JP2005341969A

JP2005341969A - 小胞体シグナル配列ペプチドと少なくとも１個の他のペプチドをエンコードする核酸配列を含有する免疫原性キメラ、及びこのキメラのワクチン及び疾患の治療における使用

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Publication number: JP2005341969A
Application number: JP2005197523A
Authority: JP
Inventors: Nicholas P Restifo; レスティフォ，ニコラス・ピー; Steven A Rosenberg; ローゼンバーグ，スティーヴン・エイ; Jack R Bennick; ベンニンク，ジャック・アール; Igor Bacik; バシク，イゴー; Jonathan W Yewdell; ユーデル，ジョナサン・ダブリュー
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 1993-03-17
Filing date: 2005-07-06
Publication date: 2005-12-15
Also published as: WO1994021680A1; CA2158455A1; US5846540A; EP0689551A1; DE69435075T2; EP0689551B1; CA2158455C; US5733548A; DE69435075D1; AU692152B2; US5856187A; JPH08508252A; AU6410794A; ATE386800T1

Abstract

【課題】小胞体シグナル配列ペプチドと少なくとも１個の他のペプチドを含有する免疫原性キメラタンパク質を開示する。
【解決手段】本発明は、免疫原として、ワクチンとして、または癌、感染性疾患または自己免疫性疾患の治療方法において用いることのできる免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成を指令し得るワクシニアウイルス構造物の設計に関する。
【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は免疫療法の分野に属する。より詳細には、本発明は小胞体シグナルペプチドと少なくとも１個の他のペプチドを含有する免疫原性キメラタンパク質を免疫原として、インビボでワクチンに利用したり、哺乳動物の癌、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染または自己免疫疾患の治療法に利用することに関する。

発明の背景
ヒトの癌及び他の疾患に対する治療法として胸腺由来リンパ球（Ｔ細胞）に基づく免疫療法を確立することは、非常に興味ある研究対象である（Oethgen, H. F. et al.（1991）in Biologic Therapy of Cancer: eds.: DeVita, V. T. Jr., Hellman, S., Rosenberg, S. A. J. B. Lippincott, p. 87）。Ｔ細胞に基づく効果的な免疫療法を確立する上で大きな障害となるのは、細胞表面上の抗原提示が抗原に対するＴ細胞の応答を引き出すのに不十分なことがしばしばあることである。従って、癌生物学、ウイルス学、及び免疫学のような分野の研究者の主な目的は、Ｔ細胞に対する抗原の提示を増大させる方法を発展させることである。本発明をより良く理解するために、Ｔ細胞が抗原をいかにして認識し、あるいは認識しないかについての短い総説を以下に示す（Restifo, N. P Biologic Therapy of Cancer Updates 2:1-10（1992）; Yewdell, J. W. Adv. in Immunology 52:1-123（1992）も参照）。

他の分子の関与なしに抗原を認識できるＢ細胞と異なり、Ｔ細胞は標的細胞の表面上の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）と共にしか抗原を認識できない。詳細には、２つの型のＭＨＣ分子が存在し、それぞれの型は、抗原となるペプチドと非共有的に結合して、Ｔ細胞の異なるサブセットのリガンドを構成する。より詳細に言えば、クラスＩＭＨＣ／ペプチド複合体はＣＤ８⁺Ｔ細胞によって認識され、一方クラスＩＩＭＨＣ／ペプチド複合体はＣＤ４⁺Ｔ細胞によって認識される。Ｔ細胞に基づく免疫療法の発展に関与する研究者にとって興味あることに、時には細胞障害性Ｔ細胞あるいはＣＴＬｓと呼ばれるＣＤ８⁺Ｔ細胞は、細胞表面にクラスＩ／ペプチド複合体を提示している標的細胞を直接殺し、これらの標的細胞の破壊のためのシグナルとなるサイトカインを分泌することができると説明されてきた。ＣＤ８⁺Ｔ細胞のこうした性質により、多くの研究者は、ＣＤ８⁺T細胞へのペプチドの提示に関与する分子機構をより良く理解するために、標的細胞内でのクラスＩ／ペプチド複合体の形成、及びこれに続くこれら複合体の標的細胞表面上への提示に到る過程の研究に力を入れた。クラスＩＭＨＣ分子によって結合されたペプチドの切断及び輸送に関与する過程については、今、明らかにされつつあることろであるが、現在までに、いくつか詳細なことがわかっている。

