KR102372615B1 - 백신 조성물 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기를 포함하는 백신 조성물로서:
(i) 보조제; 및
(ii) 담체 단백질에 접합된 하나 이상의 융합 펩티드,
상기 담체 단백질은 디프테리아 독소 변이형 CRM-197(GenBank 수탁번호 1007216A)이고, 상기 적어도 하나의 융합 펩티드는 서열번호 1-7 및 15-60 및 상기 임의의 서열에 대하여 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된 Her2/neu의 2개 이상의 비 연속적 B 세포 에피토프를 포함한다. 또한, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은, 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 Her2/neu의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 및/또는 약학적 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
(i) 보조제; 및
(ii) 담체 단백질에 접합된 하나 이상의 융합 펩티드,
상기 담체 단백질은 디프테리아 독소 변이형 CRM-197(GenBank 수탁번호 1007216A)이고, 상기 적어도 하나의 융합 펩티드는 서열번호 1-7 및 15-60 및 상기 임의의 서열에 대하여 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된 Her2/neu의 2개 이상의 비 연속적 B 세포 에피토프를 포함한다. 또한, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은, 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 Her2/neu의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 및/또는 약학적 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 일반적으로 암-관련 단백질 Her2/neu의 단편을 포함하는 백신 조성물, 상기 조성물의 제조 방법 및 Her2/neu 단백질의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
erbB2/neu 원형종양유전자(protooncogene)에 의해 코딩되는 Her2/neu 종양 항원은 인간 표피성장인자 수용체 그룹에 속하는 185 kDa의 단백질이다. 그것은 여러 글리코실화 부위를 갖는 시스테인-풍부 세포외 도메인(ECD, 아미노산 23에서 652까지), 소수성 막관통 도메인(아미노산 653에서 675까지) 및 세포내 티로신 키나아제 도메인(아미노산 676에서 1255까지)으로 구성된다. Her2/neu 수용체는 다양한 상피 세포 유형의 세포막 상에서 발현되며, 특정 성장 인자의 결합을 통해 세포 성장 및 분열의 양태를 조절한다.
Her2/neu는 많은 정상 세포에서 낮은 수준으로 발현되지만, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 위암, 췌장암, 전립선암 및 타액선암을 비롯한 다양한 암에서 과발현된다. 예를 들어, 전이성 유방암의 약 30%가 Her2/neu를 과발현하는 것으로 나타났다. 이러한 과발현은 유방암 환자의 예후가 좋지 않은 것과 관련되어 있으며, 이는 재발없는 기간의 단축과 생존 기간의 단축에 해당한다. 현재 유방암 치료의 가장 일반적인 형태는 수술, 화학요법 및/또는 방사선 요법을 포함한다. 암이 정해진 영역으로 제한되지 않는한, 수술만으로는 암을 제거할 수 없다. 또한 방사선 요법 및 화학요법은 심각한 부작용을 수반할 수 있다.
현재의 치료법과 관련된 단점을 고려하여, 면역 요법을 포함한, 유방암과 같은 증식성 질병을 치료하기 위한 추가 접근법을 찾기 위한 시도가 있어왔다.
종양에서의 Her2/neu 과발현의 임상적 의미는 Her2/neu가 항체-매개 면역요법 단독으로 또는 종래의 화학요법의 보조제로서 매력적인 표적이 되도록 하였다. 예를 들어, 단클론 항체(mAb) 4D5는 세포자멸사, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(CDC)과 같은 직접 및 간접적인 기작에 의해 마우스에서 Her2/neu 발현 종양의 성장을 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로, 이 항체, 트라스투주맙(Trastuzumab)(Herceptin®)의 인간화 형태를 임상 시험에서 테스트했다. 화학요법 또는 트라스투주맙 단독요법에 비해, Herceptin®에 세포독성 치료를 더한 후 Her2/neu를 과발현하는 유방 종양 환자의 전반적인 생존율이 증가했다. Herceptin®은 현재 단독요법으로 사용되지만, 세포독성 화학요법과 병행하여 더 높은 효능을 보인다. 그러나, 트라스투주맙은 일반적으로 Her2/neu 수용체가 과발현되는 유방암에서만 효과적이다. 또한 일반적으로 여러번 주입해야하므로 높은 치료비가 소요된다.
트라스투주맙과 같은 단클론 항체를 이용한 수동 면역요법을 사용하는 Her2/neu-관련 암의 치료 또는 예방에 대한 대안적인 접근법은 종양-특이적 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 유도 및 인간 B- 및 T-림프구에 의해 인식되는 항원의 동정에 기초한다. 예를 들어, Her2/neu를 발현하는 세포로 마우스를 예방접종함으로써 Her2/neu의 세포외 도메인(ECD)에 대항하는 수많은 항체가 생성되었다. 이들 항체의 생물학적 효과는 에피토프-특이적인 것으로 보이며; 즉, Her2/neu ECD 내에서 짧은 부분서열(subsequence)의 특이적인 인식에 기초한다. 그러나 일부 항체는 효과가 없거나, 심지어 종양 성장을 적극적으로 자극한다.
이러한 암에 대한 백신 면역요법은 체액성 및/또는 세포성 반응이 유도되는 항원에 기초한다. 이 항원은 이상적으로 발현되거나, 또는 종양-관련 항원(TAA)이라고도 불리는 종양 세포에 의해 배타적으로 과발현되어야한다. 유방암에 대해 기술된 최초의 TAA 중 하나가 Her2/neu이었다. 한편, 다양한 에피토프를 나타내는 다양한 TAA가 시험되었지만, 어느 것도 아직까지 임상 실습에 성공적으로 진입하지 못했다.
의도된 면역 반응의 유형(즉, B 세포 또는 T 세포 반응)에 따라, 상이한 전략이 전형적으로 적용된다. 예를 들어, B 세포(즉, 항체) 반응을 유도하기 위해, 항원은 B 세포 에피토프를 포함해야한다. 당 기술분야에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, B 세포 에피토프는 B 세포 수용체에 의해 인식되고 결합되는 항원의 일부이다. 지질, 다당류 및 단백질/펩티드는 B 세포 에피토프를 포함할 수 있으며, 이는 선택된 유기체에 도입될때 도입된 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 B 세포가 생산하도록 한다.
B 세포 에피토프를 포함하는 Her2/neu의 ECD의 개별 단편은 당 분야에 공지되어있다. 예를 들어, WO 2002/068474는 Her2/neu 단백질의 세포외 부분에서 서열이 발생하는 9-25개 아미노산의 펩티드를 포함하는 백신을 기술하고있다. 또한, WO 2007/118660에는 Her2/neu 단백질의 세포외 부분에서 발생하는 상이한 아미노산 서열을 나타내는 펩티드의 특정 조합을 포함하는 다중-펩티드 백신을 기술하고있다. 이들 펩티드는 개별적으로 또는 조합하여, 각각이 바람직하게 전달 시스템에 별도로 접합된, 다수의 개별 펩티드의 형태로 투여될 수 있다. 또다른 예에서, WO 2011/020604는 비로좀 전달 시스템에 결합된 다수의 Her2/neu B 세포 에피토프를 포함하는 융합 펩티드를 기술한다. 상기 비로좀은 Montanide™ 또는 ISCOM-기반 전달 시스템으로 제형화된 동일한 융합 펩티드와 비교하여, 단일 B 세포 에피토프에 대해 더 높은 항체가를 유도하는 것으로 나타났다.
Her2/neu에 대한 면역 유도에 적합한 백신을 개발하기 위한 여러 시도에도 불구하고, 임상적으로 사용하는데 효과적인 백신은 아직 없다. 본 발명의 목적은 Her2/neu의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 암과 같은 질환을 치료 또는 예방하기 위한 백신으로서 사용하기에 적합한 개선된 조성물을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 명세서는 하기를 포함하는 백신 조성물을 기술하였다:
(i) 보조제; 및
(ii) 담체 단백질에 접합된 하나 이상의 융합 펩티드,
담체 단백질은 디프테리아 독소 변이형 CRM-197(GenBank 수탁번호 1007216A; 서열번호 61)이고, 상기 적어도 하나의 융합 펩티드는 서열번호 1-7 및 15-60으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 Her2/neu의 2개 이상의 비-연속적인 B 세포 에피토프 및 상기 임의의 서열에 대하여 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서는 또한 본원에 기술된 바와 같은 백신 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 기술한다.
본 명세서는 또한 암 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 Her2/neu의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 백신 조성물 또는 본원에 기술된 바와 같은 약학적 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 기술한다.
본 명세서는 또한 암 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 Her2/neu의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 암을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서, 본원에 기술된 바와 같은 백신 조성물의 용도를 기술한다.
본 명세서는 또한 암 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 Her2/neu의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 백신 조성물 또는 약학적 조성물을 개시한다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 구현예만을 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 것은 아니다. 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본원이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사한 또는 균등한 임의의 재료 및 방법이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 실무자는 당 분야의 정의 및 용어들 및 당업자에게 공지되어 있는 다른 방법들에 대하여, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, N.Y., and Ausubel et al. (1999) Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York, Murphy et al. (1995) Virus Taxonomy Springer Verlag:79-87를 참조할 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 다르게 요구되지 않는 한, 용어 "포함한다", 또는 "포함하는" 또는 "포함한"과 같은 변형은 명시된 요소 또는 정수, 또는 요소 또는 정수의 그룹을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이지만, 다른 요소 또는 정수, 또는 요소 또는 정수의 그룹을 배제하는 것이 아니다.
"~로 구성된"은 "~로 구성된"이라는 문구 다음에 오는 것을 포함하는 것으로 제한된다. 따라서, "구성된"이라는 문구는 나열된 요소가 필수이거나 필수적이며, 다른 요소가 존재할 수 없음을 나타낸다. "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"이란 문구는 그 문구 다음에 열거된 모든 요소를 포함하여 의미하며, 열거된 요소에 대한 개시 내용에 명시된 활성이나 작용을 방해하거나 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다. 따라서, "본질적으로 이루어진"이라는 문구는 나열된 요소가 필수이거나 필수적임을 나타내지만, 다른 요소는 선택 사항이며, 나열된 요소의 활성이나 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 다르게 지시하지 않는 한 복수 양태를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 단일 세포뿐만 아니라 2개 이상의 세포를 포함하며; "유기체"에 대한 언급은 하나의 유기체뿐만 아니라 둘 이상의 유기체를 포함하며; 등이다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 서열 식별 번호(서열번호, SEQ ID NO:)로 지칭된다. 서열번호는 서열 식별자 <400> 1, <400> 2 등과 수치적으로 대응한다. 서열 식별자의 요약이 본 명세서에서 제공된다.
본 발명은 (i) 보조제 및 (ii) 무독성 디프테리아 독소 변이형 CRM-197(GenBank 수탁번호 1007216A)에 접합된 Her2/neu의 세포외 도메인(ECD)로부터 유래된 다수의 B 세포 에피토프의 융합 펩티드를 포함하는 백신 조성물이 비로좀과 같은 전달 시스템을 사용하여 달성할 수 있는 것보다 훨씬 우수한 항원-특이적 항체 반응을 유도할 수 있다는 본 발명자들의 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 입각하고 있다.
따라서, 일 양태에서,
(i) 보조제; 및
(ii) 담체 단백질에 접합된 하나 이상의 융합 펩티드
를 포함하는 백신 조성물로서,
상기 담체 단백질이 디프테리아 독소 변이형 CRM-197(GenBank 수탁번호 1007216A, 서열번호 61)이고, 상기 적어도 하나의 융합 펩티드가 서열번호 1-7 및 15-60, 및 상기 중 임의의 서열에 대하여 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 Her2/neu의 2개 이상의 비-연속적인 B 세포 에피토프를 포함하는 백신 조성물이 제공된다.
B 세포 에피토프
본원에 사용된 용어 "B 세포 에피토프"는 B 세포 수용체(항체)에 의해 인식되는 분자의 일부를 지칭한다. 따라서, "B 세포 에피토프"는 항원의 작은 부분 서열인 것으로 이해되며, 상기 에피토프 서열은 항체에 의해 인식될 수 있다. 항원은 다수의 B 세포 에피토프를 포함할 수 있으며, 따라서 다수의 별개의 항체에 의해 결합될 수 있지만, 이 항원의 임의의 주어진 에피토프 단편은 전형적으로 하나의 항체에 의해서만 결합될 것이다.
본원에서 사용된 용어 "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산 잔기 또는 아미노산 유사체의 분자를 지칭하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 아미노산 잔기는 펩티드 결합에 의해, 또는 대안적으로 다른 결합에 의해, 예를 들어 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있지만, 대부분의 경우 펩티드 결합으로 연결될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산" 또는 "아미노산 잔기"는 D- 및 L-형태 모두 포함하는, 천연 및 비천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 모두를 포함한다. "아미노산 유사체"는 하나 이상의 원자에서 상응하는 천연 발생 아미노산과 상이한 비천연 발생 아미노산으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 시스테인의 아미노산 유사체는 호모시스테인일 수 있다.
당업자는 펩티드가 Her2/neu의 B 세포 에피토프인지의 여부를 측정하는 방법을 알 것이다. 예시적인 실시예에서, 문제의 펩티드의 서열을 인간 또는 마우스 생식세포에 의해 코딩되는 항체에 의해 인식되는 것으로 알려진, 공지된 서열 및/또는 부분적 서열의 데이터베이스와 비교하는, 확립된 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써, B 세포 에피토프이거나, 또는 B 세포 에피토프를 포함하는 것으로 높은 정확성으로 펩티드를 동정할 수 있다. 대안적으로, 주어진 펩티드 또는 폴리펩티드 내 B 세포 에피토프는 표면 접근성, 사슬 유연성, 소수성/친수성 프로파일, 예측된 2차 구조 등과 같은 항원성의 상관 관계의 다양한 조합을 사용하여 컴퓨터-보조 분석에 의해 동정될 수 있다. 대안적으로, 문제의 펩티드로 동물을 적어도 한번 예방접종하고, 면역 반응을 일으킨 후, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역분석법, 웨스턴 블롯 분석 또는 스폿-블롯 분석을 사용하여 상기 투여된 펩티드의 적어도 일부에 특이적으로 결합하는 항체에 대하여, 동물의 혈청을 시험하여, 적어도 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 대해 시험함으로써 문제의 펩티드가 B 세포 에피토프이거나, B 세포 에피토프를 포함하는 것으로 확인될 수 있다. 문제의 펩티드가 B 세포 에피토프인지 여부를 측정하는 방법에 대한 보다 상세한 설명은 하기의 실시예 6 및 7에 제공된다.
하기 표 1은 그 유도체를 포함하여, Her2/neu의 세포외 도메인의 B 세포 에피토프의 아미노산 서열을 제시한다:
본원에 개시된 구현예에서, 둘 이상의 B 세포 에피토프는 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같은 서열번호 1-7 및 15-60, 및 상기 임의의 서열에 대하여 적어도 85%의 동일성을 갖는 (즉, 서열번호 1-7 및 15-60 중 어느 하나에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는) 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 본원에 개시된 또다른 구현예에서, 둘 이상의 B 세포 에피토프는 서열번호 1-7 및 상기 임의의 서열에 대하여 적어도 85%의 동일성을 갖는; 즉, 서열번호 1-7 중 어느 하나에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 상기 B 세포 에피토프 중 어느 것도 천연 Her2/neu에 인접하지 않음을 유의해야한다.
서열번호 1-7 및 15-60 중 어느 하나에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 아미노산 치환이 보존적이도록 Her2/neu의 위치에 존재하지 않는 또 다른 아미노산으로 Her2/neu ECD의 천연(즉, 자연 발생) B 세포 에피토프 내 적어도 하나의 아미노산을 치환함으로써 생성된 유도체를 포함한다. 유도체는 중간 생성물 및/또는 최종 생성물에서 융합 펩티드의 안정성을 증가시키거나, 또는 중간 생성물 및/또는 최종 생성물에서 융합 펩티드의 용해도를 증가시키거나, 또는 융합 펩티드의 면역원성을 증가시키기 위해 제조될 수 있다. 적합한 유도체를 제조하는 방법은 당업자에게 공지될 것이다. 예시적인 실시예는 변이된 핵산 분자를 사용한 유도체의 합성 또는 그의 재조합 생성을 포함한다. 또한, 유도체는 전형적으로 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 B 세포 에피토프로서의 특성(quality)을 유지할 것이다. 따라서, 본원에 개시된 것은 또한 천연 서열로의 아미노산 치환이 B 세포 에피토프로서 기능하는 유도체의 능력을 없애지 않거나 완전하게 없애지 않는 "기능적" 유도체이다.
추가의 또는 최적화된 면역자극성 융합 펩티드의 동정은 또한 유도체에 의한 면역 이펙터 세포의 자극 효과 측정으로서, 융합 펩티드에 의한 B 세포의 자극 및 유도체에 의한 B 세포의 자극을 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 유도체를 공지된 융합 펩티드와 비교함으로써, 증가된 면역 세포 자극 특성을 갖는 펩티드를 제조할 수 있다.
본원에 사용된 "보존적 치환"은 주어진 위치에서 대략 동등한 크기, 전하 및/또는 극성의 아미노산으로 치환하여 아미노산 동일성을 변화시키는 것을 지칭한다. 아미노산의 천연 보존적 치환의 예는 다음의 8개의 치환기(통상적인 1 문자 코드로 표시)를 포함한다: (1) M, I, L, V; (2) F, Y, W; (3) K, R,(4) A, G; (5) S, T; (6) Q, N; (7) E, D; 및 (8) C, S.
