TW201705978A - 疫苗組成物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種疫苗組成物,其包含:(i)佐劑;及(ii)至少一種結合至載體蛋白質之融合肽,其中該載體蛋白質為白喉毒素變異體CRM-197(GenBank登錄編號1007216A)且其中該至少一種融合肽包含選自由SEQ ID NO:1-7及15-60及與前述中的任一者具有至少85%一致性之胺基酸序列組成之群的Her2/neu之兩個或兩個以上非相鄰B細胞抗原決定基。本發明亦延伸至醫藥組成物及使用如本文中描述之該等疫苗及/或醫藥組成物治療或預防有需要患者之以Her2/neu之表現或過度表現為特徵的癌症之方法。
Description
本發明大體上係關於包含癌症相關蛋白質Her2/neu之片段之疫苗組成物、製備此類組成物之方法及其用於預防或治療以Her2/neu蛋白質之表現或過度表現為特徵的癌症之用途。
由erbB2/neu原致癌基因編碼之Her2/neu腫瘤抗原為屬於人類表皮生長因子受體家族之185kDa蛋白質。其由具有數個糖基化位點之富含半胱胺酸之細胞外結構域(ECD,自胺基酸23至652)、疏水性跨膜結構域(自胺基酸653至675)及細胞內酪胺酸激酶結構域(自胺基酸676至1255)組成。Her2/neu受體在各種上皮細胞類型之細胞膜上表現且經由特異性生長因子之結合調節細胞生長及分裂之態樣。
Her2/neu在低水準下在許多正常細胞中表現,但在各種癌症中過度表現,包括乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、胃癌、胰臟癌、前列腺癌及唾液腺癌。舉例而言,大約30%轉移性乳癌已顯示過度表現Her2/neu。此過度表現與乳癌患者之不佳預後相關,因為其與減少之無復發時段及縮短之存活時間相對應。目前,治療乳癌之最常見形式涉及手術、化學干預及/或放射線療法。除非癌症限於規定區域,否則僅手術無法消除癌症。此外,輻射治療以及化學療法可引起嚴重消極副作用。
鑒於與目前療法相關之缺點,已進行嘗試以發現用於治療增生性病症(諸如乳癌)之額外方法,包括免疫療法。
腫瘤中Her2/neu過度表現之臨床含義已使得Her2/neu為單獨或作為習知化學療法之輔助的抗體介導之免疫療法之有吸引力的目標。舉例而言,已顯示單株抗體(mAb)4D5藉由直接及間接機制,諸如細胞凋亡、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)減少小鼠中Her2/neu表現腫瘤之生長。基於此等結果,在臨床試驗中測試此抗體之人類化形式曲妥珠單抗(Herceptin®)。與僅化學療法或曲妥珠單抗相比,在細胞毒性治療加Herceptin®之後,觀測到具有過度表現Her2/neu之乳房腫瘤的患者之總存活期增加。Herceptin®現用作單一療法但與細胞毒性化學療法組合顯示甚至較高的功效。然而應注意曲妥珠單抗一般僅在過度表現Her2/neu受體之乳癌中有效。此外,典型地需要多次輸注,產生較高治療成本。
使用被動免疫療法與單株抗體(諸如曲妥珠單抗)治療或預防Her2/neu相關癌症之替代方法係基於誘導腫瘤特異性體液及/或細胞免疫反應及鑑定經人類B及T淋巴細胞識別的抗原。舉例而言,已藉由具有表現Her2/neu之細胞的免疫小鼠產生針對Her2/neu之細胞外結構域(ECD)的許多抗體。此等抗體之生物效果似乎為抗原決定基特異性的;亦即,其係基於Her2/neu ECD內短子序列之特異性識別。然而,一些抗體不具有效果或甚至主動刺激腫瘤生長。
此類用於癌症之疫苗免疫療法已基於針對其引發體液及/或細胞反應的抗原。此等抗原應理想地由腫瘤細胞專門地表現或過度表現,
通常稱為腫瘤相關抗原(TAA)。針對乳癌所描述之第一TAA中之一者為Her2/neu。同時,已測試代表不同抗原決定基之各種TAA,但至此無一者成功地在臨床實踐中利用。
視預期免疫反應類型(亦即B細胞或T細胞反應)而定,典型地應用不同策略。舉例而言,為了誘導B細胞(亦即抗體)反應,抗原應包含B細胞抗原決定基。如在此項技術中一般理解,B細胞抗原決定基為經B細胞受體識別且結合的抗原之一部分。脂質、多醣及蛋白質/肽可含有B細胞抗原決定基,其在引入所選生物體中後致使B細胞產生特異性結合至引入之抗原決定基的抗體。
Her2/neu之ECD之個別片段,包括B細胞抗原決定基,在此項技術中已知。舉例而言,WO 2002/068474描述包含序列出現在Her2/neu蛋白質之細胞外部分中的9-25個胺基酸之肽的疫苗。此外,WO 2007/118660描述多肽疫苗,其包含呈現如在Her2/neu蛋白質之細胞外部分中出現之不同胺基酸序列的肽之特定組合。此等肽可單獨或組合以各較佳單獨結合至遞送系統的多個各別肽形式投予。在另一實施例中,WO 2011/020604描述包含偶合至病毒體遞送系統之多個Her2/neu B細胞抗原決定基的融合肽。此等病毒體顯示與用蒙塔尼德(Montanide)TM或基於ISCOM之遞送系統調配的相同融合肽相比,誘導較高的針對單一B細胞抗原決定基之抗體效價。
儘管進行研發用於誘導針對Her2/neu之免疫性的適合疫苗的數種嘗試,在臨床使用中仍不存在有效疫苗。本發明之目標為提供適用於用作治療或預防以Her2/neu之表現或過度表現為特徵之病狀(諸如癌症)的疫苗的改良組成物。
本說明書描述一種疫苗組成物,其包含:(i)佐劑;及(ii)至少一種結合至載體蛋白質之融合肽,其中該載體蛋白質為白喉毒素變異體CRM-197(GenBank登錄編號1007216A;SEQ ID NO:61)且其中該至少一種融合肽包含選自由SEQ ID NO:1-7及15-60及與前述中的任一者具有至少85%一致性之胺基酸序列組成之群的Her2/neu之兩個或兩個以上非相鄰B細胞抗原決定基。
本說明書亦描述一種醫藥組成物,其包含如本文中描述之疫苗組成物及醫藥學上可接受之載劑。
本說明書亦描述一種治療或預防有需要患者之以Her2/neu之表現或過度表現為特徵之癌症的方法,該方法包含向該患者投予有效量之如本文中描述之疫苗組成物或如本文中描述之醫藥組成物的步驟。
本說明書亦描述如本文中描述之疫苗組成物在製造用於治療或預防有需要患者之以Her2/neu之表現或過度表現為特徵之癌症的藥物中的用途。
本說明書亦揭示如本文中所描述用於治療或預防有需要患者之以Her2/neu之表現或過度表現為特徵之癌症的疫苗組成物或醫藥組成物。
圖1顯示在用併入P467或P647融合肽之病毒體或CRM197融合蛋白結
合物(CRM)進行第四次免疫之後獲得的血清樣品中之抗P4抗體效價。資料以OD值形式呈現。
圖2顯示在用併入P467或P647融合肽之病毒體或CRM197融合蛋白結合物(CRM)進行第四次免疫之後獲得的血清樣品中之抗P6抗體效價。資料以OD值形式呈現。
圖3顯示在用併入P467或P647融合肽之病毒體或CRM197融合蛋白結合物(CRM)進行第四次免疫之後獲得的血清樣品中之抗P7抗體效價。資料以OD值形式呈現。
圖4顯示在用併入P467或P647融合肽之病毒體或CRM197融合蛋白結合物(CRM)進行第四次免疫之後獲得的血清樣品中之抗P467抗體效價。資料以OD值形式呈現。
圖5顯示在用併入P467或P647融合肽之病毒體或CRM197融合蛋白結合物(CRM)進行第四次免疫之後獲得的血清樣品中之抗P647抗體效價。資料以OD值形式呈現。
圖6顯示在用併入P467或P647融合肽之病毒體或CRM197融合蛋白結合物(CRM)進行第二次(BA1;第1次血液抽取)、第三次(BA2;第2次血液抽取)及第四次(BA3;第3次血液抽取)免疫之後兩週獲得的血清樣品中之抗P467抗體效價。資料以OD值形式呈現。
圖7顯示在用併入P467或P647融合肽之病毒體或CRM197融合蛋白結合物(CRM)進行第二次(BA1;第1次血液抽取)、第三次(BA2;第2次血液抽取)及第四次(BA3;第3次血液抽取)免疫之後兩週獲得的血清樣品中之抗P647抗體效價。資料以OD值形式呈現。
圖8顯示來自在用併入P467或P647融合肽之病毒體調配物(15、30、50μg)或CRM197融合蛋白結合物(CRM;30μg)進行第二次(BA1;第1次血液抽取)及第三次(BA2;第2次血液抽取)免疫之後兩週獲得的血清樣品的抗體能夠結合至Her2/neu之重組ECD。資料以OD值形式呈現。
圖9顯示來自在用併入P467或P647融合肽之病毒體調配物(15、30、50μg)或CRM197融合蛋白結合物(CRM;30μg)進行第二次(BA1;第1次血液抽取)免疫之後兩週獲得的血清樣品的重組Her2/neu特異性抗體。資料以OD值形式呈現。
圖10顯示來自在用併入P467或P647融合肽之病毒體調配物(15、30、50μg)或CRM197融合蛋白結合物(CRM;30μg)進行第四次(BA3;第3次血液抽取)免疫之後兩週獲得的血清樣品的重組Her2/neu特異性抗體。資料以OD值形式呈現。
圖11顯示在用包含P467或P647融合肽之CRM197融合蛋白結合物(CRM;30μg)進行第二次、第三次及第四次免疫之後重組Her2/neu特異性抗體效價之動力學。在1:4,000之稀釋度下分析血清。資料以OD值形式呈現。
圖12顯示在用結合至病毒體或CRM197之濃度為30μg之P467融合肽進行第2次、第3次及第4次免疫之後抗體效價之直接比較。在各組中自左至右:預備池(在免疫之前抽取的血液);TIRIV(空病毒體);P467-30mg/小鼠(結合病毒體);P467-30mg/小鼠-CRM(結合CRM197)。在相同稀釋度下分析所有血清。資料以OD值形式呈現。
圖13顯示在用結合至病毒體或CRM197之濃度為30μg之P647融合
肽進行第2次、第3次及第4次免疫之後抗體效價之直接比較。在各組中自左至右:預備池(在免疫之前抽取的血液);TIRIV(空病毒體);P647-30mg/小鼠(結合病毒體);P647-30mg/小鼠-CRM(結合CRM197)。在相同稀釋度下分析所有血清。資料以OD值形式呈現。
圖14顯示用併入P467或P647融合肽之病毒體或CRM197融合蛋白結合物(CRM)進行免疫誘導了能夠結合至在SKBR-3乳癌細胞之表面上表現之天然Her2/neu的抗體。資料以OD值形式呈現。
圖15A顯示在單獨(P467-CRM)、與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予的P467-CRM197融合蛋白在10μg、25μg及50μg下之三次給藥之後小鼠中之抗P467 IgG抗體效價。將抗體效價與在僅用P467肽(P467;25μg)、用來自Brenntag之礬(礬(Brenntag))或僅用CRM197(CRM)投予之對照動物中可見的水準相比。資料以OD值形式呈現;*p<0.05,**p<0.01及***p<0.001。
圖15B顯示在單獨(P467-CRM)、與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197融合蛋白在10μg、25μg及50μg下之三次給藥之後小鼠中之抗P467 IgG1抗體效價。將抗體效價與在僅用P467肽投予之對照動物中可見的水準相比。資料以OD值形式呈現;*p<0.05,**p<0.01及***p<0.001。
圖15C顯示在單獨(P467-CRM)、與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起
(P467-CRM+蒙塔尼德)投予的P467-CRM197融合蛋白在10μg、25μg及50μg下之三次給藥之後小鼠中之抗P467 IgG2a抗體效價。將抗體效價與在僅用P467肽(P467;25μg)、用來自Brenntag之礬(礬(Brenntag))或僅用CRM197(CRM)投予之對照動物中可見的水準相比。資料以OD值形式呈現;*p<0.05,**p<0.01及***p<0.001。
圖16A顯示在單獨(P467-CRM)、與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予的P467-CRM197融合蛋白在10μg、25μg及50μg下之三次給藥之後小鼠中之抗細胞外Her2/neu IgG抗體效價。將抗體效價與在僅用P467肽(P467;25μg)、用來自Brenntag之礬(礬(Brenntag))或僅用CRM197(CRM)投予之對照動物中可見的水準相比。資料以OD值形式呈現;*p<0.05,**p<0.01及***p<0.001。
圖16B顯示在單獨(P467-CRM)、與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197融合蛋白在10μg、25μg及50μg下之三次給藥之後小鼠中之抗細胞外Her2/neu IgG1抗體效價。將抗體效價與在僅用P467肽(P467;25μg)、用來自Brenntag之礬(礬(Brenntag))或僅用CRM197(CRM)投予之對照動物中可見的水準相比。資料以OD值形式呈現;*p<0.05,**p<0.01及***p<0.001。
圖17A顯示自用在10μg、25μg及50μg下單獨(P467-CRM)、與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197
融合蛋白免疫之小鼠衍生的CRM197活化脾細胞之IL-2產量。將IL-12水準(pg/ml)與在衍生自對照動物之CRM197活化脾細胞中可見的IL-2水準相比,該等對照動物僅用礬(礬(Brenntag))、僅用蒙塔尼德(蒙塔尼德)或僅用CRM197(CRM)投予。資料以pg/ml形式呈現;**p<0.01且ns=不統計顯著。
