CN108025061B - 疫苗组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种疫苗组合物,其包含:(i)佐剂;和(ii)与载体蛋白缀合的至少一种融合肽,其中载体蛋白是白喉毒素变体CRM‑197(GenBank登录号1007216A),以及其中至少一种融合肽包含两种或多种不连续的Her2/neu的B细胞表位,所述B细胞表位选自SEQ ID NO:1‑7和15‑60、以及与前述任一序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。本发明还延伸到药物组合物,以及使用本文所述的疫苗和/或药物组合物用于治疗或预防在有需要的患者中的癌症的方法,所述癌症的特征在于Her2/neu的表达或过表达。
Description
技术领域
本发明一般涉及一种包含癌相关蛋白Her2/neu的片段的疫苗组合物,制备该组合物的方法,以及其用于预防或治疗以Her2/neu蛋白的表达或过表达为特征的癌症的用途。
背景技术
由erbB2/neu原癌基因编码的Her2/neu肿瘤抗原是一种185kDa的蛋白,其属于人表皮生长因子受体家族。它由具有数个糖基化位点富含半胱氨酸的细胞外结构域(ECD,氨基酸23至652)、疏水跨膜结构域(氨基酸653至675)和细胞内酪氨酸激酶结构域(氨基酸676至1255)组成。Her2/neu受体在各种上皮细胞类型的细胞膜上表达,并通过结合特定生长因子调节细胞生长和分裂的方面。
Her2/neu在许多正常细胞中以低水平表达,但在多种癌症中过表达,包括乳癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌和唾液腺癌。例如,约30%的转移性乳癌已显示过表达Her2/neu。这种过表达与乳癌患者的预后差相关,因为它对应于无复发时期的减少和生存时间的缩短。目前,治疗乳癌的最常见形式涉及手术、化学干预和/或放射治疗。除非癌症限于确定的区域,否则仅手术无法消除癌症。此外,放射治疗和化学治疗可能牵涉严重的负面副作用。
鉴于与目前治疗相关的缺点,已经尝试寻找治疗增殖性疾病如乳癌的其它方法,包括免疫治疗。
在肿瘤中Her2/neu过表达的临床意义使Her2/neu成为抗体介导的免疫治疗的有吸引力的靶标,单独或作为常规化学治疗的辅助。例如,单克隆抗体(mAb)4D5已经显示通过直接和间接机制如细胞凋亡、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)或补体依赖的细胞毒作用(CDC)减少在小鼠中表达Her2/neu的肿瘤的生长。基于这些结果,在临床试验中测试了这种抗体的人源化形式曲妥珠单抗(Trastuzumab)与仅化疗或仅曲妥珠单抗相比,细胞毒性治疗加后,观察到过表达Her2/neu的乳肿瘤患者的总体生存期增加。现在被用作单一治疗,但与细胞毒性化学治疗组合显示出甚至更高的功效。然而,应注意的是,曲妥珠单抗一般仅在Her2/neu受体过表达的乳癌中有效。此外,通常需要多次输注,导致高治疗成本。
使用采用单克隆抗体如曲妥珠单抗的被动免疫治疗来治疗或预防Her2/neu相关癌症的替代方法是基于肿瘤特异性体液和/或细胞免疫应答的诱导,以及由人B淋巴细胞和T淋巴细胞识别的抗原的鉴定。例如,通过采用表达Her2/neu的细胞免疫小鼠,已经产生针对Her2/neu细胞外结构域(ECD)的许多抗体。这些抗体的生物学作用似乎是表位特异性的;即,它基于特异性识别Her2/neu ECD内的一种短的子序列。然而,一些抗体没有作用或甚至积极地刺激肿瘤生长。
这种癌症的疫苗免疫治疗基于引发体液和/或细胞应答的抗原。理想地,这些抗原应该唯一地由肿瘤细胞表达或过表达,通常称为肿瘤相关抗原(TAA)。对于乳癌描述的第一种TAA之一是Her2/neu。同时,已经对表现不同表位的各种TAA进行了测试,但到目前为止还没有成功进入临床实践。
取决于预期的免疫应答的类型(即B细胞应答或T细胞应答),通常应用不同的策略。例如,为了诱导B细胞(即抗体)应答,抗原应包含B细胞表位。如本领域一般理解的,B细胞表位是被B细胞受体识别和结合的抗原的一部分。脂质、多糖和蛋白/肽可以含有B细胞表位,其在引入选择的生物体中导致B细胞产生特异性结合引入的表位的抗体。
包括B细胞表位的Her2/neu的ECD的个体片段是本领域已知的。例如,WO2002/068474描述了一种疫苗,其包含9-25个氨基酸的肽,该序列出现在Her2/neu蛋白的细胞外部分。此外,WO 2007/118660描述了一种多肽疫苗,其包含在Her2/neu蛋白的细胞外部分中出现的呈递不同氨基酸序列的肽的特异性组合。这些肽可以以多种离散肽的形式单独或组合施用,优选各自分别与递送系统缀合。在另一个示例中,WO 2011/020604描述了融合肽,其包含与病毒体递送系统偶联的多种Her2/neu B细胞表位。与采用MontanideTM或基于ISCOM的递送系统制剂的相同的融合肽相比,这些病毒体显示诱导针对单一B细胞表位的更高的抗体滴度。
尽管对开发诱导针对Her2/neu免疫的合适疫苗进行了数次尝试,但临床使用中仍然没有有效的疫苗。本发明的目的是提供一种适合用作疫苗的改善的组合物,其用于治疗或预防以Her2/neu的表达或过表达为特征的病症(如癌症)。
发明内容
本说明书描述了一种疫苗组合物,其包含:
(i)佐剂;和
(ii)与载体蛋白缀合的至少一种融合肽,
其中载体蛋白是白喉毒素变体CRM-197(GenBank登录号1007216A;SEQ ID NO:61),并且其中至少一种融合肽包含两种或多种不连续的Her2/neu的B细胞表位,其选自SEQID NO:1-7和15-60、以及与前述任一序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
本说明书还描述了一种药物组合物,其包含本文所述的疫苗组合物和药学上可接受的载体。
本说明书还描述了一种在有需要的患者中治疗或预防癌症的方法,所述癌症的特征在于Her2/neu的表达或过表达,所述方法包括以下步骤:向所述患者施用有效量的本文所述的疫苗组合物,或本文所述的药物组合物。
本说明书还描述了本文所述的疫苗组合物在制备用于在有需要的患者中治疗或预防癌症的药物中的用途,所述癌症特征在于Her2/neu的表达或过表达。
本说明书还公开了本文所述的疫苗组合物或药物组合物,用于在有需要的患者中治疗或预防癌症,所述癌症特征在于Her2/neu的表达或过表达。
附图说明
图1显示在采用掺入P467或P647融合肽的病毒体或CRM197-融合蛋白缀合物(CRM)进行第四次免疫接种后,获得的血清样品中的抗P4抗体的滴度。数据表示为OD值。
图2显示在采用掺入P467或P647融合肽的病毒体或CRM197-融合蛋白缀合物(CRM)的进行第四次免疫接种后获得的血清样品中的抗P6抗体的滴度。数据表示为OD值。
图3显示在采用掺入P467或P647融合肽的病毒体或CRM197-融合蛋白缀合物(CRM)进行第四次免疫接种后获得的血清样品中的抗P7抗体的滴度。数据表示为OD值。
图4显示在采用掺入P467或P647融合肽的病毒体或CRM197-融合蛋白缀合物(CRM)进行第四次免疫接种后获得的血清样品中的抗P467抗体的滴度。数据表示为OD值。
图5显示在采用掺入P467或P647融合肽的病毒体或CRM197-融合蛋白缀合物(CRM)进行第四次免疫接种后获得的血清样品中的抗P647抗体的滴度。数据表示为OD值。
图6显示了在采用掺入P467或P647融合肽的病毒体或者CRM197-融合蛋白缀合物(CRM)进行第二次(BA1;第1次抽血)、第三次(BA2;第2次抽血)和第四次(BA3;第3次抽血)免疫接种后两周获得的血清样品中的抗P467抗体的滴度。数据表示为OD值。
图7显示了在采用掺入P467或P647融合肽的病毒体或者CRM197-融合蛋白缀合物(CRM)进行第二次(BA1;第1次抽血)、第三次(BA2;第2次抽血)和第四次(BA3;第3次抽血)免疫接种后两周获得的血清样品中的抗P647抗体的滴度。数据表示为OD值。
图8显示了采用掺入P467或P647融合肽的病毒体制剂(15、30、50μg)或CRM197-融合蛋白缀合物(CRM;30μg)进行第二次(BA1;第1次抽血)和第三次(BA2;第2次抽血)免疫接种后两周获得的血清样品的抗体,能够结合重组Her2/neu的ECD。数据表示为OD值。
图9显示了采用掺入P467或P647融合肽的病毒体制剂(15、30、50μg)或CRM197-融合蛋白缀合物(CRM;30μg)第二次(BA1;第1次抽血)免疫接种后两周获得的血清样品的重组Her2/neu特异性抗体。数据表示为OD值。
图10显示了采用掺入P467或P647融合肽的病毒体制剂(15、30、50μg)或CRM197-融合蛋白缀合物(CRM;30μg)第四次(BA3;第3次抽血)免疫接种后两周获得的血清样品的重组Her2/neu特异性抗体。数据表示为OD值。
图11显示了采用包含P467或P647融合肽的CRM197-融合蛋白缀合物(CRM;30μg)的第二次、第三次和第四次免疫接种后的重组Her2/neu特异性抗体滴度的动力学。以1:4000的稀释度测定血清。数据表示为OD值。
图12显示了采用浓度为30μg的缀合至病毒体或CRM197的P467融合肽第2次、第3次和第4次免疫接种后抗体滴度的直接比较。在每组中从左到右:前混合物(免疫接种前抽血);TIRIV(空的病毒体);P467-30mg/小鼠(病毒体缀合的);P467-30mg/小鼠-CRM(CRM197缀合的)。以相同的稀释度测定所有血清。数据表示为OD值。
图13显示了采用浓度为30μg的缀合至病毒体或CRM197的P647融合肽第2次、第3次和第4次免疫接种后抗体滴度的直接比较。在每组中从左到右:前混合物(免疫接种前抽血);TIRIV(空的病毒体);P647-30mg/小鼠(病毒体缀合的);P647-30mg/小鼠-CRM(CRM197缀合的)。以相同的稀释度测定所有血清。数据表示为OD值。
图14显示采用掺入P467或P647融合肽的病毒体或者CRM197-融合蛋白缀合物(CRM)免疫接种诱导的抗体,其能够结合SKBR-3乳癌细胞表面上表达的原生的(native)Her2/neu。数据表示为OD值。
图15A显示了在10μg、25μg和50μg三种剂量的P467-CRM197融合蛋白单独施用(P467-CRM)、与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)后,小鼠中的抗P467IgG抗体的滴度。将抗体滴度与单独施用P467肽(P467;25μg)、单独施用来自Brenntag的Alum(Alum(Brenntag))或CRM197(CRM)的对照动物中所见的水平相比较。数据表示为OD值;*p<0.05、**p<0.01以及***p<0.001。
图15B显示了在10μg、25μg和50μg三种剂量的P467-CRM197融合蛋白单独施用(P467-CRM)、与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)后,小鼠中的抗P467IgG1抗体的滴度。将抗体滴度与单独施用P467肽的对照动物中所见的水平相比较。数据表示为OD值;*p<0.05、**p<0.01以及***p<0.001。
图15C显示了在10μg、25μg和50μg三种剂量的P467-CRM197融合蛋白单独施用(P467-CRM)、与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)后,小鼠中的抗P467IgG2a抗体的滴度。将抗体滴度与单独施用P467肽(P467;25μg)、单独施用来自Brenntag的Alum(Alum(Brenntag))或CRM197(CRM)的对照动物中所见的水平相比较。数据表示为OD值;*p<0.05、**p<0.01以及***p<0.001。
图16A显示了在10μg、25μg和50μg三种剂量的P467-CRM197融合蛋白单独施用(P467-CRM)、与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)后,小鼠中的抗细胞外Her2/neu IgG抗体的滴度。将抗体滴度与单独施用P467肽(P467;25μg)、单独施用来自Brenntag的Alum(Alum(Brenntag))或CRM197(CRM)的对照动物中所见的水平相比较。数据表示为OD值;*p<0.05、**p<0.01以及***p<0.001。
图16B显示了在10μg、25μg和50μg三种剂量的P467-CRM197融合蛋白单独施用(P467-CRM)、与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)后,小鼠中的抗细胞外Her2/neu IgG1抗体滴度。将抗体滴度与单独施用P467肽(P467;25μg)、单独施用来自Brenntag的Alum(Alum(Brenntag))或CRM197(CRM)的对照动物中所见的水平相比较。数据表示为OD值;*p<0.05、**p<0.01以及***p<0.001。
图17A显示了来源于小鼠的CRM197激活的脾细胞的IL-2产生,所述小鼠采用10μg、25μg和50μg的P467-CRM197融合蛋白单独施用(P467-CRM)、与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)而免疫。将IL-12水平(pg/ml)与来源于单独施用Alum(Alum(Brenntag))、单独施用Montanide(Montanide)或单独施用CRM197(CRM)的对照动物中CRM197激活的脾细胞中所见的IL-2水平进行比较。数据表示为pg/ml;**p<0.01以及ns=无统计学显著性。