유도체는 또한 기능적으로 균등한 아미노산 치환으로부터 생성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 이들은 행해질 때, 대응하는 유도체화 없는 융합 펩티드와 대조적으로, 유도체화된 에피토프 단편 또는 유도체화된 에피토프 단편들을 포함하는 융합 펩티드가 투여된 동물의 혈청을 기준으로 동일한 또는 비슷한 (예를 들어, 10% 이내의) ELISA 값을 제공할 융합 펩티드가 생성될 아미노산 치환으로 이해된다. 융합 펩티드의 항원성은, 예를 들어 실시예 6 및 7에 기술된 바와 같이, ELISA에 의해 동물을 예방접종하여 유도된 항체가를 측정함으로써 결정될 수 있다. 아미노산 치환의 기능적 균등성, 보존적 또는 기타에 대하여 분석하는데 유사한 과정이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유도체화되지 않은 "모(parental)" 단편을 포함하는 융합 펩티드에 의해 유도된 면역 반응은 유도체화 단편을 포함하는 융합 펩티드에 의해 유도된 면역 반응과 동일한 분석법을 사용하여 비교된다. 유도체화된 단편을 포함하는 융합 펩티드에 의해 유도된 면역 반응이 유도체화되지않은 단편을 갖는 융합 펩티드에 의해 유도된 것만큼 강할 경우, 아미노산 치환은 기능적으로 동등한 것으로 간주될 수 있다. 유도체화된 면역 반응이 유도체화되지않은 면역 반응보다 우수하다면, 아미노산 치환은 개선된 것으로 간주될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "천연" 및 "천연적"은 본질상 정상적으로 발생하는 분자의 형태를 지칭한다. 이와 같이, Her2/neu의 ECD의 "천연" 서열은 이전에 공개된 Her2/neu 아미노산 서열의 아미노산 잔기 23-652를 지칭한다(Swiss-Prot 데이터베이스 수탁번호 P04626; ERBB2_HUMAN). 반대로, "비-천연 링커"를 포함하는 "비-천연" 서열은 Her2/neu의 ECD의 천연 서열에 속하지 않는 임의의 아미노산 서열이다. 따라서, 본원에 개시된 구현예에서, 펩티드성 "비-천연 링커"는 Her2/neu의 인접한 천연 서열에 연결되는 Her2/neu 단편의 연장을 나타내지 않는다.
융합 펩티드
다중 에피토프/펩티드에 기초한 Her2/neu-발현 또는 Her2/neu-과발현 암에 대한 면역예방 및/또는 면역요법 백신 조성물의 디자인은 이산(즉, 분리된) 펩티드와 같은 펩티드의 투여를 수반한다. 이것은 특정의 함축된 단점을 가지고 있다. 예를 들어, 동일한 조성물 내에 다수의 펩티드를 동시에 투여하면 이들 펩티드가 응집될 위험이 있으며, 이로 인해 숙주 면역계에 대한 의도된 유용성이 감소하게 된다. 극단적인 경우, 이러한 응집체의 용해도는 응집체가 침전되어 숙주 면역계에 이용할 수 없게 될 정도로 감소될 수 있다. 동시에, 상이한 용액 및 상이한 시점에서의 상기 펩티드의 개별 투여는 이러한 펩티드의 면역원성 효과가 유리한 방식으로 결합될 가능성을 감소시킨다.
다수의 에피토프가 비로좀, 리포좀 또는 바이러스-유사 입자(VLP)와 같은 특정 유형의 전달 시스템과 함께 사용되는 경우 더 많은 어려움이 발생한다. 재생가능한 백신 생산을 가능하게 하기 위해, 에피토프가 한정되는 농도로 존재하는 것이 유리하다. 그러나, 다수의 펩티드 단편을 비로좀 또는 리포솜과 같은 단일 전달 시스템에 커플링(즉, 공유 결합)시키는 경우, 동일한 수의 에피토프가 각각의 전달 시스템에 결합되는 것을 보장하기가 어렵다. 전달 시스템 당 커플링 수의 변동은 언제나 존재한다. 각각의 실행가능한 전달 시스템이, 예를 들어, 에피토프 A 및 B 각각에 커플링될 것을 비교적 확신할 수 있지만, 몇몇 전달 시스템은 의도된 것보다 약간 더 많은 에피토프 A와 연합될 반면, 에피토프 B는 다른 것들에서 의도된 양을 약간 초과할 것이다. 에피토프 A 및 B의 가우시안 분포는 단편 A:B의 의도된 비율을 중심으로 하는 경향이 있지만, 정의에 의한 임의의 가우시안 분포는 이상치(outlier)를 포함하며, 잠재적으로 최대의 면역원성 효능을 저해하는, 및 전달 시스템에서 의도된 에피토프 비율을 유지하기 위한 요건이 더욱 엄격해짐에 따라 배제하는 것이 점점 더 비용이 많이 들고 힘든 것이 이상치이다. 하나의 Her2/neu ECD 단편의 다른 단편에 대한 원하는 비율을 실현시키려는 시도에서, 상이한 에피토프 단편과 관련된 비로좀과 같은 전달 시스템을 결합할 때 유사한 우려가 적용된다.
상기 단점을 극복하거나 적어도 부분적으로 경감시키는 접근법이 본 명세서에 개시되어있다. 단일 융합 펩티드에서 Her2/neu 또는 그의 유도체의 ECD로부터의 적어도 2개의 비-연속적인 B 세포 에피토프를 연결시킴으로써, 단일 종류의 융합 펩티드만 존재하는 균일한 제형을 얻을 수 있다. 융합 펩티드의 요소(즉, 천연 ECD에서 인접하지않은 Her2/neu의 ECD의 에피토프)는 모든 펩티드에서 동일하고, 바람직하지 않은 폴리펩티드간 및 폴리펩티드내 상호작용이 최소화되도록 선택(선택 및 변형)될 수 있다.
본원에 기술된 구현예에서, 백신 조성물은 단일 유형의 융합 펩티드를 포함할 것이다. 따라서, 존재하는 B 세포 에피토프의 비율은 융합 펩티드내 상기 단편의 비율에 의해 궁극적으로 영향을 받는다. 이는 면역원성 반응을 유도하기 위한 임의의 원하는 비율이 융합 펩티드 구성 및 설계 수준에서 쉽고 확실하게 고정될 수 있음을 의미한다.
마지막으로, 본원에 기술된 융합 펩티드를 전달하기 위한 담체 단백질로서 무독성 디프테리아 독소 변이체 CRM-197을 사용하는 경우, 임의의 다른 본래 인접하지않은 그의 B 세포 에피토프에 대한 하나의 Her2/neu B 세포 에피토프의 비율이 상기한 바와 같이, 상기 비율이 단일 융합 펩티드의 수준에서 측정되므로 얼마나 많은 융합 펩티드가 담체 단백질에 결합되든지 무관하게 일정하게 유지될 것이기 때문에, 백신 조성물 내 각각의 Her2/neu B 세포 에피토프의 상대적인 분포에 관한 가변성이 최소화될 수 있거나 회피될 수 있다.
본원에 개시된 다른 구현예에서, 백신 조성물은 한 유형 이상의 융합 펩티드를 포함할 것이다.
본원에 개시된 백신 조성물은 그것이 투여되는 숙주에서 항원-특이적 항체 반응을 유도한다. 놀랍게도, 백신 조성물에 의해 유도되는 항원-특이적 반응은 Her2/neu B 세포 에피토프를 개별적으로 사용하여, 또는 비로좀과 같은 대안적인 전달 시스템을 사용하여 얻을 수 있는 면역 반응보다 훨씬 더 크다. 따라서, 본 발명은 펩티드를 비로좀으로 혼입시키는 복잡한 제조 공정, 다수의 개별 펩티드를 전달 시스템으로 통합하려고 시도하는 것과 종종 관련되는 가변성, 및 백신 조성물의 효능을 저하시킬 수 있는, 별개의 B 세포 에피토프 단편 간의 가능한 부정적인 상호작용의 단점들을 회피하거나 최소화한다.
본원에서 사용된 "융합 펩티드"라는 용어는 예를 들어, 펩티드(아미드) 결합을 통해 서로 연결되는, Her2/neu의 ECD의 2개 이상의 인접하지않은 B 세포 에피토프(예를 들어, Her2/neu의 ECD의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11개 이상의 인접하지않은 B 세포 에피토프)로 조성된 비-천연 펩티드를 지칭한다. 본원에 개시된 구현예에서, Her2/neu의 ECD의 둘 이상의 B 세포 에피토프는 천연 상태에서는 인접하지 않으며; 즉, 본래의 Her2/neu의 ECD에 있다.
본원에 개시된 구현예에서, 융합 펩티드는 Her2/neu의 ECD의 적어도 3개의 인접하지않은 B 세포 에피토프를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 펩티드는 서열번호 8-14로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 및 상기 언급된 것들 중 어느 것과도 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
하기 표 2는 본원에 개시된 구현예 중 일부에 따른 융합 펩티드뿐만 아니라 선택된 B 세포 에피토프의 목록을 제공한다:
본원에 개시된 구현예에서, 융합 펩티드는 서열번호 8(융합 펩티드 P467으로 표기함) 또는 서열번호 9(융합 펩티드 P647으로 표기함)의 아미노산 서열 또는 적어도 상기 표 2에 개시된 바와 같이 서열번호 8 또는 서열번호 9에 대하여 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 탠덤 반복에서 2회 이상 연결되는, 서열번호 1-7 및 15-60, 또는 상기 임의의 서열에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된 Her2/neu의 ECD의 2개 이상의 B 세포 에피토프를 포함하는 융합 펩티드도 또한 고려된다. 예를 들어, 본원에서 고려되는 융합 펩티드는 서열번호 1의 둘 이상의 탠덤 반복, 서열번호 2의 둘 이상의 탠덤 반복, 서열번호 3의 둘 이상의 탠덤 반복, 서열번호 4의 둘 이상의 탠덤 반복, 서열번호 5의 둘 이상의 탠덤 반복 등을 포함할 수 있다. 그러나, 융합 펩티드에 둘 이상의 상이한 B 세포 에피토프를 혼입하면, Her2/neu의 ECD의 다수의 B 세포 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체를 유도함으로써 더 유익한 면역 반응을 일으킬 가능성이 더 많다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본원에 개시된 구현예에서, 융합 펩티드는 서열번호 1-7 및 15-60, 또는 상기 임의의 서열에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된 Her2/neu의 ECD의 적어도 2개의 상이한 B 세포 에피토프를 포함한다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 융합 펩티드는 서열번호 8-14로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 융합 펩티드는 서열번호 8(융합 펩티드 P467로 표기됨) 또는 서열번호 9(융합 펩티드 P647로 표기됨)의 아미노산 서열로 구성된다.
서열번호 3 및 4의 개별적인 B 세포 에피토프에서, 표 2에 상술한 바와 같이, 서열번호 4는 서열번호 3에서 발견되지 않는 Cys에서 끝나는 부가적인 C-말단 링커(즉, GGGGGC)를 포함한다. 서열번호 4의 상기 C-말단 링커 자체는 Cys로 끝나며, 하기에 설명되는 일부 실시예에 예시된 바와 같이, 이 단일 에피토프를 담체 단백질에 커플링시킨다. 본 발명의 융합 펩티드의 일부로서 사용되는 경우, 서열번호 4의 B 세포 에피토프는 서열번호 3의 형태로 이 융합 펩티드에 존재한다. 서열번호 4의 B 세포 에피토프가 사용된 실험에서, B 세포 에피토프로서 기능하는 서열번호 3에 상응하는 서열번호 4의 부분이다.
본원에 기술된 융합 펩티드를 제조하는 적당한 방법은 당업자에게 익숙할 것이다. 예시적인 실시예는 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 각각의 B 세포 에피토프를 이웃하는 B 세포 에피토프에 연결시키고, 상기 융합 펩티드를 회수하는 펩티드 결합의 순차적 형성을 포함하는 펩티드 합성을 포함한다. 적합한 펩티드 합성 방법은 당 업계에 공지될 것이다. 예시적인 예로는 "Amino Acid and Peptide Synthesis"(Oxford Chemistry Primers; by John Jones, Oxford University Press)에 기술된 방법이 포함된다. 합성 펩티드는 또한 상이한 고체 지지체(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리아미드 또는 PEG) 상에서 액상 합성 또는 고상 펩티드 합성(SPPS)에 의해 제조될 수 있다. SPPS는 F-moc(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐) 또는 t-Boc(tert-부톡시카르보닐)의 사용을 포함시킬 수 있다. 맞춤형 펩티드는 여러 상업적 제조업체에서 입수할 수 있다.
대안적으로, 융합 펩티드는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 융합 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자는 상기 핵산 서열을 발현할 수 있는 적합한 숙주 세포에 형질감염시키고, 상기 핵산 서열의 발현에 적합한 조건하에 상기 숙주 세포를 배양하고, 상기 융합 펩티드를 회수할 수 있다. 해당 융합 펩티드(들)을 코딩하는 핵산 분자를 제조하기 위한 적합한 방법은 또한 재조합 융합 펩티드(들)의 발현 및/또는 분비에 사용되는 숙주 세포(예를 들어, 미생물)의 성질에 기초한 코돈을 최적화하는 것을 가능하게 포함하여, 유전자 코드의 지식에 기초하여 당업자에게 공지될 것이다. 적합한 숙주 세포도 또한 당업자에게 공지될 것이며, 이의 예시는 원핵 세포(예를 들어, 대장균) 및 진핵 세포(예를 들어, 피키아 파스토리스(P. pastoris))를 포함한다. "Short Protocols in Molecular Biology, 5th Edition, 2 Volume Set: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology" (by Frederick M. Ausubel (author, editor), Roger Brent (editor), Robert E. Kingston (editor), David D. Moore (editor), J. G. Seidman (editor), John A. Smith (editor), Kevin Struhl (editor), J Wiley & Sons, London)를 참조한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "코딩하다", "코딩하는" 등은 다른 핵산 또는 폴리펩티드를 제공할 수 있는 핵산의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 핵산 서열은 전형적으로 숙주 세포에서 전사 및/또는 번역되어 폴리펩티드를 생산할 수 있는 경우, 또는 전사 및/또는 번역되어 폴리펩티드를 생산할 수 있는 형태로 가공될 수 있는 경우, 폴리펩티드를 "코딩하는" 것으로 언급된다. 상기 핵산 서열은 코딩 서열, 또는 코딩 서열과 비-코딩 서열 모두를 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "코딩하다", "코딩하는" 등은 DNA 분자의 전사로부터 생성된 RNA 생성물, RNA 분자의 번역으로부터 생성된 단백질, RNA 생성물을 형성하기 위한 DNA 분자의 전사 및 RNA 생성물의 후속 번역으로부터 생성된 단백질, 또는 RNA 생성물을 제공하기 위한 DNA 분자의 전사, 처리된 RNA 생성물(예를 들어, mRNA)를 제공하기 위한 RNA 생성물의 가공 및 가공된 RNA 생성물의 후속 번역으로부터 생성된 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 B 세포 에피토프 또는 융합 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 적합한 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 예를 들어, 인간 피험자에서 Her2/neu에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 융합 펩티드가 사용되는 경우, 핵산 서열은 인간 코돈-최적화될 수 있다. 코돈 최적화를 위한 적합한 방법은 John Hopkins University Build a Genome 웹사이트 상의 "Software Tools"에 위치한 'Gene Design' 툴의 "Reverse Translation" 옵션을 이용하는 것과 같이, 당업자에게 공지되어있다.
본원에 기술된 바와 같은 Her2/neu의 2개 이상의 인접하지않은 B 세포 에피토프는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 융합 펩티드 내에서 서로 연결될 수 있다. "연결하다" 및 "연결된"이란 용어는 펩티드 결합을 통해 두개의 인접하지않은 Her2/neu B 세포 에피토프의 직접 연결을 포함하며; 즉, 하나의 Her2/neu 에피토프의 C-말단은 펩티드 결합을 통해 또다른, 천연적으로 인접하지않은 에피토프의 N-말단에 공유 결합된다. "연결하다" 및 "연결된"이라는 용어는 그의 의미내에서, 개재된 링커 요소를 통해 두개의 천연적으로 인접하지않은 Her2/neu 에피토프의 연결을 포함한다.
본원에 개시된 일 구현예에서, 상기 B 세포 에피토프 또는 이의 유도체 중 적어도 2개는 비-천연 링커 펩티드 서열을 통해 서로 연결된다.
본원에서 사용된 용어 "링커"는 융합 펩티드 내의 임의의 2개의 인접한 Her2/neu B 세포 에피토프 또는 이의 유도체 사이에 개재된 짧은 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 링커는 1 내지 10개, 바람직하게는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 천연 또는 비-천연 발생 아미노산의 폴리펩티드 링커이다. 일 구현예에서, 링커는 탄수화물 링커이다. 적합한 탄수화물 링커는 당업자에게 공지될 것이다. 본원에 개시된 또다른 구현예에서, 융합 펩티드는 하나 이상의 다른 비-펩티드성 또는 비-폴리펩티드성 링커(들)과 함께 하나 이상의 펩티드성 또는 폴리펩티드성 링커(들)을 포함한다. 또한, 상이한 유형의 링커, 펩티드성 또는 비-펩티드 성은 적당한 것으로 간주되는 동일한 융합 펩티드에 포함될 수 있다. 펩티드성 또는 폴리펩티드성 링커가 Her2/neu의 ECD로부터 2개의 각각의 B 세포 에피토프 단편을 결합시키는데 사용되는 경우, 링커는 N-말단이 펩티드 결합을 통해 한 에피토프 단편의 C-말단에 결합되도록, 및 그의 C-말단이 펩티드 결합을 통해 다른 단편의 N-말단에 결합되도록 유리하게 포함될 것이다. 융합 펩티드 내의 개별적인 B 세포 에피토프 단편은 또한 어느 한쪽 또는 양쪽 말단, 바람직하게는 C-말단에 부가된 하나 이상의 아미노산을 가질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 링커 또는 스페이서 아미노산이 펩티드의 N-말단 또는 C-말단 또는 둘 모두에 첨가되어, 인접하지않은 펩티드를 연결하고, 펩티드를 서로, 및/또는 앵커로서 작용하는 비로좀 내의 지질 분자를 통해 비로좀과 같은 전달 시스템에 편리하게 커플링시킬 수 있다. 적합한 펩티드 링커의 예시는 예를 들어 서열번호 8에 개시된 바와 같은 LP(류신-프롤린)이다.