圖17B顯示自用在10μg、25μg及50μg下單獨(P467-CRM)、與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197融合蛋白免疫之小鼠衍生的P467活化脾細胞之IL-2產量。將IL-12水準(pg/ml)與在衍生自對照動物之P467活化脾細胞中可見的IL-2水準相比,該等對照動物僅用礬(礬(Brenntag))、僅用蒙塔尼德(蒙塔尼德)或僅用CRM197(CRM)投予。資料以pg/ml形式呈現;*p<0.05,**p<0.01且ns=不統計顯著。
圖18A顯示自用在10μg、25μg及50μg下單獨(P467-CRM)、與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197融合蛋白免疫之小鼠衍生的CRM197活化脾細胞之IFN γ產量。將IFN γ水準(pg/ml)與在衍生自對照動物之CRMI97活化脾細胞中可見的IFN γ水準相比,該等對照動物僅用礬(礬(Brenntag))、僅用蒙塔尼德(蒙塔尼德)或僅用CRM197(CRM)投予。資料以pg/ml形式呈現;*p<0.05且ns=不統計顯著。
圖18B顯示自用在10μg、25μg及50μg下單獨(P467-CRM)、與
來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197融合蛋白免疫之小鼠衍生的P467活化脾細胞之IFN γ產量。將IFN γ水準(pg/ml)與在衍生自對照動物之P467活化脾細胞中可見的IFN γ水準相比,該等對照動物僅用礬(礬(Brenntag))、僅用蒙塔尼德(蒙塔尼德)或僅用CRM197(CRM)投予。資料以pg/ml形式呈現;ns=不統計顯著。
圖19A顯示自用在10μg、25μg及50μg下單獨(P467-CRM)、與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197融合蛋白免疫之小鼠衍生的CRM197活化脾細胞之IL-5產量。將IL-5水準(pg/ml)與在衍生自對照動物之CRM197活化脾細胞中可見的IL-5水準相比,該等對照動物僅用礬(礬(Brenntag))、僅用蒙塔尼德(蒙塔尼德)或僅用CRM197(CRM)投予。資料以pg/ml形式呈現;*p<0.05,**p<0.01且ns=不統計顯著。
圖19B顯示自用在10μg、25μg及50μg下單獨(P467-CRM)、與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197融合蛋白免疫之小鼠衍生的P467活化脾細胞之IL-5產量。將IL-5水準(pg/ml)與在衍生自對照動物之P467活化脾細胞中可見的IL-5水準相比,該等對照動物僅用礬(礬(Brenntag))、僅用蒙塔尼德(蒙塔尼德)或僅用CRM197(CRM)投予。資料以pg/ml形式呈現;ns=不統計顯著。
圖20A顯示在用在10μg、25μg及50μg下與來自Brenntag之礬一
起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197融合蛋白免疫的小鼠中在殺死時CD3+CD4+脾細胞(T淋巴細胞)之分佈。將CD3+CD4+脾細胞之百分比與在對照動物中可見之CD3+CD4+脾細胞之百分比相比,該等對照動物僅用礬(礬(Brenntag))、僅用蒙塔尼德(蒙塔尼德)或僅用CRM197(CRM)投予。資料以細胞總數之百分比形式呈現;ns=不統計顯著。
圖20B顯示在用在10μg、25μg及50μg下與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197融合蛋白免疫的小鼠中在殺死時CD3+CD8+脾細胞(T淋巴細胞)之分佈。將CD3+CD8+脾細胞之百分比與在對照動物中可見之CD3+CD8+脾細胞之百分比相比,該等對照動物僅用礬(礬(Brenntag))、僅用蒙塔尼德(蒙塔尼德)或僅用CRM197(CRM)投予。資料以細胞總數之百分比形式呈現;ns=不統計顯著。
圖20C顯示在用在10μg、25μg及50μg下與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197融合蛋白免疫的小鼠中在殺死時CD3-CD19+脾細胞(B細胞)之分佈。將CD3-CD19+脾細胞之百分比與在對照動物中可見之CD3-CD19+脾細胞之百分比相比,該等對照動物僅用礬(礬(Brenntag))、僅用蒙塔尼德(蒙塔尼德)或僅用CRM197(CRM)投予。資料以細胞總數之百分比形式呈現;ns=不統計顯
著。
圖20D顯示在用在10μg、25μg及50μg下與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197融合蛋白免疫的小鼠中在殺死時CD335+脾細胞(自然殺手(NK)細胞)之分佈。將CD335+脾細胞之百分比與在對照動物中可見之CD335+脾細胞之百分比相比,該等對照動物僅用礬(礬(Brenntag))、僅用蒙塔尼德(蒙塔尼德)或僅用CRM197(CRM)投予。資料以細胞總數之百分比形式呈現;*p<0.05且ns=不統計顯著。
圖21A顯示在用在10μg、25μg及50μg下與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197融合蛋白免疫的小鼠中在殺死時CD3+CD4+IFN γ+脾細胞(產生IFN γ之T細胞)之分佈。將CD3+CD4+IFN γ+脾細胞之百分比與在對照動物中可見之CD3+CD4+IFN γ+脾細胞之百分比相比,該等對照動物僅用礬(礬(Brenntag))、僅用蒙塔尼德(蒙塔尼德)或僅用CRM197(CRM)投予。資料以細胞總數之百分比形式呈現;ns=不統計顯著。
圖21B顯示在用在10μg、25μg及50μg下與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197融合蛋白免疫的小鼠中在殺死時CD3+CD8+IFN γ+脾細胞(產生IFN γ之T細胞)之分佈。將CD3+CD8+IFN γ+脾細胞之百分比與在對照動物中可見之
CD3+CD8+IFN γ+脾細胞之百分比相比,該等對照動物僅用礬(礬(Brenntag))、僅用蒙塔尼德(蒙塔尼德)或僅用CRM197(CRM)投予。資料以細胞總數之百分比形式呈現;*p<0.05且ns=不統計顯著。
圖21C顯示在用在10μg、25μg及50μg下與來自Brenntag之礬一起(P467-CRM+礬)、與來自Serva之礬一起(P467-CRM+礬(Serva))或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)投予之P467-CRM197融合蛋白免疫的小鼠中在殺死時CD335+IFN γ+脾細胞(產生IFN γ之T細胞)之分佈。將CD335+IFN γ+脾細胞之百分比與在對照動物中可見之CD335+IFN γ+脾細胞之百分比相比,該等對照動物僅用礬(礬(Brenntag))、僅用蒙塔尼德(蒙塔尼德)或僅用CRM197(CRM)投予。資料以細胞總數之百分比形式呈現;*p<0.05且ns=不統計顯著。
圖22顯示在與礬一起(P467-CRM+礬)或蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)在10μg、25μg及50μg下投予之P467-CRM肽構築體之最後一次給藥之後3週(BA2)、8週(BA3)、16週(BA4)及6個月(BA5)時的P467肽特異性IgG抗體效價。資料以OD值形式呈現。在各群中自左至右:BA2、BA3、BA4、BA5及放血前。
圖23顯示在與礬一起(P467-CRM+礬)或與蒙塔尼德一起(P467-CRM+蒙塔尼德)在10μg、25μg及50μg下投予之P467-CRM肽構築體之最後一次給藥之後3週(BA2)、8週(BA3)、16週(BA4)及6個月(BA5)時的Her2/neu特異性IgG抗體效價。資料以OD值形式呈現。在各群中自左至右:BA2、BA3、BA4、BA5及放血前。
本文中所使用之術語僅出於描述特定具體實例之目的且並不意欲為限制性的。除非另外定義,否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬的一般技術者通常所理解的含義相同的含義。與本文所描述之材料及方法類似或等效的任何材料及方法可用於實踐本發明。關於此項技術之定義及術語及熟習此項技術者已知之其它方法,從業者可參考Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Press,Plainsview,N.Y.及Ausubel等人(1999)Current Protocols in Molecular Biology(增刊47),John Wiley & Sons,New York,Murphy等人(1995)Virus Taxonomy Springer Verlag:79-87。
在本說明書通篇中,除非本文另有規定,否則字語「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變型應理解為暗示包括所陳述之要素、或整數、或要素或整數之群,但不排除任何其他要素、或整數、或要素或整數之群。
「由……組成」意謂包括且限於在片語「由……組成」之後的任何事物。因此,片語「由……組成」指示所列出要素為所必需的或必選的,且不可存在其他要素。「主要由……組成」意欲包括在該片語之後所列之任何要素,且限於不干擾或促進所列要素在揭示內容中所指定之活性或作用的其他要素。因此,片語「主要由……組成」指示所列要素為所需或必選的,但其他要素視情況選用且視其是否影響所列要素之活性或作用而定可存在或可不存在。
如本文所用,除非上下文另外明確指示,否則單數形式「一種/一個(a/an)」及「該(the)」包括複數個態樣。因此,舉例而言,提及
「一個細胞」包括單個細胞,以及兩個或兩個以上細胞;提及「一種生物體」包括一種生物體,以及兩種或兩種以上生物體等。
核苷酸及胺基酸序列藉由序列標識號(SEQ ID NO:)提及。SEQ ID NO:在數字上對應於序列標識符<400>1、<400>2等。本文提供序列標識符之概述。
本發明至少部分基於發明者之如下出人意料的發現:包含以下的疫苗組成物可引發遠大於可藉由使用諸如病毒體之遞送系統實現的反應的抗原特異性抗體反應:(i)佐劑及(ii)自Her2/neu之細胞外結構域(ECD)衍生之多個B細胞抗原決定基之結合至無毒白喉毒素變異體CRM-197(GenBank登錄編號1007216A)的融合肽。
因此,在一個態樣中,提供一種疫苗組成物,其包含:(i)佐劑;及(ii)至少一種結合至載體蛋白質之融合肽,其中該載體蛋白質為白喉毒素變異體CRM-197(GenBank登錄編號1007216A;SEQ ID NO:61)且其中該至少一種融合肽包含選自由SEQ ID NO:1-7及15-60及與前述中的任一者具有至少85%一致性之胺基酸序列組成之群的Her2/neu之兩個或兩個以上非相鄰B細胞抗原決定基。
B細胞抗原決定基
如本文所用,術語「B細胞抗原決定基」指經B細胞受體(抗體)識別之分子之一部分。因此,「B細胞抗原決定基」應理解為抗原之較小子序列,該抗原決定基子序列能夠經抗體識別。抗原可含有多個B細胞抗原決定基,且因此可由多種不同抗體結合,但此抗原之任何給定抗原決
定基片段將典型地僅由一種抗體結合。
如本文所用,術語「肽」及「多肽」在其最廣泛含義上使用以指兩個或兩個以上胺基酸殘基或胺基酸類似物之分子。胺基酸殘基可藉由肽鍵或替代地藉由其他鍵(例如酯、醚等)連接,但在大多數情況下將藉由肽鍵連接。
如本文所用,術語「胺基酸」或「胺基酸殘基」包涵天然及非天然或合成胺基酸兩者,包括D-或L-形式,及胺基酸類似物。「胺基酸類似物」應理解為在一或多個原子處與其對應天然存在之胺基酸不同的非天然存在之胺基酸。舉例而言,半胱胺酸之胺基酸類似物可為高半胱胺酸。
熟習此項技術者將知曉如何判定肽是否為Her2/neu之B細胞抗原決定基。在一說明性實施例中,肽可藉由使用現有電腦程式以高精確度鑑定為或包含B細胞抗原決定基,該等現有電腦程式比較所討論之肽之序列與已知序列及/或已知由經人類或小鼠生殖系編碼之抗體識別的部分序列之資料庫。替代地,給定肽或多肽內之B細胞抗原決定基可藉由電腦輔助分析使用抗原性之相關因素(諸如表面可接近性、鏈可撓性、親水性(hydropathy)/親水性(hydrophilicity)特徵、預測之二級結構等)之各種組合來鑑定。替代地,所討論之肽可藉由以下鑑定為是或包含B細胞抗原決定基:用所討論之肽將動物免疫至少一次,使得建立免疫反應且隨後使用例如酶聯結免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析、西方墨點分析或點漬墨分析(spot-blot analysis)針對特異性結合至至少一部分投予肽之抗體測試動物血清。如何判定所討論之肽是否為B細胞抗原決定基之更詳細描述在本文中在以下提供於實施例6及7中。
以下表1陳述Her2/neu之細胞外結構域之B細胞抗原決定基之胺基酸序列,包括其衍生物:
在本文所揭示之具體實例中,兩個或兩個以上B細胞抗原決定基選自由如表1及2中所示之SEQ ID NO:1-7及15-60及與前述中的任一者具有至少85%一致性(亦即與SEQ ID NO:1-7及15-60中之任一者具有至少85%序列一致性)之胺基酸序列組成之群。在本文所揭示之另一具體實例中,兩個或兩個以上B細胞抗原決定基選自由SEQ ID NO:1-7及與前述中的任一者具有至少85%一致性(亦即與SEQ ID NO:1-7中之任一者具有至少85%序列一致性)的胺基酸序列組成之群。應注意此等B細胞抗原決定基中無一者在天然Her2/neu中相鄰。
與SEQ ID NO:1-7及15-60中之任一者具有至少85%序列一致性之胺基酸序列包括由將Her2/neu ECD之天然(亦即天然存在之)B細