图17B显示了来源于小鼠的P467激活的脾细胞的IL-2产生,所述小鼠采用10μg、25μg和50μg的P467-CRM197融合蛋白单独施用(P467-CRM)、与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)而免疫。将IL-12水平(pg/ml)与来源于单独施用Alum(Alum(Brenntag))、单独施用Montanide(Montanide)或单独施用CRM197(CRM)的对照动物中P467激活的脾细胞中所见的IL-2水平进行比较。数据表示为pg/ml;*p<0.05、**p<0.01以及ns=无统计学显著性。
图18A显示了来源于小鼠的CRM197激活的脾细胞的IFNγ产生,所述小鼠采用10μg、25μg和50μg的P467-CRM197融合蛋白单独施用(P467-CRM)、与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)而免疫。将IFNγ水平(pg/ml)与来源于单独施用Alum(Alum(Brenntag))、单独施用Montanide(Montanide)或单独施用CRM197(CRM)的对照动物中CRM197激活的脾细胞中所见的IFNγ水平进行比较。数据表示为pg/ml;*p<0.05以及ns=无统计学显著性。
图18B显示了来源于小鼠的P467激活的脾细胞的IFNγ产生,所述小鼠采用10μg、25μg和50μg的P467-CRM197融合蛋白单独施用(P467-CRM)、与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)而免疫。将IFNγ水平(pg/ml)与来源于单独施用Alum(Alum(Brenntag))、单独施用Montanide(Montanide)或单独施用CRM197(CRM)的对照动物中P467激活的脾细胞中所见的IFNγ水平进行比较。数据表示为pg/ml;ns=无统计学显著性。
图19A显示了来源于小鼠的CRM197激活的脾细胞IL-5的产生,所述小鼠采用10μg、25μg和50μg的P467-CRM197融合蛋白单独施用(P467-CRM)、与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)而免疫。将IL-5水平(pg/ml)与来源于单独施用Alum(Alum(Brenntag))、单独施用Montanide(Montanide)或单独施用CRM197(CRM)的对照动物中CRM197激活的脾细胞中所见的IL-5水平进行比较。数据表示为pg/ml;*p<0.05、**p<0.01以及ns=无统计学显著性。
图19B显示了来源于小鼠的P467激活的脾细胞IL-5的产生,所述小鼠采用10μg、25μg和50μg的P467-CRM197融合蛋白单独施用(P467-CRM)、与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)而免疫。将IL-5水平(pg/ml)与来源于单独施用Alum(Alum(Brenntag))、单独施用Montanide(Montanide)或单独施用CRM197(CRM)的对照动物中P467激活的脾细胞中所见的IL-5水平进行比较。数据表示为pg/ml;ns=无统计学显著性。
图20A显示采用10μg、25μg和50μg的P467-CRM197融合蛋白,与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)免疫的小鼠中,处死时CD3+CD4+脾细胞(T淋巴细胞)分布。将CD3+CD4+脾细胞的百分比与单独施用Alum(Alum(Brenntag))、单独施用Montanide(Montanide)或单独施用CRM197(CRM)的对照动物中所见的CD3+CD4+脾细胞的百分比进行比较。数据表示为总细胞数的百分比;ns=无统计学显著性。
图20B显示采用10μg、25μg和50μg的P467-CRM197融合蛋白,与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)免疫的小鼠中,处死时CD3+CD8+脾细胞(T淋巴细胞)分布。将CD3+CD8+脾细胞的百分比与单独施用Alum(Alum(Brenntag))、单独施用Montanide(Montanide)或单独施用CRM197(CRM)的对照动物中所见的CD3+CD8+脾细胞的百分比进行比较。数据表示为总细胞数的百分比;ns=无统计学显著性。
图20C显示采用10μg、25μg和50μg的P467-CRM197融合蛋白,与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)免疫的小鼠中,处死时CD3-CD19+脾细胞(B细胞)分布。将CD3-CD19+脾细胞的百分比与单独施用Alum(Alum(Brenntag))、单独施用Montanide(Montanide)或单独施用CRM197(CRM)的对照动物中所见的CD3-CD19+脾细胞的百分比进行比较。数据表示为总细胞数的百分比;ns=无统计学显著性。
图20D显示采用10μg、25μg和50μg的P467-CRM197融合蛋白,与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)免疫的小鼠中,处死时CD335+脾细胞(自然杀伤(NK)细胞)分布。将CD335+脾细胞的百分比与单独施用Alum(Alum(Brenntag))、单独施用Montanide(Montanide)或单独施用CRM197(CRM)的对照动物中所见的CD335+脾细胞的百分比进行比较。数据表示为总细胞数的百分比;*p<0.05,以及ns=无统计学显著性。
图21A显示采用10μg、25μg和50μg的P467-CRM197融合蛋白,与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)免疫的小鼠中,处死时CD3+CD4+IFNγ+脾细胞(产生IFNγ的T细胞)的分布。将CD3+CD4+IFNγ+脾细胞的百分比与单独施用Alum(Alum(Brenntag))、单独施用Montanide(Montanide)或单独施用CRM197(CRM)的对照动物中所见的CD3+CD4+IFNγ+脾细胞的百分比进行比较。数据表示为总细胞数的百分比;ns=无统计学显著性。
图21B显示采用10μg、25μg和50μg的P467-CRM197融合蛋白,与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)免疫的小鼠中,处死时CD3+CD8+IFNγ+脾细胞(产生IFNγ的T细胞)的分布。将CD3+CD8+IFNγ+脾细胞的百分比与单独施用Alum(Alum(Brenntag))、单独施用Montanide(Montanide)或单独施用CRM197(CRM)的对照动物中所见的CD3+CD8+IFNγ+脾细胞的百分比进行比较。数据表示为总细胞数的百分比;*p<0.05,以及ns=无统计学显著性。
图21C显示采用10μg、25μg和50μg的P467-CRM197融合蛋白,与来自Brenntag的Alum施用(P467-CRM+Alum)、与来自Serva的Alum施用(P467-CRM+Alum(Serva))或与Montanide施用(P467-CRM+Montanide)免疫的小鼠中,处死时CD335+IFNγ+脾细胞(产生IFNγ的T细胞)的分布。将CD335+IFNγ+脾细胞的百分比与单独施用Alum(Alum(Brenntag))、单独施用Montanide(Montanide)或单独施用CRM197(CRM)的对照动物中所见的CD335+IFNγ+脾细胞的百分比进行比较。数据表示为总细胞数的百分比;*p<0.05,以及ns=无统计学显著性。
图22显示了在以10μg、25μg和50μg的P467-CRM肽构建体与Alum(P467-CRM+Alum)或Montanide(P467-CRM+Montanide)施用最后剂量之后,在3周(BA2)、8周(BA3)、16周(BA4)和6个月(BA5)时P467肽特异性IgG抗体的滴度。数据表示为OD值。在每个群集中从左到右:BA2、BA3、BA4、BA5和之前的血液(pre-bleed)。
图23显示了在以10μg、25μg和50μg的P467-CRM肽构建体与Alum(P467-CRM+Alum)或Montanide(P467-CRM+Montanide)施用最后剂量后,在3周(BA2)、8周(BA3)、16周(BA4)和6个月(BA5)时Her2/neu特异性IgG抗体的滴度。数据表示为OD值。在每个群集中从左到右:BA2、BA3、BA4、BA5和之前的血液。
具体实施方式
本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的,而非旨在限制。除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。可以使用与本文所述相似或等同的任何材料和方法来实施本发明。对于本领域技术人员已知的技术的定义和术语以及其它方法,实施者可参考Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor出版社,Plainsview,N.Y.以及Ausubel等人(1999)Current Protocols in Molecular Biology(增刊47),John Wiley&Sons,New York,Murphy等人(1995)Virus Taxonomy SpringerVerlag:79-87。
贯穿本说明书,除非上下文另有要求,词语“包含”或者如“包括”或“含有”之类的变化,将被理解为暗示包含所述元素或整数、或者元素或整数的组,但不排除任何元素或整数、或者元素或整数的组。
“由...组成”是指包括并且限于跟随在短语“由...组成”之后的。因此,短语“由...组成”表示列出的元素是需要的或强制性的,并且不存在其它元素。“基本上由...组成”是指包括在该短语之后列出的任何元素,并且包括限于不干扰或有助于所列元素的在公开中指定的活性或功能的其它元素。因此,短语“基本上由...组成”表示列出的元素是需要的或强制性的,但是其它元素是可选的,并且可能存在或不存在,这取决于它们是否影响列出的元素的活性或功能。
如本文使用的,单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数的方面,除非上下文另有明确规定。因此,例如,提及“细胞”包括单一的细胞,以及两个或多个的细胞;提及“生物体”包括单一的生物体,以及两个或多个生物体;等。
核苷酸和氨基酸序列由序列标识符号(SEQ ID NO)表示。SEQ ID NO与序列标识符<400>1、<400>2等数字对应。序列标识符的概要在本文中提供。
本公开至少部分地基于发明人令人惊奇的发现,即发现一种疫苗组合物,其包含(i)佐剂和(ii)与无毒的白喉毒素变体CRM-197(GenBank登录号1007216A)缀合的来源于Her2/neu的细胞外结构域(ECD)多种B细胞表位的融合肽,能够引发远优于通过使用如病毒体的递送系统可获得的抗原特异性抗体应答。
因此,在一个方面,提供一种疫苗组合物,其包含:
(i)佐剂;和
(ii)与载体蛋白缀合的至少一种融合肽,
其中载体蛋白是白喉毒素变体CRM-197(GenBank登录号1007216A;SEQ ID NO:61),并且其中至少一种融合肽包含两种或多种不连续的Her2/neu的B细胞表位,其选自SEQID NO:1-7和15-60、以及与前述任一序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
B细胞表位
如本文使用的术语“B细胞表位”是指被B细胞受体(抗体)识别的分子的一部分。因此,“B细胞表位”应理解为抗原的小的子序列,所述表位子序列能够被抗体识别。抗原可以含有多种B细胞表位,因此可以被多种不同的抗体结合,但是该抗原的任何给定的表位片段通常仅被一种抗体结合。
如本文使用的术语“肽”和“多肽”以其最广义的含义使用,是指两个或多个氨基酸残基或氨基酸类似物的分子。氨基酸残基可以通过肽键连接,或者可选择地通过其它键连接,例如酯,醚等,但在大多数情况下将通过肽键连接。
如本文使用的,术语“氨基酸”或“氨基酸残基”包括天然和非天然或合成氨基酸,包括D型或L型以及氨基酸类似物。“氨基酸类似物”应被理解为在一个或多个原子上,与相应的天然存在的氨基酸不同的非天然存在的氨基酸。例如,半胱氨酸的氨基酸类似物可以是同型半胱氨酸。
本领域技术人员已知如何确定肽是否是Her2/neu的B细胞表位。在示例性实例中,可以通过使用已建立的计算机程序,高度准确的将肽鉴定为B细胞表位或包含B细胞表位,所述计算机程序将所讨论肽的序列与已知被人或小鼠种系编码的抗体识别的已知序列和/或部分序列的数据库进行比较。可选择地,给定肽或多肽中的B细胞表位可以通过计算机辅助分析来鉴定,其使用抗原性(antigenicity)相关性的各种组合,如表面可接触性、链柔性、亲水性/亲水性情况(profile)、预测的二级结构等。可选择地,所讨论的肽可以通过这样的方法被鉴定为是B细胞表位或包含B细胞表位,即采用所讨论的肽免疫动物至少一次,允许免疫应答上升,然后使用例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、蛋白印迹(Western blot)分析或斑点印迹分析,测试动物的血清中特异性结合所施用的肽的至少一部分的抗体。本文以下在实施例6和7中提供了如何确定所讨论的肽是否为B细胞表位的更详细的描述。
下表1列出了Her2/neu细胞外结构域的B细胞表位的氨基酸序列,包括其衍生物:
表1:
在本文公开的一个实施方案中,两种或多种B细胞表位选自如表1和表2显示的SEQID NO:1-7和15-60,以及与前述任一序列具有至少85%同一性的氨基酸序列(即,与SEQ IDNO:1-7和15-60中任一序列具有至少85%的序列同一性)。在本文公开的另一个实施方案中,两种或多种B细胞表位选自SEQ ID NO:1-7和与前述任一序列具有至少85%同一性的氨基酸序列;即,与SEQ ID NO:1-7中任一序列具有至少85%的序列同一性。应注意的是,这些B细胞表位中没有一种在原生的Her2/neu中是连续的。
与SEQ ID NO:1-7和15-60中任一序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列包括衍生物,所述衍生物由Her2/neu ECD原生的(即天然存在的)B细胞表位中至少一个氨基酸被Her2/neu的该位置不存在的另一个氨基酸取代而产生,使得氨基酸取代保持保守。可以制备衍生物以增加融合肽在中间体和/或终产物中的稳定性,或增加融合肽在中间体和/或终产物中的溶解度,或增加融合肽的免疫原性。制备合适的衍生物的方法是本领域技术人员已知的。示例性实例包括合成衍生物或使用突变的核酸分子的衍生物重组生产。此外,如本文别处所述的,衍生物通常保留将其作为B细胞表位的特性。因此,本文还公开的是“功能”衍生物,其中原生的序列的氨基酸取代不能或不完全地消除衍生物作为B细胞表位发挥功能的能力。
额外的或最佳化的免疫刺激融合肽的鉴定还可以包括这样的步骤,即将通过融合肽对B细胞的刺激和通过衍生物对B细胞的刺激进行比较,作为衍生物刺激免疫效应细胞有效性的确定。通过将衍生物与已知的融合肽进行比较,可以制备具有增加的免疫细胞刺激性质的肽。
如本文使用的,“保守取代”是指在给定位置改变氨基酸同一性以替换大小、电荷和/或极性几乎相当的氨基酸。氨基酸的天然保守取代的实例包括以下8种取代基(由常规单字母代码指定):(1)M、I、L、V;(2)F、Y、W;(3)K、R、(4)A、G;(5)S、T;(6)Q、N;(7)E、D;和(8)C、S。
衍生物也可以由功能等同的氨基酸取代产生。如本文使用的,这些被理解为氨基酸取代,当实施所述氨基酸取代时产生这样的融合肽,基于来自动物的血清(包含衍生的表位片段的融合肽或衍生的表位片段已被施用至所述动物),与没有相应的衍生化的融合肽相比,所述的融合肽产生相同或相当(例如,10%以内)的ELISA读数。融合肽的抗原性可以例如通过ELISA测量免疫接种动物引发的抗体的滴度来确定,例如在实施例6和7中所述的。类似的过程可用于测定氨基酸取代的功能等同性、保守性或其它。例如,使用相同测定,将包含非衍生的“亲本”片段的融合肽所引发的免疫应答与包含衍生的片段的融合肽所引发的免疫应答进行比较。如果由包含衍生的片段的融合肽所引发的免疫应答与由非衍生化片段的融合肽是引发的免疫应答一样强,那么氨基酸取代可被视为是功能等同的。如果衍生的免疫应答优于非衍生的免疫应答,那么氨基酸取代可被视为是改善的。
如本文使用的,术语“原生的”和“天然的”是指通常天然存在的分子的形式。因此,Her2/neu的ECD的“原生的”序列是指先前公开的Her2/neu氨基酸序列的氨基酸残基23-652(Swiss-Prot数据库登录号P04626;ERBB2_HUMAN)。相反,包括“非原生的接头”的“非原生的”序列是不属于Her2/neu的ECD的原生序列的任何氨基酸序列。因此,在本文公开的一个实施方案中,肽“非原生的接头”不表示和相邻Her2/neu原生序列相连接的Her2/neu片段之一的延伸。
融合肽
基于多种表位/肽的Her2/neu表达或Her2/neu过表达癌症的免疫预防和/或免疫治疗疫苗组合物的设计,需要施用这样的肽,如离散的(即单独的)肽。这有一些隐含的缺点。例如,在相同组合物内同时施用多种肽会存在这些肽将聚集的风险,从而降低其对宿主免疫系统的预期可用性。在极端情况下,这种聚集的溶解度可能降低,使得聚集沉淀,对宿主免疫系统而言变得不可用。同时,在不同溶液中和不同时间点分别施用这些肽,降低了这种肽的免疫原性作用以有利的方式组合的可能性。
当采用某些类型的递送系统(如病毒体、脂质体或病毒样颗粒(VLP))使用多种单一表位时,会出现进一步的困难。为了允许可重复的疫苗生产,以确定的浓度呈递表位是有利的。然而,当将多种肽片段偶联(即共价结合)到单一递送系统如病毒体或脂质体时,难以确保相同数量的表位与每种递送系统偶联。每递送系统的偶联数量的波动总是存在的。虽然可以相对确定每种可行的递送系统将与例如每种表位A和B偶联,但一些递送系统将比预期稍微更多的结合表位A,而在其它递送系统中,表位B将稍微超过预期量。虽然表位A和B的高斯分布将趋于集中在片段A:片段B的预期比例,但按定义而言,任何高斯分布含有离群值,这些离群值可能会降低最大免疫原性功效,并且变得越来越昂贵且费力以排除,因为在递送系统中维持预期表位比例的需求变得更加严格。相似的问题也适用于当组合递送系统(如与不同表位片段结合的病毒体),试图实现一种Her2/neu ECD片段与另一种Her2/neuECD片段的期望比例。
本文公开了克服或至少部分减轻上述缺点的方法。通过在单一融合肽中,连接来自Her2/neu的ECD的至少两种不连续的B细胞表位或其衍生物,可以实现仅存在一种融合肽的均质制剂。融合肽的元素(即原生的ECD中不连续的Her2/neu的ECD的表位)在每种肽中是相同的,并且可以选择(或选择和修饰),使得不期望的多肽内和多肽间相互作用最小化。
在本文所述的一个实施方案中,疫苗组合物将包含单一类型的融合肽。因此,存在的B细胞表位的比例最终由融合肽中这些片段的比例决定。这意味着引发免疫原性应答的任何期望的比例可以在融合肽构建体和设计的水平上容易地且可靠地得以固定。
最后,当使用无毒的白喉毒素变体CRM-197作为载体蛋白来递送本文所述的融合肽时,可以最小化或避免这样的变异性,即所述变异性与每种Her2/neu B细胞表位在疫苗组合物中的相对分布有关,因为一种Her2/neu B细胞表位与其任何其它原生的不连续B细胞表位的比例将保持恒定,而无论多少融合肽与载体蛋白结合,因为如上所述,该比例在单一融合肽的水平上是确定的。
在本文公开的其它实施方案中,疫苗组合物将包含多于一种类型的融合肽。
本文公开的疫苗组合物在其所施用的宿主中引发抗原特异性抗体应答。令人惊讶的是,由疫苗组合物引发的抗原特异性应答比单独使用Her2/neu B细胞表位或使用替代递送系统(如病毒体)可获得的免疫应答具有更大的数量级。因此,本发明避免或至少将肽掺入病毒体的复杂制备过程的缺点最小化,变异性通常与以下相关:试图将多种个体肽掺入递送系统,以及单独的B细胞表位片段之间可能的不利相互作用,这可能降低产生疫苗组合物的功效。
如本文使用的,术语“融合肽”是指由Her2/neu的ECD的两种或多种不连续的B细胞表位组成的非原生肽(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、11种或更多种Her2/neu的ECD的不连续的B细胞表位),所述两种或多种不连续的B细胞表位例如通过肽(酰胺)键彼此连接。在本文公开的一个实施方案中,Her2/neu的ECD的两种或多种B细胞表位在其原生的状态下不连续;即,在原生的Her2/neu的ECD中。
在本文公开的一个实施方案中,融合肽包含Her2/neu的ECD的至少三种不连续的B细胞表位。在一个实施方案中,融合肽包含选自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:8-14和与前述任一序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
下表2提供了根据本文公开的一些实施方案的所选择的B细胞表位以及融合肽的列表:
表2:
在本文公开的一个实施方案中,融合肽包含SEQ ID NO:8(指定为融合肽P467)或SEQ ID NO:9(指定融合肽P647)的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少85%同一性的氨基酸序列,如上表2中显示的。
本文还涉及融合肽,其包含以串联重复连接两次或多次的两种或多种Her2/neu的ECD的B细胞表位,其选自:SEQ ID NO:1-7和15-60、或与前述任一序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。例如,本文涉及的融合肽可以包含SEQ ID NO:1的两个或多个串联重复、SEQID NO:2的两个或多个串联重复、SEQ ID NO:3的两个或多个串联重复、SEQ ID NO:4的两个或多个串联重复、SEQ ID NO:5的两个或多个串联重复,等。然而,应当理解的是,将两种或多种不同的B细胞表位掺入融合肽中更有可能通过引发特异性识别Her2/neu的ECD的多种B细胞表位的抗体产生更有益的免疫应答。因此,在本文公开的一个实施方案中,融合肽包含Her2/neu的ECD的至少两种不同的B细胞表位,其选自SEQ ID NO:1-7和15-60、或与前述任一序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
在本文公开的一个实施方案中,融合肽由选自SEQ ID NO:8-14的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中,融合肽由SEQ ID NO:8(指定为融合肽P467)或SEQ ID NO:9(指定为融合肽P647)的氨基酸序列组成。
在SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的个体B细胞表位中,如上表2所示,SEQ ID NO:4包含以Cys结束的额外的C末端接头(即,GGGGGC),所述接头在SEQ ID NO:3中未发现。SEQ IDNO:4中的该C-末端接头本身以Cys结束,其允许该单一表位与载体蛋白偶联,如下文所述的一些实施例所示。当用作本发明的融合肽的一部分时,SEQ ID NO:4的B细胞表位以SEQ IDNO:3的形式存在于该融合肽中。在使用SEQ ID NO:4的B细胞表位的实验中,对应于SEQ IDNO:3的SEQ ID NO:4的部分发挥B细胞表位的功能。
如本文所述的制备融合肽的合适方法将是本领域技术人员熟悉的。示例性实例包括肽合成,其涉及将每种B细胞表位与其分别相邻的B细胞表位进行连接的肽键的连续形成,如本文别处所述的,并涉及回收所述融合肽。合适的肽合成方法在本领域中是已知的。示例性实例包括在“Amino Acid and Peptide Synthesis”(Oxford Chemistry Primers;由John Jones,Oxford University出版社)中描述的方法。合成肽也可以通过在不同固体支持物(例如聚苯乙烯,聚酰胺或PEG)上的液相合成或固相肽合成(SPPS)来制备。SPPS可以包括使用F-moc(9H-芴-9-基甲氧基羰基)或t-Boc(叔丁氧基羰基)。定制肽也可从许多商业制造商获得。
可选择地,融合肽可以通过重组方法制备。例如,包含编码融合肽的核酸序列的核酸分子可以转染到能够表达所述核酸序列的合适的宿主细胞中,在适于表达所述核酸序列的条件下孵育所述宿主细胞,并回收所述融合肽。基于遗传密码的知识,制备编码感兴趣的融合肽的核酸分子的合适方法也是本领域技术人员已知的,可能包括基于用于表达和/或分泌重组融合肽的宿主细胞(例如微生物)的性质的优化密码子。合适的宿主细胞也是本领域技术人员已知的,其示例性实例包括原核细胞(例如,大肠杆菌(E.coli))和真核细胞(例如毕赤酵母(P.pastoris))。参考“Short Protocols in Molecular Biology,第5版,第2卷集:A Compendium of Methods from Methods Protocols in Molecular Biology”(由Frederick M.Ausubel(作者,编辑),Roger Brent(编辑),Robert E.Kingston(编辑),David D.Moore(编辑),J.G Seidman(编辑),John A.Smith(编辑),Kevin Struhl(编辑),JWiley&Sons,伦敦)。
如本文使用的,术语“编码”等是指核酸提供另一种核酸或多肽的能力。例如,一种核酸序列如果通常在宿主细胞中它可以被转录和/或翻译以产生多肽,或者如果它可以被加工成可被转录和/或翻译以产生多肽的形式,则称所述核酸序列“编码”多肽。这样的核酸序列可以包括编码序列或编码序列和非编码序列两者。因此,术语“编码”等包括由DNA分子的转录产生RNA产物、由RNA分子的翻译产生蛋白、由DNA分子的转录以形成RNA产物,以及随后RNA产物的翻译产生蛋白、或者由DNA分子的转录提供RNA产物,加工RNA产物以提供经加工的RNA产物(例如,mRNA),以及随后经加工的RNA产物的翻译产生蛋白。在一些实施方案中,编码本文所述的B细胞表位或融合肽的核酸序列是经过密码子优化的,用于在合适的宿主细胞中表达。例如,当融合肽用于在人受试者中诱导针对Her2/neu的免疫应答时,核酸序列可以是人密码子优化的。用于密码子优化的合适方法对于本领域技术人员是已知的,如使用位于约翰霍普金斯大学建立基因组网站(John Hopkins University Build a Genomewebsite)的“软件工具(Software Tools)”中的“基因设计(Gene Design)”工具的“反向翻译(Reverse Translation)”选项。
如本文所述的,两种或多种不连续的Her2/neu的B细胞表位可以通过本领域技术人员已知的任何方式在融合肽内彼此连接。术语“连接”和“连接的”包括通过肽键直接连接两种不连续的Her2/neu B细胞表位;即,一种Her2/neu表位的C末端通过肽键共价结合到另一个原生不连续的表位的N末端。术语“连接”和“连接的”在其意义中也包括两种原生不连续的Her2/neu表位通过插入的接头元件连接。