융합 펩티드와 담체 단백질의 커플링이 링커를 경유하는 경우, N-말단으로부터의 링커 커플링은 어떤 경우에는 유도된 원하는 면역 반응에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에, 융합 펩티드의 C-말단으로부터 이러한 링커-매개된 커플링을 수행하는 것이 바람직하다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
서열 동일성 및 서열 유사성
"적어도 85%"에 대한 언급은 예를 들어, 최적의 정렬 또는 최선의 적합 분석후, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 형태에서, 서열은 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 86%, 바람직하게는 적어도 87%, 바람직하게는 적어도 88%, 바람직하게는 적어도 89%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 바람직하게는 적어도 92%, 바람직하게는 적어도 93%, 바람직하게는 적어도 94%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99% 또는 바람직하게는 100% 서열 동일성 또는 서열 상동성을 갖는 서열을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "동일성", "유사성", "서열 동일성", "서열 유사성", "상동성", "서열 상동성" 등은 정렬된 서열내 임의의 특정 아미노산 잔기 위치에서, 아미노산 잔기가 정렬된 서열간에 동일함을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "유사성" 또는 "서열 유사성"은 정렬된 서열내 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열간에 유사한 유형임을 나타낸다. 예를 들어, 류신은 이소류신 또는 발린 잔기로 치환될 수 있다. 이는 보존적 치환으로 언급될 수 있다. 일 구현예에서, 변형되지않은 폴리펩티드와 비교할 때 변형된 폴리펩티드의 결합 특이성 또는 기능적 활성에 변형이 영향을 미치지 않도록 아미노산 서열이 그 안에 포함된 임의의 아미노산 잔기의 보존적 치환에 의해 변형될 수 있다 .
일부 구현예에서, 폴리펩티드에 대한 서열 동일성은 서열을 정렬한 후 최대 % 상동성을 달성하기 위해 필요하다면 갭을 도입한 후 상응하는 폴리펩티드의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율에 관한 것으로, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않는다. N-또는 C-말단 연장도 삽입도 서열 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되어서는 안된다. 2개 이상의 아미노산 서열의 정렬을 수행하고 그 서열 동일성 또는 상동성을 측정하기 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업자에게 공지되어있다. 예를 들어, 두 아미노산 서열의 동일성 또는 유사성의 백분율은 BLAST, FASTA 또는 Smith-Waterman 알고리즘과 같은 알고리즘을 사용하여 용이하게 계산될 수 있다. 본 발명은 본원에서 동정된 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성 또는 서열 상동성을 갖는 서열, 및 본원에 기술된 방법에서 그의 사용에 관한 것이다.
일부 구현예에 있어서, 폴리뉴클레오티드에 대한 서열 동일성은 서열을 정렬시킨 후 최대 % 상동성을 달성하기 위해 필요하다면 갭을 도입한 후 상응하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드의 백분율에 관한 것으로, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환도 고려하지 않는다. 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 서열의 정렬을 수행하고 이들의 서열 동일성 또는 상동성을 측정하기 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업자에게 잘 알려져있다.
아미노산 서열 "유사성"을 측정하기 위한 기술은 당업자에게 잘 알려져있다. 일반적으로, "유사성"은 2개 이상의 폴리펩티드의, 또는 아미노산이 동일하거나, 또는 전하 또는 소수성과 같은 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성을 갖는 적당한 위치에서의 아미노산 대 아미노산의 정확한 비교를 의미한다. 소위 "% 유사성"은 비교된 폴리펩티드 서열 사이에서 측정될 수 있다. 핵산 및 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 기술은 또한 당 기술 분야에 잘 알려져 있으며, (보통 cDNA 중간체를 통해) 그 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 그에 의해 코딩된 아미노산 서열을 결정하고, 이것을 두 번째 아미노산 서열과 비교하는 단계를 포함한다. 일반적으로, "동일성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드, 또는 아미노산 대 아미노산 대응을 지칭한다.
2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 그들의 "% 동일성"을 측정함으로써 비교될 수 있다. 두개 이상의 아미노산 서열도 마찬가지로 "% 동일성"를 측정하여 비교할 수 있다. 두 서열의 % 동일성은 핵산 또는 펩티드 서열에 상관없이 두개의 정렬된 서열 간의 정확한 일치 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 값으로 나타낼 수 있다. 핵산 서열에 대한 근사(approximate) 정렬은 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)의 국부 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이 알고리즘은 Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA에 의해 개발된 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 사용하여 펩티드 서열과 함께 사용하도록 확장되고, Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)에 의해 정규화될 수 있다. 서열 간의 % 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 적합한 프로그램은 당 업계에 일반적으로 공지되어있다.
핵산 서열 동일성을 측정하기 위한 예시적인 예는 대상 핵산 서열을 사용하여 프로그램 BLASTN 버전 2.1(Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402에 기초함)을 사용하는 GenBank 데이터베이스(http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/에서 액세스가능)와 같은 핵산 서열 데이터베이스를 검색한다. 이 프로그램은 갭이없는(ungapped) 모드로 사용할 수 있다. 기본 필터링은 복잡성이 낮은 영역으로 인해 서열 상동성을 제거하는 데 사용된다. BLASTN의 기본 매개변수를 사용할 수 있다. 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 예시적인 예로서, BLASTP 프로그램을 사용하여 GenBank 데이터베이스(웹 사이트 http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/에서 액세스 가능)와 같은 단백질 서열 데이터베이스를 검색하는데 아미노산 서열이 사용된다. 이 프로그램은 갭이없는(ungapped) 모드로 사용할 수 있다. 기본 필터링은 복잡성이 낮은 영역으로 인해 서열 상동성을 제거하는 데 사용된다. BLASTP의 기본 매개변수가 사용된다. 낮은 복잡도의 서열에 대한 필터링은 SEG 프로그램을 사용할 수 있다.
비교 윈도우 정렬을 위한 서열의 최적 정렬은 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA)의 전산화 구현에 의해, 또는 선택된 임의의 다양한 방법으로 생성된 검사와 최선의 정렬(즉, 비교 윈도우에 비해 가장 높은 상동성 비율을 얻음)에 의해 진행될 수 있다. 또한, 예를 들어 Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res.25:3389에 개시된 바와 같이 프로그램의 BLAST 패밀리를 참조할 수 있다. 서열분석에 대한 자세한 논의는 Unit 19.3 of Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15에서 찾아볼 수 있다.
담체 단백질
CRM-197(GenBank 수탁번호 1007216A; 서열번호 61)은 아미노산 잔기 52에서 단일 아미노산 치환(Gly-Glu)을 함유하는 효소적으로 불활성 및 무독성 형태의 디프테리아 독소이다. Glu52 치환을 유도하는 단일 GCA 돌연변이는 CRM-197을 그의 야생형 종류와 구별한다. CRM-197의 독성 부재는 야생형 종이 단백질 합성에 필수적인 감염된 세포에서 신장 인자 2(전위효소(translocase))의 화학적 변형을 촉매하는, A 단편의 효소 활성의 상실로 인한 것으로 보인다. 이 무독성 특성으로 인해, CRM-197이 접합 백신 제조에 적합한 담체 단백질이 된다.
융합 펩티드가 CRM-197에 결합될 수 있는 방법은 당업자에게 공지되어있다.
예시적인 예는 Chang et al. (1998, FEBS Letters, 427:362-366) 및 Berti et al. (2004, Biophysical Journal, 86:3-9)에 기술된 것뿐만 아니라 하기 실시예 1에 개시된 것들을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 융합 펩티드의 CRM-197에 대한 접합은 전형적으로 적합한 가교제를 사용하여 리실 잔기의 활성화를 통해 달성된다. CRM-197은 40개의 리신 잔기를 포함하고 있고 그중 많은 것들이 가교에 이용가능하기 때문에, CRM-197 접합의 최종 산물은 언제나 이종성이다. 이론 또는 특정 작용방식에 구애됨이 없이, 융합 펩티드:담체 단백질의 비율은 융합 펩티드의 크기 또는 분자량에 의존한다는 것이 일반적으로 이해된다. 예를 들어, 융합 펩티드가 비교적 작은 경우(예를 들어, 길이가 약 10 아미노산), 이는 20-39개의 융합 펩티드와 접합된 담체 단백질을 생성시킬 수 있다. 반대로, 더 큰 융합 펩티드의 경우, 담체 단백질은 20개 이하의 융합 펩티드와 접합될 수 있다. 본원에 기술된 구현예에서, 담체 단백질은 2 내지 39개의 융합 펩티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 담체 단백질은 20개 이상의 융합 펩티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 담체 단백질은 6 내지 12개의 융합 펩티드를 포함한다.
융합 펩티드는 전형적으로 공유 결합에 의해 담체 단백질에 커플링된다. 그러나, 일부 구현예에서, 융합 펩티드는 비공유 결합에 의해 담체 단백질에 커플링될 수 있다. 융합 펩티드가 담체 단백질과 비공유 결합되는 경우, 상기 비공유 결합은 전형적 담체 단백질의 1개 이상의 원자를 갖는 융합 펩티드의 1개 이상의 원자들 사이의 전자기적 상호작용을 포함할 것이다. 실례는 이온 결합(즉, 이 반대 전하로 인해 2개의 반대로 대전된 이온들 사이에 형성된 인력), 반 데르 발스(Van der Weals) 힘(즉, 융합 펩티드 및 담체 단백질 내에 존재하는 공유 결합의 영구적 및/또는 유도된 쌍극자 간의 힘) 및/또는 소수성 상호작용(즉, 담체 단백질의 소수성 부분과 연합하는 것으로 본원에 기술된 융합 펩티드(들)내 지방족/소수성 부분의 경향으로 인한 힘)을 포함한다.
보조제
본원에 사용된 용어 "보조제"는 전형적으로 보조제의 부재하에, 본원에 기술된 융합 펩티드-담체 단백질 접합체로부터, 또는 융합 펩티드로부터 단독으로 예상되는 것 이상으로, 융합 펩티드-담체 단백질 접합체에 의해 유도된 면역반응의 규모를 증가시킬 수 있는 물질의 부류를 지칭한다.
적당한 보조제는 당업자에게 공지될 것이다. 적합한 보조제의 비-제한적인 예는 알루미늄 염(예를 들어, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄 및 황산 알루미늄 칼륨(명반이라고도 함)), 리포좀, 비로좀, 유중수형 또는 수중유형 에멀젼(예를 들어, 프로인트 보조제, Montanide®, MF59® 및 AS03), 3-O-데스아실-4'-모노포스포릴 지질 A(MPL) 및 MPL을 함유하는 보조제(예를 들어, AS01, AS02 및 AS04), 및 사포닌계 보조제를 포함한다. 사포닌계 보조제는 예를 들어 퀼라야 사포나리아(Quillaja saponaria), 고려인삼 삼칠인삼(Panax ginseng Panax notoginseng), 미국인삼(Panax quinquefolium), 도라지(Platycodon grandiflorum), 세네가(Polygala senega), 원지(Polygala tenuifolia), 퀼라야 브라실리엔시스(Quillaja brasiliensis), 황기(Astragalus membranaceus) 및 쇠무릎(Achyranthes bidentata)으로부터의 사포닌 또는 사포닌 유도체를 포함한다. 예시적인 사포닌계 보조제는 iscoms, iscom 매트릭스, ISCOMATRIX™ 보조제, Matrix M™ 보조제, Matrix C™ 보조제, Matrix Q™ 보조제, AbISCO®-100 보조제, AbISCO®-300 보조제, ISCOPREP™, ISCOPREP™ 유도체, ISCOPREP™ 또는 ISCOPREP™ 유도체 함유 보조제, QS-21, QS-21 유도체, 및 QS-21 또는 QS21 유도체 함유 보조제를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 백신 조성물은 또한 예를 들어 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자를 포함하는 면역조절제와 연합될 수 있다. 동일한 백신 조성물 내의 둘 이상의 보조제의 혼합물도 또한 본원에서 고려된다.
일 구현예에서, 보조제는 수산화 알루미늄이다. 또다른 구현예에서, 보조제는 Montanide이다.
본원에 개시된 구현예에서, 백신 조성물은 체크포인트 억제제를 추가로 포함한다. "체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor)"라는 용어는 당업자라면 하나 이상의 체크포인트 단백질을 전체적으로 또는 부분적으로 저해하거나 감소시키거나 그렇지 않으면 간섭하거나 조절하는 분자를 의미하는 것으로 이해할 것이다. 적합한 체크포인트 억제제의 예시적인 예는 항체 및 그의 항원-결합 단편(예를 들어, Fab 단편)을 포함한다. 적합한 체크포인트 단백질은 당업자에게 공지될 것이며, 이의 예시는 CTLA-4 및 그의 리간드 CD80 및 CD86; PD1 및 그의 리간드 PDL1 및 PDL2; OX40 및 그의 리간드 OX40L; LAG-3 및 그의 리간드 MHC 종류 I 또는 II; TIM-3 및 그의 리간드 GAL-9; 및 B- 및 T-림프구 감쇠제(BTLA) 및 그의 리간드 헤르페스 바이러스 유입 매개체(HVEM)를 포함한다.
약학적 조성물
본 명세서는 또한 본원에 기술된 바와 같은 백신 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 기술한다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체(예를 들어, 부형제, 희석제 등)는 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등과 같은 다양한 수성 (약학적으로 허용가능한) 담체가 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 통상의 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나 멸균-여과될 수 있다. 생성된 수용액은 사용하기 위해 포장되거나 동결 건조될 수 있으며, 동결 건조된 제제는 투여 전에 무균 용액과 조합된다. 상기 조성물은 많은 다른 것들 중에서, 생리적 조건을 근사화하는데 필요한 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예를 들어 pH-조정제 및 완충제, 긴장성 조정제(tonicity-adjusting agent), 습윤제 등, 예를 들어 아세트산 나트륨, 젖산 나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트, 수크로스 또는 다른 탄수화물을 포함한다. 비경구적으로 투여가능한 화합물을 제조하기 위한 적합한 방법은 당업자에게 공지되거나 명백할 것이며, 예를 들어 A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds 7.sup.th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3.sup.rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc에 보다 상세히 기술되어 있다.
약학적 조성물은 비경구 투여(예컨대, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사) 또는 비강 흡입 또는 경구 흡입과 같은 흡입에 의한 투여에 적합한 에어로졸 형태에 적합한 형태일 수 있다.
본원에 기술된 약학적 조성물은 또한 키트에 제공될 수 있다. 키트는 투여 장치(들), 부형제(들) 및/또는 희석제(들)과 같은 본원에 기술된 방법을 수행하는 것을 돕기 위한 추가 성분을 포함할 수 있다. 상기 키트는 다양한 성분을 수용하기 위한 용기 및 상기 방법에서 키트 성분을 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 구현예에서, 약학적 조성물은 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 체크포인트 억제제를 추가로 포함한다.
암 치료 또는 예방을 위한 용도 및 방법
또한, 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 Her2/neu의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 환자에게 본원에 기술된 유효량의 백신 조성물 또는 본원에 기술된 바와 같은 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시되어 있다.
본원은 또한 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 Her2/neu의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방을 위한 약제를 제조하는데 사용되는, 본원에 기술된 바와 같은 백신 조성물의 용도로 확장된다.
본원은 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 Her2/neu의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는, 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 백신 또는 본원에 기술된 바와 같은 약학적 조성물로 확장된다.
당업자는 Her2/neu 단백질의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 암의 유형을 잘 알고 있을 것이다. 그 예로는 유방암, 난소암, 자궁내막암, 위암, 췌장암, 전립선암 및 타액선암이 있다. 일 구현예에서, 상기 암은 유방암이다. 또 다른 구현예에서, 상기 암은 위암이다.
본원에 기술된 바와 같은 백신 또는 약학적 조성물은 전형적으로 "유효량"; 즉 치료 또는 예방 효과 중에서도 임의의 하나 이상을 유발하는 데 효과적인 양으로 투여된다. 당업자는 약학 조성물에 포함시키거나 원하는 결과를 위해 투여될 효과적인 무독성 양을 통상적인 실험에 의해 결정할 수 있을 것이다. 일반적으로, 본원에 개시된 바와 같은 백신 및/또는 약학적 조성물은 투여 경로 및 수혜자의 신체적 특징(건강 상태 포함)과 양립할 수 있는 방식으로, 및 원하는 효과(들)(즉, 치료적으로 효과적인, 면역원성 및/또는 보호성)를 유발하는 방법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물의 적당한 투여량은 대상자의 신체적 특징(예를 들어, 연령, 체중, 성별), 조성물이 단일 제제로서 또는 보조 치료법의 일부로 사용되는지 여부, 임의의 기저 암의 진행(즉, 병리학적 상태) 및 당업자에 의해 인식될 수 있는 다른 인자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 조성물의 적당한 투여량을 결정할 때 고려될 수 있는 일반적인 고려 사항의 다른 예시적인 예는 Gennaro (2000, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; and Gilman et al., (Eds), (1990), "Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics", Pergamon Press)에 논의되어 있다.
상기 양이 상기 개략된 고려 사항 중 일부를 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것으로 예상된다.
본원에 기술된 바와 같이, (담체 단백질에 접합된) 융합 펩티드의 유효량은 일반적으로 대상 당 융합 펩티드 약 5 ㎍ 내지 약 1.0 mg, 대상 당 융합 펩티드 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 또는 대상 당 융합 펩티드 약 15 ㎍ 내지 약 60 ㎍일 것이다. 유효량은 예를 들어, 항원-특이적 항체가의 측정을 포함하는 표준 방법에 의해 확인될 수 있다. 본원에 기술된 조성물에 의해 제공되는 면역 수준은 부스터에 대한 필요성을 판단하기 위해 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 대상에 조성물을 1차로 투여한 후 전형적으로 수일 또는 수주 후 혈청 내 항원-특이적 항체가를 평가한 후, 임의의 부스터 예방접종을 필요로 하거나 및/또는 원할 수 있다. 항원-특이적 항체가는 하기 실시예에 예시된 바와 같이, 다중투여량 사용함으로써 개선되기 쉽다.
본원에 기술된 바와 같은 백신 및/또는 약학적 조성물은 그것을 필요로 하는 대상에게 단독으로 또는 추가의 치료제(들)과 조합하여; 즉 보조제 요법의 일부로서 투여될 수 있다. 보조제 요법의 문맥에서, 투여는 동시 또는 순차적일 수 있으며; 즉, 백신 및/또는 약학적 조성물을 먼저 투여한 후 추가의 치료제 및/또는 예방제를 투여하거나, 또는 백신 및/또는 약학적 조성물을 투여한 후 추가의 치료제를 투여한다. 따라서, 둘 이상의 개체(entity)가 "접합되어" 있는 대상에 투여되는 경우, 이들은 동시에 단일 구성으로, 또는 동시에 다른 구성으로, 또는 별도의 조성으로 별도의 시간에 투여될 수 있다.