胞抗原決定基中之至少一個胺基酸用不存在於Her2/neu之該位置處的另一胺基酸取代以使得胺基酸取代保持保守性產生的衍生物。可製得衍生物以便增加中間物及/或最終產物中融合肽之穩定性或增加中間物及/或最終產物中融合肽之溶解性或增加融合肽之免疫原性。製備適合衍生物之方法將為熟習此項技術者已知。說明性實施例包括使用突變核酸分子合成衍生物或其重組產物。此外,衍生物將典型地保留其作為如本文中他處描述之B細胞抗原決定基之品質。因此,本文亦揭示「官能性」衍生物,其中對天然序列進行之胺基酸取代不或不完全消除衍生物充當B細胞抗原決定基之能力。
額外或優化免疫刺激融合肽之鑑定亦可包括比較B細胞藉由融合肽之刺激與B細胞藉由衍生物之刺激作為免疫效應細胞藉由衍生物之刺激之效用之確定的步驟。藉由比較衍生物與已知融合肽,可製備具有增加之免疫細胞刺激特性的肽。
如本文所用,「保守取代」指改變在給定位置處之胺基酸一致性以置換為大約相等尺寸、電荷及/或極性之胺基酸。胺基酸之天然保守性取代之實例包括以下8個取代組(由習知單字母代碼指定):(1)M、I、L、V;(2)F、Y、W;(3)K、R,(4)A、G;(5)S、T;(6)Q、N;(7)E、D;及(8)C、S。
衍生物亦可由功能上等效之胺基酸取代產生。如本文所用,此等應理解為當實現時產生融合肽之胺基酸取代,與無對應衍生之融合肽相比,該融合肽將基於來自已投予包含衍生抗原決定基片段之融合肽的動物的血清提供相同或相當(例如在10%內)ELISA讀數。融合肽之抗原性可
例如藉由經由如例如在實施例6及7中描述之ELISA量測由動物之免疫引發之抗體效價來確定。可使用類似方法分析保守性或其他胺基酸取代之功能等效性。舉例而言,使用相同分析比較由包含非衍生「親本」片段之融合肽引發之免疫反應與由包含衍生片段之融合肽引發之免疫反應。若由包含衍生片段之融合肽引發之免疫反應與由具有非衍生片段之融合肽引發之免疫反應一樣強,則胺基酸取代可視為功能上等效。若衍生免疫反應優於非衍生免疫反應,則胺基酸取代可視為改良的。
如本文所用,術語「天然(native)」及「天然(natural)」指如通常在自然界中出現之分子形式。因而,Her2/neu之ECD之「天然」序列指預先公開之Her2/neu胺基酸序列(Swiss-Prot資料庫登錄編號P04626;ERBB2_HUMAN)之胺基酸殘基23-652。相反,「非天然」序列,包括「非天然連接子」,為不屬於Her2/neu之ECD之天然序列的任何胺基酸序列。因此,在本文所揭示之具體實例中,肽「非天然連接子」不表示Her2/neu片段中之任一者之連接至Her2/neu之鄰接天然序列中的延伸。
融合肽
基於多種抗原決定基/肽設計用於表現Her2/neu或過度表現Her2/neu之癌症的免疫預防及/或免疫治療疫苗組成物需要以各別(亦即單獨)肽形式投予此等肽。此具有某些暗示缺點。舉例而言,在相同組成物內同時投予多種肽有此等肽將聚集,從而降低其對宿主免疫系統之預期可用性的風險。在極端情況下,此等聚集物之溶解性可降低,使得聚集物沈澱,變得對於宿主免疫系統不可用。同時,在不同溶液中及在不同時間點單獨投予此等肽減少此等肽之免疫原性影響可以有利方式組合的可能性。
當多種單一抗原決定基與某些類型之遞送系統(諸如病毒體、脂質體或病毒樣粒子(VLP))一起使用時出現其他困難。為了允許可再現疫苗產生,有利地以規定濃度呈現抗原決定基。然而,當將多個肽片段偶合(亦即共價締合)至單一遞送系統(諸如病毒體或脂質體)時,難以確保相同數目之抗原決定基偶合至各遞送系統。始終存在每個遞送系統之偶合數目的波動。雖然可相對確定各可行遞送系統將偶合至比如抗原決定基A與B中之每一者,一些遞送系統將與比預期略微更多的抗原決定基A締合,而在其他中抗原決定基B將略微超過預期量。雖然抗原決定基A與B之高斯分佈(Gaussian distribution)將傾向於集中於片段A:B之預期比,按照定義任何高斯分佈含有離群值,且此等離群值潛在地降低最大免疫原性功效,且變得愈來愈昂貴及難以排除,因為在遞送系統中維持預期抗原決定基比率之要求變得更嚴格。當試圖實現一個Her2/neu ECD片段與另一個之所需比而組合與不同抗原決定基片段締合之遞送系統(諸如病毒體)時類似問題亦適用。
本文揭示克服或至少部分減輕以上缺點之方法。藉由在單一融合肽中連接至少兩種來自Her2/neu之ECD的非相鄰B細胞抗原決定基或其衍生物,可獲得僅存在一種融合肽之均質調配物。融合肽之元件(亦即在天然ECD中非相鄰之Her2/neu之ECD的抗原決定基)在各肽中相同,且可經選擇(或經選擇及修飾)以使得非所需多肽內及多肽間相互作用最小化。
在本文中描述之具體實例中,疫苗組成物將包含單一類型之融合肽。因此,存在之B細胞抗原決定基之比最終由融合肽中此等片段之
比指定。此意謂用於引發免疫原性反應之任何所需比率可容易地及可靠地固定在融合肽構築及設計之水準下。
最後,當使用無毒白喉毒素變異體CRM-197作為載體蛋白質來遞送本文中描述之融合肽時,與各Her2/neu B細胞抗原決定基在疫苗組成物中之相對分佈相關的變化性可最小化或避免,因為一個Her2/neu B細胞抗原決定基與其任何其他天然非相鄰B細胞抗原決定基之比將保持恆定,不論多少融合肽結合於載體蛋白質,因為如上文所提及,在單一融合肽之水準下確定此比。
在本文所揭示之其他具體實例中,疫苗組成物將包含一種以上融合肽。
本文所揭示之疫苗組成物在投予其之宿主中引發抗原特異性抗體反應。出人意料地,由疫苗組成物引發之抗原特異性反應為比可單獨使用Her2/neu B細胞抗原決定基或使用替代遞送系統(諸如病毒體)獲得的免疫反應大的數量級。因此,本發明避免用於將肽併入至病毒體中的複雜製造方法之缺點或至少使其最小化,其為通常與嘗試將多種個別肽併入至遞送系統中及可降低所得疫苗組成物之功效的單獨B細胞抗原決定基片段之間的可能不良相互作用相關的變化性。
如本文所用,術語「融合肽」指由Her2/neu之ECD之例如經由肽(醯胺)鍵彼此連接之兩個或兩個以上非相鄰B細胞抗原決定基(例如Her2/neu之ECD之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11個或11個以上非相鄰B細胞抗原決定基)構成的非天然肽。在本文所揭示之具體實例中,Her2/neu之ECD之兩個或兩個以上B細胞抗原決定基在其天然狀態中,亦
即在天然Her2/neu之ECD中不相鄰。
在本文所揭示之具體實例中,融合肽包含Her2/neu之ECD之至少三個非相鄰B細胞抗原決定基。在一具體實例中,融合肽包含選自由SEQ ID NO:8-14及與前述中的任一者具有至少85%一致性之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列。
以下表2提供所選B細胞抗原決定基以及根據本文所揭示之一些具體實例的融合肽之清單:
在本文所揭示之具體實例中,融合肽包含SEQ ID NO:8(指定融合肽P467)或SEQ ID NO:9(指定融合肽P647)之胺基酸序列或與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少85%一致性的胺基酸序列,如以上表2中所示。
本文中亦涵蓋包含Her2/neu之ECD之兩個或兩個以上B細胞抗原決定基的融合肽,該等抗原決定基選自由以下組成之群:以串聯重複形式串接兩次或多於兩次之SEQ ID NO:1-7及15-60,或與前述中的任一者具有至少85%一致性的胺基酸序列。舉例而言,本文中涵蓋之融合肽可包含SEQ ID NO:1之兩個或兩個以上串聯重複、SEQ ID NO:2之兩個或兩個以上串聯重複、SEQ ID NO:3之兩個或兩個以上串聯重複、SEQ ID NO:4之兩個或兩個以上串聯重複、SEQ ID NO:5之兩個或兩個以上串聯重複等。然而應瞭解,將兩個或兩個以上不同B細胞抗原決定基併入至融合肽中更可能藉由引發特異性識別Her2/neu之ECD之多個B細胞抗原決定基的抗體產生更有利免疫反應。因此,在本文所揭示之具體實例中,融合肽包含Her2/neu之ECD之至少兩個選自由以下組成之群的不同B細胞抗原決定基:SEQ ID NO:1-7及15-60,或與前述中的任一者具有至少85%一致性的胺基酸序列。
在本文所揭示之具體實例中,融合肽由選自由SEQ ID NO:8-14組成之群的胺基酸序列組成。在另一具體實例中,融合肽由SEQ ID NO:8(指定融合肽P467)或SEQ ID NO:9(指定融合肽P647)之胺基酸序列組成。
在如上文在表2中所述之SEQ ID NO:3及4之個別B細胞抗原決定基中,SEQ ID NO:4包含以Cys(亦即GGGGGC)結尾之未在SEQ ID NO:3中發現之另一C端連接子。此在SEQ ID NO:4中之C端連接子自身以Cys結尾,其允許此單一抗原決定基偶合至載體蛋白質,如在下文中陳述之一些實施例中所說明。當用作本發明之融合肽之一部分時,SEQ ID NO:4之B細胞抗原決定基以SEQ ID NO:3形式存在於此融合肽中。在使用SEQ ID
NO:4之B細胞抗原決定基之實驗中,其為與SEQ ID NO:3對應之充當B細胞抗原決定基之SEQ ID NO:4的部分。
製備如本文中描述之融合肽之適合方法將為熟習此項技術者所熟悉。說明性實例包括肽合成,其涉及依序形成如本文中他處描述之將各B細胞抗原決定基連接至其分別相鄰B細胞抗原決定基之肽鍵,及回收該融合肽。適合之肽合成方法將在此項技術中已知。說明性實施例包括「Amino Acid and Peptide Synthesis」(Oxford Chemistry Primers;John Jones,Oxford University Press)中描述之方法。合成肽亦可藉由液相合成或固相肽合成(SPPS)在不同固體載體(例如聚苯乙烯、聚醯胺或PEG)上製得。SPPS可併入F-moc(9H-茀-9-基甲氧基羰基)或t-Boc(第三丁氧基羰基)之使用。定製肽亦可購自許多商業製造商。
替代地,融合肽可藉由重組方法製備。舉例而言,包含編碼融合肽之核酸序列的核酸分子可轉染至能夠表現該核酸序列之適合宿主細胞中,在適用於表現該核酸序列之條件下培育該宿主細胞,及回收該融合肽。用於製備編碼所關注融合肽之核酸分子之適合方法基於基因密碼之知識亦將為熟習此項技術者已知,可能包括基於將用於表現及/或分泌重組融合肽之宿主細胞(例如微生物)之性質來優化密碼子。適合之宿主細胞亦將為熟習此項技術者已知,其說明性實例包括原核細胞(例如大腸桿菌)及真核細胞(例如巴斯德畢赤酵母(P.pastoris))。參考「Short Protocols in Molecular Biology,第5版,2卷集:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology」(Frederick M.Ausubel(原創者、編者),Roger Brent(編者),Robert E.Kingston(編者),David D.Moore(編者),J.G.Seidman
(編者),John A.Smith(編者),Kevin Struhl(編者),J Wiley & Sons,London)。
如本文所用,術語「編碼(encode/encoding)」及其類似術語指核酸提供另一核酸或多肽之能力。舉例而言,若核酸序列可典型地在宿主細胞中轉錄及/或轉譯以產生多肽或若其可加工成可經轉錄及/或轉譯以產生多肽之形式,則將其稱為「編碼」多肽。此類核酸序列可包括編碼序列或編碼序列及非編碼序列兩者。因此,術語「編碼(encode/encoding)」及其類似術語包括由DNA分子之轉錄產生之RNA產物、由RNA分子之轉譯產生之蛋白質、由DNA分子之轉錄以形成RNA產物及RNA產物之隨後轉譯產生之蛋白質或由DNA分子之轉錄以提供RNA產物、RNA產物之處理以提供經處理RNA產物(例如mRNA)及經處理RNA產物之隨後轉譯產生的蛋白質。在一些具體實例中,編碼本文中描述之B細胞抗原決定基或融合肽之核酸序列經密碼子優化以便在適合宿主細胞中表現。舉例而言,在融合肽將用於在人類個體中誘導針對Her2/neu之免疫反應之情況下,核酸序列可經人類密碼子優化。密碼子優化之適合方法將為熟習此項技術者已知,諸如使用John Hopkins University Build a Genome網站上之位於「Software Tools」中之「Gene Design」工具之「Reverse Translation」選項。
如本文中描述之Her2/neu之兩個或兩個以上非相鄰B細胞抗原決定基可藉由熟習此項技術者已知之任何方式在融合肽內彼此連接。術語「連接」及「經連接」包括兩個非相鄰Her2/neu B細胞抗原決定基經由肽鍵之直接連接;亦即一個Her2/neu抗原決定基之C端經由肽鍵共價結合至另一天然非相鄰抗原決定基之N端。術語「連接」及「經連接」亦在其含義內包括兩個天然非相鄰Her2/neu抗原決定基經由插入連接子元件之連
接。
在本文所揭示之具體實例中,該等B細胞抗原決定基或其衍生物中之至少兩者經由非天然連接肽序列彼此連接。
如本文所用,術語「連接子」指融合肽內插入於任何兩個相鄰Her2/neu B細胞抗原決定基或其衍生物之間的短多肽序列。在一具體實例中,連接子為1至10個,較佳1、2、3、4或5個天然或非天然存在之胺基酸之多肽連接子。在一具體實例中,連接子為碳水化合物連接子。適合之碳水化合物連接子將為熟習此項技術者已知。在本文所揭示之另一具體實例中,融合肽包含一或多個肽或多肽連接子以及一或多個其他非肽或非多肽連接子。此外,在認為合適時可在同一融合肽中併入不同類型之肽或非肽連接子。在肽或多肽連接子用於接合來自Her2/neu之ECD的兩個各別B細胞抗原決定基片段之情況下,將有利地併入連接子以使得其N端經由肽鍵結合至一個抗原決定基片段之C端,且其C端經由肽鍵結合至另一片段之N端。融合肽內之個別B細胞抗原決定基片段亦可具有添加至任一個或兩個末端,較佳至C端的一或多種胺基酸。因此舉例而言,連接子或間隔子胺基酸可添加至肽之N端或C端或兩者,以連接非相鄰肽且允許肽彼此適宜偶合及/或經由病毒體中充當錨之脂質分子偶合至諸如病毒體之遞送系統。適合肽連接子之說明性實例為LP(白胺酸-脯胺酸),如例如SEQ ID NO:8中所示。