在本文公开的一个实施方案中,至少两种所述B细胞表位或其衍生物通过非原生接头肽序列彼此连接。
如本文使用的,术语“接头”是指在融合肽内的插入在任何两个相邻的Her2/neu B细胞表位或其衍生物之间的短的多肽序列。在一个实施方案中,接头是1-10个,优选1、2、3、4或5个天然或非天然存在的氨基酸的多肽接头。在一个实施方案中,接头是碳水化合物接头。合适的碳水化合物接头是本领域技术人员已知的。在本文公开的另一个实施方案中,融合肽包含一种或多种肽或多肽接头以及一种或多种其它非肽或非多肽接头。此外,肽或非肽的不同类型的接头可以被掺入在相同的融合肽中,这被认为是合适的。在使用肽或多肽接头连接来自Her2/neu的ECD的两个分别的B细胞表位片段的情况下,接头将被有利地掺入,使得其N末端通过肽键与一个表位片段的C末端连接,其C末端通过肽键连接到另一片段的N末端连接。融合肽内的个体B细胞表位片段也可以具有一个或多个氨基酸,其添加到一端或两端,优选添加到C末端。因此,例如,可以将接头或间隔氨基酸添加到肽的N末端或C末端或者两端,以连接不连续的肽,并且允许方便肽彼此偶联和/或与递送系统偶联,如通过病毒体中的脂质分子作为锚点。合适的肽接头的示例性实例是LP(亮氨酸-脯氨酸),例如,在SEQ ID NO:8中显示的。
本领域技术人员将理解,当融合肽与载体蛋白通过接头偶联时,优选的是从融合肽的C末端实施这种接头介导的偶联,因为在某些情况下,接头从N-末端的偶联可能对期望引发的免疫应答具有负面影响。
序列同一性和序列相似性
提及“至少85%”包括85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性或相似性,例如,在最佳比对或最佳拟合分析之后。因此,在本发明的优选形式中,序列与本文鉴定的序列具有至少85%,优选至少86%、优选至少87%、优选至少88%、优选至少89%、优选至少90%、优选至少91%、优选至少92%、优选至少93%、优选至少94%、优选至少95%、优选至少96%、优选至少97%、优选至少98%、优选至少99%或优选100%的序列同一性或序列同源性,例如,在最佳比对或最佳拟合分析之后。
如本文使用的术语“同一性”、“相似性”、“序列同一性”、“序列相似性”、“同源性”、“序列同源性”等表示在比对的序列中的任何特定氨基酸残基位置,氨基酸残基在比对的序列之间是相同的。本文使用的术语“相似性”或“序列相似性”表示在比对的序列中的任何特定位置,氨基酸残基在序列之间是相似类型的。例如,亮氨酸可以取代为异亮氨酸或缬氨酸残基。这可以称为保守取代。在一个实施方案中,氨基酸序列可以通过其中包含的任何氨基酸残基的保守取代进行修饰,使得当与未修饰的多肽相比时,修饰对修饰的多肽的结合特异性或功能活性没有影响。
在一些实施方案中,关于多肽的序列同一性涉及候选序列中的氨基酸残基的百分比,在序列比对之后所述候选序列中的氨基酸残基与相应多肽的残基相同,并且如果需要,引入空位(gap)以实现最大百分比同源性,并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。N末端或C末端延伸和插入不应被解释为减少序列同一性或同源性。用于进行两个或多个氨基酸序列比对并确定其序列同一性或同源性的方法和计算机程序是本领域技术人员熟知的。例如,可以使用诸如BLAST、FASTA或Smith-Waterman算法的算法,能够容易地计算两个氨基酸序列的同一性或相似性的百分比。本发明延伸至与本文鉴定的序列具有至少具有70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性或序列同源性的序列,并且在本文所述的方法中使用它们。
在一些实施方案中,关于多核苷酸的序列同一性涉及候选序列中的核苷酸的百分比,所述候选序列中的核苷酸在比对序列后,与相应多核苷酸的核苷酸相同,并且如果需要,引入空位以实现最大百分比同源性,并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。用于进行两个或多个多核苷酸或核酸序列比对并确定其序列同一性或同源性的方法和计算机程序是本领域技术人员熟知的。
确定氨基酸序列“相似性”的技术是本领域技术人员熟知的。一般地,“相似性”是指两个或多个多肽的精确的、或者在合适的位置的氨基酸与氨基酸比较,其中氨基酸相同或具有相似的化学和/或物理性质,比如电荷或疏水性。然后可以在比较的多肽序列之间确定所谓的“百分比相似性”。用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术也是本领域熟知的,包括确定该基因的mRNA的核苷酸序列(通常通过cDNA中间体)并确定由其编码的氨基酸序列,并将其与第二个氨基酸序列比较。一般地,“同一性”分别是指两个多核苷酸或多肽序列的精确核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的对应关系。
还可以通过确定“同一性百分比”来比较两个或多个多核苷酸序列。同样可以通过确定“同一性百分比”来比较两个或多个氨基酸序列。两个序列(无论是核酸或肽序列)的同一性百分比可以描述为两个比对的序列之间的精确匹配数,除以较短的序列的长度,并乘以100。核酸序列的近似比对由Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)的局部同源性算法(local homology algorithm)提供。该算法可以扩展为使用由Dayhoff开发的得分矩阵的肽序列,Atlas of Protein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff ed.,5suppl.3:353-358,国家生物医学研究基地(National BiomedicalResearch Foundation)USA华盛顿D.C.,并按照Gribskov,Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763(1986)进行归一化。用于计算序列之间的百分比同一性或相似性的合适的程序在本领域中一般是已知的。
用于确定核酸序列同一性的示例性实例使用主题核酸序列在核酸序列数据库中搜索,如GenBank数据库(可访问http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/),使用程序BLASTN版本2.1(基于Altschul等人(1997)Nucleic Acids Research 25:3389-3402)。该程序可以在无空位(ungapped)模式中使用。默认过滤用于除去由于低复杂度区域引起的序列同源性。可以使用BLASTN的默认参数。用于确定氨基酸序列同一性的示例性实例,氨基酸序列用于在蛋白序列数据库搜索,如GenBank数据库(可访问网站http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/),使用BLASTP程序。程序可以在无空位模式下使用。默认过滤用于除去由于低复杂度区域引起的序列同源性。利用BLASTP的默认参数。过滤低复杂度的序列可能会使用SEG程序。
用于比对比较窗口的最佳序列比对,可以通过计算机化的算法应用(GAP、BESTFIT、FASTA、和Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的TFASTA,遗传学计算机小组(Genetics Computer Group),575Science Drive Madison,WI,USA)或者通过检查和任何所选择的各种方法产生的最佳比对(即比较窗口之间产生最高的百分比同源性)而进行。也可以参考BLAST程序家族,例如Altschul等人(1997)Nucl.Acids.Res.25:3389所公开的。序列分析的详细讨论可见于Ausubel等人"Current Protocols inMolecular Biology",John Wiley&Sons Inc,1994-1998,第15章的单元19.3。
载体蛋白
CRM-197(GenBank登录号1007216A;SEQ ID NO:61)是在氨基酸残基52处,含有单一氨基酸取代(Gly-Glu)的无酶活性的和无毒的形式的白喉毒素。导致Glu52取代的单一GCA突变将CRM-197与其野生型物种区分开来。CRM-197的毒性缺失似乎是由于其片段A的酶活性的丧失,所述片段A在野生型物种中催化在感染细胞中对蛋白合成至关重要的延伸因子2(转位酶)的化学修饰。这种无毒的性质使得CRM-197成为适用于制备缀合疫苗的载体蛋白。
SEQ ID NO:61(CRM-197;GenBank登录号1007216A)
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
融合肽可以与CRM-197偶联的方法是本领域技术人员已知的。
示例性实例包括由Chang等人(1998,FEBS Letters,427:362-366)和Berti等人(2004,Biophysical Journal,86:3-9)描述的那些,以及下文实施例1中所示的那些。
如本文所述的,融合肽与CRM-197的缀合通常通过使用合适的交联剂活化赖氨酰残基来实现。由于CRM-197含有40个赖氨酸残基,它们的很多可用于交联,因此CRM-197缀合的终产物总是异质的。不受理论或特定作用模式的约束,一般理解融合肽:载体蛋白的比例取决于融合肽的尺寸或分子量。例如,当融合肽相对较小(例如,长度为约10个氨基酸)时,可能产生与20-39个融合肽缀合的载体蛋白。相反,对于较大的融合肽,载体蛋白可以与至多或少于20个融合肽缀合。在本文所述的一个实施方案中,载体蛋白包含2至39个融合肽。在另一个实施方案中,载体蛋白包含至少20个融合肽。在另一个实施方案中,载体蛋白包含6至12个融合肽。
融合肽通常通过共价键与载体蛋白偶联。然而,在一些实施方案中,融合肽可以通过非共价结合与载体蛋白偶联。当融合肽与载体蛋白非共价结合时,非共价结合通常将涉及融合肽的一个或多个原子与载体蛋白的一个或多个原子之间的电磁相互作用。示例性实例包括离子键合(即,在两个带相反电荷的离子之间,由于这种相反的电荷而形成的吸引力)、范德华力(Van der Weals forces)(即,在融合肽和载体蛋白之内存在的共价键的永久和/或诱导偶极之间的力)和/或疏水相互作用(即,由本文所述的融合肽中的疏水/脂族部分与载体蛋白的疏水部分结合的趋势产生的力)。
佐剂
如本文使用的,术语“佐剂”通常是指这样一类物质,其可以增加由融合肽-载体蛋白缀合物引发的免疫应答的量级,超过不存在佐剂时单独用本文所述融合肽或融合肽-载体蛋白缀合物所预期引发的免疫应答的量级。
合适的佐剂是本领域技术人员已知的。合适佐剂的非限制性实例包括铝盐(例如,氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾(也称为Alum))、脂质体、病毒体、油包水或水包油乳剂(例如弗氏佐剂、和AS03)、3-O-脱酰基-4'-单磷酰脂质A(MPL)和含有MPL的佐剂(例如AS01、AS02和AS04)和基于皂苷的佐剂。基于皂苷的佐剂包括皂苷或皂苷衍生物形式,例如皂树(Quillaja saponaria)、人参(Panax ginseng)、三七(Panaxnotoginseng)、西洋参(Panax quinquefolium)、桔梗(Platycodon grandiflorum)、美远志(Polygala senega)、远志(Polygala tenuifolia)、巴西皂树(Quillaja brasiliensis)、黄芪(Astragalus membranaceus)以及牛膝(Achyranthes bidentata)。示例性的基于皂苷的佐剂包括免疫刺激复合物(iscom)、免疫刺激复合物基质、ISCOMATRIXTM佐剂、Matrix MTM佐剂、Matrix CTM佐剂,Matrix QTM佐剂、佐剂、佐剂、ISCOPREPTM、ISCOPREPTM衍生物、含有ISCOPREPTM或ISCOPREPTM衍生物的佐剂、QS-21、QS-21衍生物和含有QS-21或QS21衍生物的佐剂。如本文所述的疫苗组合物还可以与免疫调节剂结合,包括例如细胞因子、趋化因子和生长因子。本文中还涉及在相同疫苗组合物中两种或多种佐剂的混合物。
在一个实施方案中,佐剂是氢氧化铝。在另一个实施方案中,佐剂是Montanide。
在本文公开的一个实施方案中,疫苗组合物还包含检查点抑制剂。术语“检查点抑制剂”将被本领域技术人员理解为意指全部地或部分地抑制、减少或者干扰或调节一种或多种检查点蛋白的分子。合适的检查点抑制剂的示例性实例包括抗体及其抗原结合片段(例如,Fab片段)。合适的检查点蛋白将是本领域技术人员已知的,其示例性实例包括CTLA-4及其配体CD80和CD86;PD1及其配体PDL1和PDL2;OX40及其配体OX40L;LAG-3及其配体MHCI类或II类;TIM-3及其配体GAL-9;以及B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)及其配体疱疹病毒侵入介体(HVEM)。
药物组合物