추가적인 치료제(들)은 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 체크포인트 억제제를 포함할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 기술된 바와 같이 유효량의 체크포인트 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
원하는 면역 반응을 유도하기 위해 필요한 경우 개별 투여량의 최적 양 및 간격은 본 명세서의 다른 부분에서 기술된 바와 같이, 예를 들어 투여의 형태, 경로 및 부위에 의해, 및 치료될 특정 대상의 성질에 의해 결정될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 최적 조건은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 경우, 본원에 기술된 바와 같이, 백신 및/또는 약학적 조성물의 수회 또는 다중 투여를 하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 투여될 수 있다. 투여 간격은 약 1일 간격 내지 약 12주 간격일 수 있고, 특정 구현예에서는 약 1 내지 4주 간격일 수 있다. 종양 크기의 감소 및/또는 전이의 발생 감소와 같은 바람직한 치료 결과를 얻기 위해서는 주기적인 재-투여가 필요할 수 있다. 또한, 통상적인 치료 과정 또는 효능 또는 면역 상태 측정 시험을 사용하여 최적의 투여 경로가 확인될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
본원에서 고려되는 면역 반응 또는 항원-특이적 항체 반응의 "유도"는 면역 반응을 유도하거나 자극하는 것 및/또는 환원과 같은 바람직한 생리학적 효과, 예컨대 종양의 크기 감소 및/또는 전이의 감소 발생 감소를 얻기 위해 기존의 면역 반응을 강화시키는 것을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 상기 효과는 암 발생을 완전히 또는 부분적으로 예방하고, 전이의 발생을 완전히 또는 부분적으로 예방하고, 및/또는 상기 암과 관련된 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여" 또는 "투여하는"은 전형적으로 환자의 면역 시스템이 융합 펩티드(들) 내의 다중 Her2/neu B 세포 에피토프에 대한 반응을 일으키도록 본원에 기술된 바와 같이 백신 및/또는 약학 조성물을 환자의 신체에 도입하는 단계를 지칭한다. 본원에서 사용된 "필요로 하는 환자"는 암으로 진단받은 환자를 포함하며, 암 세포는 Her2/neu 단백질을 발현 또는 과발현한다. 또한 임의의 증상이 나타나지 않았지만, 예를 들어 암의 가족력이 있고 따라서 암 발생의 유전적 소인이 의심되는 사람과 같이 아직 암으로 진단되지 않은 사람도 포함된다. 따라서, 가장 넓은 의미에서 "필요로 하는 환자"라는 용어는 이미 현재 필요있는 개인뿐만 아니라 Her2/neu 관련 암 발생 위험이 있는 개인을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 암을 "예방하는" 약제는 이상적으로는 0에 이르기까지 개인의 암 발병 위험을 감소시킬 것이다. 또한,이 용어는 또한 예를 들어, 1차 종양 수술 후 암의 재발을 예방하는 것을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 암을 "치료하는" 약제는 이상적으로는 근본적인 원인을 제거함으로써 질병을 완전히 제거할 것이므로, 조성물의 투여를 중단하면 질병이 재발하지 않고 차도 상태로 남을 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 암을 "경감"시키는 약제는 질병의 근본적인 원인을 제거하지는 않지만, 임의의 확립된 등급 시스템에 의해 측정된 바와 같이, 및/또는 환자의 복지 개선, 예를 들어 통증 및/또는 불편함 감소에 의해 측정된 바와 같이, 질병의 중증도를 감소시킨다.
"유효량"은 확립된 투약 요법에 따른 단독 투여 또는 추가 투여와 함께, 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이 원하는 예방, 치료 또는 경감에 영향을 주는 약학적 제제의 양이다.
투여 경로 및 처방은 치료될 질환의 단계 또는 중증도에 따라 달라질 수 있으며, 숙련된 당업자에 의해 결정되어야한다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 백신 또는 약학적 조성물은 피하, 피부내, 림프관내 또는 국소 또는 점막(비강), 또는 근육내 형태로 투여될 수 있다. 이들 형태는 모두 약학 분야의 당업자에게 잘 알려져있다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 당업자에게 알려져 있는, 근육내, 피하, 림프관내 또는 비강내 경로로 투여될 수 있다.
본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 본원에 기술된 조성물을 사용하는 투여 요법은 예를 들어 환자의 연령, 체중 및 의학적 상태, 치료될 질환의 단계 및 중증도, 및 투여하고자 하는 특정 융합 펩티드를 포함하여, 다양한 요소들에 따라 선택된다. 통상의 기술을 갖는 의사는 악성 종양의 진행 또는 중증도를 예방, 치료 또는 경감시키는데 필요한, 예를 들어 담체 단백질(이에 결합된 융합 펩티드를 포함함)의 유효량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 투여 요법은 또한 투여될 보조제의 양을 고려할 것이며, 이는 대상에게 투여될 담체 단백질/융합 펩티드(들)의 양을 좌우할 요소, 예컨대 환자의 연령, 체중 및 의학적 상태와 같은 요소의 적어도 일부에 따라 변할 것으로 예상된다. 독성없이, 또는 수용가능한 독성에 지나지 않는 조건하에 효능을 내는 범위(즉, 유효량)의 담체 단백질/융합 펩티드(들) 및/또는 보조제의 농도를 달성하는데 있어서 최적의 정밀도는 표적 부위(들)에 대한 담체 단백질/융합 펩티드 및/또는 보조제의 이용 가능성의 동영학(kinetic)에 적어도 부분적으로, 기반을 둔 요법을 필요로 한다. 이 공정은 전형적으로 당업자의 능력 내에있는 담체 단백질/융합 펩티드(들) 및/또는 보조제의 분포, 평형 및 제거를 고려할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
당업자는 본원에 기술된 본 발명이 구체적으로 기술된 것 이외의 변형 및 수정되기 쉬움을 이해할 것이다. 본 발명은 정신 및 범위 내에 속하는 상기 모든 변형 및 수정을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 개별적으로 또는 집합적으로 언급되거나 지시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특징 중 임의의 둘 이상의 모든 조합을 포함한다.
도 1은 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)로 4차 예방접종한 후 수득한 혈청 샘플에서의 항-P4 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 2는 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)로 4차 예방접종한 후 수득한 혈청 샘플에서의 항-P6 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 3은 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)로 4차 예방접종한 후 수득한 혈청 샘플에서의 항-P7 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 4는 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)로 4차 예방접종한 후 수득한 혈청 샘플에서의 항-P467 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 5는 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)로 4차 예방접종한 후 수득한 혈청 샘플에서의 항-P647 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 6은 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)로 2차(BA1; 1차 혈액 추출), 3차(BA2; 2차 혈액 추출) 및 4차(BA3; 3차 혈액 추출) 예방접종한 후 2주 후에 수득된 혈청 샘플내 항-P467 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 7은 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)로 2차(BA1; 1차 혈액 추출), 3차(BA2; 2차 혈액 추출) 및 4차(BA3; 3차 혈액 추출) 예방접종한 후 2주 후에 수득된 혈청 샘플내 항-P647 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 8은 P467 또는 P647 융합 펩티드(15, 30, 40 및 50 μg)를 혼입한 비로좀 제형 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM; 30 μg)로 2차(BA1; 1차 혈액 추출) 및 3차(BA2; 2차 혈액 추출) 예방접종한 후 2주후에 수득된 혈청 샘플로부터의 항체가 Her2/neu의 재조합 ECD에 결합할 수 있음을 보여준다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 9는 P467 또는 P647 융합 펩티드(15, 30, 50 μg)를 혼입한 비로좀 제형 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM; 30 μg)로 2차(BA1; 1차 혈액 추출) 예방접종한 후 2주 후에 수득된 혈청 샘플로부터의 재조합 Her2/neu 특이적 항체를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 10은 P467 또는 P647 융합 펩티드(15, 30, 50 μg)를 혼입한 비로좀 제형 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM; 30 μg)로 4차(BA3; 3차 혈액 추출) 예방접종한 후 2주 후에 수득된 혈청 샘플로부터의 재조합 Her2/neu 특이적 항체를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 11은 P467 또는 P647 융합 펩티드를 포함하는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM; 30㎍)에 의한 2차, 3차 및 4차 예방접종 후 재조합 Her2/neu 특이적 항체가의 동역학을 나타낸다. 혈청을 1:4,000으로 희석하여 분석하였다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 12는 30 μg의 농도로 비로좀 또는 CRM197에 접합된 P467 융합 펩티드에 의한 2차, 3차 및 4차 예방접종 후 항체가를 직접 비교한 것을 나타낸다. 각 그룹에서 왼쪽에서 오른쪽으로: 예비 풀(Pre Pool)(예방접종 전에 추출한 혈액); TIRIV(비어있는 비로좀); P467-30mg/마우스(비로좀 접합체); P467-30mg/마우스-CRM(CRM197 접합체). 모든 혈청을 동일한 희석액에서 분석하였다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 13은 30 μg의 농도로 비로좀 또는 CRM197에 접합된 P647 융합 펩티드에 의한 2차, 3차 및 4차 예방접종 후 항체가를 직접 비교한 것을 나타낸다. 각 그룹에서 왼쪽에서 오른쪽으로 : 예비 풀(예방접종 전에 추출한 혈액); TIRIV(비어있는 비로좀); P647-30mg/마우스(비로좀 접합체); P647-30mg/마우스-CRM(CRM197 접합체). 모든 혈청을 동일한 희석액에서 분석하였다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 14는 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)에 의한 예방접종이 SKBR-3 유방암 세포의 표면 상에 발현된 천연 Her2/neu에 결합할 수 있는 항체를 유도함을 보여준다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 15a는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질을, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반(Alum)과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide), 3회 투여된 마우스에서 항-P467 IgG 항체가를 나타낸다. 항체가는 P467 펩티드 단독으로(P467; 25μg), Brenntag제 명반과 함께(명반(Brenntag)), 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여된 대조군 동물에서 관찰된 수준과 비교되었다. 데이터는 OD 값으로 표시된다; *p <0.05, **p <0.01 및 ***p <0.001.
도 15b는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질을, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide), 3회 투여된 마우스에서 항-P467 IgG1 항체가를 나타낸다. 항체가는 P467 펩티드 단독으로 투여된 대조군 동물에서 관찰된 수준과 비교되었다. 데이터는 OD 값으로 표시된다; *p <0.05, **p <0.01 및 ***p <0.001.
도 15c는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질을, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide), 3회 투여된 마우스에서 항-P467 IgG2a 항체가를 나타낸다. 항체가는 P467 펩티드 단독(P467; 25μg), Brenntag제 명반(명반(Brenntag))과 함께, 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여된 대조군 동물에서 관찰된 수준과 비교되었다. 데이터는 OD 값으로 표시된다; *p <0.05, **p <0.01 및 ***p <0.001.
도 16a는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질을, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide), 3회 투여된 마우스에서 항-세포외 Her2/neu IgG 항체가를 나타낸다. 항체가는 P467 펩티드 단독으로(P467; 25μg), Brenntag제 명반(명반(Brenntag))과 함께, 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여된 대조군 동물에서 관찰된 수준과 비교되었다. 데이터는 OD 값으로 표시된다; *p <0.05, **p <0.01 및 ***p <0.001.
도 16b는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질을, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide), 3회 투여된 마우스에서 항-세포외 Her2/neu IgG1 항체가를 나타낸다. 항체가는 P467 펩티드 단독으로(P467; 25μg), Brenntag제 명반(명반(Brenntag))과 함께, 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여된 대조군 동물에서 관찰된 수준과 비교되었다. 데이터는 OD 값으로 표시된다; *p <0.05, **p <0.01 및 ***p <0.001.
도 17a는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 유래된 CRM197-활성화된 비장세포에 의한 IL-2 생성을 나타낸다. IL-12 수준(pg/ml)은 명반 단독으로(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 유래된 CRM197-활성화된 비장세포에서 관찰된 IL-2 수준과 비교하였다. 데이터는 pg/ml로 표시된다; **p <0.01 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 17b는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 유래된 P467-활성화된 비장세포에 의한 IL-2 생성을 나타낸다. IL-12 수준(pg/ml)은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 유래된 P467-활성화된 비장세포에서 관찰된 IL-2 수준과 비교하였다. 데이터는 pg/ml로 표시된다; *p <0.05, **p <0.01 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 18a는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 유래된 CRM197-활성화된 비장세포에 의한 IFNγ 생성을 나타낸다. IFNγ 수준(pg/ml)은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 유래된 CRM197-활성화된 비장세포에서 관찰된 IFNγ 수준과 비교하였다. 데이터는 pg/ml로 표시된다; *p <0.05 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 18b는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 유래된 P467-활성화된 비장세포에 의한 IFNγ 생성을 나타낸다. IFNγ 수준(pg/ml)은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 유래된 P467-활성화된 비장세포에서 관찰된 IFNγ 수준과 비교하였다. 데이터는 pg/ml로 표시된다; ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 19a는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 유래된 CRM197-활성화된 비장세포에 의한 IL-5 생성을 나타낸다. IL-5 수준(pg/ml)은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 유래된 CRM197-활성화된 비장세포에서 관찰된 IL-5 수준과 비교하였다. 데이터는 pg/ml로 표시된다; *p <0.05, **p <0.01 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 19b는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 유래된 P467-활성화된 비장세포에 의한 IL-5 생성을 나타낸다. IL-5 수준(pg/ml)은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 유래된 P467-활성화된 비장세포에서 관찰된 IL-5 수준과 비교하였다. 데이터는 pg/ml로 표시된다; ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 20a는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 희생시 CD3+CD4+ 비장세포(T 림프구)의 분포를 나타낸다. CD3+CD4+ 비장세포의 백분율은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 관찰된 CD3+CD4+ 비장세포의 백분율과 비교하였다. 데이터는 총 세포 수의 백분율로 표시된다; ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 20b는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 희생시 CD3+CD8+ 비장세포(T 림프구)의 분포를 나타낸다. CD3+CD8+ 비장세포의 백분율은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 관찰된 CD3+CD8+ 비장세포의 백분율과 비교하였다. 데이터는 총 세포 수의 백분율로 표시된다; ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 20c는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 희생시 CD3-CD19+ 비장세포(B 세포)의 분포를 나타낸다. CD3-CD19+ 비장세포의 백분율은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 관찰된 CD3-CD19+ 비장세포의 백분율과 비교하였다. 데이터는 총 세포 수의 백분율로 표시된다; ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 20d는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 희생시 CD335+ 비장세포(자연살해(NK)세포)의 분포를 나타낸다. CD335+ 비장세포의 백분율은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 관찰된 CD335+ 비장세포의 백분율과 비교하였다. 데이터는 총 세포 수의 백분율로 표시된다; *p <0.05 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 21a는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 희생시 CD3+CD4+IFNγ+ 비장세포(IFNγ-생성 T 세포)의 분포를 나타낸다. CD3+CD4+IFNγ+ 비장세포의 백분율은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 관찰된 CD3+CD4+IFNγ+ 비장세포의 백분율과 비교하였다. 데이터는 총 세포 수의 백분율로 표시된다; ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 21b는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 희생시 CD3+CD8+IFNγ+ 비장세포(IFNγ-생성 T 세포)의 분포를 나타낸다. CD3+CD8+IFNγ+ 비장세포의 백분율은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 관찰된 CD3+CD8+IFNγ+ 비장세포의 백분율과 비교하였다. 데이터는 총 세포 수의 백분율로 표시된다; *p <0.05 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 21c는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 희생시 CD335+IFNγ+ 비장세포(IFNγ-생성 T 세포)의 분포를 나타낸다. CD335+IFNγ+ 비장세포의 백분율은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 관찰된 CD335+IFNγ+ 비장세포의 백분율과 비교하였다. 데이터는 총 세포 수의 백분율로 표시된다; *p <0.05 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 22는 명반(P467-CRM+명반) 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍로 투여된 P467-CRM 펩티드 구조물의 최종 투여 후 3주(BA2), 8주(BA3), 16주(BA4) 및 6개월(BA5)에 P467 펩티드-특이적 IgG 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다. 각 클러스터의 왼쪽에서 오른쪽으로: BA2, BA3, BA4, BA5 및 채혈전.
도 23은 명반(P467-CRM+명반) 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍로 투여된 P467-CRM 펩티드 구조물의 최종 투여 후 3주(BA2), 8주(BA3), 16주(BA4) 및 6개월(BA5)에 Her2/neu-특이적 IgG 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다. 각 클러스터의 왼쪽에서 오른쪽으로: BA2, BA3, BA4, BA5 및 채혈전.