熟習此項技術者應瞭解在融合肽與載體蛋白質之偶合為經由連接子之情況下,較佳地自融合肽之C端實現此類連接子介導之偶合,因為自N端之連接子偶合在一些情況下可對將引發之所需免疫反應具有負
面影響。
序列一致性及序列相似性
提及「至少85%」包括例如在最佳比對或最佳擬合分析之後,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性或相似性。因此,在本發明之較佳形式中,例如在最佳比對或最佳擬合分析之後,序列與本文中鑑定之序列具有至少85%、較佳至少86%、較佳至少87%、較佳至少88%、較佳至少89%、較佳至少90%、較佳至少91%、較佳至少92%、較佳至少93%、較佳至少94%、較佳至少95%、較佳至少96%、較佳至少97%、較佳至少98%、較佳至少99%或較佳100%序列一致性或序列同源性。
如本文所用,術語「一致性」、「相似性」、「序列一致性」、「序列相似性」、「同源性」、「序列同源性」及其類似術語意謂在比對序列中在任何特定胺基酸殘基位置處,在比對序列之間胺基酸殘基相同。如本文所用,術語「相似性」或「序列相似性」指示在比對序列中在任何特定位置處,在序列之間胺基酸殘基為類似類型。舉例而言,白胺酸可取代異白胺酸或纈胺酸殘基。此可稱為保守取代。在一具體實例中,胺基酸序列可藉助於其中所含之胺基酸殘基中的任一者之保守取代經修飾,以使得當與未經修飾多肽相比時,修飾對經修飾多肽之結合特異性或功能活性不具有影響。
在一些具體實例中,相對於多肽之序列一致性涉及在比對序列及視需要引入空隙以實現最大同源性百分比之後與對應多肽之殘基一致的候選序列中胺基酸殘基之百分比,且不將任何保守性取代考慮為序列一
致性之一部分。既不將N端或C端延伸,亦不將插入認作為降低序列一致性或同源性。進行兩個或兩個以上胺基酸序列之比對及測定其序列一致性或同源性之方法及電腦程式為熟習此項技術者熟知。舉例而言,兩個胺基酸序列之一致性或相似性之百分比可容易地使用演算法,例如BLAST、FASTA或史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)演算法計算。本發明延伸至與本文中鑑定之序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性或序列同源性之序列及其在本文所描述之方法中之用途。
在一些具體實例中,相對於多核苷酸之序列一致性涉及在比對序列及視需要引入空隙以實現最大同源性百分比之後與對應多核苷酸之核苷酸一致的候選序列中核苷酸之百分比,且不將任何保守性取代考慮為序列一致性之一部分。進行兩個或兩個以上多核苷酸或核酸序列之比對及測定其序列一致性或同源性之方法及電腦程式為熟習此項技術者熟知。
測定胺基酸序列「相似性」之技術為熟習此項技術者熟知。通常,「相似性」意謂兩種或兩種以上多肽或在合適位置處之準確胺基酸與胺基酸比較,其中胺基酸一致或具有類似化學及/或物理特性,諸如電荷或疏水性。隨後可測定比較多肽序列之間的所謂「相似性%」。測定核酸及胺基酸序列一致性之技術亦在此項技術中熟知且包括測定該基因之mRNA之核苷酸序列(通常經由cDNA中間物)及測定由此編碼之胺基酸序列,且將此與第二胺基酸序列比較。通常,「一致性」分別指兩個多核苷酸或多肽序列之準確核苷酸與核苷酸或胺基酸與胺基酸對應性。
亦可藉由測定兩個或兩個以上多核苷酸序列之「一致性百分
比」來比較其。同樣地可藉由測定兩個或兩個以上胺基酸序列之「一致性百分比」來比較其。兩個序列(無論核酸或肽序列)之一致性百分比可描述為兩個比對序列之間的準確匹配之數目除以較短序列之長度乘以100。核酸序列之近似比對由Smith及Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)之局部同源性演算法提供。此演算法可使用由Dayhoff,Atlas of Protein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff編,5增刊3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA開發及由Gribskov,Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763(1986)校正之計分矩陣延伸至與肽序列一起使用。計算序列之間的一致性或相似性百分比之適合程式一般在此項技術中已知。
測定核酸序列一致性之說明性實施例使用目標核酸序列來使用程式BLASTN 2.1版(基於Altschul等人(1997)Nucleic Acids Research 25:3389-3402)對核酸序列資料庫(諸如GenBank資料庫(可在http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/獲得))進行搜尋。此程式可用於無空隙模式中。使用預設過濾來移除歸因於低複雜性區域之序列同源性。可使用BLASTN之預設參數。測定胺基酸序列一致性之說明性實施例使用胺基酸序列來使用BLASTP程式搜尋蛋白質序列資料庫,諸如GenBank資料庫(可在網站http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/獲得)。該程式可用於無空隙模式中。使用預設過濾來移除歸因於低複雜性區域之序列同源性。利用BLASTP之預設參數。低複雜性序列之過濾可使用SEG程式。
用於比對比較窗之序列之最佳比對可藉由電腦實施演算法(Wisconsin Genetics軟體套件版本7.0,Genetics Computer Group,575 Science
Drive Madison,WI,USA中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)或藉由檢測及由所選各種方法中的任一者產生之最佳比對(亦即在比較窗上產生最高同源性百分比)進行。亦可參考如例如由Altschul等人,1997,Nucl.Acids Res.25:3389揭示之BLAST程式家族。序列分析之詳述論述可見於Ausubel等人,「Current Protocols in Molecular Biology」,John Wiley & Sons公司,1994-1998,第15章之單元19.3中。
載體蛋白質
CRM-197(GenBank登錄編號1007216A;SEQ ID NO:61)為白喉毒素之在胺基酸殘基52處含有單胺基酸取代(Gly-Glu)的酶促失活及無毒形式。引起Glu52取代之單一GCA突變區別CRM-197與其野生型種類。CRM-197之毒性之不存在似乎由於其片段A之酶活性損失,此在野生型種類中催化感染細胞中為蛋白質合成所必需之延長因子2(移位酶)之化學修飾。此無毒特性使得CRM-197為用於製備結合疫苗之適合載體蛋白質。
SEQ ID NO:61(CRM-197;GenBank登錄編號1007216A)
融合肽可偶合至CRM-197之方法為熟習此項技術者已知。
說明性實例包括由Chang等人(1998,FEBS Letters,427:362-366)及Berti等人2004,Biophysical Journal,86:3-9)描述之彼等,以
及下文中在下文中之實例1中陳述之彼等。
如本文中描述之融合肽與CRM-197之結合典型地經由使用適合交聯劑活化離胺醯基殘基實現。因為CRM-197含有40個離胺酸殘基,且其中之許多可用於交聯,所以CRM-197結合之最終產物始終為非均質的。不受理論或特定作用方式束縛,一般應理解融合肽:載體蛋白質之比視融合肽之尺寸或分子量而定。舉例而言,在融合肽相對較小(例如長度為約10個胺基酸)之情況下,有可能產生與20-39個融合肽結合之載體蛋白質。相反,對於較大融合肽,載體蛋白質可與至多或少於20個融合肽結合。在本文所描述之具體實例中,載體蛋白質包含2至39個融合肽。在另一具體實例中,載體蛋白質包含至少20個融合肽。在另一具體實例中,載體蛋白質包含6至12個融合肽。
融合肽典型地藉由共價鍵偶合至載體蛋白質。然而,在一些具體實例中,融合肽可藉由非共價締合偶合至載體蛋白質。在融合肽與載體蛋白質非共價締合之情況下,非共價締合將典型地涉及融合肽之一或多個原子與載體蛋白質之一或多個原子之間的電磁相互作用。說明性實例包括離子鍵結(亦即在兩個帶相反電荷之離子之間藉助於此相反電荷形成的吸引力)、範德瓦爾斯(Van der Weals)力(亦即融合肽及載體蛋白質內現存共價鍵之永久及/或誘導偶極之間的力)及/或疏水相互作用(亦即由本文中描述之融合肽內之疏水性/脂族部分與載體蛋白質之疏水性部分締合之趨勢產生的力)。
佐劑
如本文所用,術語「佐劑」典型地指可將由融合肽-載體蛋
白質結合物引發之免疫反應之量級增加超過將僅自融合肽或自如本文中描述之不存在佐劑之融合肽-載體蛋白質結合物預期的量級的一類物質。
適合佐劑將為熟習此項技術者已知。適合佐劑之非限制性實例包括鋁鹽(例如氫氧化鋁、磷酸鋁及硫酸鉀鋁(亦稱為礬))、脂質體、病毒體、油包水或水包油乳液(例如弗氏佐劑(Freund's adjuvant)、蒙塔尼德®、MF59®及AS03)、3-O-去醯基-4'-單磷醯基脂質A(MPL)及含有MPL之佐劑(例如AS01、AS02及AS04)及基於皂素之佐劑。基於皂素之佐劑包括來自例如以下之皂素或皂素衍生物:皂皮樹(Quillaja saponaria)、人參(Panax ginseng)、三七(Panax notoginseng)、西洋參(Panax quinquefolium)、桔梗(Platycodon grandiflorum)、美遠志(Polygala senega)、遠志(Polygala tenuifolia)、巴西皂樹(Quillaja brasiliensis)、黃耆(Astragalus membranaceus)及牛膝(Achyranthes bidentata)。例示性基於皂素之佐劑包括免疫刺激複合物(iscom)及免疫刺激複合物基質、ISCOMATRIXTM佐劑、Matrix MTM佐劑、Matrix CTM佐劑、Matrix QTM佐劑、AbISCO®-100佐劑、AbISCO®-300佐劑、ISCOPREPTM、ISCOPREPTM衍生物、含有ISCOPREPTM或ISCOPREPTM衍生物之佐劑、QS-21、QS-21衍生物及含有QS-21或QS21衍生物之佐劑。如本文中描述之疫苗組成物亦可與免疫調節劑締合,包括例如細胞因子、趨化因子及生長因子。本文中亦涵蓋同一疫苗組成物內之兩種或兩種以上佐劑之混合物。
在一具體實例中,佐劑為氫氧化鋁。在另一具體實例中,佐劑為蒙塔尼德。
在本文所揭示之具體實例中,疫苗組成物進一步包含檢查點
抑制劑。術語「檢查點抑制劑」將由熟習此項技術者理解為意謂全部或部分抑制、減少或以其他方式干擾或調節一或多種檢查點蛋白質之分子。適合之檢查點抑制劑之說明性實例包括抗體及其抗原結合片段(例如Fab片段)。適合之檢查點蛋白質將為熟習此項技術者已知,其說明性實例包括CTLA-4及其配位體CD80及CD86、PD1及其配位體PDL1及PDL2、OX40及其配位體OX40L、LAG-3及其配位體MHC I類或II類、TIM-3及其配位體GAL-9及B及T淋巴細胞弱化子(BTLA)及其配位體疱疹病毒進入介體(HVEM)。
醫藥組成物
本說明書亦描述一種醫藥組成物,其包含如本文中描述之疫苗組成物及醫藥學上可接受之載劑。適合之醫藥學上可接受之載劑(例如賦形劑、稀釋劑等)將為熟習此項技術者已知。舉例而言,可使用各種水性(醫藥學上可接受的)載劑,諸如緩衝水、0.4%鹽水、0.3%甘胺酸、玻糖醛酸及其類似物。此等組成物可藉由習知熟知滅菌技術滅菌或可經無菌過濾。所得水溶液可封裝以按原樣使用或凍乾,經凍乾之製劑在投予之前與無菌溶液組合。組成物可視需要進一步包含醫藥學上可接受之輔助物質以接近生理條件,諸如pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、濕潤劑及其類似物,例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、蔗糖或其他碳水化合物,以及許多其他。製備可非經腸投予之化合物之適合方法將為熟習此項技術者已知或顯而易見且更詳細地描述於例如A.Gennaro(2000)「Remington:The Science and Practice of Pharmacy」,第20版,Lippincott,Williams,& Wilkins;Pharmaceutical Dosage
Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人編第7增刊版,Lippincott,Williams,& Wilkins;及Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人,編,第3增刊版Amer.Pharmaceutical Assoc中。
醫藥組成物可呈適用於非經腸投予(例如皮下、肌肉內或靜脈內注射)之形式或適用於藉由吸入(諸如藉由鼻內吸入或經口吸入)投予之氣溶膠形式。
本文所描述之醫藥組成物亦可提供於套組中。套組可包含額外組分以輔助進行如本文中描述之方法,諸如投予裝置、賦形劑及/或稀釋劑。套組可包括用於容納各種組分之容器及在此等方法中使用套組組分之說明書。
在本文所揭示之具體實例中,醫藥組成物進一步包含如本文中他處描述之檢查點抑制劑。
用於治療或預防癌症之用途及方法
本文亦揭示一種治療或預防有需要患者之以Her2/neu之表現或過度表現為特徵之癌症的方法,該方法包含向該患者投予有效量之如本文中描述之疫苗組成物或如本文中描述之醫藥組成物的步驟。
本發明亦延伸至如本文中描述之疫苗組成物在製造用於治療或預防有需要患者之以Her2/neu之表現或過度表現為特徵之癌症的藥物中的用途。
