоп, СВ. Мак, Т.В. (1993). ОШегепіаІ ТТ сеї совійтціайогу гедцігетепіз іп СО28 аеїісіепі тісе.

Зсіепсе 261, 609-612. 145. Зпег, А., Садзлгіпей, К.Т., Овмад, ІР., Сіегісі, М., Киїїрего, М., Реагсе, Е.)., ВеггоївКу, 9.А., «

Мозтапп, Т.К., датев, 5.Ї., Могве, Н.С. (1992). Коїе ої Т-сеїЇ дегімей суюКіпез іп (Ше домуп гедціайоп ої іттипе гезропзез іпрагазійс апа геїгоміга! іптесіоп. |Іттипо! Кем. 127,183-204. - с 146. ЗіереїйнкК, К.Н., Спи, І.Н., Кіттеї!лиаап, С.Р., МУейег, К., мап Негпмі)пеп, Н.К., КпеїЇ, Р. (1990). ц Реїїпе Іттиподеїісіепсу мігив (РІМ) іпбтесіоп іп (Ще саї аз а тоде! їтог НІМ іпТесіоп іп тап: ГРІМ іпдисей и"? ітраігтепі ої іттипе Тпсіоп. АІЮО5 Кев. Нит. Кеїгомігивзез 6, 1373-1378. 147. ЗіереїйпК, К.Н., Ті)пааг, Е., Ниіїзтап, К.С., Ниіїзтап, МУ., деКопде, А., Багру, І.Н., Егапсів, М.)., Кіттеілиаап, С.Р., Овіегттацйз, А.О. (1995). Еппапсетепі ої Тейпе іттиподеїісіепсу мігиз іпесіоп айег -І іттипігайоп м/п епмеіІоре діусоргоїеіп зирипії массіпев. У Мігої. 69, 3704-3711. 148. 5іпдег, 5.9. (1992). ІпігасеїІшіаг соттипісайоп апа сеїїхеїЇ аапевіоп. Зсіепсе 255, 1671-1674. о 149. тіїтдаїї, М.О., МУопд, 9.0., ГіпвІіеу, Р.5., Найаг, О.К. (1995). Совітшціайоп ої СО4- Т-сеїв міа -І СО28 тодиавез питап іттипоадеїїсіепсу (уре 1 іптесіоп апа геріїсайоп іп міго. АІО5 Кез. Ни. Кеїго. 11, 885-892. цу 150. Зргіпдег, Т.А., ОЮивіп, М.С., Ківпітої, Т.К., Магіп, 5.0. (1987). Те Іутрпосуїе ппсіоп азвосіаїей І БА-1, СО2 апа І БА-3 тоїіесшціев: сеїЇ ааневіоп гесеріоге ої (пе іттипе зувіет. Аппи. Кеу. Іттипої. о 5, 223-252. 151. Зргіпдег, Т.А. (1990). Ааневіоп гесеріогг ої (пе іттипе зувіет. Майшге 346, 425-434. 152. -ейаск, Р.М., Іепеспом, ЮО.)., Сгау, 0.5., Віцевіопе, 9У.А., Бйси, Р.МУ. (1994). 1/-4 ігеаїйтепі ої 8таї врієпіс В сеїЇз іпдисев со-віїтцаюгу тоїесшцев В7-1 апа В7-2. у. Іттипої. 152, 5723-5733. 153. Бутіпдіоп, Е.МУ., Вгаду, МУ., Ііпвіеу, Р.5. (1993). Ехргезвіоп апа їопсіоп ої В7 оп питап ерідегтаї іФ) Ї апдегпап'з сеїЇв. 9. Іттипої. 150,1286-1295. ко 154. Тауїюг, М.К. апа Сопеп, -.). (1992). СеїЇ теадіаей суфюіохісйу. Си. Оріп. Іттипої. 4, 338-343. 155. Тпотаз, К., Оамі, Ї.5., ІІрзКу, Р.Е. (1994). КПешйтаїйсій взупоміцт ів епгіспед іп таїйшге апіїдеп бо ргезепіїпуд депагікс сеїІв. У. Іттипої!. 152, 2613-2623. 156. Томупзепа, 5.Е., апа АЇївоп, 9У.Р. (1993). Титог ге|есіоп айег аїгесі совійтціайоп ої СОвж Т-сеїІв

Бу В7 ігапеГесієд теіапота сеїІв. 5сіепсе 259, 368-370. 157. Тигка Г.А., Іедрецег, 9У.А., ее, К., дипе, С.Н., Тпотрзоп, С.В. (1990). СО28 ів ап іпдисібіе Т сеї зипасе апіїідеп (Наї Ігапзаисез а ргоїїГегайме відпа! іп СОЗ" тайшге (тутосуїев. У). Іттипої. 144, 1646-1653. 65 158. Тигтка, Г.А., Ііпвіеу, Р.5., Раїпе, К., Зспіемеп, 0.Ї., Тпотрзоп, СВ., І еареЧег, 9.А.(1991). Зідпаї ігапзаисіоп міа СО4, СО8 апа СО28 іп тайштге апа іттайтге (путосуїев. 9. |Іттипої. 146, 1428-1436.