本说明书还描述了一种药物组合物,其包含本文所述的疫苗组合物和药学上可接受的载体。合适的药学上可接受的载体(例如,赋形剂、稀释剂等)是本领域技术人员已知的。例如,可以使用各种水性的(药学上可接受的)载体,如缓冲水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸、透明质酸等。可以通过常规的、熟知的灭菌技术灭菌这些组合物,或者可以无菌过滤这些组合物。所得水溶液可以按原样或冻干包装,冻干制剂在施用前与无菌溶液混合。组合物可以进一步包含接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质,如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等,例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、蔗糖或其它碳水化合物等。用于制备肠胃外施用的化合物的合适方法对于本领域技术人员是已知的或显而易见的,并且在例如A.Gennaro(2000)“Remington:TheScience and Practice of Pharmacy”,第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins;Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人编辑,第七版Lippincott,Williams,&Wilkins;和Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人,编辑第三版,Amer.Pharmaceutical Assoc中更详细描述的。
药物组合物可以是适合肠胃外施用的形式(例如,皮下、肌肉内或静脉内注射),或者适合通过吸入施用的气溶胶形式,例如通过鼻内吸入或口腔吸入。
本文所述的药物组合物也可以在试剂盒中提供。试剂盒可以包含额外的组分以有助于进行如本文所述的方法,如施用装置、赋形剂和/或稀释剂。试剂盒可以包括用于容纳各种组分的容器以及在这些方法中使用试剂盒组分的说明书。
在本文公开的实施方案中,药物组合物还包含如本文别处所述的检查点抑制剂。
治疗或预防癌症的用途和方法
本文还公开了一种治疗或预防在有需要的患者中的癌症的方法,所述癌症的特征在于Her2/neu的表达或过表达,所述方法包括以下步骤:向所述患者施用有效量的如本文所述的疫苗组合物,或如本文所述的药物组合物。
本公开还延伸到如本文所述的疫苗组合物在制备用于治疗或预防在有需要的患者中的癌症的药物中的用途,所述癌症特征为Her2/neu的表达或过表达。
本公开还延伸到如本文所述的疫苗或如本文所述的药物组合物,用于治疗或预防在有需要的患者中的癌症,所述癌症特征为Her2/neu的表达或过表达。
本领域技术人员将熟悉特征在于Her2/neu蛋白的表达或过表达的癌症的类型。示例性实例包括乳癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌和唾液腺癌。在一个实施方案中,癌症是乳癌。在另一个实施方案中,癌症是胃癌。
如本文所述的疫苗或药物组合物通常以“有效量”施用;即有效引发尤其是治疗或预防作用的任何一种或多种的量。本领域技术人员将能够通过常规实验来确定包括在药物组合物中有效的、无毒的量,或者用于期望的结果施用的有效的、无毒的量。一般地,如本文所公开的疫苗和/或药物组合物可以以这样的方式施用,即与施用途径和接受者的身体特征(包括健康状况)兼容的方式,以这样的方式使得其引发期望的作用(即治疗有效的、免疫原性的和/或保护性的)。例如,组合物的合适的剂量可以取决于多种因素,包括但不限于受试者的身体特征(例如,年龄、体重、性别)、组合物是否用作单一试剂或用作辅助治疗的部分、任何潜在癌症的进展(即病理状态)以及本领域技术人员可以认识到的其它因素。在确定例如组合物的合适剂量时可以考虑的一般考量的其它示例性实例由Gennaro所讨论(2000,"Remington:The Science and Practice of Pharmacy",第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins;以及Gilman等人(编)(1990),"Goodman And Gilman's:ThePharmacological Bases of Therapeutics",Pergamon出版社)。
关于上述一些考量,期望该量将落入可以通过本领域技术人员已知的方法确定的相对宽的范围内。
如本文所述的融合肽(与载体蛋白缀合)的有效量一般在每受试者约5μg至约1.0mg的融合肽、每受试者约10μg至约500μg的融合肽、或每受试者约15μg至约60μg的融合肽的范围内。例如可以通过涉及测量抗原特异性抗体滴度的标准方法来确定有效量。可以监测由本文所述的组合物提供的免疫水平以确定增强(booster)的需要(如果有的话)。例如,通常在受试者中首次施用组合物后数天或数周,评估血清中的抗原特异性抗体滴度之后,可能需要和/或期望任选的增强免疫接种。抗原特异性抗体滴度可能通过使用多个剂量来提高,如下文实施例中所示例的。
如本文所述的疫苗和/或药物组合物可以单独或与额外的治疗剂组合施用于有需要的受试者;即作为辅助治疗的部分。在辅助治疗的情况下,施用可以是同时的或顺序的;即,先施用疫苗和/或药物组合物,然后施用额外的治疗和/或预防剂,或者在施用额外的治疗剂后施用疫苗和/或药物组合物。因此,当两种或多种实体“联合(in conjunction)”施用于受试者时,它们可以以单一的组合物同时施用,或以单独的组合物同时施用,或者以单独的组合物在分开的时间施用。
额外的治疗剂可以包含如本文别处所述的检查点抑制剂。因此,在一个实施方案中,本文公开的方法还包括向所述患者施用有效量的如本文所述的检查点抑制剂的步骤。
对于本领域技术人员显而易见的是,如本文别处所述的,如果需要诱导期望的免疫应答,个体剂量的最佳量和间隔可以例如通过施用的形式、途径和部位以及待治疗的特定受试者的性质而确定。可以使用本领域技术人员已知的常规技术来确定最佳条件。
在一些情况下,可能期望几次或多次施用如本文所述的疫苗和/或药物组合物。例如,组合物可以被施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。施用可以是约一天的间隔至约十二周的间隔,并且在某些实施方案中,从约一周至约四周的间隔。可能需要定期重新施用以实现期望的治疗结果,如肿瘤尺寸的减小和/或转移发生的减少。对于本领域技术人员来说显而易见的是,可以使用常规治疗过程或功效或免疫状态确定测试,来确定最佳施用过程。
应当理解的是,如本文所述的“诱导”免疫或抗原特异性抗体应答包括引发或刺激免疫应答和/或增强先前存在的免疫应答,以获得期望的生理作用,如肿瘤尺寸的减小和/或转移发生的减少。在完全或部分预防癌症的发生、完全或部分预防转移的发生、和/或完全或部分预防与所述癌症相关的症状方面,该作用可以是预防性的。
如本文所使用的,术语“施用”或“给药”通常是指将如本文所述的疫苗和/或药物组合物引入患者体内的步骤,使得患者的免疫系统对融合肽内的多种Her2/neu B细胞表位产生(mount)应答。如本文使用的,“有需要的患者”包括已被诊断患有癌症的个体,其中癌细胞表达或过表达Her2/neu蛋白。还包括尚未被诊断患有癌症的个体,如没有出现任何症状的那些个体,但是可能具有例如癌症家族史,因此怀疑具有发展成癌症的遗传倾向。从广义上讲,因此术语“有需要的患者”包括已经存在需要的个体,以及处于发展成Her2/neu相关癌症风险的个体。
如本文使用的“预防”癌症的药物将减少个体发展癌症的风险,理想地减少至零。此外,该术语还指预防例如原发肿瘤手术后癌症的再发展。如本文使用的,“治疗”癌症的药物理想地将通过消除其潜在原因以完全消除疾病,使得在组合物施用停止时,该疾病不会再发展,而是保持缓解。如本文使用的“改善”癌症的药物不能消除疾病的潜在原因,而是减少疾病的严重程度,如通过任何已建立的分级系统所测量的,和/或通过改善患者的健康所测量的,例如降低疼痛和/或不适。
如本文别处所讨论的,“有效量”是指单独的或根据已建立剂量的方案与其它剂量一起产生期望的预防、治疗或改善作用的药物制剂的量。
施用的途径和方案可以变化,其取决于待治疗的病症的阶段或严重程度,并且由技术人员确定。例如,如本文所述的根据本发明的疫苗或药物组合物可以以皮下、皮内、淋巴内或局部或粘膜(鼻)或肌肉内形式施用。所有这些形式是制药领域的普通技术人员所熟知的。
在某些实施方案中,本文所述的组合物可以以本领域普通技术人员已知的肌肉内、皮下、淋巴内或鼻内途径施用。
如本文别处所讨论的,使用本文描述的组合物的剂量方案根据多种因素来选择,包括例如患者的年龄、体重和医疗状况、待治疗的病症的阶段和严重程度、以及预期施用的特定融合肽。普通技术医生可以容易地确定和规定例如预防、治疗或改善恶性肿瘤的进展或严重程度所需的载体蛋白(包含与其偶联的融合肽)的有效量。剂量方案还将考虑待施用的佐剂的量,其预期将取决于至少一些因素而变化,所述因素将控制施用于受试者的载体蛋白/融合肽的量,例如患者的年龄、体重和医疗状况。在产生功效(即有效量)(无毒或不超过可接受的毒性)的范围内实现载体蛋白/融合肽和/或佐剂浓度的最佳精度,需要基于至少部分基于载体蛋白/融合肽和/或佐剂对靶标位点的利用度(availability)的动力学的方案。该过程通常涉及载体蛋白/融合肽和/或佐剂的分布、平衡和消除的考量,这在本领域技术人员的能力范围内。
本文提及的所有专利、专利申请和出版物的全部内容通过引用并入本文。
本领域技术人员将认识到,除了具体描述的那些之外,本文描述的本发明易于变化和修改。应当理解,本发明包括落入精神和范围内的所有这些变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同指出或表示的所有步骤、特征、组合物和化合物,以及任何两个或多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
现在将参考以下实施例描述本发明的某些实施方案,所述实施例仅旨在说明目的,而不旨在限制上文所述的一般范围。
实施例
以下实施例涉及将两种融合肽(来源于Her2/neu的不连续的B细胞表位)与重组无毒的白喉毒素CRM197的缀合。通过SDS-PAGE和免疫印迹进行融合肽-载体蛋白缀合物的初步分析。最后,将融合肽-载体蛋白缀合物运送到奥地利进行动物的初步免疫原性研究。
实施例1-Her2/neu肽抗原与重组无毒的白喉毒素变体CRM-197的缀合
基于病毒体的乳癌疫苗PEV6A/B已经在临床I期临床试验中成功测试(Wiedermann等人,Breast Cancer Res Treat.2010)。然而,这种疫苗制剂在关于稳定性和组分相容性方面具有实质的技术限制,最好的示例为两次单独的注射是不可避免的。
PEV6C方法克服了PEV6A/B的技术限制。PEV6C在单一肽链中组合了所有三种抗原(分别为P6、P7和P4;SEQ ID NO:1-3)(也参见WO 2011/020604A1;Multi-epitope vaccinefor her2/neu-associated cancers),并且可以制剂成稳定的、可冻干的(lyophilizable)单一剂量应用形式。
制备和结果
使用以下融合蛋白与载体蛋白CRM-197缀合:
肽1:P467(缀合前):
H-Pro-Glu-Ser-Phe-Asp-Gly-Asp-Pro-Ala-Ser-Asn-Thr-Ala-Pro-Leu-Gln-Pro-Arg-Val-Leu-Gln-Gly-Leu-Pro-Arg-Glu-Tyr-Val-Asn-Ala-Arg-His-Ser-Leu-Pro-Tyr-Met-P ro-Ile-Trp-Lys-Phe-Pro-Asp-Glu-Glu-Gly-Ala-Cys乙酸盐(SEQ ID NO:8);和
肽2:P647(缀合前):
H-Arg-Val-Leu-Gln-Gly-Leu-Pro-Arg-Glu-Tyr-Val-Asn-Ala-Arg-His-Ser-Pro-Glu-Ser-Phe-Asp-Gly-Asp-Pro-Ala-Ser-Asn-Thr-Ala-Pro-Leu-Gln-Pro-Tyr-Met-Pro-Ile-Tr p-Lys-Phe-Pro-Asp-Glu-Glu-Gly-Ala-Cys乙酸盐(SEQ ID NO:9)。
缀合反应在pH 7.4的PBS缓冲液中进行,使用交联剂磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(Sulfo-SMCC)。该试剂首先与CRM-197载体蛋白上的伯胺(primary amines)(即赖氨酸残基)反应,然后允许与硫醇基(即半胱氨酸残基)反应。在CRM-197中,39个赖氨酸残基理论上可用于与交联剂反应。为了达到在载体蛋白上的肽抗原良好分布,调节融合肽:载体蛋白的比例,以实现平均每CRM197分子20个融合肽分子的缀合。允许反应在室温(RT)下进行45分钟,如下:
表3:材料
程序
1.从-20℃取出融合肽,并在室温(RT)下放置约10分钟,然后打开瓶。
2.称取融合肽至3mL玻璃瓶:
(a)P467,7.8mg,采用780μL的注射用水(WFI)重悬;
(b)P467,7.1mg,采用710μL的二甲基亚砜(DMSO)重悬;
(c)P647,6.9mg,采用690μL的WFI重悬;
(d)P647,9.0mg,采用900μL的DMSO重悬;
所有溶液都容易地重悬,且不可见聚集或浑浊。
3.采用Milli Q水稀释20×磷酸缓冲盐水(PBS)至1×PBS,并加入乙二胺四乙酸(EDTA)至终浓度为1mM。
4.采用0.5mL WFI重建6瓶CRM197至2mg/mL。将3个瓶混合产生2个批次,并储存在4℃(每批1.5mL,每个3mg)。
5.取一瓶Sulfo-SMCC(2mg),并向其中加入200μL的PBS/1mM ETDA,并溶解(10mg/mL储备溶液;溶液保持浑浊)。
6.向每个3mg CRM197的瓶中加入75μL的Sulfo-SMCC(10mg/mL)。总体积:1.575mL。
7.在缓慢混合(涡旋,25rpm)下,在室温下孵育瓶45分钟。在此期间,采用PBS/EDTA缓冲液平衡x2Zeba旋转脱盐柱(Zeba Spin Desalting Column)。