本發明亦延伸至如本文中描述之疫苗或如本文中描述之醫藥組成物,其用於治療或預防有需要患者之以Her2/neu之表現或過度表現為特徵的癌症。
熟習此項技術者將熟悉以Her2/neu蛋白質之表現或過度表現為特徵的癌症之類型。說明性實例包括乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、胃癌、胰臟癌、前列腺癌及唾液腺癌。在一具體實例中,癌症為乳癌。在另一具體實例中,癌症為胃癌。
如本文所描述之疫苗或醫藥組成物典型地以「有效量」,亦即有效引發尤其任一種或多種治療或預防效果的量投予。熟習此項技術者將能夠藉由常規實驗確定有效無毒量以包括在醫藥組成物中或投予用於所需結果。通常,如本文中所揭示之疫苗及/或醫藥組成物可以與投予途徑及接受者之身體特徵(包括健康狀況)相容之方式及以使得其引發所需效果之方式(亦即治療學上有效、免疫原性及/或保護性)投予。舉例而言,組成物之合適劑量可視各種因素而定,包括(但不限於)個體之身體特徵(例如年齡、體重、性別)、組成物是否用作單一藥劑或作為輔助療法之一部分、任何基本癌症之進程(亦即病理學狀態)及可由熟習此項技術者辨識之其他因素。當例如確定組成物之合適劑量時可考慮之一般考慮因素之其他說明性實例由Gennaro(2000,「Remington:The Science and Practice of Pharmacy」,第20版,Lippincott,Williams,& Wilkins;及Gilman等人,(編),(1990),「Goodman And Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics」,Pergamon Press)論述。
考慮到以上概述之一些考慮因素,吾人預期量將落入可經由熟習此項技術者已知之方法確定的相對廣泛範圍中。
如本文中描述之融合肽(結合至載體蛋白質)之有效量將一般在每名個體,約5μg至約1.0mg融合肽,每名個體約10μg至約500μg
融合肽,或每名個體約15μg至約60μg融合肽之範圍內。可例如藉由包括量測抗原特異性抗體效價之標準方法確定有效量。由本文中描述之組成物提供之免疫性水準可經監測以確定對輔助劑之需要(若存在)。舉例而言,在於血清中評估抗原特異性抗體效價之後,典型地在於個體中第一次投予組成物之後數天或數週,可需要及/或期望視情況存在之輔助劑免疫。抗原特異性抗體效價可能藉由使用多種劑量增強,如下文中實施例中所說明。
如本文所描述之疫苗及/或醫藥組成物可與額外治療劑分開或組合,亦即作為輔助療法之一部分向有需要之個體投予。在輔助療法的情況下,投予可為同時或依序;亦即首先投予疫苗及/或醫藥組成物,隨後投予額外治療劑及/或預防劑,或在投予額外治療劑之後投予疫苗及/或醫藥組成物。因此,在兩個或兩個以上實體「結合」向個體投予之情況下,其可同時在單一組成物中或同時在單獨組成物中或間隔一段時間在單獨組成物中投予。
額外治療劑可包含如本文中他處描述之檢查點抑制劑。因此,在一具體實例中,本文所揭示之方法進一步包含向該患者投予有效量之如本文中描述之檢查點抑制劑的步驟。
熟習此項技術者將顯而易見,必要時用於誘導所需免疫反應之個別劑量之最佳數量及間隔可例如由投予形式、途徑及部位及待治療之特定個體之性質決定,如本文中他處所描述。可使用熟習此項技術者已知之習知技術確定最優條件。
在一些情況下,可能需要具有如本文中描述之疫苗及/或醫
藥組成物之數次或多次投予。舉例而言,組成物可投予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。投予可為約一天間隔至約十二週間隔,且在某些具體實例中約一週至約四週間隔。可需要週期性再投予來實現理想治療結果,諸如腫瘤尺寸減小及/或癌轉移之出現減少。熟習此項技術者亦將顯而易見,最佳投予療程可使用習知治療療程或功效或免疫狀態確定測試確定。
應瞭解如本文中所涵蓋,「誘導」免疫或抗原特異性抗體反應包括引發或刺激免疫反應及/或增強先前存在之免疫反應以獲得所需生理效果,諸如腫瘤尺寸減小及/或癌轉移之出現減少。就完全或部分預防癌症之出現、完全或部分預防癌轉移之出現及/或完全或部分預防與該癌症相關之症狀而言,效果可為預防性的。
如本文所用,術語「投予(administration/administering)」典型地指將如本文中描述之疫苗及/或醫藥組成物引入至患者體內以使得患者之免疫系統對融合肽內之多個Her2/neu B細胞抗原決定基產生反應的步驟。如本文所用,「有需要之患者」包括已診斷有癌症之個體,其中癌細胞表現或過度表現Her2/neu蛋白質。其亦包括尚未診斷有癌症之個體,諸如未呈現有任何症狀之彼等個體,但該等個體可具有例如癌症之家族病史且因此有患癌症之疑似遺傳傾向性。在其最廣泛含義中,術語「有需要之患者」因此涵蓋具有已經存在之需要的個體,以及處於患Her2/neu相關癌症之風險下的個體。
如本文所用,「預防」癌症之藥物將降低個體患癌症之風險,理想地降至零。此外,此術語亦指例如在原發性腫瘤之手術之後預防癌症之再發展。如本文所用,「治療」癌症之藥物將理想地藉由消除疾病之根本
病因以使得在停止投予組成物後,疾病不再發展,但保持緩解來完全消除疾病。如本文所用,「改善」癌症之藥物不消除疾病之根本病因,但降低如藉由任何現有分級系統所量測及/或如藉由患者之健康改良(例如疼痛及/或不適減少)所量測之疾病嚴重性。
「有效量」為單獨或與根據現有給藥方案之其他劑量一起實現如本文中他處所論述之所需預防、治療或改善的醫藥製劑之量。
投予之途徑及療程可視待治療之病狀之階段或嚴重性而改變,且由熟習此項技術者確定。舉例而言,根據本發明之如本文中描述之疫苗或醫藥組成物可以皮下、皮內、淋巴管內或局部或經黏膜(經鼻)或肌肉內形式投予。所有此等形式為醫藥領域中之一般技術者所熟知。
在某些具體實例中,本文所描述之組成物可以一般技術者已知之肌肉內、皮下、淋巴管內或鼻內途徑投予。
如本文中他處所論述,根據各種因素選擇利用如本文中描述之組成物的給藥方案,包括例如患者之年齡、體重及醫學病狀、待治療之病狀之階段及嚴重性及意欲用於投予之特定融合肽。一般技術之醫師可容易地確定例如載體蛋白質(包含與其偶合之融合肽)之預防、治療或改善惡性病之進展或嚴重性所需要之規定及有效量。給藥方案亦將考慮待投予之佐劑之量,其預期視將控制向個體投予之載體蛋白質/融合肽之量的至少一些因素(諸如患者之年齡、體重及醫學病狀)而改變。在產生功效(亦即有效量)而無毒性或不超過可接受之毒性的範圍下實現載體蛋白質/融合肽及/或佐劑之濃度方面之最佳精度需要至少部分基於載體蛋白質/融合肽及/或佐劑對目標位點之可用性之動力學的方案。此方法將典型地涉及考慮
載體蛋白質/融合肽及/或佐劑之分佈、平衡及消除,其將在熟習此項技術者之能力內。
本文中提及之所有專利、專利申請案及公開案均以全文引用之方式併入本文中。
熟習此項技術者應瞭解,本文所描述之本發明除特定描述之彼等內容外允許進行變化及修改。應理解本發明包括屬於精神及範疇內之所有此等變化形式及其修改。本發明亦包括在本說明書中單獨或共同地提及或指示之所有步驟、特徵、組成物及化合物,及該等步驟或特徵中之任何兩者或兩者以上之任何及所有組合。
現將參考以下實施例描述本發明之某些具體實例,該等實施例僅意欲用於說明目的且不意欲限制上文描述之一般性之範疇。
實施例
以下實施例係關於兩種融合肽(衍生自Her2/neu之非相鄰B細胞抗原決定基)與重組解毒白喉毒素CRM197之結合。藉由SDS-PAGE及免疫墨點法進行融合肽-載體蛋白質結合物之初始分析。最後,將融合肽-載體蛋白質結合物運送至奧地利(Austria)以便在動物中進行初始免疫原性研究。
實例1-Her2/neu肽抗原與重組解毒白喉毒素變異體CRM-197之結合
已成功地在臨床I期試驗中測試基於病毒體之乳癌疫苗PEV6A/B(Wiedermann等人,Breast Cancer Res Treat.2010)。然而,此疫苗調配物之特徵為關於穩定性及組分相容性之很大技術限制,其最佳由不可避免兩次單獨注射之事實說明。
PEV6C方法克服PEV6A/B之技術限制。PEV6C在單一肽鏈中組合所有三種抗原(分別為P6、P7及P4;SEQ ID NO:1-3)(亦參見WO 2011/020604A1;針對her2/neu相關癌症之多抗原決定基疫苗)且可以穩定可凍乾單劑量施用形式調配。
製備及結果
以下融合蛋白用於結合至載體蛋白質CRM-197:肽1:P467(在結合之前):
乙酸鹽(SEQ ID NO:8);及肽2:P647(在結合之前):
乙酸鹽(SEQ ID NO:9)。
在pH 7.4下之PBS緩衝液中使用交聯劑磺基丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(Sulfo-SMCC)進行結合反應。此試劑首先與CRM-197載體蛋白質上之一級胺(亦即離胺酸殘基)反應,隨後使其與硫醇基(亦即半胱胺酸殘基)反應。在CRM-197中,39個離胺酸殘基理論上可用於與交聯試劑反應。為了達成肽抗原在載體蛋白質上之良好分佈,調節融合肽:載體蛋白質比率以實現每個CRM197分子20個融合肽分子之平均結合。使反應如下在室溫(RT)下進行45min:
程序
1.自-20℃移除融合肽且使其在室溫(RT)下靜置約10min,隨後打開瓶。
2.將融合肽稱重至3mL玻璃瓶中:(a)P467,7.8mg,用780μL注射用水(WFI)再懸浮;(b)P467,7.1mg,用710μL二甲亞碸(DMSO)再懸浮;(c)P647,6.9mg,用690μL WFI再懸浮;(d)P647,9.0mg,用900μL DMSO再懸浮;
所有溶液容易地再懸浮,且不可見聚集物或濁度。
3.將20×磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)用Milli Q水稀釋至1×PBS,且添加乙二胺四乙酸(EDTA)至1mM之最終濃度。
4.用0.5mL WFI將6個CRM197瓶復原至2mg/mL。合併3個瓶產生2份批料,且在4℃下儲存(每批1.5mL,各3mg)。
5.取出一瓶Sulfo-SMCC(2mg),且向其中添加200μL PBS/1mM ETDA且溶解(10mg/mL儲備溶液;溶液保持混濁)。
6.向3mg CRM197之各瓶中添加75μL Sulfo-SMCC(10mg/mL)。總體積:1.575mL。
7.在室溫下在緩慢混合(旋轉,25rpm)下培育瓶45min。在該時間期間,用PBS/EDTA緩衝液平衡x2 Zeba旋轉脫鹽管柱。
8.在培育步驟7之後,將反應物轉移至平衡之Zeba旋轉管柱(1.5mL)中且添加200μL PBS/EDTA,且隨後在1000×g下離心4min。
9.回收1.8mL各溶液。
10.如下添加至新3mL瓶中:(a)瓶1:600μL P467(於WFI中10mg/mL);及(b)瓶2:600μL P647(於WFI中10mg/mL)。
11.向各瓶中添加50μL 20×PBS以將溶液之pH提高至大約7。
12.向各瓶中添加1.8mL脫鹽CRM197-SMCC。
13.在室溫下在緩慢混合(旋轉)下培育瓶45min,隨後在4℃下儲存瓶直至分析。在培育期間,注意到在瓶2中沈澱變得可見。然而,在溶液升溫之後沈澱消失。
概述
肽P467-CRM197,大約2.449mg/mL,P467,大約1.22mg/mL,CRM197,大約2450μL;在1×PBS/1mM EDTA中,批次140829-1_am。
肽P647-CRM197,大約2.449mg/mL,P647,大約1.22mg/mL,CRM197,大約2450μL;在1×PBS/1mM EDTA中,批次140829-2_am。
觀測到在反應進行時P647-CRM197肽結合物顯示聚集之趨勢。在P467-CRM197肽結合物之情況下,肉眼不可見聚集。
實施例2-使用小鼠抗血清E進行CRM197-抗原結合物之考馬斯藍染色及免疫墨點
藉由SDS-PAGE分析結合物調配物且藉由凝膠之考馬斯藍染色及藉由免疫墨點法,使用先前產生之針對結合至破傷風類毒素之肽抗原P4、P6及P7之組合的小鼠血清(抗血清E)評估。
程序
如下製備兩種SDS-PA凝膠:
˙將CRM197(2mg/mL)儲備溶液1:10稀釋在PBS pH 7.4中
˙將抗結合物溶液1:10稀釋在PBS pH 7.4中
˙將未結合的融合肽製備為10mg/mL之儲備溶液且1:20稀釋在PBS pH 7.4中
總計製備36μL各樣品,且每泳道裝載15μL。製備兩種相同凝膠:凝膠1用考馬斯藍染色,且凝膠2用於西方墨點法。樣品在凝膠1及凝膠2中之分佈概述在以下表5中:
結果
凝膠1-考馬斯藍染色
將凝膠1在室溫下在震盪下浸沒在生物安全之考馬斯藍染料中1小時,且隨後在室溫下用MilliQ水沖洗1小時。
凝膠2-西方墨點法
在電泳之後,自盒移除凝膠2,且立刻在Milli Q水中沖洗。隨後根據製造商之說明(BioRad)製備轉移夾層且安裝在渦輪轉移墨點(Turbo Transfer Blot)機器中。在轉移之後,針對預染色標記蛋白質之完全存在控制硝化纖維素膜。僅最少量之標記在SDS PA凝膠中保持可見。膜隨
後在室溫下在SuperBlock緩衝液中培育1小時。將小鼠血清池E 1:500稀釋在SuperBlock中,且在室溫下在膜上培育2小時。膜隨後用1×PBS洗滌三次,各持續5min。膜隨後用抗小鼠IgG(KPL,074-1802;Ab20)培育,在室溫下在SuperBlock中1:5000稀釋持續1小時。膜隨後用1×PBS洗滌三次,各持續5min,且在室溫下用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)顯色5min。
結果顯示各CRM197結合物之分子量朝向較大分子量明顯偏移,指示融合肽與CRM197之較強結合。在兩種情況下觀測之寬結合物帶亦表明融合肽在載體蛋白質上之相對較大分佈,如自結合反應所預期。結果亦表明無(或最少)未結合CRM197蛋白質剩餘。另一方面,觀測到一小部分融合肽,估計為使用之總融合肽之<10%。