159. Опапие, Е.К. (1984). Апіїдеп ргезепіїпу Типсіоп ої (пе тасгорпаде. Аппи. Кеу. Іттипої. 2, 395-428. 160. мап Кооїеп, С, КепвіпК, /., Равсца!Ї,ЗаІседо, О., мап Оег5, К., Аагдеп, Ї. (1991). МопокКіпе ргодисіоп Бу питап Т-сеїІв: 1-1 аІрна ргодисіоп із Ітйей ю тетогу Т-сеїІ8. 9. Іттипої. 146,2654-2658. 161. мап Земепіег, О.А., ЗПітіги, М., Зпам, 5. (1991). КоЇїез ої тийіріе ассеззогу тоіесцієв іп Т сеї асіїмайоп. Сигт. Оріп Іттипої. З, 294-303. 162. МУапо, К, Мигрпу, К.М., Гой, О.М., МУеамег, С, КивзвеїЇ, 9У.Н. (1993). ЮОйегепіа! асіїмайоп о ої апіїдеп-війтиціайгеай вицісіде апа суїокіпе ргодисіоп раїйумлауз іп СО4- Т-сейв ів огедшайєй ру «Ше апіїідеп-ргезепіїпод сеїЇ. У Іттипої!. 150, 3832-42. 70 163. МУеізв, А. апа І тап, О.К. (1994). Зідпа! ігапзаисіоп Бу ІМмтрпосуїе апіїдеп гесеріогв. СеїЇ 76, 263-274. 164. МУШіатве, А. апа Вагсіау, А. (1988). Те іттиподіорийп зирепатіу-дотаіїпв їог сеїЇ в!,ипасе гесодпійоп. Апп. Кеу. Іттипої. 6, 381-405. 165. УУіпанадеп, А., Мемсотбре, 9., ЮОапдопа, Р., Зігапа, С, МУоодгооїе, М.М., Сигпег, МХ., Найег, О.А. (1995). ЄЕхргезвіоп ої совійтшШаюгу тоІесшевз В7-1 (СО80), 8В7-2 (СО86) апа іпіепеикіпй 12 іп тиКріе зспіеговіз Іезіопв. 9). Ехр. Мед. 182, 1985-1996. 166. Мататоїю, 9.К., Напзеп, Н., Но, МУ.Е., Могізпйа, Т.У., ОКида, Т., Замжма, Т.К. (1989). Ерідеті про

Іодіса! апа сіїпісаї азресів ої Тейпе іттиподеїісіепсу мігив іпіесйоп іп саїв їйот (Пе сопііїпепіа! Опіей

Зіафгез апа Сапада апа розвіріе тоде ої (гапзітізвіоп. 9У.А.М.М.А. 194, 213-220. 167. МазиКауа, М., ІпаївиКкі, А., Корауавзні, М. (1989). ЮОйШегепіа! іп мйго асіїмайоп ої СО4-СО08- апа 2о СОвнсра- пегрез зітріех мігиз-зресійс пПитап суююхіс Т-сеїЇІв. ). Іттипої. 143, 2051-2057. 168. Уввеії, Н., Зсппеїдег, Р.М., Іапіег, Г.С. (1993). ІпіегіеиКіп 7 зресіїїсайу іпдисевз В7/ВВ1 апіідеп оп питап сога Бріоса апа регірнега! ріоса Т-сеїЇІз апа Т сеї сіопев. Іпі. Іттипої. 5, 753-759. 169. 7апивзі, 5., Зітопеї|її, С, С'Апагеа, М., Санаи, С, Сіегісі, М., Тігейї, О., ОеРаої, Р. (1996). СО8" Іутрпосуїе рпепоїуре апа суїюКіпе ргодисіоп іп опо-їегт поп-ргодгезвог апа іп ргодгеззог райепів м/йй /НІМ-1 Га іптесіоп. Сіїп. Ехр. Іттипої. 105, 220-224. 170. 2пои, Т., МУеамег, С, Ііпвіеу, Р.5., Моипів, У.О. (1994). Т-сейв ої віаррпуіососса!| епіегоїохіп о

В-Ююїегілей ашоіттипе МК -Ірг/рг тісе гедціге совійтиціайоп (Пгоцдй (Ше 8В7-СО028/СТІА-4 раймжау "ог асімайоп апа осап ре огеапегділей іп омімо бу вітшціайоп ої (Ше ТТ сеї гесеріог іп (Ше арзепсе ої совіїтиагу відпаї!. Еиг. У. Іттипої. 24, 1019-1025. ее)