簡潔に言えば、クラスＩ分子にとって抗原となるペプチドの細胞質タンパク質からの生成（Tevethia, S. S., et al. Virology 107:13-23（1980）; Bennink, J. R., et al. Nature 296:75-76（1982）; Yewdell, J. W., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1785-1789（1985）; Yewdell, J. W., et al. Science 239: 637-640（1988）; Townsend, A. R. M., et al. Cell 39, 13-25（1984））は、未知の細胞質にあるプロテアーゼによって行われる。一旦細胞質で生成すると、これらのペプチドはＴＡＰ１及びＴＡＰ２と呼ばれるＭＨＣにエンコードされる２個の遺伝子産物の存在を必要とする過程を経て小胞体（ＥＲ）に運ばれる（Deverson, E., et al. Nature 348: 738-741（1990）; Trowsdale, J., et al. 348: 741-744（1990）; Spies, T., et al. Nature 348: 744-747（1990）; Monaco, J. J., et al. Science 250: 1723-1726（1990））。ＥＲにおいて、ペプチドはクラスＩＭＨＣ分子と非共有的に結合してクラスＩＭＨＣ／ペプチド複合体を形成し、次いでこれが細胞表面に輸送される。細胞表面上に提示されたクラスＩ／ペプチド複合体はＣＤ８⁺Ｔ細胞の細胞表面受容体のリガンドとして働き、そして提示されたペプチドに対するＴ細胞の応答を引き出すことができる。最終的にＣＤ８⁺Ｔ細胞への抗原提示に到るプロセシング経路が複雑であるため、ここに概略した抗原プロセシング経路の構成員のいずれかひとつでも発現しない場合には、ＣＴＬＳに対する抗原の提示が減少することになると予想される。

Eisenlohrら（Cell 71: 963-972（1992））及びAndersonら（J. Exp. Med. 174: 489-492（1991））の最近の研究では、ＴＡＰ１及びＴＡＰ２をエンコードする遺伝子に欠失を有する細胞系では対照細胞と比較してＣＴＬｓに対する抗原の提示が劇的に減少しているが、抗原となるペプチドをＥＲシグナル配列のカルボキシ末端側の近くにつないだ“ミニ遺伝子”をこれらの細胞に導入することにより、ＴＡＰ欠損細胞系でも効果的な抗原提示が達成されることが証明された。こうしたシグナル配列は一般にタンパク質のＮＨ₂−末端にみられ、その機能はそのタンパク質をＥＲ膜に向かわせることである。しかしながら、これらの研究にみられるＥＲシグナル配列の抗原提示に対する増幅効果は対照細胞ではみられないこと、従ってＴＡＰ欠損細胞系にインビトロでトランスフェクションあるいは感染をさせた場合にのみみられることに注意すべきである。しかしながら、近年、ＴＡＰ１及びＴＡＰ２の発現は細胞をガンマ−インターフェロンに曝した後に増大するという他の研究者による知見（Trowsdale, J., et al. Cell, 348: 741-744（1990））から、細胞質から開始された抗原提示はインビボでは制限されているという考えを支持する証拠が出された。この結果より、ＴＡＰ−介在性のペプチド輸送はインビトロと同様インビボで制限されている可能性があり、従ってインビボでのペプチドの輸送を増大できるか、または輸送活性全体を迂回できる方法によって、Ｔ細胞に対するペプチドの提示を増加させることができると示唆された。

本発明は、小胞体シグナル配列ペプチドと少なくとも１個の他のペプチドを含有する免疫原性キメラタンパク質に関する。免疫原性キメラタンパク質はインビボで特異的なＴ細胞応答を引き出すために用いられる。

本発明は、均等な天然の核酸配列と同様に免疫原性キメラタンパク質の製造を指令することのできる合成核酸配列に関する。この応用のためには、核酸配列とはＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはこれらの合成による変異型であって免疫原性キメラタンパク質をエンコードするいずれのものをもいう。

本発明はまた、免疫原性キメラタンパク質または該免疫原性キメラタンパク質をエンコードする核酸配列を薬理学的に許容し得る担体中に含有する、哺乳動物を癌、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染あるいは自己免疫疾患に対して免疫化するためのワクチンに関する。