8.在孵育步骤7后,将反应物转移到平衡的Zeba旋转柱(1.5mL)中,并加入200μL的PBS/EDTA,然后以1000×g离心4分钟。
9.每溶液回收1.8mL。
10.加入新的3mL瓶,如下:
(a)瓶1:600μL的P467(在WFI中10mg/mL);和
(b)瓶2:600μL的P647(在WFI中10mg/mL)。
11.向每个瓶中加入50μL的20×PBS,将溶液的pH提高到约7。
12.向每个瓶中加入1.8mL脱盐的CRM197-SMCC。
13.在缓慢混合(涡旋)下,在室温下将瓶孵育45分钟,然后将瓶储存在4℃直到分析。在孵育期间,注意到在瓶2中逐渐可见的沉淀。然而,加热溶液后,沉淀消失。
总结
肽P467-CRM197,ca.2.449mg/mL P467,ca.1.22mg/mL CRM197,ca.2450μL;在1×PBS/1mM EDTA中,Lot 140829-1_am。
肽P647-CRM197,ca.2.449mg/mL P647,ca.1.22mg/mL CRM197,ca.2450μL;在1×PBS/1mM EDTA中,Lot 140829-2_am。
观察到P647-CRM197肽缀合物在反应进行时显示出聚集趋势。P467-CRM197肽缀合物,肉眼无可见的聚集。
实施例2-考马斯蓝(Coomassie Blue)染色和使用小鼠抗血清E的CRM197-抗原缀合物的免疫印迹
通过SDS-PAGE分析缀合物制剂,并通过凝胶的考马斯蓝染色和免疫印迹来评估,使用先前产生的针对缀合破伤风类毒素(抗血清E)的肽抗原P4、P6和P7的组合的小鼠血清。
表4:材料
程序
如下制备两种SDS-PA凝胶:
·在PBS pH 7.4中将CRM197(2mg/mL)储备溶液以1:10稀释
·在PBS pH 7.4中将抗缀合物溶液以1:10稀释
·将未缀合的融合肽制备为10mg/mL的储备溶液,并在PBS pH 7.4中以1:20稀释
总计,每样品制备了36μL,每个泳道加载了15μL。制备两个相同的凝胶:凝胶1采用考马斯蓝染色,凝胶2用于Western印迹。在凝胶1和凝胶2中的样品分布总结在下表5中:
表5:
结果
凝胶1-考马斯蓝染色
将凝胶1浸入Bio-Safe考马斯蓝染色液中,在室温下振荡1小时,然后在室温下采用MilliQ水冲洗1小时。
凝胶2-Western印迹
电泳后,从盒中取出凝胶2,并立刻在Milli Q水冲洗。然后根据制造商的说明书(BioRad)准备转移(transfer)三明治(sandwich),并安装在Turbo Transfer Blot机器中。转移后,控制硝酸纤维素膜以完全存在预染的标记物蛋白。仅最小量的标记物在SDS PA凝胶中保持可见。然后在室温下,将膜在SuperBlock缓冲液中孵育1小时。在SuperBlock中将小鼠血清混合物E以1:500稀释,并在室温下,在膜上孵育2小时。然后将膜采用1×PBS洗涤三次,每次5分钟。然后将膜与在SuperBlock中以1:5000稀释的抗小鼠IgG(KPL,074-1802;Ab20)在室温下孵育1小时。然后将膜用1×PBS洗涤三次,每次5分钟,并在室温下采用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色(develop)5分钟。
结果显示,每种CRM197缀合物的分子量明显向较大分子量移动(shift),表示融合肽与CRM197的强的缀合。在两种情况下观察到的宽的缀合条带也表明融合肽在载体蛋白上相对大的分布,如缀合反应所预期的那样。结果还表明,没有(或最少)的未缀合的CRM197蛋白残留的量。在另一方面,观察到少量的融合肽,估计是使用的总融合肽的<10%。
结论
观察到CRM197缀合物的明显移动,表示P467和P647融合肽与CRM197载体蛋白的成功缀合。
P467-CRM197和P647-CRM197缀合物之间没有观察到显著性差异。
在两个缀合反应中观察到有限量的游离融合肽。
采用所使用抗血清的免疫印迹证实,与CRM197白喉毒素的一些交叉反应性,尽管它是用破伤风类毒素肽缀合物引起的。证实了缀合后CRM197分子的移动,但是由于这对于两种融合肽不是特异性的,所以其与蛋白的缀合不能被证实。抗血清染色游离的未缀合的融合肽,采用P467略好于P647。
实施例3-使用小鼠抗血清D的CRM197-抗原缀合物的免疫印迹
通过SDS-PAGE分析并通过免疫印迹评估缀合物制剂,使用先前产生的针对缀合流感病毒体(抗血清D)的肽抗原P4、P6和P7的组合的小鼠血清。通过使用抗血清D的免疫印迹分别证实了CRM197载体蛋白上融合肽P467和P647的存在。
表6:材料
程序
如下制备一种SDS-PA凝胶:
将包含CRM197、融合肽-CRM197缀合物或未缀合的融合肽的所有溶液在pH7.4的PBS中稀释至1mg/mL。总计,每种样品制备了36μL,每个泳道加载了15μL。在凝胶1和凝胶2中的样品分布总结在下表7中:
表7:
结果
Western印迹-电泳后,从盒中取出凝胶,并立刻在Milli Q水冲洗。根据制造商的说明书(BioRad)准备转移三明治,并安装在Turbo Transfer Blot机器中。转移后,控制硝酸纤维素膜完全存在于预染标记蛋白。仅最小量的标记物在SDS PA凝胶中保持可见。然后将硝酸纤维素膜在含有吐温20(MPBST)的磷酸缓冲盐水中的5%乳中在室温下孵育1小时。
在MPBST中将小鼠血清混合物D以1:500稀释,并在室温下在膜上孵育1小时。然后将膜采用1×MPBST洗涤三次,每次5分钟,然后与在MPBST中以1:5000稀释的抗小鼠IgG(KPL,074-1802;Ab20)在室温下孵育30分钟。然后将膜采用1×MPBST洗涤三次,每次5分钟,并在室温下采用TMB溶液显色10分钟。
结论
使用抗血清D的免疫印迹显示仅与CRM197-融合肽缀合物的反应性。未缀合的CRM197没有观察到交叉反应性。这些结果表示,显著量的融合肽与载体蛋白缀合,并证实观察到的CRM197-融合肽缀合物在凝胶中迁移的移动是由于融合肽与载体蛋白的缀合,不是由于CRM197分子间交联。检测到归因于游离未缀合的融合肽的信号,这是因为抗血清不与它们反应,或者因为融合肽迁移到凝胶底部并且未转移到硝酸纤维素膜。
抗血清D与P647-CRM197缀合物的反应略强于P467-CRM197缀合物。结果表明抗血清与缀合的融合肽比与游离融合肽反应强烈。
实施例4-P467-CRM197和P647-CRM197斑点印迹
在使用抗血清D的斑点印迹实验中也证实了在CRM197载体蛋白上融合肽P467和P647的存在。
样品
·CRM197,1mg/mL,在pH 7.4的PBS中;
·P467抗原,1mg/mL,在pH 7.4的PBS中;
·P647抗原,1mg/mL,在pH 7.4的PBS中;
·P467-CRM197,1mg/mL,在PBS pH 7.4的PBS中(计算的浓度);和
·P647-CRM197,1mg/mL,在PBS pH 7.4的PBS中(计算的浓度)。
表8:材料
程序
使用预切硝酸纤维素膜,采用铅笔画线。在Eppendorf管中在pH 7.4的PBS中进行每种样品的两倍稀释,以1mg/mL(1μg/μL)起始。每个斑点的理论浓度(1μL)为1μg/500ng/250ng/125ng/62.5ng/31.25ng。对于每个斑点,约1μL的每种样品被转移到膜(一式两份),如下概述:
·泳道A CRM197;
·泳道B P467抗原(无脂质缀合的游离融合肽);
·泳道C P647抗原(无脂质缀合的游离融合肽);
·泳道D P467-CRM197(以1μg的融合肽和0.5μg的CRM197起始);和
·泳道E P647-CRM197(以1μg的融合肽和0.5μg的CRM197起始)
使膜在室温下在空气中干燥10分钟,随后采用在PBST(MPBST)中的5%乳在室温下封闭30分钟。然后将膜与一抗(小鼠抗血清混合物D,在MPBST中1:500稀释)在室温下孵育1小时。然后将膜采用MPBST洗涤三次,每次5分钟,然后与二抗(抗小鼠IgG;KPL,074-1802;Ab20;在MPBST中1:5000稀释)在室温下孵育30分钟。孵育后,将膜采用MPBST洗涤三次,每次5分钟,然后在室温下采用TMB溶液孵育约3分钟,然后采用Milli Q水洗涤,之后干燥。
结论
采用小鼠抗血清D的斑点印迹显示仅与CRM197-融合肽缀合物的反应性。与未缀合的CRM197蛋白的最小交叉反应性。由于缀合物中CRM197的量与融合肽的量相比为约50%,所以该样品中的最小背景可能是由于与白喉毒素变体的交叉反应性。
游离的(未缀合的)融合肽(不含脂质缀合物的融合肽)仅在P647的情况下与抗血清产生的信号,而P467没有。其原因尚不清楚。然而,在P647的第一样品稀释中的信号比后续稀释稍弱。这可能表示存在抗体结合位点或减少与硝酸纤维素膜的结合的抑制剂。该抑制剂的性质是未知的,但可能归因于起初用于制备高浓度融合肽储备的DMSO(10mg/mL)。
小鼠抗血清D与P467-CRM197和P647-CRM197缀合物反应非常强,证实大多数融合肽与载体蛋白的缀合。
由于与融合肽-CRM197缀合物相比,游离融合肽的抗血清反应性不相等,不可能对抗原的量进行定量。然而,由于在缀合反应之后没有应用纯化步骤,对于融合肽采用理论起始浓度进行计算是可以接受的。
总之,结果表明抗血清与缀合的融合肽比与游离融合肽反应强烈。
实施例5–用于小鼠中剂量滴定研究的样品制备
以下描述了在小鼠中用于剂量滴定实验的融合肽-CRM197缀合物的制备。
表9:材料
程序
为了制备用于动物研究的样品,将缀合反应溶液稀释至确定的靶标浓度。对于以下制备,假设肽与蛋白的缀合效率至少为90%。
高剂量组的样品制备(组1):
这些样品预期每管含有约420μg的缀合的融合肽(1.2mg/mL):
管1:
·1045μL的P467-CRM197
·880μL的(1×)PBS pH 7.4
将该溶液充分混合,将350μL转移至五个玻璃瓶(各2.5mL)中,并如下标记:P467-CRM197;组1-高剂量;估计的P467conc:~1.2mg/mL;Lot 140903-1_am。
管2:
·1045μL的P647-CRM197(吸液前强烈涡旋)
·880μL的(1×)PBS pH 7.4
将该溶液充分混合,并将350μL转移至五个玻璃瓶(各2.5mL)中,并如下标记:P647-CRM197;组1-高剂量;估计的P647conc:~1.2mg/mL;Lot140903-4_am。
中等剂量组的样品制备(组2):
这些样品预期每管含有约210μg的缀合的融合肽(0.6mg/mL):
管1:
·525μL的P467-CRM197
·1400μL的(1×)PBS pH 7.4
将该溶液充分混合,将每350μL转移至五个2.5mL玻璃瓶中,并如下标记:P467-CRM197;组2-中等剂量;估计的P467conc:~0.6mg/mL;Lot 140903-2_am。
管2:
·525μL的P647-CRM197(吸液前强烈涡旋)
·1400μL的(1×)PBS pH 7.4
将该溶液充分涡旋,并将350μL转移至五个2.5mL玻璃瓶中,并如下标记:P647-CRM197;组2-中等剂量;估计的P647conc:~0.6mg/mL;Lot 140903-5_am。
低剂量组的样品制备(组3):
这些样品预期每管含有约105μg的缀合的融合肽(0.3mg/mL):
管1:
·262μL的P467-CRM197
·1663μL的(1×)PBS pH 7.4
将该溶液充分混合,将每350μL转移至五个2.5mL玻璃瓶中,并如下标记:P467-CRM197;组3-低剂量;估计的P467conc:~0.3mg/mL;Lot 140903-3_am。
管2:
·262μL的P647-CRM197(吸液前强烈涡旋)
·1663μL的(1×)PBS pH 7.4
将该溶液充分涡旋,并将每350μL转移至五个2.5mL玻璃瓶中,并如下标记:P647-CRM197;组3-低剂量;估计的P647conc:~0.3mg/mL;Lot 140903-6_am。
实施例6-免疫接种研究
肽抗原
两种融合肽P467(SEQ ID NO:8)和P647(SEQ ID NO:9)在Bachem(瑞士)合成。将两种杂交体与病毒体(来自灭活的流感病毒A/Brisbane/59/2007的病毒包膜)偶联,所述病毒体适合作为抗原递送系统,并且不需要额外的佐剂。测试了三种浓度(计算融合肽的量):每次注射15μg、30μg和50μg。为了比较,将两种融合肽与CRM197偶联,并以每次注射浓度30μg用于一对一(head-to-head)实验。所有缀合程序(CRM和病毒体)在Mymetics(瑞士)进行。
将病毒体制剂冷冻递送,并在解冻后形成混浊的(cloudy)悬浮液。
偶联后,接受CRM-P647缀合物为沉淀制剂,而CRM-P467保持溶于基于水的缓冲液。
合成三种Her-2/neu衍生的B细胞表位P4(SEQ ID NO:3)、P6(SEQ ID NO:1)和P7(SEQ ID NO:2),并在piChem(奥地利)偶联至KLH(钥孔血蓝蛋白),并用作包被抗原,以通过ELISA来评估对单一肽的抗体应答。
为了评估针对未缀合的融合肽的抗体应答,在ELISA测定中使用P467和P647作为包被抗原。
免疫接种方案
根据以下研究设计,以2-3周间隔皮下免疫雌性Balb/C小鼠:
接受病毒体缀合物的组接触(prime)一次灭活的流感病毒(灭活的A/Brisbane/59/2007)。在接触后16天开始采用缀合的构建体的免疫接种。以即刻使用的方式,递送所有病毒体制剂,并且不应用任何添加剂每次注射100μl。
采用NaCl溶液稀释CRM-融合肽缀合物的储备,并在注射施用之前与氢氧化铝凝胶悬浮液混合。将CRM-P647(沉淀的)涡旋并以与CRM-P467相同的方式使用悬浮液。
对照组接受空病毒体(TIRIV)或NaCl溶液加氢氧化铝。