Claims (41)

«- Формула винаходу м

1. Терапевтичний вектор, що використовується в терапії інфекційних захворювань котів, який містить о Зв принаймні одну чужорідну нуклеїнову кислоту, кожна з яких (а) кодує білок, вибраний з групи, що складається з ч- білка котячого СЮО28, представленого в ЗЕО ІЮ МО:8, або його імуногенної частини; з білка котячого СО8О, представленого в ЗЕО ІЮ МО:2 або 4, або його імуногенної частини; з білка котячого СО86, представленого в ЗЕО ІЮО МО:6, або його імуногенної частини; або з білка котячого СТІ А-4, представленого в ЗЕО ІЮ МО:10, або його імуногенної частини; і (б) здатна експресуватися при введенні вектора у відповідного хазяїна. «

2. Терапевтичний вектор за п. 1, який відрізняється тим, що вектор являє собою терапевтичний шщ с рекомбінантний вірус з принаймні однією чужорідною нуклеїновою кислотою, вбудованою в неістотну ділянку . вірусного геному.

а З. Терапевтичний вектор за п. 2, який відрізняється тим, що містить принаймні дві чужорідні нуклеїнові кислоти, кожна з яких вбудована в неістотну ділянку вірусного геному.

4. Терапевтичний вектор за п. З, який відрізняється тим, що містить принаймні три чужорідні нуклеїнові -І кислоти, кожна з яких вбудована в неістотну ділянку вірусного геному.

5. Терапевтичний вектор за п. 4, який відрізняється тим, що містить чотири чужорідні нуклеїнові кислоти, о кожна з яких вбудована в неїістотну ділянку вірусного геному. -і б. Терапевтичний вектор за п. 2, який відрізняється тим, що вірусом є вірус віспи єнотів, вірус віспи 5р свиней або вірус герпесу котів.

-

7. Терапевтичний вектор за будь-яким з пп. 2-6, який відрізняється тим, що містить більш ніж одну со чужорідну нуклеїнову кислоту, кожна з яких вбудована в одну і ту ж неістотну ділянку.

8. Терапевтичний вектор за будь-яким з пп. 2-6, який відрізняється тим, що містить більш ніж одну чужорідну нуклеїнову кислоту, при цьому всі вказані чужорідні нуклеїнові кислоти не вбудовані в одну і ту ж в Неїстотну ділянку.

9. Терапевтичний вектор за будь-яким з пп. 2-6, який відрізняється тим, що додатково містить чужорідну Ф) нуклеїнову кислоту, яка кодує імуноген, що походить від патогену. ка

10. Терапевтичний вектор за п. 9, який відрізняється тим, що патогеном є котячий патоген, рабівірус, хламідія, Тохоріазта допаії, Оігойагіа іттійв, блоха або бактеріальний патоген. 60

11. Терапевтичний вектор за п. 10, який відрізняється тим, що котячим патогеном є вірус імунодефіциту котів (ГРІМ), вірус лейкозу котів (Бе! М), вірус інфекційного перитоніту котів (БІР), вірус панлейкопенії котів, котячий каліцивірус, котячий реовірус типу 3, котячий ротавірус, котячий корнавірус, синцитіальний вірус котів, вірус саркоми котів, вірус герпесу котів, вірус хвороби Борна котів або котячий паразит.

12. Терапевтичний вектор за будь-яким з пп. 2-6, який відрізняється тим, що принаймні одна чужорідна 65 Нуклеїнова кислота включає промотор для експресії чужорідної нуклеїнової кислоти.

13. Терапевтичний вектор за будь-яким з пп. 2-6, який відрізняється тим, що експресія принаймні однієї -Б4-

чужорідної нуклеїнової кислоти знаходиться під контролем промотору, який є ендогенним для вірусу.

14. Терапевтичний вектор за будь-яким з пп. 2-6, який відрізняється тим, що додатково містить чужорідну нуклеїнову кислоту, що кодує детектований маркер.

15. Терапевтичний вектор за п. 14, який відрізняється тим, що детектованим маркером є бета-галактозидаза

Е.сої.

16. Терапевтичний вектор за п. 11, який відрізняється тим, що імуногеном котячого патогену є дад-протеаза ЕМ, білок оболонки ЕРІМ, дад-протеаза Ре! М або білок оболонки Ре! М.

17. Терапевтичний вектор за будь-яким з пп. 2-6, який відрізняється тим, що вірусом є вірус герпесу котів, /о а неістотною ділянкою є ген глікопротеїну Е вірусу герпесу котів.

18. Терапевтичний вектор за п. 17, який відрізняється тим, що вірус герпесу котів позначений як 5-ЕНМ-031 (АТСС, номер доступу МК-2604).