本発明はまた癌、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染あるいは自己免疫疾患にり患した哺乳動物の予防または治療のための医薬組成物を提供する。該医薬組成物は免疫原性キメラタンパク質または該免疫原性キメラタンパク質をエンコードする核酸配列を適当な希釈剤または担体中に含有する。

本発明は更に下記（ａ）〜（ｃ）からなる、癌、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染あるいは自己免疫疾患の治療方法に関する：
（ａ）特異的なＴ細胞応答を引き出すのに有効な量の免疫原性キメラタンパク質または該免疫原性キメラタンパク質をエンコードする核酸配列で哺乳動物を免疫化し；
（ｂ）該Ｔ細胞を該免疫化した哺乳動物から単離し；そして
（ｃ）該Ｔ細胞を該免疫化した哺乳動物あるいは免疫化していない哺乳動物に治療学的に有効な量で適用する。

発明の詳細な説明
本発明は、小胞体（ＥＲ）シグナル配列ペプチドと少なくとも１個の他のペプチドを含有する免疫原性キメラタンパク質に関する。本発明のためには、“シグナル配列ペプチド”とは、一般にタンパク質のアミノ末端に位置することがこの分野で知られており、該タンパク質を小胞体に向かわせることのできる、約１５から約２５個のアミノ酸の長さのアミノ酸配列をいう。好ましい具体例で、利用されるシグナル配列ペプチドとして、アデノウイルスタイプ５、Ｅ３／１９Ｋ遺伝子産物由来のもの（Persson, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6349-6353（1980））があり、これは以下の配列番号１として示される。

しかしながら、多くの他のシグナル配列ペプチドが知られており（van Heijne, G., J. Mol. Biol. 184: 99-105（1985））、これらのペプチド配列またはその類縁体は本発明の免疫原性キメラタンパク質において配列番号１に置き代わることができることは当業者が容易に認めるところである。

“他のペプチド”とは、明細書及び請求の範囲を通して用いているように、あるペプチドをＥＲシグナル配列ペプチドを含有する免疫原性キメラタンパク質の１部として用いた場合に免疫原性があることを示す。すなわち、“他のペプチド”自体は免疫原性があってもなくても良い。１つの具体例として、他のペプチドは約５から約１０００個のアミノ酸の長さの範囲であり、腫瘍細胞、ウイルス、細菌、または寄生虫由来のもの、あるいは自己免疫疾患と関連するものでも良い。

好ましい具体例で、他のペプチドは約８から約１０個のアミノ酸の長さである。こうしたペプチドの例として、配列番号２

で示すアデノウイルスＥ１Ａペプチド（Kast et al. Cell, 59: 603-314（1989））、配列番号３

で示すＳＶ４０Ｔ抗原ペプチド（Gould et al. J. Virol., 65: 5401-5409（1991））のような腫瘍ペプチド、及び配列番号４

で示すエプスタイン・バールウイルス抗原ペプチド（Burrows, S. R. et al. Eur. J. Immunol. 22: 191-195（1992））、配列番号５

で示すインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の核タンパク質のペプチドＮＰ１４７−１５３（Rotzscke, O. et al. Nature 348: 252-254（1990））のようなウイルスペプチドがあるが、これに限定されるものではない。

典型的な腫瘍ペプチドはＰ８１５肥満細胞腫細胞由来のＰＩＡ（Lethe, B., Eur. J. Immunol., 22: 2283-2288（1992））である。ＰＩＡの配列は配列番号６で示す。

本発明において、シグナル配列ペプチドと他のペプチドが免疫原性キメラタンパク質の中で配置される順序は変えることができる。１つの具体例として、他のペプチドはシグナル配列ペプチドより先にあるか、またはアミノ末端側にある。好ましい具体例は、シグナル配列ペプチドが他のペプチドのアミノ末端側にあるものである。これらの配置の順序に関わらず、シグナル配列ペプチドと他のペプチドはゼロから約１０００個のアミノ酸によって分離していても良い。好ましい具体例は、シグナル配列ペプチドと他のペプチドは互いに直接隣り合っている、すなわち０個のアミノ酸で分けられているものである。

更に別の具体例として、免疫原性キメラタンパク質の中に他のペプチドの複数個のコピーがあっても良い。該他のペプチドのコピーの数は２から１００の範囲である。好ましいコピーの数は、約２から約１０である。好ましい具体例としては、シグナル配列ペプチドは他のペプチドの複数個のコピーのアミノ末端側にあり、これらの複数個のコピーは途切れることなく連続して配置したものがある。