动物
60只雌性Balb/C小鼠,分娩6-8周(29.10.2014),起源:查尔斯河,德国。
10组:每组n=5只小鼠-动物设施:维也纳综合医院(General Hospital Vienna)/生物医学单位(Biomedical Unit)。
组
·组A-空病毒体(TIRIV)-100μl/小鼠;
·组B-P467-病毒体-50μg/小鼠,以100μl;
·组C-P467-病毒体-30μg/小鼠,以100μl;
·组D-P467-病毒体-15μg/小鼠,以100μl;
·组E-P647-病毒体-50μg/小鼠,以100μl;
·组F-P647-病毒体-30μg/小鼠,以100μl;
·组G-P647-病毒体-15μg/小鼠,以100μl;
·组H-NaCl+氢氧化铝(对照)-100μl/小鼠;
·组I-P467-CRM+氢氧化铝-30μg/小鼠,以150μl;和
·组J-P647-CRM+氢氧化铝-30μg/小鼠,以150μl。
在免疫接种前、第2次免疫接种后三周、第3次免疫接种后两周和第4次免疫接种后两周取血液。然后分析血液样品:
·肽特异性抗体滴度(IgG);
·构建体特异性抗体滴度(IgG);
·重组细胞外Her-2/neu特异性的抗体(IgG)滴度;和
·针对SKBR-3癌细胞中表达的原生Her-2/neu的特异性。
ELISA方案
1)肽特异性ELISA
采用KLH-融合肽缀合物,以0.5μg/孔包被微滴定板。为进行背景估计,单独采用KLH包被孔。封闭后,加入稀释的血清。采用HRP标记的抗体(兔抗小鼠IgG POX,Fc片段特异性,Nr:315-035-008;Jackson Immuno Research)和随后的TMB染色检测结合的IgG。在加入终止溶液后在450nm对630nm处进行读板。
(2)融合肽特异性ELISA
将未修饰的融合肽P467和P647用作包被抗原,其在碳酸盐缓冲液中浓度为0.5μg/孔。然后如在以上肽特异性方案中描述的加入稀释的血清并分析。
(3)细胞外Her-2/neu特异性ELISA
包含人Her-2/neu的重组细胞外结构域(Her2/neu的氨基酸残基23-652)和人IgG1的Fc区的融合蛋白(ErbB2/Fc嵌合体,cat.No#1129-ER R&D Systems)用作包被抗原。采用0.1μg/孔的蛋白包被板,以及0.1%BSA用于背景估计。如上所述,然后加入稀释的血清,并在从仅BSA的孔中减去背景信号后,进行分析。
(4)使用SKBR3细胞的Her-2/neu特异性细胞测定
将过表达Her-2/neu的人乳癌细胞系SKBR-3(HTB30,ATCC,USA)用作原生的Her2/neu蛋白的来源。在传代后三天收获细胞,并储存在-80℃。如先前在Godell V和Disis MLJ.Immunol.Meth(2005)中描述的,进行细胞裂解,进行一些小的修改:变体1:采用人源化抗Her-2/neu抗体赫赛汀(由维也纳综合医院提供)包被板;变体2:采用人源化抗Her-2/neu抗体Perjeta(由维也纳综合医院提供)包被板。在直接使用前,采用Pierce BCA蛋白测定试剂盒#23227定量细胞裂解物中的蛋白含量。将裂解物在1%BSA/PBS中稀释至浓度为100μg/孔。封闭后,将细胞裂解物加入孔中。为了控制个体背景,加入BSA/PBS。对于IgG检测,使用HRP连接的羊抗小鼠IgG(Amersham/GE Healthcare)。如上进行TMB染色。对于每种血清样品,OD值计算为SKBR-3包被的孔与BSA包被的孔的OD读数之差。
实施例7-肽特异性抗体
使用来自最终血液(即,在四次免疫接种后)的血清。分析来自病毒体和CRM197免疫的小鼠的血清的不同稀释,如下:
·采用病毒体制剂处理的组:1:5000稀释;
·采用CRM-融合肽缀合物处理的组:1:100000稀释。
以OD值描述数据。减去KLH包被的孔的背景(参见图1-3)。
结果
在所有处理组(组B-G和I-J)中引发针对所有三种单一肽的抗体。对照组(组A和H)未检测到肽特异性抗体。观察到抗体滴度显著差异。
与采用相应的病毒体制剂进行的四次免疫接种相比,采用CRM-融合肽缀合物的四次免疫接种诱导了对所有三种个体肽的约十倍更高的抗体滴度。
无论偶联配偶体(partner),两种构建体(P467和P647)诱导针对P7B细胞表位(SEQID NO:2)的最高抗体滴度,而针对P4B细胞表位(SEQ ID NO:3)诱导了最低滴度。
如图4和5中显示的,还产生了与融合肽结合的抗体。这些结果来源于来自使用第四次免疫接种后最终血液的血清的实验。对于采用病毒体免疫的组,血清以1:5000稀释。对于采用CRM197-融合肽缀合物免疫的组,血清以1:100000稀释。在图4和图5中描述的数据以OD值给出。与图1-3显示的肽特异性结果一致,与采用相应的病毒体制剂免疫的那些相比,在采用CRM197-融合肽缀合物免疫的组中观察到约十倍更高的抗体滴度。一般地,P647比P467观察到更高的滴度。
实施例8–采用CRM-缀合物免疫接种过程中的抗体动力学
在第2次、第3次和第4次免疫接种后两周取血液,测量两种融合肽(P467和P647)特异性的抗体(血清以1:100000稀释)。如在图6和7中显示的,融合蛋白特异性抗体滴度在第2次免疫接种后已经相当高,并且在第3次和第4次免疫接种后略有增加。在第3次和第4次免疫接种后,融合蛋白特异性抗体滴度的小幅增加表示采用CRM197-融合肽缀合物的两次或三次免疫接种(即两次或三次连续剂量)可足以产生有效的免疫应答。(BA1-两次免疫接种后抽血;BA2-三次免疫接种后抽血;BA2-四次免疫接种后抽血)。
实施例9-细胞外Her-2/neu特异性抗体
在两个时间点取血液;BA1(两次免疫接种后抽血)和BA2(三次免疫接种后抽血)。分析不同的血清稀释,将来自采用病毒体制剂免疫的组的血清以1:400稀释,以及来自采用CRM-融合肽缀合物免疫的组的血清以1:2000稀释。图8中描述的数据是OD值。
如图8中显示的,两种融合肽-构建体(病毒体和CRM197缀合的)诱导与重组细胞外Her-2/neu蛋白结合的抗体。在假处理的小鼠和免疫接种前血清中观察到没有显著的Her-2/neu反应性。根据肽和融合肽特异性结果,与30μg浓度的病毒体制剂相比,在采用CRM-融合肽缀合物免疫的组中观察到显著更高的Her-2/neu特异性滴度。在采用病毒体进行第三次免疫接种后也观察到显著的抗体滴度。在已采用CRM-融合肽缀合物免疫的小鼠中,在第2次免疫接种后抗体滴度是高的,在第3次免疫接种后没有显著增加。
在第2次、第3次和第4次免疫接种后血清抗体滴度的分析显示,与CRM-缀合物相比,采用病毒体缀合物的抗体应答的动力学不同。第2次免疫接种后(免疫接种开始后6周),与病毒体缀合物相比,在采用CRM-融合肽缀合物免疫的动物中观察到更高的抗体滴度(参见图9)。在采用病毒体缀合物进行第3次免疫接种后,观察到抗体滴度的显著增加(参见图8)。在第4次免疫接种后,Her-2/neu特异性抗体滴度在病毒体和CRM免疫的小鼠之间相当(参见图10)。在采用CRM-融合肽缀合物免疫的小鼠中,第3次和第4次免疫接种之间抗体滴度小幅增加,表示第2次免疫接种后的免疫原性强,第3次免疫接种后甚至具有更强的免疫原性(参见图11)。
如图12中显示的,采用30μg的P467-病毒体缀合物或30μg的P467-CRM缀合物第2次、第3次和第4次免疫接种后,针对重组Her-2/neu的抗体应答的动力学比较,显示即使在第2次免疫接种后,采用CRM缀合物(每集群中的第四列)免疫接种后的抗Her-2/neu抗体滴度显著高于采用相应的病毒体缀合物免疫接种后的抗体滴度(每集群中的第三列)。在第4次免疫接种后,两种缀合物导致相当的重组抗Her-2/neu抗体滴度。
如图13中显示的,采用30μg的P647-病毒体缀合物或30μg的P647-CRM缀合物,在第2次、第3次和第4次免疫接种后,针对重组Her-2/neu的抗体应答的动力学比较,显示即使在第2次免疫接种后,采用CRM缀合物(每集群中的第四列)免疫接种后的抗Her-2/neu抗体滴度显著高于用相应的病毒体缀合物免疫接种后的抗体滴度(每集群中的第三列)。
这些结果证实使用病毒体或CRM197作为融合肽的递送系统的Her-2/neu特异性抗体滴度的动力学的显著差异。采用病毒体缀合物观察到的抗体滴度的增加显著慢于采用CRM缀合物,并且通常需要四次免疫接种(关于融合肽P467)达到与相应的CRM免疫接种中所见的相似水平。关于融合肽P647,病毒体缀合物不如CRM缀合物,因为即使在第4次免疫接种后它们也不会诱导相当的抗体滴度(图13)。
实施例10-对原生的Her-2/neu蛋白的特异性
分析来源于在四次免疫接种后抽取的最终血液样品的血清。数据以OD值表示,所有血清以1:100稀释。
如图14中显示的,产生的抗体识别在SKBR-3乳癌细胞中过表达的原生形式的Her-2/neu。低的血清稀释是必需的,以在ELISA的范围内采用未纯化的细胞裂解物工作,与发明人先前的数据一致。尽管在采用病毒体缀合物免疫的组中针对肽和重组细胞外Her-2/neu蛋白的抗体滴度显著更低,OD值在病毒体缀合物和CRM197-融合肽缀合物之间是相当的。这些结果可以通过抗体与SKBR-3细胞裂解物(例如细胞膜)中组分的反应性来解释,其中是抗体是针对脂质连接的或病毒体的一些部分所产生的。这种连接不存在于CRM197-融合肽缀合物中。
实施例11–采用肽P467-CRM与Alum/Al(OH)3或Montanide的免疫后的免疫应答的评估
试剂的制备
将融合蛋白P467(长度为49个氨基酸;在Bachem合成,瑞士)与CRM197(白喉毒素突变体;PiChem/Graz/奥地利)偶联,并以0.4mg/ml的储备浓度递送。在存在或不存在三种佐剂,在小鼠中评估P467-CRM介导的免疫应答:
2)Alu-凝胶-S-悬浮液(来自德国Serva的氢氧化铝;纯度1.3%,无菌,铝含量5.9-7.1mg/ml,目录号12261,批号111589;根据制造商的说明书以1/3稀释使用);和
3)Montanide ISA 51VG(来自法国Seppic,目录号36362ZFL2R3;批号2423395)。
以下“免疫方案”中描述了免疫方案。简要地,测试三种浓度的肽构建体:每次注射10μg、25μg和50μg。在两组小鼠中测试了在以上实施例中概述的动物研究中使用的来自Serva的氢氧化铝(参见“免疫方案”),并与使用来自Brenntag的氢氧化铝进行比较。这两组中,与来自Serva的氢氧化铝一同使用的P467-CRM的量为10μg和25μg。
采用Montanide对肽构建体进行乳化
根据制造商的说明书(Seppic,法国)进行P467-CRM、PBS或NaCl与Montanide的乳化。将P467-CRM肽构建体与PBS(用于氢氧化铝,Brenntag)或NaCl(用于氢氧化铝,Serva)混合。然后将佐剂加入到溶液中并在室温下充分涡旋。然后将混合物在施用前保持在室温至少45分钟。
免疫方案
以3周间隔(每组n=8只小鼠;对照组n=4)皮下免疫雌性Balb/C小鼠(查尔斯河,德国,分娩6-8周)。
小鼠的组,即A至O,如下进行免疫:
组A(P467-CRM,10μg/注射):250μl的P467-CRM与1250μl NaCl(1500μl)。150μl/小鼠(=10μg/小鼠)
组B(P467-CRM,25μg/注射):625μl的P467-CRM与875μl NaCl(1500μl)。150μl/小鼠(=25μg/小鼠)
组C(P467-CRM,50μg/注射):1250μl的P467-CRM与250μl NaCl(1500μl)。150μl/小鼠(=50μg/小鼠)
组D(P467-CRM-Alum Brenntag,10μg/注射):250μl的P467-CRM与175μl AlumBrenntag+1325μl PBS(1750μl)。175μl/小鼠(=10μg/小鼠)
组E(P467-CRM-Alum Brenntag,25μg/注射):625μl的P467-CRM与175μl AlumBrenntag+950μl PBS(1750μl)。175μl/小鼠(=25μg/小鼠)
组F(P467-CRM-Alum Brenntag,50μg/注射):1250μl的P467-CRM与175μl AlumBrenntag+325μl PBS(1750μl)。175μl/小鼠(=50μg/小鼠)
组G(P467-CRM-Alum Serva,10μg/注射):250μl的P467-CRM与1000μl Alum Serva+250μl NaCl(1500μl)。150μl/小鼠(=10μg/小鼠)
组H(P467-CRM-Alum Serva,25μg/注射):625μl的P467-CRM与1000μl Alum Serva(1625μl)。160μl/小鼠(=10μg/小鼠)
组I(P467-CRM-Montanide,10μg/注射):300μl的P467-CRM与300μl NaCl+600μlMontanide。100μl/小鼠
组J(P467-CRM-Montanide,25μg/注射):700μl的P467-CRM与700μl Montanide。126μl/小鼠
组K(P467-CRM-Montanide,50μg/注射):1300μl的P467-CRM与1300μl Montanide。252μl/小鼠
组L(P467-Monomer,25μg/注射):250μl的P467-CRM与1250μl NaCl。150μl/小鼠(=25μg/小鼠)
组M(Montanide):1000μl NaCl+1000μl Montanide。252μl/小鼠
组N(Alum Brenntag):1575μl PBS+175μl Alum Brenntag。175μl/小鼠
组O(CRM,50μg/注射):储备浓度:2mg/ml。在NaCl中1:4稀释(150+450NaCl)。100μl/小鼠