도 2는 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)로 4차 예방접종한 후 수득한 혈청 샘플에서의 항-P6 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 3은 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)로 4차 예방접종한 후 수득한 혈청 샘플에서의 항-P7 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 4는 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)로 4차 예방접종한 후 수득한 혈청 샘플에서의 항-P467 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 5는 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)로 4차 예방접종한 후 수득한 혈청 샘플에서의 항-P647 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 6은 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)로 2차(BA1; 1차 혈액 추출), 3차(BA2; 2차 혈액 추출) 및 4차(BA3; 3차 혈액 추출) 예방접종한 후 2주 후에 수득된 혈청 샘플내 항-P467 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 7은 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)로 2차(BA1; 1차 혈액 추출), 3차(BA2; 2차 혈액 추출) 및 4차(BA3; 3차 혈액 추출) 예방접종한 후 2주 후에 수득된 혈청 샘플내 항-P647 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 8은 P467 또는 P647 융합 펩티드(15, 30, 40 및 50 μg)를 혼입한 비로좀 제형 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM; 30 μg)로 2차(BA1; 1차 혈액 추출) 및 3차(BA2; 2차 혈액 추출) 예방접종한 후 2주후에 수득된 혈청 샘플로부터의 항체가 Her2/neu의 재조합 ECD에 결합할 수 있음을 보여준다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 9는 P467 또는 P647 융합 펩티드(15, 30, 50 μg)를 혼입한 비로좀 제형 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM; 30 μg)로 2차(BA1; 1차 혈액 추출) 예방접종한 후 2주 후에 수득된 혈청 샘플로부터의 재조합 Her2/neu 특이적 항체를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 10은 P467 또는 P647 융합 펩티드(15, 30, 50 μg)를 혼입한 비로좀 제형 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM; 30 μg)로 4차(BA3; 3차 혈액 추출) 예방접종한 후 2주 후에 수득된 혈청 샘플로부터의 재조합 Her2/neu 특이적 항체를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 11은 P467 또는 P647 융합 펩티드를 포함하는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM; 30㎍)에 의한 2차, 3차 및 4차 예방접종 후 재조합 Her2/neu 특이적 항체가의 동역학을 나타낸다. 혈청을 1:4,000으로 희석하여 분석하였다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 12는 30 μg의 농도로 비로좀 또는 CRM197에 접합된 P467 융합 펩티드에 의한 2차, 3차 및 4차 예방접종 후 항체가를 직접 비교한 것을 나타낸다. 각 그룹에서 왼쪽에서 오른쪽으로: 예비 풀(Pre Pool)(예방접종 전에 추출한 혈액); TIRIV(비어있는 비로좀); P467-30mg/마우스(비로좀 접합체); P467-30mg/마우스-CRM(CRM197 접합체). 모든 혈청을 동일한 희석액에서 분석하였다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 13은 30 μg의 농도로 비로좀 또는 CRM197에 접합된 P647 융합 펩티드에 의한 2차, 3차 및 4차 예방접종 후 항체가를 직접 비교한 것을 나타낸다. 각 그룹에서 왼쪽에서 오른쪽으로 : 예비 풀(예방접종 전에 추출한 혈액); TIRIV(비어있는 비로좀); P647-30mg/마우스(비로좀 접합체); P647-30mg/마우스-CRM(CRM197 접합체). 모든 혈청을 동일한 희석액에서 분석하였다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 14는 P467 또는 P647 융합 펩티드를 혼입한 비로좀 또는 CRM197-융합 단백질 접합체(CRM)에 의한 예방접종이 SKBR-3 유방암 세포의 표면 상에 발현된 천연 Her2/neu에 결합할 수 있는 항체를 유도함을 보여준다. 데이터는 OD 값으로 표시된다.
도 15a는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질을, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반(Alum)과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide), 3회 투여된 마우스에서 항-P467 IgG 항체가를 나타낸다. 항체가는 P467 펩티드 단독으로(P467; 25μg), Brenntag제 명반과 함께(명반(Brenntag)), 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여된 대조군 동물에서 관찰된 수준과 비교되었다. 데이터는 OD 값으로 표시된다; *p <0.05, **p <0.01 및 ***p <0.001.
도 15b는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질을, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide), 3회 투여된 마우스에서 항-P467 IgG1 항체가를 나타낸다. 항체가는 P467 펩티드 단독으로 투여된 대조군 동물에서 관찰된 수준과 비교되었다. 데이터는 OD 값으로 표시된다; *p <0.05, **p <0.01 및 ***p <0.001.
도 15c는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질을, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide), 3회 투여된 마우스에서 항-P467 IgG2a 항체가를 나타낸다. 항체가는 P467 펩티드 단독(P467; 25μg), Brenntag제 명반(명반(Brenntag))과 함께, 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여된 대조군 동물에서 관찰된 수준과 비교되었다. 데이터는 OD 값으로 표시된다; *p <0.05, **p <0.01 및 ***p <0.001.
도 16a는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질을, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide), 3회 투여된 마우스에서 항-세포외 Her2/neu IgG 항체가를 나타낸다. 항체가는 P467 펩티드 단독으로(P467; 25μg), Brenntag제 명반(명반(Brenntag))과 함께, 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여된 대조군 동물에서 관찰된 수준과 비교되었다. 데이터는 OD 값으로 표시된다; *p <0.05, **p <0.01 및 ***p <0.001.
도 16b는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질을, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide), 3회 투여된 마우스에서 항-세포외 Her2/neu IgG1 항체가를 나타낸다. 항체가는 P467 펩티드 단독으로(P467; 25μg), Brenntag제 명반(명반(Brenntag))과 함께, 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여된 대조군 동물에서 관찰된 수준과 비교되었다. 데이터는 OD 값으로 표시된다; *p <0.05, **p <0.01 및 ***p <0.001.
도 17a는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 유래된 CRM197-활성화된 비장세포에 의한 IL-2 생성을 나타낸다. IL-12 수준(pg/ml)은 명반 단독으로(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 유래된 CRM197-활성화된 비장세포에서 관찰된 IL-2 수준과 비교하였다. 데이터는 pg/ml로 표시된다; **p <0.01 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 17b는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 유래된 P467-활성화된 비장세포에 의한 IL-2 생성을 나타낸다. IL-12 수준(pg/ml)은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 유래된 P467-활성화된 비장세포에서 관찰된 IL-2 수준과 비교하였다. 데이터는 pg/ml로 표시된다; *p <0.05, **p <0.01 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 18a는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 유래된 CRM197-활성화된 비장세포에 의한 IFNγ 생성을 나타낸다. IFNγ 수준(pg/ml)은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 유래된 CRM197-활성화된 비장세포에서 관찰된 IFNγ 수준과 비교하였다. 데이터는 pg/ml로 표시된다; *p <0.05 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 18b는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 유래된 P467-활성화된 비장세포에 의한 IFNγ 생성을 나타낸다. IFNγ 수준(pg/ml)은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 유래된 P467-활성화된 비장세포에서 관찰된 IFNγ 수준과 비교하였다. 데이터는 pg/ml로 표시된다; ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 19a는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 유래된 CRM197-활성화된 비장세포에 의한 IL-5 생성을 나타낸다. IL-5 수준(pg/ml)은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 유래된 CRM197-활성화된 비장세포에서 관찰된 IL-5 수준과 비교하였다. 데이터는 pg/ml로 표시된다; *p <0.05, **p <0.01 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 19b는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, 단독으로(P467-CRM), Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 유래된 P467-활성화된 비장세포에 의한 IL-5 생성을 나타낸다. IL-5 수준(pg/ml)은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 유래된 P467-활성화된 비장세포에서 관찰된 IL-5 수준과 비교하였다. 데이터는 pg/ml로 표시된다; ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 20a는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 희생시 CD3+CD4+ 비장세포(T 림프구)의 분포를 나타낸다. CD3+CD4+ 비장세포의 백분율은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 관찰된 CD3+CD4+ 비장세포의 백분율과 비교하였다. 데이터는 총 세포 수의 백분율로 표시된다; ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 20b는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 희생시 CD3+CD8+ 비장세포(T 림프구)의 분포를 나타낸다. CD3+CD8+ 비장세포의 백분율은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 관찰된 CD3+CD8+ 비장세포의 백분율과 비교하였다. 데이터는 총 세포 수의 백분율로 표시된다; ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 20c는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 희생시 CD3-CD19+ 비장세포(B 세포)의 분포를 나타낸다. CD3-CD19+ 비장세포의 백분율은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 관찰된 CD3-CD19+ 비장세포의 백분율과 비교하였다. 데이터는 총 세포 수의 백분율로 표시된다; ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 20d는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 희생시 CD335+ 비장세포(자연살해(NK)세포)의 분포를 나타낸다. CD335+ 비장세포의 백분율은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 관찰된 CD335+ 비장세포의 백분율과 비교하였다. 데이터는 총 세포 수의 백분율로 표시된다; *p <0.05 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 21a는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 희생시 CD3+CD4+IFNγ+ 비장세포(IFNγ-생성 T 세포)의 분포를 나타낸다. CD3+CD4+IFNγ+ 비장세포의 백분율은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 관찰된 CD3+CD4+IFNγ+ 비장세포의 백분율과 비교하였다. 데이터는 총 세포 수의 백분율로 표시된다; ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 21b는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 희생시 CD3+CD8+IFNγ+ 비장세포(IFNγ-생성 T 세포)의 분포를 나타낸다. CD3+CD8+IFNγ+ 비장세포의 백분율은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 관찰된 CD3+CD8+IFNγ+ 비장세포의 백분율과 비교하였다. 데이터는 총 세포 수의 백분율로 표시된다; *p <0.05 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 21c는 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍의 P467-CRM197 융합 단백질로, Brenntag제 명반과 함께(P467-CRM+명반), Serva제 명반과 함께(P467-CRM+명반(Serva)), 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 투여되어 예방접종한 마우스에서 희생시 CD335+IFNγ+ 비장세포(IFNγ-생성 T 세포)의 분포를 나타낸다. CD335+IFNγ+ 비장세포의 백분율은 명반 단독(명반(Brenntag)), Montanide 단독(Montanide) 또는 CRM197 단독(CRM)으로 투여한 대조군 동물에서 관찰된 CD335+IFNγ+ 비장세포의 백분율과 비교하였다. 데이터는 총 세포 수의 백분율로 표시된다; *p <0.05 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음.
도 22는 명반(P467-CRM+명반) 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍로 투여된 P467-CRM 펩티드 구조물의 최종 투여 후 3주(BA2), 8주(BA3), 16주(BA4) 및 6개월(BA5)에 P467 펩티드-특이적 IgG 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다. 각 클러스터의 왼쪽에서 오른쪽으로: BA2, BA3, BA4, BA5 및 채혈전.
도 23은 명반(P467-CRM+명반) 또는 Montanide와 함께(P467-CRM+Montanide) 10 ㎍, 25 ㎍ 및 50 ㎍로 투여된 P467-CRM 펩티드 구조물의 최종 투여 후 3주(BA2), 8주(BA3), 16주(BA4) 및 6개월(BA5)에 Her2/neu-특이적 IgG 항체가를 나타낸다. 데이터는 OD 값으로 표시된다. 각 클러스터의 왼쪽에서 오른쪽으로: BA2, BA3, BA4, BA5 및 채혈전.
본 발명의 특정 구현예는 단지 설명의 목적을 위한 이하의 실시예를 참조하여 기술될 것이며, 본원에서 설명된 일반성의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
하기 실시예는 재조합 해독된 디프테리아 독소인 CRM197에 대한 2개의 융합 펩티드(Her2/neu로부터 유래된 인접하지않은 B 세포 에피토프)의 접합에 관한 것이다. SDS-PAGE 및 면역블롯팅에 의한 융합 펩티드-담체 단백질 접합체의 초기 분석을 수행하였다. 마지막으로, 융합 펩티드-담체 단백질 접합체는 동물에 대한 초기 면역원성 연구를 위해 오스트리아로 운송되었다.
실시예
1 - 재조합 해독된 디프테리아 독소 변이체인 CRM-197에 대한 Her2/neu 펩티드 항원의 접합
비로좀-기반 유방암 백신인 PEV6A/B는 제1상 임상시험에서 성공적으로 시험되었다(Wiedermann et al., Breast Cancer Res Treat. 2010). 그러나, 이 백신 제형은 안정성과 구성 요소의 적합성 면에서 실질적인 기술적 한계를 나타냈으며, 이는 두 번의 별도 주사가 불가피하다는 사실에 가장 잘 설명되었다.
PEV6C 접근법은 PEV6A/B의 기술적 한계를 극복한다. PEV6C는 단일 펩티드 사슬(또한, WO 2011/020604A1 참조; her2/neu-관련 암에 대한 다중-에피토프 백신 참조)에서 3가지 모든 항원(P6, P7 및 P4; 각각 서열번호 1-3)을 조합하고, 안정한, 동결건조가능한 단일 투여적용 형태로 제형화할 수 있다.
제조 및 결과
하기 융합 단백질을 담체 단백질 CRM-197에 접합시키는데 사용하였다:
접합 반응은 가교제 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(Sulfo-SMCC)를 사용하여 pH 7.4의 PBS 완충액에서 수행되었다. 이 시약은 티올기(즉, 시스테인 잔기)과 반응하기 전에 CRM-197 담체 단백질상의 1차 아민(즉, 리신 잔기)과 먼저 반응한다. CRM-197에서, 39개의 리신 잔기는 가교제와의 반응에 이론적으로 이용가능했다. 담체 단백질상의 펩티드 항원의 양호한 분포에 도달하기 위해, 융합 펩티드:담체 단백질 비율을 조절하여 CRM197 분자 당 20개의 융합 펩티드 분자의 평균 접합을 달성하였다. 반응을 실온(RT)에서 45분 동안 다음과 같이 진행시켰다:
[표 3]
재료
과정
1.-20℃에서 융합 펩티드를 제거하고, 실온(RT)에서 약 10분 동안 기다린 후, 바이알을 개봉한다.
2. 융합 펩티드를 3 mL 유리 바이알에 넣어 무게를 잰다:
(a) P467, 7.8 mg, 주사용수(WFI) 780 μL로 재현탁함;
(b) P467, 7.1 mg, 디메틸설폭시드(DMSO) 710 μL로 재현탁함;
(c) P647, 6.9 mg, WFI 690 μL로 재현탁함;
(d) P647, 9.0mg, DMSO 900μL로 재현탁함;
모든 용액은 쉽게 재현탁되었으며, 응집체 또는 탁도는 보이지 않았다.
3. Milli Q 물로 20x 인산완충 식염수(PBS) 내지 1x PBS 희석하고, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)를 1 mM의 최종 농도로 첨가한다.
4. WFI 0.5 mL에 의해 CRM197 6개의 바이알을 2 mg/mL으로 재구성한다. 3개의 바이알을 풀링하여, 2개의 배치를 만들고, 4℃에 보관한다(배치 당 1.5 mL, 각 3 mg).
5. 설포-SMCC(2 mg) 1개의 바이알을 취해 거기에 200 μL PBS/1 mM ETDA를 넣고, 용해시킨다(10 mg/mL 스톡 용액; 용액이 탁하게 남아 있음).
6. 3 mg CRM197의 각 바이알에 설포-SMCC(10 mg/mL) 75 μL를 첨가한다. 총 부피: 1.575 mL.
7. 저속 혼합(회전, 25 rpm)하에 실온에서 45분 동안 바이알을 배양한다. 그 시간동안, x2 Zeba 스핀 탈염 컬럼(Spin Desalting Columns)을 PBS/EDTA 완충액으로 평형시킨다.
8. 배양 단계 7 후, 평형화된 Zeba 스핀 컬럼(1.5 mL)으로 반응물을 옮기고, 200 μL의 PBS/EDTA를 첨가한 다음 1000 x g에서 4분간 원심분리한다.
9. 각 용액 1.8mL를 회수하였다.
10. 다음과 같이 신선한 3 mL 바이알에 첨가한다:
(a) 바이알 1 : 600 μL P467(10 mg/mL WFI); 및
(b) 바이알 2 : 600 μL P647(10 mg/mL WFI).
11. 각 바이알에 50μL의 20x PBS를 첨가하여, 용액의 pH를 약 7로 올린다.
12. 각 바이알에 1.8 mL의 탈염된 CRM197-SMCC를 첨가한다.
13. 느린 혼합(회전)하에 실온에서 45분동안 바이알을 배양한 후, 분석할 때까지 바이알을 4℃에 저장한다. 배양 동안, 바이알 2에서 침전물이 눈에 띄게 나타났다. 그러나, 용액을 가온한 후 침전물은 사라졌다.
개요
펩티드 P467-CRM197, ca. 2.449 mg/mL P467, ca. 1.22 mg/mL CRM197, ca. 2450 μL; 1xPBS/1mM EDTA, 롯트 140829-1_am.
펩티드 P647-CRM197, ca. 2.449 mg/mL P647, ca. 1.22 mg/mL CRM197, ca. 2450 μL; 1xPBS/1mM EDTA, 롯트 140829-2_am.
반응이 진행되는 동안 P647-CRM197 펩티드 접합체가 응집되는 경향을 보이는 것이 관찰되었다. P467-CRM197 펩티드 접합체에 의하면, 눈으로 볼 수 있는 응집체는 없다.
실시예
2 - 마우스 항혈청 E를 사용한
CRM197
-항원 접합체의
쿠마시
블루
염색 및 면역블롯
접합체 배합물을 SDS-PAGE로 분석하고, 겔의 쿠마시 블루 염색, 및 파상풍 톡소이드에 접합된 펩티드 항원 P4, P6 및 P7의 조합에 대해 이전에 생성된 마우스 혈청(항혈청 E)을 사용하는 면역 블롯팅으로 평가하였다.
[표 4]
재료
과정
2개의 SDS-PA 겔을 다음과 같이 제조하였다:
ㆍ CRM197(2 mg/mL) 스톡 용액을 PBS pH 7.4에서 1:10 희석하였다.
ㆍ 항-접합체 용액을 PBS pH 7.4에서 1:10 희석하였다.
ㆍ 접합되지않은 융합 펩티드를 10 mg/mL의 저장 용액으로 제조하고, PBS pH 7.4에서 1:20 희석하였다.
총 36μL의 모든 샘플을 제조하고, 레인 당 15μL를 로딩하였다. 2개의 동일한 겔을 제조하였다: 겔 1을 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 염색하고, 겔 2를 웨스턴 블롯용으로 사용하였다. 겔 1 및 겔 2에서의 샘플 분포는 하기 표 5에 요약되어있다:
[표 5]
결과
겔 1 - 쿠마시 블루 염색
겔 1을 진탕하에, Bio-Safe 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색에 1시간동안 실온에서 함침시킨 후, 실온에서 1시간 동안 MilliQ 물로 세정하였다.
겔 2 - 웨스턴 블롯
전기영동 후, 겔 2를 카세트로부터 제거하고, Milli Q 물로 바로 세정하였다. 그후, 제조사의 지시(BioRad)에 따라 전달 샌드위치를 제조하고, 터보 트랜스퍼 블롯(Turbo Transfer Blot) 기계에 설치하였다. 전달 후, 예비염색된 마커 단백질의 완전한 존재를 위해 니트로셀룰로스 막을 조절하였다. 최소량의 마커만 SDS PA 겔에 남아 볼 수 있었다. 그런 다음, 막을 실온에서 SuperBlock 뷔페에서 1시간동안 배양했다. 마우스 혈청 풀 E를 SuperBlock에서 1:500으로 희석하고, 실온에서 2시간동안 막 상에서 배양하였다. 그후, 막을 1x PBS로 각각 5분동안 3회 세척하였다. 그후, 막을 항-마우스 IgG(KPL, 074-1802; Ab20)와 함께 배양하고, 실온에서 1시간동안 SuperBlock에서 1:5000으로 희석하였다. 그런 다음, 막을 각각 5분 동안 1x PBS로 3회 세척하고, 실온에서 5분 동안 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)으로 전개시켰다.