更に別の具体例として、数種の異なる他のペプチドが免疫原性キメラタンパク質内にあり、異なる他のペプチドの数が２から約１０個の範囲のものがある。好ましい具体例としては、これらの他のペプチドがシグナル配列ペプチドの後にあり、他のペプチドの配置順は変えられるように連続して配置したものがある。

本発明の免疫原性キメラタンパク質は合成ポリペプチド、または免疫原性キメラタンパク質をエンコードする核酸配列から合成されるタンパク質として提供することができる。
１つの具体例として、合成免疫原性キメラタンパク質は、免疫原性キメラタンパク質に含有されるべきシグナル配列ペプチドと他のペプチドの既知のアミノ酸配列に基づいて合成することができる。ＰＩＡ腫瘍ペプチドのアミノ末端側にＥＲシグナル配列を含有する好ましい免疫原性キメラタンパク質のアミノ酸配列は配列番号７として示す。

当業者であれば、約２５から約１００個の範囲のアミノ酸の長さの免疫原性キメラタンパク質は種々のメーカーから販売されている自動化された装置で合成でき、また注文して調製することもできることを知っているだろう。

もう１つの具体例として、免疫原性キメラタンパク質は核酸配列から発現させることができ、こうした配列としてはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク合成を指令し得るこれらの変異型のいずれでも良い。１つの具体例としては、シグナル配列ペプチドと他のペプチドをコードする配列を含有するそれぞれの制限消化断片を連結し、原核生物または真核生物の細胞内で機能する適当な発現ベクターに挿入することができる。こうした制限消化断片はシグナル配列ペプチドまたは他のペプチドをエンコードする原核生物または真核生物の細胞から単離されたクローンから得ることができる。

適当な発現ベクターとは、免疫原性キメラタンパク質をコードする完全な核酸配列を運び、発現できるベクターを意味する。
こうしたベクターとして、好ましい、あるいは必要な作動性エレメントと共に上記のような核酸配列が挿入され、次いで宿主の中に運ばれ、その中で複製されるベクターがある。好ましいベクターは、その制限部位がよく報告され、核酸配列の転写に好ましい、あるいは必要な作動性のエレメントを含有するものである。

ここでいう“作動性エレメント”とは、少なくとも１個のプロモーター、少なくとも１個のオペレーター、少なくとも１個のリーダー配列、少なくとも１個の決定因子、少なくとも１個の終止コドン、そしてベクターの核酸の適当な転写及びこれに続く翻訳に必要な、あるいは好ましい他のＤＮＡ配列を含む。特に、こうしたベクターは、核酸配列の転写を開始できる、少なくとも１個の選択し得るマーカー及び少なくとも１個のプロモーター配列と共に、宿主内で認識され得る少なくとも１個の複製の元の配列を含有することが期待される。

本発明のクローニングベクターをつくるために、免疫原性キメラタンパク質及びそれに付き添う作動性エレメントをエンコードする核酸配列の複数個のコピーをそれぞれベクターに挿入することができることに更に注意すべきである。こうした具体例では、宿主は１個のベクターから目的とする免疫原性キメラタンパク質をより大量に製造するであろう。同様のやり方で、複数の異なる免疫原性キメラタンパク質及びそれに付き添う作動性エレメントをエンコードする核酸配列の１個の（または複数の）コピーをベクターに挿入することによって、１個のベクターからそれぞれの免疫原性キメラタンパク質を発現させることができる。更に別の具体例として、internal ribosomal entry site（ＩＲＥＳ）の統制下でそれぞれの免疫原性キメラタンパク質の発現を行うことで、複数の（配列が同一または異なる）免疫原性キメラタンパク質が１個のベクターから発現できるポリシストロン性ベクターがつくられる（Molla A. et al. Nature 356: 255-257（1992）; Jang S. K. et al. J. of Virol. 263: 1651-1660（1989））。ベクターに挿入される免疫原性キメラタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列のコピーの数は、適当な宿主に運ばれ、そこで複製・転写されるために、生成するベクターの大きさの限界にのみ制限される。

発現ベクターの好ましいものは真核生物細胞内で機能するものである。こうしたベクターの例としてワクシニアウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスがあるが、これらに限定されるものではない。最も好ましいベクターはワクシニアウイルスである。実施例１では本発明で用いるワクシニアウイルス構造物、ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５の構造を記載する。