結論
觀測到CRM197結合物之明顯偏移,指示P467及P647融合肽與CRM197載體蛋白質之成功結合。
在P467-CRM197與P647-CRM197結合物之間不存在可觀測的顯著差異。
在兩個結合反應中觀測到限制量之自由融合肽。
用所用抗血清進行之免疫墨點展現與CRM197白喉毒素之一些交叉反應性,儘管其在破傷風類毒素肽結合物之情況下升高。其確認在結合之後CRM197分子之偏移,但因為此不對兩種融合肽具有特異性,不可確認其與蛋白質之結合。抗血清將自由未結合融合肽染色,其中P467比P647略微好。
實施例3-使用小鼠抗血清D進行CRM197-抗原結合物之免疫墨點
藉由SDS-PAGE分析結合物調配物且藉由免疫墨點法使用先前產生之針對與流感病毒體結合之肽抗原P4、P6及P7之組合的小鼠血清(抗血清D)評估。單獨地藉由免疫墨點使用抗血清D確認CRM197載體蛋白質上融合肽P467及P647之存在。
程序
如下製備一種SDS-PA凝膠:
將所有包含CRM197、融合肽-CRM197結合物或未結合融合肽之溶液在pH 7.4下之PBS中稀釋至1mg/mL。總計製備36μL各樣品,且每泳道裝載15μL。樣品在凝膠1及凝膠2中之分佈概述在以下表7中:
結果
西方墨點法-在電泳之後,自盒移除凝膠,且立即在Milli Q水中沖洗。根據製造商之說明(BioRad)製備轉移夾層且安裝在渦輪轉移墨點機器中。在轉移之後,針對預染色標記蛋白質之完全存在控制硝化纖維素膜。僅最少量之標記在SDS PA凝膠中保持可見。硝化纖維素膜隨後在含5%牛奶之具有Tween 20之磷酸鹽緩衝鹽水(MPBST)中在室溫下培育1小時。
將小鼠血清池D 1:500稀釋在MPBST中,且在膜上在室溫下培育1小時。膜隨後用1×MPBST洗滌三次,各持續5min且隨後用抗小鼠IgG(KPL,074-1802;Ab20)培育,在室溫下在MPBST中1:5000稀釋30min。膜隨後用1×MPBST洗滌三次,各持續5min且在室溫下用TMB溶液顯色10min。
結論
用所用抗血清D進行之免疫墨點顯示僅與CRM197-融合肽結合物之反應性。在未結合CRM197之情況下未觀測到交叉反應性。此等結果指示大量融合肽結合至載體蛋白質,且確認對於CRM197-融合肽結合物,凝膠中之遷移之所觀測偏移歸因於融合肽與載體蛋白質之結合,且不歸因於CRM197分子間交聯。偵測到歸因於自由未結合融合肽之信號,因為抗血清不與該等自由未結合融合肽反應,或因為融合肽遷移至凝膠之底部且為不轉移該硝化纖維素膜。
與P467-CRM197結合物相比,抗血清D略微較強地與P647-CRM197結合物反應。結果表明與自由融合肽相比,抗血清強烈與結合融合肽反應。
實施例4-P467-CRM197及P647-CRM197點漬墨
亦在點漬墨實驗中使用抗血清D確認CRM197載體蛋白質上融合肽P467及P647之存在。
樣品
˙CRM197,1mg/mL,於PBS pH 7.4中;˙P467抗原,1mg/mL,在於PBS pH 7.4中;˙P647抗原,1mg/mL,於PBS pH 7.4中;˙P467-CRM197,1mg/mL,於PBS pH 7.4(計算濃度)中;及˙P647-CRM197,1mg/mL,於PBS pH 7.4(計算濃度)中。
程序
使用預切割硝化纖維素膜且用鉛筆繪製線。在Eppendorf管
中在pH 7.4下之PBS中,在1mg/mL(1μg/μL)下起始,進行各樣品之兩倍稀釋。每點(1μL)之理論濃度為1μg/500ng/250ng/125ng/62.5ng/31.25ng。對於各點,將大約1μL各樣品轉移至膜(一式兩份),如以下概述:˙線A CRM197;˙線B P467抗原(無脂質結合之自由融合肽);˙線C P647抗原(無脂質結合之自由融合肽);˙線D P467-CRM197(開始於1μg融合肽及0.5μg CRM197);及˙線E P647-CRM197(開始於1μg融合肽及0.5μg CRM197)
使膜在室溫下在空氣中乾燥10min且隨後在室溫下用含5%牛奶之PBST(MPBST)阻斷30min。膜隨後在室溫下用初級抗體(小鼠抗血清池D,1:500在MPBST中稀釋)培育1小時。膜隨後用MPBST洗滌三次,各持續5min,且隨後在室溫下用二級抗體(抗小鼠IgG;KPL,074-1802;Ab20;1:5000在MPBST中稀釋)培育30min。在此培育之後,膜用MPBST洗滌三次,各持續5min,且隨後在室溫下用TMB溶液培育大約3min,隨後用Milli Q水洗滌,隨後乾燥。
結論
用小鼠抗血清D之點漬墨顯示僅與CRM197-融合肽結合物之反應性。存在與未結合CRM197蛋白質之最少交叉反應性。由於與融合肽之量相比,結合物中CRM197之量為約50%,此樣品中之最少背景可能歸因於與白喉毒素變異體之交叉反應性。
自由(未結合)融合肽(無脂質結合物之融合肽)在抗血清下僅在P647的情況下,但不在P467之情況下給出信號。此之原因不立即清
楚。然而,在P647之第一樣品稀釋中,與在之後稀釋中相比,信號略微較弱。此可指示存在抗體結合位點之抑制劑,或與硝化纖維素膜之結合減少。此抑制劑之性質未知,但其可歸因於最初用於製備融合肽之高濃度儲備液(10mg/mL)的DMSO。
小鼠抗血清D與P467-CRM197及P647-CRM197結合物極強地反應,確認大部分融合肽與載體蛋白質之結合。
由於與融合肽-CRM197結合物相比,自由融合肽之不等抗血清反應性,不可能定量抗原之量。然而,因為在結合反應之後未施加純化步驟,用融合肽之理論起始濃度計算為可接受的。
總之,結果表明與自由融合肽相比,抗血清與結合之融合肽強烈反應。
實施例5-樣品製備以便在小鼠中進行劑量滴定研究
以下描述製備融合肽-CRM197結合物以便在小鼠中進行劑量滴定實驗。
程序
為了製備用於動物研究之樣品,將結合物反應溶液稀釋至規定之目標濃度。對於以下製備,假設肽與蛋白質之結合效率為至少90%。
用於高劑量組(第1組)之樣品製備:
預期此等樣品含有每管大約420μg結合之融合肽(1.2mg/mL):
管1:
˙1045μL P467-CRM197
˙880μL(1×)PBS pH 7.4
充分混合此溶液,且將350μL轉移至五個玻璃瓶(各2.5mL)且如下標記:P467-CRM197;第1組-高劑量;估計P467濃度:約1.2mg/mL;批次140903-1_am。
管2:
˙1045μL P647-CRM197(在吸液之前強烈渦旋)
˙880μL(1×)PBS pH 7.4
充分混合此溶液,且將350μL轉移至五個玻璃瓶(各2.5mL)且如下標記:P647-CRM197;第1組-高劑量;估計P647濃度:約1.2mg/mL;批次140903-4_am。
用於中等劑量組(第2組)之樣品製備:
預期此等樣品含有每管大約210μg結合之融合肽(0.6mg/mL):
管1:
˙525μL P467-CRM197
˙1400μL(1×)PBS pH 7.4
充分混合此溶液,且將各350μL轉移至五個2.5mL玻璃瓶且如下標記:P467-CRM197;第2組-中等劑量;估計P467濃度:約0.6mg/mL;批次140903-2_am。
管2:
˙525μL P647-CRM197(在吸液之前強烈渦旋)
˙1400μL(1×)PBS pH 7.4
使此溶液充分渦旋,且將350μL轉移至五個2.5mL玻璃瓶
且如下標記:P647-CRM197;第2組-中等劑量;估計P647濃度:約0.6mg/mL;批次140903-5_am。
用於低劑量組(第3組)之樣品製備:
預期此等樣品含有每管大約105μg結合之融合肽(0.3mg/mL):
管1:
˙262μL P467-CRM197
˙1663μL(1×)PBS pH 7.4
充分混合此溶液且將各350μL轉移至五個2.5mL玻璃瓶且如下標記:P467-CRM197;第3組-低劑量;估計P467濃度:約0.3mg/mL;批次140903-3_am。
管2:
˙262μL P647-CRM197(在吸液之前強烈渦旋)
˙1663μL(1×)PBS pH 7.4
使此溶液充分渦旋,且將各350μL轉移至五個2.5mL玻璃瓶且如下標記:P647-CRM197;第3組-低劑量;估計P647濃度:約0.3mg/mL;批次140903-6_am。
實施例6-免疫研究
肽抗原
在Bachem(Switzerland)合成兩種融合肽P467(SEQ ID NO:8)及P647(SEQ ID NO:9)。將兩種混合物偶合至適合作為抗原遞送系統且不需要額外佐劑之病毒體(來自失活流感病毒A/Brisbane/59/2007之病毒包
膜)。測試針對融合肽之量計算之三種濃度:每次注射15μg、30μg及50μg。為了比較,將兩種融合肽偶合至CRM197且以每次注射30μg之濃度用於頭-頭實驗中。在Mymetics(Switzerland)進行所有結合程序(CRM及病毒體)。
病毒體調配物冷凍遞送且在解凍之後形成混濁懸浮液。
在偶合之後,接受呈沈澱調配物形式之CRM-P647結合物,而CRM-P467保持可溶於基於水之緩衝液中。
在piChem(Austria)合成三個經Her-2/neu衍生之B細胞抗原決定基P4(SEQ ID NO:3)、P6(SEQ ID NO:1)及P7(SEQ ID NO:2)且偶合至匙孔螺血氰蛋白(keyhole limpet hemocyanin;KLH)且用作包被抗原以藉由ELISA評估抗體對單一肽之反應。
為了評估抗體針對未結合融合肽之反應,P467及P647在ELISA分析中用作包被抗原。
免疫方案
雌性Balb/C小鼠根據以下研究設計以2-3週間隔皮下免疫:
接受病毒體結合物之群組用失活流感病毒(失活A/Brisbane/59/2007)預致敏一次。在預致敏之後16天開始用結合構築體免疫。所有病毒體調配物即用遞送且在無任何添加劑的情況下每次注射施加100μl。
將CRM-融合肽結合物之儲備液用NaCl溶液稀釋且與氫氧化鋁凝膠懸浮液混合,隨後藉由注射投予。使CRM-P647(沈澱)渦旋且懸浮液以與CRM-P467相同之方式使用。
對照組接受空病毒體(TIRIV)或NaCl溶液加氫氧化鋁。
動物
60隻雌性Balb/C小鼠,在遞送時6-8週(29.10.2014),來源:Charles River,Germany。
10組:每組n=5隻小鼠-動物機構:General Hospital Vienna/Biomedical Unit。
群組
˙A組-空病毒體(TIRIV)-100μl/小鼠;˙B組-P467-病毒體-50μg/小鼠,100μl中;˙C組-P467-病毒體-30μg/小鼠,100μl中;˙D組-P467-病毒體-15μg/小鼠,100μl中;˙E組-P647-病毒體-50μg/小鼠,100μl中;˙F組-P647-病毒體-30μg/小鼠,100μl中;˙G組-P647-病毒體-15μg/小鼠,100μl中;˙H組-NaCl+氫氧化鋁(對照)-100μl/小鼠;˙I組-P467-CRM+氫氧化鋁-30μg/小鼠,150μl中;及˙J組-P647-CRM+氫氧化鋁-30μg/小鼠,150μl中。
在免疫之前、在第2次免疫之後三週、在第3次免疫之後兩週及在第4次免疫之後兩週獲取血液。隨後針對以下分析血液樣品:˙肽特異性抗體效價(IgG);˙構築體特異性抗體效價(IgG);˙對重組細胞外Her-2/neu具有特異性之抗體效價(IgG);及˙對在SKBR-3癌細胞中表現之天然Her-2/neu之特異性。
ELISA方案
1)肽特異性ELISA
微量滴定盤以0.5μg/孔用KLH-融合肽結合物塗佈。對於背景估計,孔僅用KLH塗佈。在阻斷之後,添加稀釋血清。用HRP標記之抗體(兔抗小鼠IgG POX,Fc片段特異性,Nr:315-035-008;Jackson Immuno Research)偵測結合IgG且隨後TMB染色。在添加停止溶液之後在450對630nm下讀取盤。
(2)融合肽特異性ELISA
未經修飾的融合肽P467及P647以於碳酸鹽緩衝液中0.5μg/孔的濃度用作包被抗原。隨後添加稀釋血清且如以上肽特異性方案中所描述分析。
(3)細胞外Her-2/neu-特異性-ELISA
包含人類Her-2/neu之重組細胞外結構域(Her2/neu之胺基酸殘基23-652)及人類IgG1之Fc區(ErbB2/Fc嵌合體,目錄號1129-ER R&D Systems)的融合蛋白用作包被抗原。盤塗佈有0.1μg/孔之蛋白質及0.1% BSA(用於背景估計)。隨後添加稀釋血清且如上文所描述,在減去來自僅BSA之孔的背景信號之後分析。
(4)使用SKBR3-細胞進行Her-2/neu特異性細胞分析
過度表現Her-2/neu之人類乳癌細胞系SKBR-3(HTB30,ATCC,USA)用作天然Her2/neu蛋白質之來源。在繼代之後三天收集細胞且在-80℃下儲存。如先前在Godell V及Disis ML J.Immunol.Meth(2005)中所描述在一些較小修改下進行細胞溶解:變體1:盤用人類化抗-Her-2/neu
抗體赫賽汀(Herceptin)(由General Hospital Vienna提供)塗佈;變體2:盤用人類化抗-Her-2/neu抗體帕傑它(Perjeta)(由General Hospital Vienna提供)塗佈。直接在使用之前用Pierce BCA蛋白質分析套組編號23227定量細胞溶解物中之蛋白質含量。溶解物於1% BSA/PBS中稀釋至100μg/孔之濃度。在阻斷之後,將細胞溶解物添加至孔中。為了控制個別背景,添加BSA/PBS。對於IgG偵測,使用HRP-連接之綿羊抗小鼠IgG(Amersham/GE Healthcare)。如上進行TMB染色。對於各血清樣品,OD值計算為SKBR-3塗佈孔之OD讀數減去BSA塗佈孔之OD讀數之間的差。
實施例7-肽特異性抗體