결과는 더 큰 분자량을 향한 각 CRM197 접합체에 대한 분자량의 명확한 변화(shift)를 나타냈으며, 이는 융합 펩티드의 CRM197에 대한 강한 접합을 나타낸다. 두 경우 모두에서 관찰된 넓은 접합체 밴드는 또한 접합 반응으로부터 기대되는 바와 같이 담체 단백질 상에서 비교적 큰 분포의 융합 펩티드를 제시하였다. 결과는 또한 접합되지않은 CRM197 단백질이 남아있지 않거나 (또는 최소한으로) 남아 있음을 시사했다. 반면에, 소량의 융합 펩티드가 관찰되었으며, 사용된 총 융합 펩티드의 10% 미만인 것으로 추정된다.
결론
CRM197 접합체에서의 명확한 변화(shift)가 관찰되었으며, 이것은 P467 및 P647 융합 펩티드가 CRM197 담체 단백질에 성공적으로 접합되었음을 나타낸다.
P467-CRM197 및 P647-CRM197 접합체간에 유의미한 차이는 관찰되지 않았다.
제한된 양의 유리 융합 펩티드가 두 접합 반응 모두에서 관찰되었다.
사용된 항혈청에 의한 면역 블롯은 파상풍 톡소이드 펩티드 접합체에 의해 상승되었음에도 불구하고, CRM197 디프테리아 독소와의 일부 교차 반응성을 나타내었다. 그것은 접합 후 CRM197 분자의 변화를 확인하지만, 이것은 두 융합 펩티드에 특이적이지 않으므로 단백질에 대한 그것의 접합은 확인될 수 없었다. 항혈청은 P467이 P647보다 약간 양호한, 접합되지않은 유리 융합 펩티드를 염색시킨다.
실시예 3 - 마우스 항혈청 D를 사용한 CRM197-항원 접합체의 면역 블롯
접합체 제제를 SDS-PAGE로 분석하고, 인플루엔자 비로좀에 접합된 펩티드 항원 P4, P6 및 P7의 조합에 대해 이전에 생성된 마우스 혈청(항혈청 D)을 사용하는 면역 블롯팅으로 평가하였다. CRM197 담체 단백질상의 융합 펩티드 P467 및 P647의 존재는 항혈청 D를 사용한 면역블롯에 의해 별도로 확인되었다.
[표 6]
재료
과정
하나의 SDS-PA 겔을 하기와 같이 제조하였다:
CRM197, 융합 펩티드-CRM197 접합체 또는 접합되지않은 융합 펩티드를 포함하는 모든 용액을 PBS 내에 pH 7.4에서 1 mg/mL로 희석시켰다. 총 36μL의 모든 샘플을 제조하였으며, 레인 당 15μL를 로딩하였다. 겔 1 및 겔 2에서의 샘플 분포는 하기 표 7에 요약되어있다:
[표 7]
결과
웨스턴 블롯 - 전기영동 후, 카세트로부터 겔을 제거하고, Milli Q 물에서 바로 세정하였다. 제조업체의 지침(BioRad)에 따라 트랜스퍼 샌드위치를 제조하고, 터보 트랜스퍼 블롯 기계(Turbo Transfer Blot machine)에 설치했다. 트랜스퍼 후, 니트로셀룰로스 막은 예비염색된 마커 단백질의 완전한 존재에 대해 제어되었다. 최소량의 마커만 SDS PA 겔에 남아 볼 수 있었다. 그 다음, 니트로셀룰로스 막을 실온에서 1시간동안 Tween 20(MPBST)로 인산 완충 식염수 중 5% 우유에서 배양하였다.
마우스 혈청 풀 D를 MPBST에서 1:500으로 희석하고, 실온에서 1시간동안 막 상에서 배양하였다. 그런 다음 막을 각각 5분 동안 1x MPBST로 3회 세척한 다음, 항 마우스 IgG(KPL, 074-1802; Ab20)와 함께 배양하고, 실온에서 30분동안 MPBST에서 1:5000으로 희석하였다. 그후 막을 각각 5분 동안 1x MPBST로 3회 세척하고, 실온에서 10분동안 TMB 용액으로 전개시켰다.
결론
사용된 항혈청 D에 의한 면역 블롯은 CRM197-융합 펩티드 접합체와의 반응성만을 나타냈다. 접합되지않은 CRM197에서 교차-반응성은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 상당량의 융합 펩티드가 담체 단백질에 접합되었고, CRM197-융합 펩티드 접합체에 대한 겔 내 관찰된 이동의 변화가 융합 펩티드의 담체 단백질에 대한 접합에 의한 것이며, CRM197 분자간 가교는 아니라는 것을 확인하였다. 항체가 반응하지 않기 때문에, 또는 겔의 바닥으로 이동된 융합 펩티드가 니트로셀룰로스 막으로 옮겨지지 않았기 때문에, 유리된 접합되지않은 융합 펩티드에 기인한 신호가 검출되었다.
항혈청 D는 P467-CRM197 접합체보다 P647-CRM197 접합체와 약간 더 강하게 반응하였다. 이 결과는 항혈청이 유리된 융합 펩티드보다 접합된 융합 펩티드와 강하게 반응하였음을 제시하였다.
실시예 4 - P467-CRM197 및 P647-CRM197 스폿 블롯
CRM197 담체 단백질에 대한 융합 펩티드 P467 및 P647의 존재는 또한 항혈청 D를 사용한 스폿 블롯 실험에서 확인되었다.
샘플
ㆍ CRM197, 1 mg/mL PBS pH 7.4;
ㆍ P467 항원, 1 mg/mL PBS pH 7.4;
ㆍ P647 항원, 1 mg/mL PBS pH 7.4;
ㆍ P467-CRM197, 1 mg/mL PBS pH 7.4(계산 농도); 및
ㆍ P647-CRM197, 1 mg/mL PBS pH 7.4(계산 농도).
[표 8]
재료
과정
예비-절단된 니트로셀룰로스 막을 사용하고, 라인을 연필로 그렸다. 각 샘플의 2배 희석을 1 mg/mL(1 μg/μL)에서 시작하여 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에서 pH 7.4의 PBS에서 수행하였다. 스폿 당 이론적인 농도(1 μL)는 1 μg/500 ng/250 ng/125 ng/62.5 ng/31.25 ng이었다. 각 지점에 대해 약 1 μL의 각 샘플을 이하에 설명된대로 막으로 (이중으로) 옮겼다.
ㆍ 라인 A CRM197;
ㆍ 라인 B P467 항원(지질 접합이 없는 유리 융합 펩티드);
ㆍ 라인 C P647 항원(지질 접합이 없는 유리 융합 펩티드);
ㆍ 라인 D P467-CRM197(1 μg의 융합 펩티드와 0.5 μg의 CRM197로 시작); 및
ㆍ 라인 E P647-CRM197(융합 펩티드 1 μg 및 CRM197 0.5 μg으로 시작)
실온에서 10분 동안 막을 공기 중에서 건조시키고, 이어서 실온에서 PBST(MPBST) 중 5% 우유로 30분동안 차단시켰다. 이어서, 실온에서 막을 1시간동안 1차 항체(마우스 항혈청 풀 D, MPBST에서 1:500로 희석됨)와 함께 배양하였다. 그후, 막을 각각 5분간 MPBST로 3회 세척한 후, 2차 항체(항 마우스 IgG; KPL, 074-1802; Ab20; MPBST에서 1:5000으로 희석됨)와 함께 30분동안 실온에서 배양하였다. 이 배양 후, 막을 각각 5분 동안 MPBST로 3회 세척한 후, 실온에서 TMB 용액으로 약 3분 동안 배양한 다음, Milli Q 물로 세척한 후 건조시켰다.
결론
마우스 항혈청 D를 사용한 스폿 블롯은 CRM197-융합 펩티드 접합체와의 반응성만을 나타냈다. 접합되지않은 CRM197 단백질과는 최소의 교차 반응이 있었다. 복합체 내의 CRM197의 양은 융합 펩티드의 양과 비교하여 약 50%이었기 때문에, 이 샘플에서의 최소 배경은 디프테리아 독소 변이체와의 교차-반응에 기인한 것 같았다.
유리(접합되지않은) 융합 펩티드(지질 접합체가 없는 융합 펩티드)는 P647의 경우에만 항혈청과 신호를 나타냈지만, P467의 경우에는 신호를 나타내지 않았다. 그 이유는 바로 알 수는 없다. 그러나, P647의 첫 번째 샘플 희석에서, 신호는 다음 희석에서보다 다소 약했다. 이것은 항체 결합 부위에 대한 억제제의 존재 또는 니트로셀룰로스 막에 대한 감소된 결합을 나타낼 수 있다. 이 억제제의 성질은 알려져 있지 않지만, 원래 융합 펩티드(10mg/mL)의 고농축 스톡을 제조하는데 사용된 DMSO 때문일 수 있다.
마우스 항혈청 D는 P467-CRM197 및 P647-CRM197 접합체와 매우 강하게 반응하여, 대부분의 융합 펩티드가 담체 단백질에 접합되는 것을 확인하였다.
융합 펩티드-CRM197 접합체와 비교하여 유리 융합 펩티드의 항혈청 반응성이 동일하지 않기 때문에, 항원의 양을 정량할 수 없었다. 그러나, 접합 반응 후에 정제 단계가 적용되지 않기 때문에, 융합 펩티드에 대한 이론적인 출발 농도로 계산하는 것이 허용가능하다.
요약하면, 결과는 항혈청이 유리 융합 펩티드보다 접합된 융합 펩티드와 강하게 반응한다는 것을 시사한다.
실시예 5 - 마우스에서 투여량-적정 연구를 위한 샘플 제조
하기는 마우스에서 투여량-적정 실험을 위한 융합 펩티드-CRM197 접합체의 제조를 기술한다.
[표 9]
재료
과정
동물 연구용 샘플을 제조하기 위해, 접합 반응 용액을 소정의 목표 농도로 희석시켰다. 하기 제조를 위해, 펩티드의 단백질에 대한 접합 효율은 90% 이상인 것으로 가정하였다.
고용량 그룹(그룹 1)을 위한 샘플 제조:
이들 샘플은 튜브 당 접합된 융합 펩티드 약 420 μg을 함유할 것으로 예상되었다(1.2 mg/mL):
튜브 1:
ㆍ 1045 μL의 P467-CRM197
ㆍ 880 μL의 (1x) PBS pH 7.4
이 용액을 잘 혼합하고, 350 μL를 5개의 유리 바이알(각각 2.5 mL)에 옮기고, 다음과 같이 표지하였다: P467-CRM197; 그룹 1-고용량; 추정된 P467 농도 : ~1.2 mg/mL; 롯트 140903-1_am.
튜브 2:
ㆍ 1045 μL의 P647-CRM197(피펫팅 전에 강력하게 볼텍싱됨)
ㆍ 880 μL의 (1x) PBS pH 7.4
이 용액을 잘 혼합하고 350㎕를 5개의 유리 바이알(각각 2.5mL)에 옮기고, 다음과 같이 표지하였다: P647-CRM197; 그룹 1-고용량; 추정된 P647 농도: ~1.2 mg/mL; 롯트 140903-4_am.
중간 용량 그룹(그룹 2)을 위한 샘플 제조:
이들 샘플은 튜브 당 접합된 융합 펩티드 약 210 μg을 함유할 것으로 예상되었다(0.6 mg/mL):
튜브 1:
ㆍ 525 μL의 P467-CRM197
ㆍ 1400 μL의 (1x) PBS pH 7.4
이 용액을 잘 혼합하고, 350μL를 5개의 2.5mL 유리 바이알에 각각 옮기고, 다음과 같이 표지하였다: P467-CRM197; 그룹 2 - 중간 용량; 추정된 P467 농도: ~0.6 mg/mL; 롯트 140903-2_am.
튜브 2:
ㆍ 525 μL의 P647-CRM197(피펫팅 전에 강력하게 볼텍싱됨)
ㆍ 1400 μL의 (1x) PBS pH 7.4
이 용액을 잘 볼텍싱하고, 350㎕를 5개의 2.5mL 유리 바이알에 옮기고, 다음과 같이 표지하였다: P647-CRM197; 그룹 2 - 중간 용량; 추정된 P647 농도: ~0.6 mg/mL; 롯트 140903-5_am.
저용량 그룹(그룹 3)을 위한 샘플 제조:
이들 샘플은 튜브 당 접합된 융합 펩티드 약 105 μg을 함유할 것으로 예상되었다(0.3 mg/mL):
튜브 1:
ㆍ 262 μL의 P467-CRM197
ㆍ 1663 μL의 (1x) PBS pH 7.4
이 용액을 잘 혼합하고, 350μL를 5개의 2.5mL 유리 바이알에 각각 옮기고, 다음과 같이 표지하였다: P467-CRM197; 그룹 3 - 저용량; 추정된 P467 농도: ~0.3 mg/mL; 롯트 140903-3_am.
튜브 2:
ㆍ 262 μL의 P647-CRM197(피펫 팅 전에 강력하게 볼텍싱 됨)
ㆍ 1663 μL의 (1x) PBS pH 7.4
이 용액을 잘 볼텍싱하고, 350㎕를 5개의 2.5mL 유리 바이알에 옮기고, 다음과 같이 표지하였다: P647-CRM197; 그룹 3 - 저용량; 추정된 P647 농도: ~0.3 mg/mL; 롯트 140903-6_am.
실시예 6 - 예방접종 연구
펩티드 항원
두개의 융합 펩티드, P467(서열번호 8) 및 P647(서열번호 9)을 Bachem(스위스)에서 합성하였다. 두 하이브리드를 항원 전달 시스템으로 적합하고 추가의 보조제를 필요로하지 않는 비로좀(활성화되지않은 인플루엔자 바이러스 A/Brisbane/59/2007의 바이러스성 엔벨로프)에 결합하였다. 융합 펩티드의 양에 대해 계산된 3가지 농도, 즉 주사 당 15μg, 30μg 및 50μg을 시험하였다. 비교를 위해, 두 융합 펩티드를 CRM197에 결합시키고, 1회 주사 당 30μg의 농도로 대면(head-to-head) 실험에 사용하였다. 모든 접합 과정(CRM 및 비로좀)은 Mymetics(스위스)에서 수행되었다.
상기 비로좀 조성물은 냉동 상태로 전달되어, 해동 후 흐린 현탁액을 형성하였다.
커플링 후, CRM-P647 접합체는 침전된 제형으로서 수용된 반면, CRM-P467은 수성 완충액에서 가용성으로 유지되었다.
3개의 Her-2/neu 유래된 B 세포 에피토프 P4(서열번호 3), P6(서열번호 1) 및 P7(서열번호 2)을 합성하고, piChem(오스트리아)에서 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌)에 커플링하고, ELISA에 의한 단일 펩티드에 대한 항체 반응을 평가하기 위한 코팅 항원으로 사용하였다.
접합되지않은 융합 펩티드에 대한 항체 반응을 평가하기 위해, P467 및 P647을 ELISA 분석에서 코팅 항원으로 사용하였다.
면역 프로토콜
암컷 Balb/C 마우스를 하기 연구 설계에 따라 2-3주 간격으로 피하 예방접종시켰다:
비로좀 접합체를 투여한 그룹을 활성화되지 않은 인플루엔자 바이러스(활성화되지않은 A/Brisbane/59/2007)로 1회 프라이밍하였다. 프라이밍한지 16일후부터 접합된 구조물에 의한 예방접종을 시작하였다. 모든 비로좀 제형은 사용될 준비가 완료되어, 주사 당 100μl의 임의의 첨가제없이 사용되었다.
CRM-융합 펩티드 접합체의 스톡(stock)을 NaCl 용액으로 희석하고, 주사에 의한 투여 전에 수산화 알루미늄 겔 현탁액과 혼합하였다. CRM-P647(침전됨)을 볼텍싱하고, 현탁액을 CRM-P467과 동일한 방식으로 사용하였다.
대조군에는 빈 비로좀(TIRIV) 또는 NaCl 용액+수산화 알루미늄을 투여하였다.
동물
60 마리의 암컷 Balb/C 마우스, 전달시(2014년 10월 29일)에 6 내지 8주령, 출처: Charles 강, 독일.
10 그룹 : 1 그룹당 n = 5 마우스 - 동물 시설: 비엔나 종합 병원/생체 의학실.
그룹
ㆍ 그룹 A - 빈 비로좀(TIRIV) - 100μl/마우스;
ㆍ 그룹 B - P467-비로좀 - 100μl에서 50μg/마우스;
ㆍ 그룹 C - P467-비로좀 - 100μl에서 30μg/마우스;
ㆍ 그룹 D - P467-비로좀 - 100μl에서 15μg/마우스;
ㆍ 그룹 E - P647-비로좀 - 100μl에서 50μg/마우스;
ㆍ 그룹 F - P647-비로좀 - 100μl에서 30μg/마우스;
ㆍ 그룹 G - P647-비로좀 - 100μl에서 15μg/마우스;
ㆍ 그룹 H - NaCl+수산화 알루미늄(대조군) - 100μl/마우스;
ㆍ 그룹 I - P467-CRM+수산화 알루미늄 - 150μl에서 30μg/마우스; 및
ㆍ 그룹 J - P647-CRM+수산화 알루미늄 - 150μl에서 30μg/마우스.
예방접종 전, 2차 예방접종 3주 후, 3차 예방접종 2주 후 및 4차 예방접종 2주 후에 혈액을 채취하였다. 혈액 샘플을 분석한 결과 :
ㆍ 펩티드-특이적 항체가(IgG);
ㆍ 구조물 특이적 항체가(IgG);
ㆍ 재조합 세포외 Her-2/neu(IgG)에 특이적인 항체가; 및
ㆍ SKBR-3 암세포에서 발현되는 본래의 Her-2/neu에 대한 특이성.