对照组单独地仅接受CRM、氢氧化铝(Brenntag)或Montanide。
在第一次剂量(BA0)前、第2次免疫后20天(BA1)和第3免疫后18天(BA2),从动物收集血液。为了评估抗体滴度动力学,在第3次免疫后8周(BA3)也采血。
在来自每组的剩余的4只小鼠(除了处死所有小鼠的对照组M、N和O之外)中,在第3次免疫后8和16周(分别为BA4和BA5)进一步评估抗体滴度,以确定抗体动力学和必要的增强间隔。
脾细胞制备和培养
处死小鼠(n=4/组),在无菌条件下除去它们的脾脏,切碎并通过无菌过滤器过滤。如前所述制备细胞悬浮液(Wiedermann等人,Int.Immunol.1999;Oct;11(10):1717-24)。将脾细胞以每孔0.5×106的浓度在96孔圆底板中铺板,并采用20μg/ml浓度的CRM或P467刺激72小时。上清液储存在-20℃直到分析。采用ConA进行刺激作为对照。
ELISA方案
(i)肽特异性抗体水平的测量
将以碳酸盐缓冲液稀释的未缀合的融合肽P467(Bachem,瑞士)以0.5μg/微滴定孔的浓度用作包被抗原。将血清(n=8/组)稀释,加入孔中,采用辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗小鼠IgG POX(Fc片段特异性,目录号315-035-008;Jackson Immuno Research),然后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)来检测结合的IgG抗体。加入终止溶液,并在450nm对630nm对板进行读数。
为了检测IgG亚类IgG1和IgG2a,将稀释的血清应用至微滴定板的抗原包被的孔上,随后是大鼠抗小鼠IgG1或大鼠抗小鼠IgG2a抗体。然后使用二抗HRP标记的小鼠抗大鼠IgG,然后是TMB进行检测。加入终止溶液,并在450nm对630nm之处对板进行读数。
(ii)Her-2/neu特异性抗体水平的测量
采用包含与人IgG1的Fc区缀合的人Her-2/neu(氨基酸残基23-652)的重组细胞外结构域的融合蛋白包被微滴定板的孔。每孔采用0.1μg的融合蛋白进行包被。然后如上所述分析稀释的小鼠血清。
为了检测IgG亚类IgG1和IgG2a,将稀释的血清应用至抗原包被的孔,然后是加入大鼠抗小鼠IgG1或大鼠抗小鼠IgG2a。使用二抗HRP标记的小鼠抗大鼠IgG(H+L)抗体进行检测。
(iii)体外细胞因子产生的测量-IL-2、IL-5和IFNγ
收集来自CRM或P467刺激的脾细胞的上清液,并根据制造商的说明书(AffymetrixeBioscience,USA)通过ELISA分析IL-2、IL-5和IFNγ的浓度。在分析前,将上清液未稀释或1∶10-1∶20稀释使用。
荧光激活的细胞分选(FACS)分析
对新鲜分离的脾细胞(24孔平底板中的2.5×106细胞/ml)进行FACS。在佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA;10ng/ml)和离子霉素(1.25μM)存在下孵育细胞2时,在布雷非德菌素A(Brefeldin A,10μg/ml)存在下在37℃额外的4小时。然后将细胞在4℃保持过夜,并在第二天早晨采用以下靶标的抗小鼠抗体染色:
抗体 | 颜色 |
CD3 | Fitc |
CD4 | Percp |
CD8a<sub>(Ly-2)</sub> | PE |
IFNγMaB | APC |
颗粒酶B | Pe Cy7 |
CD335(NKp46) | eFluor450 |
CD19 | APCeFluor780 |
(i)染色方案:
收获细胞并分成微(micronic)管(每管1×106个/细胞)。采用上述抗体混合物对每种小鼠样品进行单染色。
然后洗涤细胞,采用Fc封闭(抗小鼠CD16/32)进行封闭,并采用CD3、CD4、CD8、CD19和CD335的抗体染色,然后固定/透化、以及IFNγ和颗粒酶B的细胞内染色。
对脾细胞群-T细胞(CD3+CD4+和CD3+CD8+)、B细胞(CD3-CD19+)和NK细胞(CD3-CD335+)的表征进行分析。分析还包括检测细胞内IFNγ蛋白。
统计分析
在Prism上应用未配对t检验(双尾,95%的置信区间),用于ELISA结果的分析。显著差异由一个或多个星号表示(*P值<0.05、**0.01<P值<0.001,***P值<0.001)。没有显著性表示为“ns”。当比较两组以上时,在Prism上应用单因素方差分析(ANOVA)。在Prism上应用Mann Whitney测试(双尾,95%的置信区间),用于分析FACS结果。
结果
体液应答
(i)肽特异性抗体水平
将来源于三次免疫后的最终血液的血清,以及免疫接种前的血清以1:100000(对于IgG和IgG1)或1:100(对于IgG2a)进行稀释。总血清IgG、IgG1和IgG2a的抗体滴度分别如图15A-C中显示的。
在图中,将以下组(框架(framed))彼此进行比较并进行统计学评估:
·D、E、F:Alum:10μg、25μg、50μg
·I、J、K:Montanide:10μg、25μg、50μg
数据显示,在采用P467-CRM免疫的所有小鼠中引发抗-P467抗体。在对照动物或单独采用P467免疫的小鼠中没有诱导抗体应答。与Alum(Brenntag)相比,当与Montanide施用P467-CRM时,IgG、IgG1和IgG2a的抗体水平显著更高。IgG2a滴度一般低于IgG1,尽管采用P467-CRM+Montanide免疫的动物中IgG2a滴度明显相当高。
(ii)Her-2/neu特异性抗体水平
将来源于三次免疫后的最终血液的血清,以及免疫前的血清以1:2500(至10000)(IgG)、1:10000(IgG1)和1:100(IgG2a)稀释。血清IgG、IgG1和IgG2a的抗体滴度分别如图16A-C中显示的。
在所有采用P467-CRM免疫的动物中,高滴度的抗细胞外Her-2/neu IgG和IgG1抗体是明显的。在对照组或单独采用P467免疫的小鼠中,没有明显的抗Her-2/neu抗体应答。与Alum(Brenntag)相比,当与Montanide施用P467-CRM肽构建体时,IgG和IgG1抗体滴度显著更高。
细胞因子(IL-2、IFNγ、IL-5)的体外产生
(i)采用CRM或P467刺激后IL-2的产生
与来源于在Alum存在下采用P467-CRM免疫的小鼠的CRM刺激的脾细胞相比,来源于在Montanide存在下采用P467-CRM免疫的小鼠的CRM-刺激的脾细胞中,IL-2水平是更高的(参见图17A和17B)。
(ii)采用CRM或P467刺激后IFNγ的产生
图18A和18B显示存在CRM(图18A)或P467(图18B),体外培养的脾细胞的上清液中IFNγ的浓度。在采用25μg的P467-CRM与Montanide免疫的小鼠中,IFNγ水平超出范围。排除来自该小鼠的数据,并进行额外的分析,如图18C(由CRM刺激)和图18D(由P467刺激)中显示的。
在来源于Alum或Montanide存在下,采用P467-CRM免疫的所有小鼠的脾细胞中,通过CRM刺激诱导IFNγ产生。采用Montanide(在10μg组中),IFNγ水平高于存在Alum(Brenntag)时采用P467-CRM免疫的相应组。采用P467-CRM刺激,采用50μg P467-CRM免疫的Montanide组中IFNγ水平最强。
(iii)采用CRM或P467刺激后IL-5的产生
图19A和19B显示存在CRM(图19A)或P467(图19B),体外培养的脾细胞的上清液中IL-5的浓度。
在来源于在Montanide存在下,采用P467-CRM免疫的小鼠的CRM-刺激的脾细胞中IL-5水平显著更高。在采用P467-CRM肽构建体刺激后,在Montanide免疫的小鼠中诱导一些IL-5产生,尽管与CRM刺激后的水平相比,IL-5水平低约10倍。
通过FACS分析表征脾细胞;IFNγ产生的细胞内染色
为了评估是否不同佐剂的使用(即,Alum对比Montanide)改变淋巴细胞分布,特别是CD8+和CD4+淋巴细胞,存在Montanide或Alum,采用不同浓度的P467免疫后,进行脾细胞的FACS分析。从小鼠中分离脾细胞并分析T细胞(CD3+CD4+,图20A,和CD3+CD8+,图20B)、B细胞(CD3-CD19+,图20C)和NK细胞(CD3-CD335+,图20D)的百分比。
数据显示,当与Alum(Brenntag)相比,来源于采用更高剂量的P467-CRM(即25mg和50mg)与Montanide一起免疫的小鼠的脾细胞中的NK细胞显著减少。
通过FACS分析检测产生IFNγ的脾细胞
为了研究采用不同佐剂进行的免疫是否会导致产生IFNγ的CD4+或CD8+细胞分布的变化,分离来自所有组的小鼠的脾细胞,并在T细胞中测量细胞内IFNγ(CD4+,图21A,和CD8+,图21B)和NK细胞(CD3-CD335+,图21C)。
数据显示,CD4+T细胞产生IFNγ,其在采用增加浓度的P467-CRM免疫的小鼠中是明显的。所有对照组(和原生的小鼠)显示相似的IFNγ水平。相比之下,来源于采用25μgP467-CRM与Montanide免疫的小鼠的CD8+T细胞的IFNγ水平是更高的。该数据还显示了来源于采用P467-CRM+Montanide免疫的小鼠的NK细胞的IFNγ产生。
抗Her2和P467肽抗体应答的动力学
为了评估抗体应答的动力学,在最后一次免疫后8周、16周和6个月取血液样品。然后根据本文公开的方法分析血液样品的Her2/neu特异性和P467肽特异性抗体滴度。
如图22显示的,在与Alum或Montanide施用最后剂量的P467-CRM肽构建体后,在8周(BA3)、16周(BA4)和6个月(BA5),P467肽特异性IgG抗体滴度保持升高。类似地,如图23中显示的,与Alum或Montanide施用最后剂量的P467-CRM肽构建体后,在8周(BA3)、16周(BA4)和6个月(BA5)Her2/neu特异性IgG抗体滴度保持升高。
总结
包含融合肽的CRM197-融合肽缀合物和病毒体制剂均产生对单一B细胞表位(P4、P6和P7)以及融合肽(P467和P647)特异性的抗体。还应注意,这些抗体也结合到Her-2/neu的重组细胞外结构域和SKBR-3乳癌细胞上表达的原生的Her2/neu蛋白。
CRM197-融合肽缀合物在诱导B细胞表位和Her2/neu特异性抗体中更有效;即,与相应的病毒体制剂相比,产生显著更高的抗体滴度(约10至20倍)。
基于针对重组Her-2/neu的抗体滴度,在免疫接种过程中抗体应答的动力学存在明显差异,结果显示,CRM-缀合物导致抗体滴度的较早增加(早已在第2次免疫接种后,在第3次免疫接种后达到峰值),而采用病毒体缀合物的抗体滴度的增加更慢,并且需要四次免疫接种以达到采用相应的CRM缀合物免疫的小鼠中所见的水平。
病毒体一般是合适的抗原递送系统。然而,本文公开的结果清楚地显示了采用病毒体缀合物免疫接种后的抗体滴度的延迟增加,以及为实现在采用相应的CRM缀合物免疫的动物中观察到的相似滴度,四次免疫接种的必要性。用于最佳抗体应答的时间和剂量均是Her-2/neu疫苗组合物临床应用所考虑的重要因素。因此,这些结果显示,CRM197在疫苗递送的情况下是Her-2/neu融合肽的更合适的载体蛋白。
显示Alum(Brenntag)和Montanide均进一步增加了上述抗体对P467-CRM肽构建体的应答。与Alum相比,采用Montanide免疫的所有小鼠中(所有剂量中)的抗P467特异性IgG、以及IgG1的抗体滴度是显著更高的。与Alum相比,采用Montanide免疫的小鼠中(在所有剂量中)的抗P467IgG2a抗体滴度也是更高的。与所研究的所有剂量的肽构建体共同施用时,采用Montanide免疫的小鼠中,抗Her-2/neu IgG和IgG1抗体滴度显著更高。与P467肽特异性抗体相反,检测到很少或没有抗Her-2/neu IgG2a抗体。
与存在P467培养的细胞相比,当存在CRM在体外培养细胞时,通过脾细胞以显著更高的量产生IFNγ。在采用CRM刺激后,当与Montanide应用时施用较低剂量的肽构建体的组中,与当与Alum(Brenntag)应用时接受相同剂量的构建体的组相比,IFNγ水平是显著更高的。数据表示,Montanide诱导更高的抗体滴度,也比Alum更高的细胞因子水平。
Claims (11)
1.一种疫苗组合物,其包含:
i)佐剂,其中所述佐剂是油包水乳剂;和
ii)与载体蛋白缀合的融合肽,
其中所述载体蛋白是SEQ ID NO:61所示的白喉毒素变体CRM-197,以及其中所述融合肽包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中所述融合肽由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗组合物,其中所述载体蛋白包含2至39个融合肽。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物,其中所述载体蛋白包含6至12个融合肽。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗组合物,还包含检查点抑制剂。
8.一种药物组合物,其包含权利要求1至7中任一项所述的疫苗组合物和药学上可接受的载体。
9.权利要求1至7中任一项所述的疫苗组合物在制备用于在有需要的患者中治疗或预防癌症的药物中的用途,所述癌症的特征在于Her2/neu的过表达。
10.根据权利要求9所述的用途,其中所述癌症是乳癌。
11.根据权利要求9所述的用途,其中所述癌症是胃癌。
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