使用來自最後放血(亦即在四次免疫之後)的血清。如下自病毒體及CRM197免疫小鼠之血清分析不同稀釋度:˙用病毒體調配物處理之組:1:5,000稀釋度;˙用CRM-融合肽結合物處理之組:1:100,000稀釋度。
資料以OD值形式描述。減去KLH塗佈孔上之背景(參見圖1至3)。
結果
在所有處理組(B-G組及I-J組)中引發針對所有三種單一肽之抗體。在對照組(A及H組)中未偵測到肽特異性抗體。觀測到顯著抗體效價差異。
與用對應病毒體調配物進行之四次免疫相比,用CRM-融合肽結合物進行之四次免疫誘導針對所有三種個別肽之大約十倍較高抗體效價。
不論偶合搭配物,兩種構築體(P467及P647)均誘導針對P7 B細胞抗原決定基(SEQ ID NO:2)之最高抗體效價,但誘導針對P4 B細胞抗原決定基(SEQ ID NO:3)之最低效價。
如圖4及5中所示,亦產生結合於融合肽之抗體。此等結果來源於使用來自第四次免疫之後的最後放血之血清的實驗。對於用病毒體免疫之組,血清1:5,000稀釋。對於用CRM197-融合肽結合物免疫之組,血清1:100,000稀釋。圖4及5中描繪之資料以OD值形式給出。根據圖1至3中顯示之肽特異性結果,與用對應病毒體調配物免疫之組相比,在用CRM197-融合肽結合物免疫之組中觀測到大約十倍較高抗體效價。一般而言,與P467相比,對於P647觀測到較高效價。
實施例8-在用CRM-結合物免疫之過程中的抗體動力學
在第2次、第3次及第4次免疫之後兩週獲取血液且量測對兩種融合肽(P467及P647)具有特異性之抗體(血清1:100,000稀釋)。如圖6及7中所示,在第2次免疫之後融合蛋白特異性抗體效價已經非常高且在第3次及第4次免疫之後略微增加。在第3次及第4次免疫之後融合蛋白特異性抗體效價之較小增加指示用CRM197-融合肽結合物進行兩次或三次免疫(亦即兩種或三種連續劑量)可足以產生有效免疫反應。(BA1-在兩次免疫之後抽取之血液;BA2-在三次免疫之後抽取之血液;BA2-在四次免疫之後抽取之血液)。
實施例9-細胞外Her-2/neu-特異性抗體
在兩個時間點,BA1(在兩次免疫之後抽取之血液)及BA2(在三次免疫之後抽取之血液)獲取血液。分析不同血清稀釋度-來自用病
毒體調配物免疫之組的血清1:400稀釋且來自用CRM-融合肽結合物免疫之組的血清1:2,000稀釋。圖8中描繪之資料為OD值。
如圖8中所示,兩種融合肽構築體(病毒體及CRM197結合)誘導結合至重組細胞外Her-2/neu蛋白質之抗體。在假處理小鼠及免疫前血清中未觀測到顯著Her-2/neu反應性。根據肽及融合肽特異性結果,在30μg濃度下與病毒體調配物相比,在用CRM-融合肽結合物免疫之組中觀測到顯著較高Her-2/neu特異性效價。在用病毒體進行第三次免疫之後亦觀測到顯著抗體效價。在第2次免疫之後已用CRM-融合肽結合物免疫之小鼠中,抗體效價較高,在第3次免疫之後其未顯著增加。
在第2次、第3次及第4次免疫之後對血清抗體效價之分析披露與CRM結合物相比在病毒體結合物下抗體反應之不同動力學。在第2次免疫之後(在開始免疫之後6週),與病毒體結合物相比,在用CRM-融合肽結合物免疫之動物中觀測到較高抗體效價(參見圖9)。在用病毒體結合物進行第3次免疫之後,觀測到抗體效價之顯著增加(參見圖8)。在第4次免疫之後,在病毒體免疫小鼠與CRM-免疫小鼠之間Her-2/neu特異性抗體效價相當(參見圖10)。在用CRM-融合肽結合物免疫之小鼠中,在第3次與第4次免疫之間存在抗體效價之較小增加,指示在第2次免疫之後的強免疫原性,在第3次免疫之後免疫原性甚至更強(參見圖11)。
如圖12中所示,在用30μg P467-病毒體結合物或30μg P467-CRM結合物進行第2次、第3次及第4次免疫之後針對重組Her-2/neu之抗體反應之動力學之比較揭露甚至在第2次免疫之後,在用CRM結合物免疫之後的抗Her-2/neu抗體效價(各群中第四列)顯著大於在用對應病毒
體結合物免疫之後的抗體效價(各群中第三列)。在第4次免疫之後,兩種結合物產生相當重組抗Her-2/neu抗體效價。
如圖13中所示,在用30μg P647-病毒體結合物或30μg P647-CRM結合物進行第2次、第3次及第4次免疫之後針對重組Her-2/neu之抗體反應之動力學之比較揭露甚至在第2次免疫之後,在用CRM結合物免疫之後的抗Her-2/neu抗體效價(各群中第四列)顯著大於在用對應病毒體結合物免疫之後的抗體效價(各群中第三列)。
此等結果展現在使用病毒體或CRM197作為融合肽之遞送系統之Her-2/neu特異性抗體效價之動力學中的驚人差異。在病毒體結合物之情況下觀測到之抗體效價增加與CRM結合物相比顯著較慢且典型地需要四次免疫(關於融合肽P467)以達成如在對應CRM免疫之情況下所見之類似水準。關於融合肽P647,病毒體結合物不如CRM結合物,因為甚至在第4次免疫之後其未誘導相當抗體效價(圖13)。
實施例10-對天然Her-2/neu蛋白質之特異性
分析來源於在四次免疫之後抽取之最終血液樣品的血清。資料以OD值形式呈現且所有血清1:100稀釋。
如圖14中所示,產生之抗體識別在SKBR-3乳癌細胞中過度表現之天然形式之Her-2/neu。低血清稀釋度為在ELISA範圍內用未純化細胞溶解物操作所必需且根據發明人之先前資料。儘管在用病毒體結合物免疫之組中針對肽及重組細胞外Her-2/neu蛋白質之抗體效價顯著較低,在病毒體融合肽結合物與CRM197融合肽結合物之間OD值相當。此等結果可由針對病毒體之一些部分與SKBR-3細胞溶解物中之組分(例如細胞膜)之
脂質連接升高的抗體反應性解釋。在CRM197-融合肽結合物中此連接不存在。
實施例11-在用肽P467-CRM用礬/Al(OH)
3
或蒙塔尼德免疫之後的免疫反應之評估
製備試劑
將融合蛋白P467(長度為49個胺基酸;在Bachem,Switzerland合成)偶合至CRM197(白喉毒素突變體;PiChem/Graz/Austria)且以0.4mg/ml之儲備濃度遞送。在小鼠中在三種佐劑之存在或不存在下評估P467-CRM介導之免疫反應:1)ALHYDROGEL®「85」(來自Brenntag,Denmark之氫氧化鋁;鋁含量10mg/ml,批號85563;根據製造商之說明以1/10之稀釋度使用);2)Alu-Gel-S-懸浮液(來自Serva,Germany之氫氧化鋁;1.3%純度,無菌,鋁含量5.9-7.1mg/ml,目錄號12261,批號111589;根據製造商之說明以1/3之稀釋度使用);及3)蒙塔尼德ISA 51VG(來自Seppic,France,目錄號36362ZFL2R3;批號2423395)。
免疫方案描述於以下「免疫方案」中。簡言之,測試三種濃度之肽構築體:每次注射10μg、25μg及50μg。在兩組小鼠中測試用於以上實施例中概述之動物研究的來自Serva之氫氧化鋁(參見「免疫方案」)且與使用來自Brenntag之氫氧化鋁相比。在此兩個組中與來自Serva之氫氧化鋁一起使用之P467-CRM之量為10μg及25μg。
用蒙塔尼德乳化肽構築體
根據製造商之說明(Seppic,法國)進行用蒙塔尼德乳化P467-CRM、PBS或NaCl。將P467-CRM肽構築體與PBS(對於氫氧化鋁,Brenntag)或NaCl(對於氫氧化鋁,Serva)混合。隨後將佐劑添加至溶液中且在室溫下充分渦旋。隨後將混合物保持在室溫下持續45分鐘之最小值,隨後投予。
免疫方案
雌性Balb/C小鼠(Charles River Germany,在遞送時6-8週)皮下以3週間隔免疫(每組n=8隻小鼠;對照組n=4)。
小鼠,亦即A至O之組如下免疫:
A組(P467-CRM,10μg/注射):250μl P467-CRM與1250μl NaCl一起(1500μl)。150μl/小鼠(=10μg/小鼠)
B組(P467-CRM,25μg/注射):625μl P467-CRM與875μl NaCl一起(1500μl)。150μl/小鼠(=25μg/小鼠)
C組(P467-CRM,50μg/注射):1250μl P467-CRM與250μl NaCl一起(1500μl)。150μl/小鼠(=50μg/小鼠)
D組(P467-CRM-礬Brenntag,10μg/注射):250μl P467-CRM與175μl礬Brenntag+1325μl PBS一起(1750μl)。175μl/小鼠(=10μg/小鼠)
E組(P467-CRM-礬Brernntag,25μg/注射):625μl P467-CRM與175μl礬Brenntag+950μl PBS一起(1750μl)。175μl/小鼠(=25μg/小鼠)
F組(P467-CRM-礬Brenntag,50μg/注射):1250μl P467-CRM與175μl礬Brenntag+325μl PBS一起(1750μl)。175μl/小鼠(=50μg/小鼠)
G組(P467-CRM-礬Serva,10μg/注射):250μl P467-CRM與1000μl
礬Serva+250μl NaCl一起(1500μl)。150μl/小鼠(=10μg/小鼠)
H組(P467-CRM-礬Serva,25μg/注射):625μl P467-CRM與1000μl礬Serva一起(1625μl)。160μl/小鼠(=10μg/小鼠)
I組(P467-CRM-蒙塔尼德,10μg/注射):300μl P467-CRM與300μl NaCl+600μl蒙塔尼德一起。100μl/小鼠
J組(P467-CRM-蒙塔尼德,25μg/注射):700μl P467-CRM與700μl蒙塔尼德一起。126μl/小鼠
K組(P467-CRM-蒙塔尼德,50μg/注射):1300μl P467-CRM與1300μl蒙塔尼德一起。252μl/小鼠
L組(P467-單體,25μg/注射):250μl P467-CRM與1250μl NaCl一起。150μl/小鼠(=25μg/小鼠)
M組(蒙塔尼德):1000μl NaCl+1000μl蒙塔尼德。252μl/小鼠
N組(礬Brenntag):1575μl PBS+175μl礬Brenntag。175μl/小鼠
O組(CRM,50μg/注射):儲備濃度:2mg/ml。於NaCl中1:4稀釋(150+450 NaCl)。100μl/小鼠
對照組僅接受CRM、氫氧化鋁(Brenntag)或蒙塔尼德。
在第一次給藥之前(BA0)、在第2次免疫之後20天(BA1)及在第3次免疫之後18天(BA2)自動物收集血液。為了評估抗體效價動力學,亦在第3次免疫(BA3)之後8週時獲取血液。
在來自各組(除殺死所有小鼠之對照組M、N及O外)之剩餘4隻小鼠中,進一步在第3次免疫之後8及16週(分別BA4及BA5)評估抗體效價以確定抗體動力學及必需輔助劑間隔。
脾細胞製備及培養
殺死小鼠(n=4組)且在無菌條件下移除其脾,絞碎且經由無菌過濾器過濾。如先前所描述(Wiedermann等人,Int.Immunol.1999;Oct;11(10):1717-24)製備細胞懸浮液。脾細胞以0.5×106/孔之濃度塗於96孔圓底培養盤中且用在20μg/ml之濃度下之CRM或P467刺激72小時。在-20℃下儲存上清液直至分析。進行用ConA之刺激作為對照。
ELISA方案
(i)量測肽特異性抗體水準
在碳酸鹽緩衝液中稀釋之未結合融合肽P467(Bachem,Switzerland)以0.5微克/微量滴定孔的濃度用作包被抗原。將血清(n=8/組)稀釋,添加至孔中且用辣根過氧化酶(HRP)標記之兔抗小鼠IgG POX(Fc片段特異性,目錄號315-035-008;Jackson Immuno Research)偵測結合IgG抗體,隨後添加3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)。添加停止溶液且在450對630nm下讀取盤。
為了偵測IgG子集IgG1及IgG2a,將稀釋血清施加至微量滴定盤之抗原塗佈孔,隨後為大鼠抗小鼠IgG1或大鼠抗小鼠IgG2a抗體。二級抗體HRP標記之小鼠抗大鼠IgG隨後用於偵測隨後為TMB。添加停止溶液且在450對630nm下讀取盤。
(ii)量測Her-2/neu-特異性抗體水準
微量滴定盤之孔用包含結合至人類IgG1之Fc區的人類Her-2/neu之重組細胞外結構域(胺基酸殘基23-652)的融合蛋白塗佈。各孔用0.1μg融合蛋白塗佈。隨後如上文所描述分析稀釋小鼠血清。
為了偵測IgG子集1gG1及IgG2a,將稀釋血清施加至抗原塗佈孔,隨後添加大鼠抗小鼠IgG1或大鼠抗小鼠IgG2a。二級HRP標記之小鼠抗大鼠IgG(H+L)抗體用於偵測。
(iii)量測活體外細胞因子產生-IL-2、IL-5及IFN γ
收集來自CRM或P467刺激之脾細胞的上清液且根據製造商之說明(Affymetrix eBioscience,USA)藉由ELISA分析IL-2、IL-5及IFN γ之濃度。上清液在分析之前未經稀釋使用或1:10-1:20稀釋使用。
螢光活化細胞分選(FACS)分析
對新分離之脾細胞(24孔平底培養盤中2.5×106個細胞/毫升)進行FACS。細胞在佛波醇豆蔻酸酯乙酸酯(PMA;10ng/ml)及離子黴素(Ionomycin)(1.25μM)存在下培育2小時且在37℃下在佈雷菲爾德菌素(Brefeldin)A(10μg/ml)存在下培育額外4小時。細胞隨後在4℃下保持隔夜且第二天早晨用抗小鼠抗體針對以下目標染色:
(i)染色方案:
收集細胞且分開至細微管(每管1×106個細胞)。對於各小鼠樣品用前述抗體混合物進行單一染色。
隨後洗滌細胞,用Fc阻斷物(抗小鼠CD16/32)阻斷且用針對CD3、CD4、CD8、CD19及CD335之抗體染色,隨後為IFN γ及顆粒
酶B之固定/透化及細胞內染色。
進行分析以用於脾細胞群體-T細胞(CD3+CD4+及CD3+CD8+)、B細胞(CD3-CD19+)及NK細胞(CD3-CD335+)之特性化。分析亦包括偵測細胞內IFN γ蛋白質。
統計學分析