ELISA 프로토콜
1) 펩티드 특이적 ELISA
미세적정판을 0.5 μg/웰로 KLH-융합 펩티드 접합체로 코팅하였다. 배경 추정을 위해 웰을 KLH만으로 코팅하였다. 블로킹 후, 희석된 혈청을 첨가하였다. 결합된 IgG는 HRP-표지된 항체(토끼 항 마우스 IgG POX, Fc 단편 특이적, Nr: 315-035-008; Jackson Immuno Research) 및 후속 TMB 염색으로 검출되었다. 450 대 630 nm에서 정지 용액을 첨가한 후 플레이트를 판독하였다.
(2) 융합 펩티드-특이적 ELISA
변형되지않은 융합 펩티드 P467 및 P647을 탄산염 완충액 중 0.5㎍/웰의 농도로 코팅 항원으로 사용하였다. 그리고나서, 희석된 혈청을 상기 펩티드-특이적 프로토콜에 기술된 바와 같이 첨가하고 분석하였다.
(3) 세포외 Her-2/neu-특이적-ELISA
인간 Her-2/neu의 재조합 세포외 도메인(Her2/neu의 아미노산 잔기 23-652) 및 인간 IgG1의 Fc 영역(ErbB2/Fc 키메라, 카탈로그 번호 1129-ER R&D Systems)을 포함하는 융합 단백질을 코팅 항원으로 사용하였다. 플레이트는 배경 추정을 위해 0.1 μg/웰의 단백질 및 0.1% BSA로 코팅되었다. 그후, BSA-단독 웰로부터 배경 신호를 추출한 후에, 희석된 혈청을 상기한 바와 같이 첨가하고 분석하였다.
(4) SKBR3-세포를 이용한 Her-2/neu-특이적 세포 분석
Her-2/neu를 과발현하는 인간 유방암 세포주 SKBR-3(HTB30, ATCC, USA)을 천연 Her2/neu 단백질의 공급원으로 사용하였다. 세포를 계대 배양 3일 후 수확하고, -80℃에서 보관하였다. Godell V 및 Disis ML J. Immunol . Meth(2005)에 기술된 대로 세포 용해를 수행하였으며, 약간의 변형을 가했다: 변형 1: 플레이트를 인간화된 항-Her-2/neu 항체 Herceptin(비엔나 종합 병원에서 제공)으로 코팅함; 변형 2: 플레이트를 인간화 항-Her-2/neu 항체 Perjeta(비엔나 종합 병원에서 제공)로 코팅하였다. 세포 용해물의 단백질 함량은 사용 직전에 Pierce BCA Protein Assay Kit #23227로 정량하였다. 용해물을 1% BSA/PBS 중에서 100μg/웰의 농도로 희석시켰다. 차단 후, 세포 용해물을 웰에 첨가하였다. 개별 배경을 제어하기 위해, BSA/PBS가 첨가되었다. IgG 검출을 위해 HRP-결합된 양(sheep) 항-마우스 IgG(Amersham/GE Healthcare)를 사용하였다. 상기와 같이 TMB 염색을 수행하였다. 각 혈청 샘플에 대해, OD 값은 SKBR-3-코팅된 웰에서 BSA-코팅된 웰을 뺀 값의 차이로 계산되었다.
실시예 7 - 펩티드-특이적 항체
최종 혈액으로부터의 혈청(즉, 4회의 예방접종 후)을 사용하였다. 다음과 같이 비로좀 및 CRM197 예방접종된 마우스의 혈청으로부터 상이한 희석을 분석하였다:
ㆍ 비로좀 제형으로 치료받은 그룹: 1:5,000 희석;
ㆍ CRM-융합 펩티드 접합체로 치료받은 그룹: 1:100,000 희석.
데이터는 OD 값으로 나타내었다. KLH 코팅된 웰에 대한 배경을 공제한다(도 1-3 참조).
결과
모든 3개의 단일 펩티드에 대한 항체가 모든 치료 그룹에서 유도되었다(그룹 B-G 및 I-J). 펩티드-특이적 항체는 대조군(그룹 A 및 그룹 H)에서 검출되지 않았다. 항체가의 현저한 차이가 관찰되었다.
CRM-융합 펩티드 접합체로 4회 예방접종한 결과, 대응하는 비로좀 제제로 4회 예방접종한 것과 비교하여 3개의 개별 펩티드 모두에 대해 약 10배 높은 항체가를 유도하였다.
커플링 파트너와 관계없이, 두 구조체(P467 및 P647)는 P7 B 세포 에피토프(서열번호 2)에 대해 가장 높은 항체가를 유도하는 반면, P4 B 세포 에피토프(서열번호 3)에 대해 가장 낮은 항체가를 유도했다.
도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이, 융합 펩티드에 결합하는 항체도 또한 생산되었다. 이 결과는 4회 예방접종 후 최종 혈액으로부터의 혈청을 사용한 실험에서 유도되었다. 비로좀으로 예방접종된 그룹의 경우, 혈청을 1:5,000으로 희석하였다. CRM197-융합 펩티드 접합체로 예방접종된 그룹의 경우, 혈청을 1:100,000으로 희석하였다. 도 4 및 도 5에 도시된 데이터는 OD 값으로 주어진다. 도 1-3에 도시된 펩티드-특이적인 결과에 따라, CRM197-융합 펩티드 접합체로 예방접종된 그룹에서, 대응하는 비로좀 제제로 예방접종된 그룹에 비해 약 10배 높은 항체가가 관찰되었다. 일반적으로, P467보다는 P647에서 더 높은 항체가가 관찰되었다.
실시예 8 - CRM-접합체로 예방접종하는 과정에서의 항체 동역학
2차, 3차 및 4차 예방접종 2주 후에 혈액을 채취하고, 융합 펩티드(P467 및 P647) 둘 다에 특이적인 항체를 측정하였다(혈청을 1:100,000으로 희석함). 도 6 및 도 7에 도시된 바와 같이, 융합 단백질-특이적 항체가는 2차 예방접종 후에 이미 상당히 높았고, 3차 및 4차 예방접종 후에 약간 증가하였다. 3차 및 4차 예방접종 후 융합 단백질-특이 항체가의 작은 증가는 CRM197-융합 펩티드 접합체에 의한 2 내지 3회의 예방접종(즉, 2 또는 3회 연속 투여)이 효과적인 면역 반응을 생성하기에 충분할 수 있음을 나타낸다. (BA1 - 2회 예방접종 후 혈액 채취; BA2 - 3회 예방접종 후 혈액 채취; BA2 - 4회 예방접종 후 혈액 채취).
실시예 9 - 세포외 Her-2/neu-특이적 항체
혈액은 2개의 시점에서 채취되었다; BA1(2회 예방접종 후 채혈) 및 BA2(3회 예방접종 후 채혈). 상이한 혈청 희석을 분석하였다 - 비로좀 제제로 예방접종된 그룹의 혈청을 1:400으로 희석하고, CRM-융합 펩티드 접합체로 예방접종한 그룹의 혈청을 1:2,000으로 희석하였다. 도 8에 도시된 데이터는 OD 값이다.
도 8에 도시된 바와 같이, (비로좀- 및 CRM197-접합된) 융합 펩티드-구조물은 모두 재조합 세포외 Her-2/neu 단백질에 결합하는 항체를 유도하였다. sham으로 처리한 마우스 및 예방접종 전 혈청에서 유의미한 Her-2/neu 반응성은 관찰되지 않았다. 펩티드- 및 융합 펩티드-특이적 결과에 따르면, 30μg 농도의 비로좀 제제와 비교하여 CRM-융합 펩티드 접합체로 예방접종된 그룹에서 현저히 높은 Her-2/neu 특이적 항체가가 관찰되었다. 비로좀에 의한 3차 예방접종 후에도 유의미한 항체가가 관찰되었다. 2차 예방접종 후 CRM-융합 펩티드 접합체로 이미 예방접종된 마우스에서, 항체가는 높았으며, 3차 예방접종 후에 현저히 증가하지 않았다.
2차, 3차 및 4차 예방접종 후 혈청 항체가를 분석한 결과, CRM-접합체와 비교하여 비로좀-접합체와의 항체 반응의 상이한 동역학이 밝혀졌다. 2차 예방접종 후(예방접종 개시 6주 후), CRM-융합 펩티드 접합체로 예방접종된 동물에서 비로좀 접합체와 비교하여 높은 항체가가 관찰되었다(도 9 참조). 비로좀 접합체에 의한 3차 예방접종 후, 항체가의 유의미한 증가가 관찰되었다(도 8 참조). 4차 예방접종 후, Her-2/neu 특이 항체가는 비로좀-예방접종된 마우스와 CRM-예방접종된 마우스 사이에서 비교가능했다(도 10 참조). CRM-융합 펩티드 접합체로 예방접종된 마우스에서, 3차 및 4차 예방접종 사이의 항체가가 약간 증가하였으며, 이는 2차 예방접종 후 강한 면역원성을 나타내었으며, 3차 예방접종 후에는 더욱 강한 면역원성을 나타내었다(도 11 참조).
도 12에 도시된 바와 같이, 30 μg의 P467-비로좀 접합체 또는 30 μg의 P467-CRM 접합체에 의한 2차, 3차 및 4차 예방접종 후 재조합 Her-2/neu에 대한 항체 반응의 동역학의 비교는, 2차 예방접종 후에도 CRM 접합체로 예방접종한 후의 항-Her-2/neu 항체가(각 클러스터의 4번째 컬럼)가 대응하는 비로좀 접합체로 예방접종한 후 항체가(각 클러스터의 3번째 컬럼)보다 상당히 높았음을 보여준다. 4차 예방접종 후, 두 접합체는 비교가능한 재조합 항-Her-2/neu 항체가를 유도한다.
도 13에 도시된 바와 같이, P647-비로좀 접합체 30 ㎍ 또는 P647-CRM 접합체 30 ㎍에 의한 2차, 3차 및 4차 예방접종 후 재조합 Her-2/neu에 대한 항체 반응의 동역학의 비교는, 2차 예방접종 후에도 CRM 접합체로 예방접종한 후의 항 Her-2/neu 항체가(각 클러스터의 4번째 컬럼)가 대응하는 비로좀 접합체로 예방접종한 후 항체가(각 클러스터의 3번째 컬럼)보다 상당히 높았음을 보여준다.
이러한 결과는 비로좀 또는 CRM197을 융합 펩티드의 전달 시스템으로 사용하여 Her-2/neu-특이적 항체가의 동역학에서 현저한 차이를 입증한다. 비로좀 접합체에 의해 관찰된 항체가의 증가는 CRM 접합체에 의해 관찰된 것보다 상당히 느렸으며, (융합 펩티드 P467과 관련하여) 4회의 예방접종이 상응하는 CRM 예방접종에 의해 보이는 것과 유사한 수준에 도달할 필요가 있었다. 융합 펩티드 P647과 관련하여, 비로좀 접합체는 4차 예방접종 후에도 유사한 항체가를 유도하지 않았기 때문에 CRM 접합체보다 열등했다(도 13).
실시예 10 - 천연 Her-2/neu 단백질에 대한 특이성
4회의 예방접종 후 채혈한 최종 혈액 샘플로부터 유래된 혈청을 분석하였다. 데이터를 OD 값으로 나타내고, 모든 혈청을 1:100으로 희석시켰다.
도 14에 도시된 바와 같이, 생성된 항체는 SKBR-3 유방암 세포에서 과발현된 Her-2/neu의 천연 형태를 인식하였다. 정제되지 않은 세포 용해물을 갖는 ELISA의 범위 내에서 작동하는데 낮은 혈청 희석이 필수적이었고, 본 발명자의 이전 데이터와 일치하였다. 비로좀 접합체로 예방접종된 그룹에서 펩티드 및 재조합 세포외 Her-2/neu 단백질에 대한 항체가가 상당히 낮았음에도 불구하고, OD 값은 비로좀- 및 CRM197-융합 펩티드 접합체 사이에서 유사했다. 이러한 결과는 SKBR-3 세포 용해물의 성분(예를 들어, 세포막)과, 지질 결합 또는 비로좀 일부에 대해 생성된 항체와의 반응성으로 설명될 수 있다. 이 결합은 CRM197-융합 펩티드 접합체에는 존재하지 않는다.
실시예
11 - 명반/
Al(OH)
3
또는
Montanide를
갖는 펩티드 P467-CRM으로 예방접종한 후 면역 반응 평가
시약 제조
융합 단백질 P467(길이가 49 아미노산; Bachem에서 합성됨, Switzerland)을 CRM197(디프테리아 독소 변이체; PiChem/Graz/Austria)에 커플링시키고, 0.4 mg/ml의 스톡 농도로 전달하였다. 3개의 보조제의 존재 또는 부재하에 마우스에서 P467-CRM-매개 면역 반응을 평가하였다:
1) ALHYDROGEL® "85"(Brenntag, Denmark의 수산화 알루미늄; 알루미늄 함량 10 mg/ml, 배치 번호 85563; 제조사의 지침에 따라 1/10의 희석으로 사용);
2) Alu-Gel-S-현탁액(독일 Serva의 수산화 알루미늄; 1.3% 순도, 무균, 알루미늄 함량 5.9-7.1 mg/ml, 카탈로그 번호 12261, 배치 번호 111589; 제조자의 지시에 따라 1/3의 희석액에서 사용); 및
3) Montanide ISA 51VG(Seppic제, France, 카탈로그 번호 36362ZFL2R3; 배치 번호 2423395).
예방접종 프로토콜은 하기의 '예방접종 프로토콜'에 기술되어 있다. 간단히 말해서, 3가지 농도의 펩티드 구조물을 시험하였다: 주사 당 10μg, 25μg 및 50μg. 위의 실시예에서 설명한 동물 연구에서 사용된 Serva의 수산화 알루미늄을 두 그룹의 마우스에서 시험하고('예방접종 프로토콜' 참조), Brenntag의 수산화 알루미늄 사용과 비교하였다. 이 두 그룹에서 Serva의 수산화 알루미늄과 함께 사용된 P467-CRM의 양은 10㎍ 및 25㎍이었다.
Montanide에 의한 펩티드 구조물의 유화
제조사의 지침(Seppic, France)에 따라 P467-CRM, PBS 또는 NaCl을 Montanide로 유화시켰다. P467-CRM 펩티드 구조물을 PBS(수산화 알루미늄, Brenntag) 또는 NaCl(수산화 알루미늄, Serva)와 혼합하였다. 이어서, 상기 보조제를 상기 용액에 첨가하고, 실온에서 철저히 볼텍싱하였다. 이어서, 혼합물을 투여하기 전에 최소 45분 동안 실온에서 유지시켰다.
예방접종 프로토콜
암컷 Balb/C 마우스(Charles River Germany, 배달시 6-8주)를 3주 간격으로 피하 예방접종시켰다(n = 그룹당 8 마리의 마우스, 대조군 n = 4).
마우스 그룹, 즉 A 내지 O를 다음과 같이 예방접종시켰다:
그룹 A(P467-CRM, 10μg /주사): 1250μl의 NaCl과 함께 250μl의 P467-CRM(1500μl). 150 ㎕/마우스(= 10 ㎍/마우스)
그룹 B(P467-CRM, 25μg /주사): 875μl의 NaCl과 함께 625μl의 P467-CRM(1500μl). 150 ㎕/마우스(= 25 ㎍/마우스)
그룹 C(P467-CRM, 50μg /주사): 250μl의 NaCl과 함께 1250μl의 P467-CRM(1500㎕). 150 ㎕/마우스(= 50 ㎍/마우스)
그룹 D(P467-CRM-명반 Brenntag , 10μg /주사): 175μl의 명반 Brenntag+1325μl PBS와 함께 250μl의 P467-CRM(1750μl). 175μl/마우스(= 10μg/마우스)
그룹 E(P467-CRM-명반 Brenntag , 25μg /주사): 175μl의 명반 Brenntag+950μl PBS와 함께 625μl의 P467-CRM(1750μl). 175μl/마우스(= 25㎍/마우스)
그룹 F(P467-CRM-명반 Brenntag , 50μg /주사): 175μl 명반 Brenntag+325μl PBS와 함께 1250μl의 P467-CRM(1750μl). 175μl/마우스(= 50μg/마우스)
그룹 G(P467-CRM-명반 Serva , 10μg /주사): 1000μl의 명반 Serva+250μl NaCl와 함께 250μl의 P467-CRM(1500μl). 150 ㎕/마우스(= 10 ㎍/마우스)
그룹 H(P467-CRM-명반 Serva , 25μg /주사): 1000μl 명반 Serva와 함께 625μl의 P467-CRM(1625μl). 160μl/마우스(= 10μg/마우스)
그룹 I(P467-CRM- Montanide , 10μg /주사): 300μl의 NaCl+600μl의 Montanide와 함께 300μl의 P467-CRM. 100μl/마우스
그룹 J(P467-CRM- Montanide , 25μg /주사): 700μl의 Montanide와 함께 700μl의 P467-CRM. 126μl/마우스
그룹 K(P467-CRM- Montanide , 50μg /주사): 1,300μl의 Montanide와 함께 1300μl의 P467-CRM. 252μl/마우스
그룹 L(P467-단량체, 25μg /주사): 1250μl NaCl과 함께 250μl의 P467-CRM. 150 ㎕/마우스(= 25 ㎍/마우스)
그룹 M(Montanide): 1000μl NaCl+1000μl Montanide. 252μl/마우스
그룹 N(명반 Brenntag): 1575μl PBS+175μl 명반 Brenntag. 175μl/마우스
그룹 O(CRM, 50μg /주사): 스톡 농도: 2mg/ml. NaCl(150+450 NaCl)에서 1:4 희석됨. 100μl/마우스
대조군은 CRM, 수산화 알루미늄(Brenntag) 또는 Montanide를 단독으로 투여 받았다.
1차 접종(BA0) 전에, 2차 예방접종 후 20일(BA1) 및 3차 예방접종 후 18일(BA2)에 동물로부터 혈액을 수집하였다. 항체가 동역학을 평가하기 위해, 3차 접종 후 8주째(BA3)에 혈액을 채취하였다.