更に他の具体例として、ＥＲキメラタンパク質をエンコードする合成オリゴヌクレオチドを合成し、適当な発現ベクター内にサブクローン化することができる。好ましいオリゴヌクレオチド配列を配列番号８に示す。

当業者であれば、オリゴヌクレオチドは種々のメーカーから販売されている自動化された装置で合成でき、あるいは注文により調製できることがすぐわかるであろう。
免疫原性キメラタンパク質をエンコードする核酸配列が適当な発現ベクター内に存在すると、発現ベクターは適当な真核生物細胞系で免疫原性キメラタンパク質を発現するために利用できる。こうした真核生物細胞系としてはＨｅＬａ、Ｌ９２９、Ｔ２またはＲＭＡ−Ｓのような細胞系があるが、これらに限定されるものではない。好ましい真核生物細胞系はＴ２及びＲＭＡ−Ｓである。１つの好ましい方法は、Ｔ２またはＲＭＡ−Ｓ細胞系にトランスフェクトするためにワクシニアウイルス構造物を利用するものである。発現した免疫原性キメラタンパク質は代謝的放射標識のようなこの分野で知られる方法で検出することができる。

更に他の具体例としては、細胞内で発現した免疫原性キメラタンパク質を粗ライゼートとして得るか、あるいは分画沈澱、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、アフィニティー及びイムノアフィニティークロマトグラフィー等を含むこの分野で知られる標準的なタンパク質精製方法で精製できる。イムノアフィニティークロマトグラフィーの場合、免疫原性キメラタンパク質は免疫原性キメラタンパク質に特異的な抗体が結合した樹脂を含有するカラムを通過させることによって精製することができる。

本発明はまた、他のペプチドに対するＴ細胞の応答を引き出すのに有効な量の免疫原性キメラタンパク質を適用することからなる免疫化の方法を提供する。このようなＴ細胞の応答は、⁵¹Ｃｒ遊離アッセイ（Restifo, N. P. J. of Exp. Med., 177: 265-272（1993））を含む種々のアッセイによって測定できる。このような細胞障害性応答をすることのできるＴ細胞は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）、ＣＤ４⁺Ｔ細胞またはこれら双方である。

免疫原性キメラタンパク質は、純粋な、または実質的に純粋な形で適用し得るが、薬理学的な組成物、処方または製剤として提供するのが好ましい。そうした処方では、免疫原性キメラタンパク質は１種またはそれ以上の薬理学的に許容し得る担体及び任意の他の治療のための成分と共に含有される。便宜的には処方は１回の投与量で提供し、製薬分野でよく知られる方法で調製することができる。

全ての方法において、活性成分を１種またはそれ以上の補助成分を構成する担体と関連させる段階がある。一般に、処方は均一に、そして活性成分を液体担体または微粉砕された固体担体あるいはこれら双方と密に関連させ、必要に応じ、製品を望みの処方に成型して調製される。

静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内投与に適した処方では、好ましくは患者の血液と等張な活性成分の殺菌した水溶液を含有するのが好適である。こうした処方は固体の活性成分を塩化ナトリウム（例えば０．１−２．０Ｍ）、グリシン等のような生理的に適合する物質を含有し、生理的条件に適合する緩衝されたｐＨを有する水に溶解させて水溶液とし、該水溶液を殺菌することで調製することができる。これらは、例えば密閉したアンプルまたはバイアルのような１回量または数回量分の容器に入れることができる。

本発明の処方には安定剤を入れることができる。安定剤の例としては、ポリエチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機酸及び有機酸があり、単独で、または混合剤として用いられる。これらの安定化剤は抗体の重量に対して０．１１−１０，０００倍量で用いるのが好ましい。２種またはそれ以上の安定化剤であっても適当な濃度及びｐＨの水溶液において用いられる。このような水溶液で調整される特異的な浸透圧は、一般に０．１−３．０osmosesの範囲であり、好ましくは０．８０−１．２の範囲である。水溶液のｐＨは５．０−９．０の範囲、好ましくは６−８の範囲に調整する。本発明の免疫原性キメラタンパク質を調製するにあたり、抗−吸着剤を用いることができる。