在Prism上應用非配對t測試(雙尾,95%之信賴區間)以便分析ELISA結果。顯著差異由一或多個星號指示(* P值<0.05,** 0.01<P值<0.001,*** P值<0.001)。非顯著性指示為「ns」。當比較超過兩個組時在Prism上應用單因子變異數分析(ANOVA)。在Prism上應用曼惠特尼(Mann Whitney)測試(雙尾,95%之信賴區間)以便分析FACS結果。
結果
體液反應
(i)肽特異性抗體水準
將來源於三次免疫之後的最終放血之血清以及免疫前血清1:100.000(對於IgG及IgG1)或1:100(對於IgG2a)稀釋。總血清IgG、IgG1及IgG2a之抗體效價分別顯示於圖15A-C中。
在圖中,將以下組(成框)相互比較且在統計上評估:
˙D、E、F:礬:10μg、25μg、50μg
˙I、J、K:蒙塔尼德:10μg、25μg、50μg
資料顯示在用P467-CRM免疫之所有小鼠中引發抗P467抗體。在對照動物中或在僅用P467免疫之小鼠中未誘導抗體反應。與礬(Brenntag)相比,當P467-CRM與蒙塔尼德一起投予時,IgG、IgG1及IgG2a
之抗體水準顯著較高。IgG2a效價一般低於IgG1,儘管在用P467-CRM+蒙塔尼德免疫之動物中顯著較高之IgG2a效價顯而易見。
(ii)Her-2/neu-特異性抗體水準
將來源於三次免疫之後的最終放血之血清及免疫前血清1:2500(至10.000)(IgG)、1:10.000(IgG1)及1:100(IgG2a)稀釋。血清IgG、IgG1及IgG2a之抗體效價分別顯示於圖16A-C中。
在用P467-CRM免疫之所有動物中抗細胞外Her-2/neu IgG及IgG1抗體之較高效價顯而易見。在對照組中或在僅用P467免疫之小鼠中不顯而易見抗Her-2/neu抗體反應。與礬(Brenntag)相比,當P467-CRM肽構築體與蒙塔尼德一起投予時IgG及IgG1抗體效價顯著較高。
活體外產生細胞因子(IL-2、IFN γ、IL-5)
(i)在用CRM或P467刺激之後產生IL-2
當與來源於在礬存在下用P467-CRM免疫之小鼠的經CRM刺激之脾細胞相比時,IL-2水準在來源於在蒙塔尼德存在下用P467-CRM免疫之小鼠的經CRM刺激之脾細胞中較高(參見圖17A及17B)。
(ii)在用CRM或P467刺激之後產生IFN γ
圖18A及18B顯示已活體外在CRM(圖18A)或P467(圖18B)存在下培養之脾細胞之上清液中IFN γ之濃度。在用25μg P467-CRM在蒙塔尼德下免疫之小鼠中,IFN γ之水準在範圍以外。排除來自此小鼠之資料且進行額外分析,如圖18C(藉由CRM刺激)及圖18D(藉由P467刺激)中所示。
藉由CRM刺激在來源於在礬或蒙塔尼德存在下用
P467-CRM免疫之所有小鼠的脾細胞中誘導IFN γ產生。在蒙塔尼德下(在10μg組中),IFN γ水準大於在礬(Brenntag)存在下用P467-CRM免疫之對應組中。在用P467-CRM刺激後,在用50μg P467-CRM免疫之蒙塔尼德組中IFN γ水準最強。
(iii)在用CRM或P467刺激之後產生IL-5
圖19A及19B顯示已活體外在CRM(圖19A)或P467(圖19B)存在下培養之脾細胞之上清液中IL-5之濃度。
在來源於在蒙塔尼德存在下用P467-CRM免疫之小鼠的經CRM刺激之脾細胞中,IL-5水準顯著較高。在用P467-CRM肽構築體刺激之後,在蒙塔尼德免疫小鼠中誘導一些IL-5產生,儘管當與CRM刺激之後的水準相比時IL-5之水準約10倍較低。
脾細胞藉由FACS分析之特性化;IFN γ產生之細胞內染色
為了評估使用不同佐劑(亦即礬相對蒙塔尼德)是否改變淋巴細胞分佈,尤其CD8+及CD4+淋巴細胞,在蒙塔尼德或礬存在下用不同濃度之P467免疫之後進行脾細胞之FACS分析。自小鼠分離脾細胞且分析T細胞(CD3+CD4+,圖20A,及CD3+CD8+,圖20B)、B細胞(CD3-CD19+,圖20C)及NK細胞(CD3-CD335+,圖20D)之百分比。
當與礬(Brenntag)相比時,資料顯示在來源於用較高劑量之P467-CRM(亦即25及50mg)以及蒙塔尼德免疫之小鼠的脾細胞中NK細胞顯著減少。
藉由FACS分析偵測產生IFN γ之脾細胞
為了研究用不同佐劑免疫是否將引起產生IFN γ之CD4+或
CD8+細胞之分佈改變,分離來自所有組之小鼠之脾細胞且在T細胞(CD4+,圖21A,及CD8+,圖21B)及NK細胞(CD3-CD335+,圖21C)中量測細胞內IFN γ。
資料顯示CD4+ T細胞產生IFN γ,其在用增加濃度之P467-CRM免疫之小鼠中明顯。所有對照組(及未處理小鼠)顯示類似IFN γ水準。相比之下,在來源於在蒙塔尼德下用25μg P467-CRM免疫之小鼠的CD8+ T細胞中IFN γ水準較高。資料亦顯示由來源於用P467-CRM+蒙塔尼德免疫之小鼠的NK細胞產生IFN γ。
抗Her2及P467肽抗體反應之動力學
為了評估抗體反應之動力學,在最後一次免疫之後8週、16週及6個月時獲取血液樣品。隨後根據本文所揭示之方法針對Her2/neu特異性及P467肽特異性抗體效價分析血液樣品。
如圖22中所示,在與礬或蒙塔尼德一起投予之P467-CRM肽構築體之最後一次給藥之後8週(BA3)、16週(BA4)及6個月(BA5)時P467肽特異性IgG抗體效價保持升高。類似地,如圖23中所示,在與礬或蒙塔尼德一起投予之P467-CRM肽構築體之最後一次給藥之後8週(BA3)、16週(BA4)及6個月(BA5)時Her2/neu-特異性IgG抗體效價保持升高。
概述
CRM197融合肽結合物及包含融合肽之病毒體調配物兩者均產生對單一B細胞抗原決定基(P4、P6及P7)以及對融合肽(P467及P647)具有特異性之抗體。亦應注意此等抗體亦結合於Her-2/neu之重組細
胞外結構域及在SKBR-3乳癌細胞上表現之天然Her2/neu蛋白質。
與對應病毒體調配物相比,CRM197-融合肽結合物在誘導B細胞抗原決定基及Her2/neu特異性抗體方面更有效;亦即產生顯著較高抗體效價(大約10至20倍)。
基於針對重組Her-2/neu之抗體效價,在免疫過程中在抗體反應之動力學中存在明顯差異,結果顯示CRM-結合物產生抗體效價之較早增加(在第2次免疫之後,在第3次免疫之後具有峰值),而在病毒體結合物下抗體效價之增加較慢且需要四次免疫來達成在用對應CRM結合物免疫之小鼠中可見之水準。
病毒體一般為適合之抗原遞送系統。然而,本文所揭示之結果清楚地顯示在用病毒體結合物免疫之後抗體效價之延遲增加,以及需要四次免疫來實現在用對應CRM結合物免疫之動物中觀測到的類似效價。最佳抗體反應之時間及劑量為考慮用於Her-2/neu疫苗組成物之臨床應用的重要因素。因此,此等結果顯示在疫苗遞送的情況下CRM197為Her-2/neu融合肽之更適合的載體蛋白質。
顯示礬(Brenntag)及蒙塔尼德兩者均進一步增加前述抗體對P467-CRM肽構築體之反應。當與礬相比時,在所有用蒙塔尼德免疫之小鼠中(在所有劑量中)抗P467特異性IgG以及IgG1抗體效價顯著較高。與礬相比,在用蒙塔尼德免疫之小鼠中(在所有劑量中)抗P467 IgG2a抗體效價亦較高。當在研究之所有劑量下與肽構築體共同投予時在用蒙塔尼德免疫之小鼠中抗Her-2/neu IgG及IgG1抗體效價顯著較高。與P467肽特異性抗體相反,偵測到極少或未偵測到抗Her-2/neu IgG2a抗體。
當與在P467存在下培養之細胞相比時,當細胞活體外在CRM存在下培養時由脾細胞以顯著較高量產生IFN γ。在用CRM刺激之後,當與蒙塔尼德一起施加時在用較低劑量之肽構築體投予之組中,相比於當與礬(Brenntag)一起施加時接受相同劑量之構築體之組,IFN γ水準顯著較高。資料指示與礬相比,蒙塔尼德誘導較高抗體效價,以及較高細胞因子水準。
Claims (26)
- 一種疫苗組成物,其包含:(i)佐劑;及(ii)至少一種結合至載體蛋白質之融合肽,其中該載體蛋白質為白喉毒素變異體CRM-197(SEQ ID NO:61)且其中該至少一種融合肽包含選自由SEQ ID NO:1-7及與前述中之任一者具有至少85%一致性的胺基酸序列組成之群的Her2/neu之兩個或兩個以上非相鄰B細胞抗原決定基。
- 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物,其中該融合肽包含選自由SEQ ID NO:8-14及與前述中之任一者具有至少85%一致性之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物,其中該融合肽包含與SEQ ID NO:8-14中的任一者具有至少90%一致性之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物,其中該融合肽包含與SEQ ID NO:8-14中的任一者具有至少95%一致性之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物,其中該融合肽包含與SEQ ID NO:8-14中的任一者具有至少99%一致性之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第2項之疫苗組成物,其中該融合肽包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之胺基酸序列或與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少85%一致性之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第2項之疫苗組成物,其中該融合肽包含與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少90%一致性之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第2項之疫苗組成物,其中該融合肽包含與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少95%一致性之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第2項之疫苗組成物,其中該融合肽包含與SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少99%一致性之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第6項之疫苗組成物,其中該融合肽由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之胺基酸序列組成。
- 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之疫苗組成物,其中該載體蛋白質包含2至39個融合肽。
- 如申請專利範圍第11項之疫苗組成物,其中該載體蛋白質包含6至12個融合肽。
- 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之疫苗組成物,其中該佐劑選自由以下組成之群:氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鉀鋁、磷酸鈣氫氧化物、弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)、蒙塔尼德(Montanide)®、弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant)、免疫刺激複合物(iscom)、免疫刺激複合物基質、ISCOMATRIXTM佐劑、Matrix MTM佐劑、Matrix CTM佐劑、Matrix QTM佐劑、AbISCO®-100佐劑、AbISCO®-300佐劑、ISCOPREPTM、ISCOPREPTM衍生物、含有ISCOPREPTM或ISCOPREPTM衍生物之佐劑、QS-21、QS-21衍生物及含有QS-21或QS21衍生物之佐劑。
- 如申請專利範圍第13項之疫苗組成物,其中該佐劑為氫氧化鋁。
- 如申請專利範圍第13項之疫苗組成物,其中該佐劑為蒙塔尼德。
- 如申請專利範圍第1項至第15項中任一項之疫苗組成物,其進一步包 含檢查點抑制劑。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1項至第16項中任一項之疫苗組成物及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種治療或預防有需要患者之以Her2/neu之表現或過度表現為特徵之癌症的方法,該方法包含向該患者投予有效量之如申請專利範圍第1項至第16項中任一項之疫苗組成物或如申請專利範圍第17項之醫藥組成物之步驟。
- 如申請專利範圍第18項之方法,其中該癌症為乳癌。
- 如申請專利範圍第18項之方法,其中該癌症為胃癌。
- 一種如申請專利範圍第1項至第16項中任一項之疫苗組成物之用途,其用於製造用以治療或預防有需要患者之以Her2/neu之表現或過度表現為特徵之癌症的藥物。
- 如申請專利範圍第21項之用途,其中該癌症為乳癌。
- 如申請專利範圍第21項之用途,其中該癌症為胃癌。
- 一種用於以下用途之如申請專利範圍第1項至第16項中任一項之疫苗組成物或如申請專利範圍第17項之醫藥組成物,其用於治療或預防有需要患者之以Her2/neu之表現或過度表現為特徵的癌症。
- 如申請專利範圍第24項之疫苗組成物,其中該癌症為乳癌。
- 如申請專利範圍第24項之疫苗組成物,其中該癌症為胃癌。
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