19. Терапевтичний вектор за будь-яким з пп. 2-6, який відрізняється тим, що вірусом є вірус віспи свиней, а неістотною ділянкою є більш великий НіпаПІ-ВаПП-субфрагмент НіпапПІ-фрагмента М вірусу віспи свиней.

20. Терапевтичний вектор за п. 19, який відрізняється тим, що вірус віспи свиней позначений як 5-5РМ-246 (АТСС, номер доступу МК-2603).

21. Терапевтичний вектор за будь-яким з пп. 2-6, який відрізняється тим, що чужорідна нуклеїнова кислота кодує імуногенну частину білка котячого СО28, СО8О або СО86, при цьому імуногенна частина є розчинною.

22. Терапевтичний вектор за будь-яким з пп. 2-6, який відрізняється тим, що чужорідна нуклеїнова кислота кодує білок СТІ А-4 котів.

23. Терапевтичний вектор за п. 2, який відрізняється тим, що додатково містить нуклеїнову кислоту, що кодує геном вірусу котячого імунодефіциту або його частину.

24. Терапевтичний вектор за п. 2, який відрізняється тим, що додатково містить нуклеїнову кислоту, що кодує геном вірусу лейкозу котів або його частину. с

25. Терапевтичний вектор за п. 23 або 24, який відрізняється тим, що додатково містить нуклеїнову кислоту, що кодує котячий ЗМ-СЗЕ, котячий ІІ -12р35 або котячий ІІ -12р40. і)

26. Терапевтичний вектор за п. 2, який відрізняється тим, що вірусним геномом є дволанцюгова нуклеїнова кислота.

27. Терапевтичний вектор за п. 2, який відрізняється тим, що вірусним геномом є одноланцюгова нуклеїнова со Зо Кислота.

28. Терапевтичний вектор за п. 27, який відрізняється тим, що одноланцюгова нуклеїнова кислота є (87 антисмисловою. ї-

29. Терапевтичний вектор за п. 27, який відрізняється тим, що одноланцюгова нуклеїнова кислота є смисловою. о

30. Терапевтична вакцина, що використовується в терапії інфекційних захворювань котів, що містить ї- ефективну імунізуючу кількість терапевтичного вектора за будь-яким з пп. 2-6 і прийнятний носій.

31. Терапевтична вакцина за п. 30, яка відрізняється тим, що ефективна імунізуюча кількість терапевтичного вектора складає від біля 1х105 б.у.о./мл до біля 1х10 б.у.о./мл. «

32. Терапевтична вакцина за п. ЗО, яка відрізняється тим, що додатково включає суміш, що містить 70 терапевтичний вектор і ефективну імунізуючу кількість другого імуногена. - с

33. Спосіб підсилення імунної відповіді у котів, що включає введення коту ефективної імунізуючої ц кількості терапевтичного вектора за будь-яким з пп. 2-6. "»

34. Спосіб імунізації котів проти інфекційних захворювань, що включає введення коту ефективної кількості терапевтичного вектора за будь-яким з пп. 2-6.

35. Спосіб пригнічення імунної відповіді у котів, що включає введення коту ефективної супресуючої -І кількості терапевтичного вектора за п. 21 або 22.

36. Спосіб за п. 33 або 34, який відрізняється тим, що введення здійснюють внутрішньовенно, підшкірно, о внутрішньом'язово, черезм'язово, місцево, перорально або внутрішньочеревинно. -І

37. Спосіб за п. 35, який відрізняється тим, що кішка є реципієнтом трансплантованого органу або тканини або схильна до імунної реакції. -

38. Спосіб пригнічення імунної відповіді у котів, що включає введення коту нуклеїнової кислоти, здатної (Че гібридизуватися з нуклеїновою кислотою терапевтичного вектора за п. 27 і здатної гібридизуватися з (а) МРНК-транскриптом котячого СО28, (в) мРНК-транскриптом котячого СОВ8О, або (с) мРНК-транскриптом котячого сО86, і інгібувати їх трансляцію, при цьому вказана нуклеїнова кислота присутня в кількості, ефективній для інгібування трансляції і, тим самим, пригнічуючи імунну відповідь у котів.

39. Спосіб зменшення або знищення пухлини у котів, що включає введення коту терапевтичного вектора за п. Ф, 2, при цьому нуклеїнова кислота кодує білок котячого СО8О, білок котячого СЮО86 або їх комбінацію в кількості, ко ефективній для зменшення або знищення пухлини.

40. Спосіб за п. 39, який відрізняється тим, що терапевтичний вектор додатково містить котячий антиген, бо асоційований з пухлиною, і здатний його експресувати, при цьому введення є системним.

41. Терапевтична вакцина, що використовується в терапії інфекційних захворювань котів, що містить ефективну імунізуючу кількість терапевтичного вектора за п. 23 або 24 і прийнятний носій. б5