각 그룹의 남은 4 마리(모든 마우스가 희생된 대조군 M, N 및 O 제외)에서 3차 예방접종 후 8주 및 16주(각각 BA4 및 BA5)에 항체가를 추가로 평가하여, 항체 동역학 및 필요한 부스터 간격을 확인하였다.
비장세포 준비 및 배양
마우스(n=4/그룹)를 희생시키고, 무균 조건 하에서 이들의 비장을 제거하고, 분쇄하고, 무균 필터를 통해 여과시켰다. 세포 현탁액은 상기한 바와 같이 제조하였다(Wiedermann et al, Int . Immunol., 1999; Oct; 11(10): 1717-24). 비장세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 웰 당 0.5×106의 농도로 플레이팅하고, 72시간동안 20μg/ml의 농도로 CRM 또는 P467로 자극하였다. 분석할 때까지 상청액을 -20℃에서 보관했다. ConA를 이용한 자극을 대조군으로서 수행하였다.
ELISA 프로토콜
(ⅰ) 펩티드-특이적 항체 수준의 측정
카보네이트 완충액으로 희석된 접합되지않은 융합 펩티드 P467(Bachem, 스위스)을 코팅 항원으로서 0.5㎍/미량역가 웰의 농도로 사용하였다. 혈청(n=8/그룹)을 희석하고, 웰에 첨가하고, 결합된 IgG 항체를 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-표지된 토끼 항-마우스 IgG POX(Fc 단편 특이적, 카탈로그 번호 315-035-008; Jackson Immuno Research)로 검출한 후 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 첨가하였다. 정지 용액을 첨가하고, 플레이트를 450 내지 630 nm에서 판독하였다.
IgG 서브셋 IgG1 및 IgG2a의 검출을 위해, 희석된 혈청을 미량역가판의 항원-코팅된 웰에 적용하고, 이어서 래트 항-마우스 IgG1 또는 래트 항-마우스 IgG2a 항체를 적용하였다. 그후 2차 항체인 HRP-표지된 마우스 항-래트 IgG를 검출에 사용한 후, TMB를 사용하였다. 정지 용액을 첨가하고, 플레이트를 450 내지 630 nm에서 판독하였다.
(ii) Her-2/neu-특이적 항체 수준의 측정
인간 IgG1의 Fc 영역에 접합된 인간 Her-2/neu(아미노산 잔기 23-652)의 재조합 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질로 미량역가판의 웰을 코팅하였다. 각 웰을 0.1 μg의 융합 단백질로 코팅하였다. 이어서, 희석된 마우스 혈청을 상기한 바와 같이 분석하였다.
IgG 서브셋 IgG1 및 IgG2a의 검출을 위해, 희석된 혈청을 항원-코팅된 웰에 적용한 다음, 래트 항-마우스 IgG1 또는 래트 항-마우스 IgG2a를 첨가하였다. 2차 HRP-표지된 마우스 항-래트 IgG(H+L) 항체를 검출에 사용하였다.
(iii) 시험관내 사이토카인 생산-IL-2, IL-5 및 IFNγ의 측정
CRM- 또는 P467-자극된 비장세포로부터의 상청액을 수집하고, 제조사의 지침(Affymetrix eBioscience, USA)에 따라 ELISA에 의해 IL-2, IL-5 및 IFNγ의 농도를 분석하였다. 상청액은 분석 전에 희석하지 않거나, 1:10-1:20으로 희석하여 사용하였다.
형광-활성화된 세포 분류(FACS) 분석
새로 분리된 비장세포(24 웰 바닥이 평평한 플레이트에서 2.5×106 세포/ml)상에서 FACS를 수행하였다. 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate, PMA; 10ng/ml)와 이오노마이신(Ionomycin)(1.25μM)의 존재 하에서 세포를 2시간동안 배양하고, Brefeldin A(10μg/ml)의 존재하에 37℃에서 추가로 4시간동안 배양하였다. 그런 다음 세포를 밤새 4℃에 보관하고, 다음 날 아침에 하기 표적에 대한 항-마우스 항체로 염색하였다:
(i) 염색 프로토콜:
세포를 수확하고, 마이크로닉 튜브(튜브 당 1×106/세포)로 분할하였다. 상기 항체 칵테일로 각 마우스 샘플에 대해 단일 염색을 수행하였다.
이어서, 세포를 세척하고, Fc 블록(항-마우스 CD16/32)으로 차단하고, CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD335에 대한 항체로 염색한 후, IFNγ 및 그랜자임 B에 대한 고정/투과 및 세포내 염색을 수행하였다.
비장세포 개체군 - T 세포(CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+), B 세포(CD3-CD19+) 및 NK 세포(CD3-CD335+)의 특성 분석을 위해 분석을 수행하였다. 분석은 또한 세포내 IFNγ 단백질의 검출을 포함하였다.
통계 분석
ELISA 결과의 분석을 위해, 비-쌍형 t-테스트(양측(two tailed), 신뢰 구간 95%)을 프리즘에 적용하였다. 유의미한 차이는 하나 이상의 별표(*P 값 <0.05, **0.01 <P 값 <0.001, ***P 값 <0.001)로 표시된다. 의미없음은 'ns'로 표시된다. 둘 이상의 그룹을 비교할 때 일원 분산 분석(ANOVA)이 프리즘에 적용되었다. FACS 결과 분석을 위해 만 휘트니(Mann Whitney) 테스트(양측, 신뢰 구간 95%)가 프리즘에 적용되었다.
결과
체액 반응
(ⅰ) 펩티드-특이적 항체 수준
예방접종전-혈청 뿐만 아니라 3회 예방접종 후 최종혈액으로부터 유래된 혈청을 1:100.000(IgG 및 IgG1의 경우) 또는 1:100(IgG2a의 경우)으로 희석하였다. 총 혈청 IgG, IgG1 및 IgG2a에 대한 항체가도 15A-C에 각각 도시되어있다.
도면에서, 하기 그룹(프레임)을 서로 비교하고 통계적으로 평가하였다:
ㆍ D, E, F: 명반: 10μg, 25μg, 50μg
ㆍ I, J, K: Montanide: 10μg, 25μg, 50μg
데이터는 P467-CRM으로 예방접종된 모든 마우스에서 항-P467 항체가 유도되었음을 보여준다. 대조군 동물 또는 P467 단독으로 예방접종된 마우스에서는 항체 반응이 유도되지 않았다. 명반(Brenntag)과 비교하여, P467-CRM을 Montanide와 함께 투여했을 때 IgG, IgG1 및 IgG2a에 대한 항체 수준이 유의미하게 높았다. P467-CRM+Montanide로 예방접종된 동물에서 상당히 높은 IgG2a 역가가 명백하였지만, IgG2a 역가는 일반적으로 IgG1보다 낮았다.
(ii) Her-2/neu-특이적 항체 수준
3회 예방접종후 최종혈액으로부터 유도된 혈청 및 예방접종전 혈청을 1:2500(내지 10.000)(IgG), 1:10.000(IgG1) 및 1:100(IgG2a)으로 희석하였다. 혈청 IgG, IgG1 및 IgG2a에 대한 항체가가 각각 도 16a-c에 도시되어있다.
P467-CRM으로 예방접종된 모든 동물에서 높은 역가의 항-세포외 Her-2/neu IgG 및 IgG1 항체가 확인되었다. 대조군 동물 또는 P467 단독으로 예방접종된 마우스에서는 항-Her-2/neu 항체 반응이 나타나지 않았다. 명반(Brenntag)과 비교하여, P467-CRM 펩티드 구조물을 Montanide와 함께 투여했을 때 IgG 및 IgG1 항체가가 상당히 높았다.
사이토카인(IL-2, IFNγ, IL-5)의 시험관내 제조
(i) CRM 또는 P467로 자극 후 IL-2 생성
명반 존재 하에 P467-CRM으로 예방접종된 마우스로부터 유래된 CRM-자극된 비장세포와 비교할 때, Montanide의 존재하에 P467-CRM으로 예방접종된 마우스로부터 유래된 CRM-자극된 비장세포에서 IL-2 수준이 더 높았다(도 17a 및 도 17b 참조).
(ii) CRM 또는 P467로 자극 후 IFNγ 생성
도 18a 및 18b는 CRM(도 18a) 또는 P467(도 18b)의 존재하에 시험관내에서 배양된 비장세포의 상청액에서의 IFNγ 농도를 나타낸다. Montanide가 포함된 25 μg P467-CRM으로 예방접종된 마우스에서, IFNγ 수준이 범위를 벗어났다. 도 18c(CRM에 의한 자극) 및 도 18d(P467에 의한 자극)에 도시된 바와 같이, 이 마우스로부터의 데이터를 제외하고, 추가 분석을 수행하였다.
명반 또는 Montanide의 존재 하에 P467-CRM으로 예방접종된 모든 마우스로부터 유래된 비장세포에서의 IFNγ 생산을 CRM 자극에 의해 유도하였다. Montanide(10μg 그룹)에서 IFNγ 수준은 명반(Brenntag)의 존재하에 P467-CRM으로 예방접종된 해당 그룹에 비해 높았다. P467-CRM으로 자극시, IFNγ 수준은 50μg P467-CRM으로 예방접종된 Montanide 그룹에서 가장 강했다.
(iii) CRM 또는 P467로 자극 후 IL-5 생성
도 19a 및 19b는 CRM(도 19a) 또는 P467(도 19b)의 존재하에 시험관내에서 배양된 비장세포의 상청액에서 IL-5의 농도를 나타낸다.
Montanide 존재하에 P467-CRM으로 예방접종된 마우스로부터 유래된 CRM-자극된 비장세포에서 IL-5 수준이 유의미하게 높았다. P467-CRM 펩티드 구조체로 자극한 후, Montanide 예방접종된 마우스에서 일부 IL-5 생성이 유도되었지만, IL-5 수준은 CRM 자극 후 수준과 비교할 때 약 10배 낮았다.
FACS 분석에 의한 비장세포의 특성 분석; IFNγ 생산의 세포내 염색
상이한 보조제(즉, 명반 대 Montanide)의 사용이 림프구 분포, 특히 CD8+ 및 CD4+ 림프구를 변경하는지를 평가하기 위해, Montanide의 존재하에 P467의 상이한 농도로 예방접종한 후에 비장 세포의 FACS 분석을 수행하였다. 비장세포를 마우스로부터 분리하고, T 세포(CD3+CD4+, 도 20a 및 CD3+CD8+, 도 20b), B 세포(CD3-CD19+, 도 20c) 및 NK 세포(CD3-CD335+, 도 20d)의 비율을 분석하였다.
데이터는 명반(Brenntag)과 비교할 때, Montanide와 함께 더 많은 양의 P467-CRM(즉, 25mg 및 50mg)으로 예방접종된 마우스 유래의 비장세포내 NK 세포의 유의미한 감소를 나타낸다.
FACS 분석에 의한 IFNγ-생성 비장세포의 검출
상이한 보조제에 의한 예방접종이 IFNγ-생성 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 분포를 변화시키는지를 조사하기 위해, 모든 그룹의 마우스의 비장세포를 분리하고, T 세포에서 세포내 IFNγ를 측정하였다(CD4+,도 21a, 및 CD8+,도 21b) 및 NK 세포(CD3-CD335+, 도 21c).
데이터는 CD4+ T 세포가 IFNγ를 생성하였음을 보여주며, 증가된 농도의 P467-CRM으로 예방접종된 마우스에서 확연하였다. 모든 대조군(및 순수 마우스)은 유사한 IFNγ 수준을 나타냈다. 대조적으로, IFNγ 수준은 Montanide와 함께 25μg P467-CRM으로 예방접종된 마우스로부터 유래된 CD8+ T 세포에서 더 높았다. 데이터는 또한 P467-CRM+Montanide로 예방접종된 마우스로부터 유래된 NK 세포에 의한 IFNγ 생산을 나타낸다.
항-Her2 및 P467 펩티드 항체 반응의 동역학
항체 반응의 동역학을 평가하기 위해, 최종 예방접종 후 8주, 16주 및 6개월에 혈액 샘플을 채취하였다. 이어서, 혈액 샘플을 본원에 개시된 방법에 따라 Her2/neu-특이적 및 P467 펩티드-특이적 항체가에 대해 분석하였다.
도 22에 도시된 바와 같이, 명반 또는 Montanide가 투여된 P467-CRM 펩티드 구조물의 최종 투여 후 8주(BA3), 16주(BA4) 및 6개월(BA5)에 P467 펩티드-특이적 IgG 항체가가 여전히 높았다. 이와 유사하게, 도 23에 도시된 바와 같이, 명반 또는 Montanide가 투여된 P467-CRM 펩티드 구조물의 최종 투여 후 8주(BA3), 16주(BA4) 및 6개월(BA5)에 Her2/neu-특이적 IgG 항체가가 여전히 높았다.
개요
융합 펩티드를 포함하는 CRM197-융합 펩티드 접합체 및 비로좀 제제 모두 융합 펩티드(P467 및 P647) 뿐만 아니라 단일 B 세포 에피토프(P4, P6 및 P7)에 대하여 특이적인 항체를 생성하였다. 또한, 이들 항체는 Her-2/neu의 재조합 세포외 도메인에 결합하고, 및 SKBR-3 유방암 세포 상에 발현된 천연 Her2/neu 단백질에도 결합한다는 것을 알아야한다.
CRM197-융합 펩티드 접합체는 B 세포 에피토프- 및 Her2/neu-특이적 항체를 유도하는데 더욱 효과적이었으며; 즉, 대응하는 비로좀 제제와 비교하여 상당히 높은 항체가(약 10 내지 20배)가 생성되었다.
재조합 Her-2/neu에 대한 항체가에 기초하여, 예방접종 과정중에 항체 반응의 동역학에 명확한 차이가 있었고, 결과는 CRM-접합체가 항체가의 초기 증가를 유도하는 반면(2차 예방접종후 이미 증가됨, 3차 예방접종 후 피크임), 비로좀 접합체에 의한 항체가의 증가는 느려졌으며, 대응하는 CRM 복합체로 예방접종된 마우스에서 관찰된 수준에 도달하기 위해서는 4회의 예방접종이 필요했음을 보여준다.
비로좀은 일반적으로 적합한 항원 전달 시스템이다. 그러나, 본원에 개시된 결과는 비로좀 접합체로 예방접종한 후 항체가 증가가 지연될 뿐만 아니라, 대응하는 CRM 접합체로 예방접종된 동물에서 관찰된 유사한 항체가를 달성하기 위해 4회의 예방접종이 필요하다는 것을 분명히 보여준다. 최적의 항체 반응을 위한 시간 및 투여량은 Her-2/neu 백신 조성물의 임상적용에 고려해야 할 중요한 요소이다. 따라서, 이들 결과는 CRM197이 백신 전달의 맥락에서 Her-2/neu 융합 펩티드에 대하여 보다 적합한 담체 단백질임을 보여준다.
명반(Brenntag) 및 Montanide는 모두 P467-CRM 펩티드 구조물에 대한 상기 항체 반응을 추가로 증가시키는 것으로 나타났다. IgG1 뿐만 아니라 항-P467-특이적 IgG 항체가는 명반에 비해 Montanide(모든 투여량에서)로 예방접종된 모든 마우스에서 유의미하게 높았다. 항-P467 IgG2a 항체가는 또한 명반에 비해 Montanide(모든 투여량으로)로 예방접종된 마우스에서 더 높았다. 조사한 모든 투여량으로 펩티드 구조물과 함께 투여했을 때, 항-Her-2/neu IgG 및 IgG1 항체가가 Montanide로 예방접종된 마우스에서 유의미하게 더 높았다. P467 펩티드-특이적 항체와는 대조적으로, 항-Her-2/neu IgG2a 항체가 거의 또는 전혀 검출되지 않았다.
IFNγ는 P467의 존재하에 배양된 세포와 비교할 때, CRM의 존재하에 시험관내에서 세포를 배양하였을 때, 비장세포에 의해 현저히 더 많은 양으로 생성되었다. CRM으로 자극한 후, 명반(Brenntag)을 적용했을 때 동일한 투여량의 구조물을 투여받은 그룹과 비교하여, Montanide와 함께 투여한 경우, 더 적은 투여량의 펩티드 구조물을 투여한 그룹에서 IFNγ 수준이 유의미하게 더 높았다. 이 데이터는 Montanide가 항체가를 높게 유도하지만, 명반보다 더 높은 사이토카인 수치를 유도함을 나타낸다.
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Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp
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<213> homo sapiens
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Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> homo sapiens
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Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn
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<213> homo sapiens
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<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 61
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
165 170 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
180 185 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
245 250 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
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Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
275 280 285
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290 295 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305 310 315 320
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325 330 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
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Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
355 360 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
370 375 380
Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr
385 390 395 400
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405 410 415
Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val
420 425 430
Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr
435 440 445
His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile
450 455 460
Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly
465 470 475 480
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485 490 495
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515 520 525
Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
530 535
Claims (26)
- 하기를 포함하는 Her2/neu 발현 또는 과발현 암에 대한 백신 조성물로서:
(i) 보조제로서, 유중수형 에멀젼(water-in-oil emulsion); 및
(ii) 담체 단백질에 접합된 하나 이상의 융합 펩티드,
상기 유중수형 에멀젼은 몬타나이드(Montanide®)이고;
상기 담체 단백질은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 디프테리아 독소 변이형 CRM-197이고;
상기 하나 이상의 융합 펩티드는 서열번호 8 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는, Her2/neu 발현 또는 과발현 암에 대한 백신 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 융합 펩티드는 서열번호 8 또는 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는, Her2/neu 발현 또는 과발현 암에 대한 백신 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 담체 단백질은 2 내지 39개의 융합 펩티드를 포함하는, Her2/neu 발현 또는 과발현 암에 대한 백신 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 담체 단백질은 6 내지 12개의 융합 펩티드를 포함하는, Her2/neu 발현 또는 과발현 암에 대한 백신 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 체크포인트 억제제를 추가로 포함하는, Her2/neu 발현 또는 과발현 암에 대한 백신 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 포함하는, Her2/neu 발현 또는 과발현 암에 대한 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 암은 유방암인, 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 암은 위암인, 약학적 조성물.
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