作用の持続時間をコントロールするために、更に別の薬理学的方法を用いることができる。タンパク質またはその誘導体と複合体を形成するか、これを吸着するポリマーを利用して製剤の放出をコントロールすることができる。送達のコントロールは、放出のコントロールのために用いる方法と同様、適当な高分子（例えばポリエステル、ポリアミンの酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または硫酸プロタミン）及びその高分子の濃度を選択することで行うことができる。製剤の放出をコントロールすることによって作用の持続時間をコントロールするために可能な他の方法は、タンパク質、タンパク質類似体、またはその機能的な誘導体を、ポリエステル、ポリアミンの酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテート共重合体のような重合性物質の粒子の中に取り込むものである。

あるいはまた、これらの薬剤を重合性粒子中に取り込む代わりに、これらの物質を、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルのような、コアセルベーション法や界面重合法によって調製したマイクロカプセル、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル及びナノカプセルのようなコロイド状の薬物運搬システム、あるいはマクロエマルジョン中に包接することが可能である。

経口投与の薬剤が要求される場合には、組成物をラクトース、スクロース、澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウムまたはアラビアガムのような典型的な担体と組み合わせることができる。

更に他の具体例として、免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成を指令し得る核酸配列をＴ細胞の応答を引き出すのに有効な量で適用することからなる免疫化の方法がある。こうした核酸配列は、当業者に知られる方法で適当な発現ベクターに挿入される（図１）。インビボで高率で遺伝子の転移をさせるのに適した発現ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス及びワクシニアウイルスのベクターがある。そのような発現ベクターの作動性エレメントは本明細書で先に開示しており、また当業者に知られているものである。好ましいベクターはワクシニアウイルスである。免疫原性キメラタンパク質の宿主細胞による合成を指令し得る核酸配列を含有する発現ベクターは、純粋な、または実質的に純粋な形で、あるいは核酸に親和性を有する物質及び核酸に親和性を有する物質に結合したインターナリゼーション因子との複合体として適用することができる（WuG. et al. J. Biol. Chem. 262: 4429-4432（1987）; Wagner E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3655-3659（1990））。核酸に親和性を有する物質で好ましいものは、ポリリジンのようなポリカチオンである。インターナリゼーション因子には、マクロファージ、リンパ球、Ｂ細胞、樹状細胞またはランゲルハンス細胞のような免疫原提示細胞の表面上に存在する受容体に対して特異性を有するリガンドがある。インターナリゼーション因子として好ましいものには、トランスフェリン及び免疫原提示細胞に特異的な抗体があるが、これらに限定されるものではない。

免疫原性キメラタンパク質をエンコードする核酸配列を含有する発現ベクターは、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内または経口投与することができる。好ましい投与形態は静脈内投与である。

免疫原性キメラタンパク質及び免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成を指令し得る核酸配列を含有する発現ベクターは、キットの形で、単独で、または上記の医薬組成物の形で供給できる。

本発明はまた、薬理学的に許容し得る担体中に免疫原性キメラタンパク質または免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成を指令し得る核酸配列を含有する発現ベクターを含有する、癌、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または自己免疫疾患に対して哺乳動物を免疫化するためのワクチンに関する。他の具体例で、異なる免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成を指令し得る核酸配列をそれぞれ含有する複数の発現ベクターは、多価のワクチンとして適用できる。

ワクチンの接種は伝統的な方法で行うことができる。例えば、免疫原性キメラタンパク質を食塩水または水のような適当な希釈剤、あるいは完全または非完全アジュバントの中で用いることができる。更に、タンパク質の免疫原性をより強くするために、免疫原性キメラタンパク質を担体に結合させても、またさせなくても良い。こうした担体分子の例として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシガイ（keyhole limpet）のヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド等があるが、これらに限定されるものではない。免疫原性キメラタンパク質はＴ細胞応答を引き出すのに適した、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下等のいずれの経路によっても投与することができる。免疫原性キメラタンパク質は、Ｔ細胞応答が引き出されるまで、１回または周期的な間隔をおいて投与できる。Ｔ細胞応答を引き出すのに有効な免疫原性キメラタンパク質の投与量は、約０．００００１から約１０mg/kgの範囲である。Ｔ細胞応答を引き出すのに有効な、免疫原性キメラタンパク質をエンコードする発現ベクターの投与量は、約１０⁵から約１０⁷プラーク形成単位の範囲である。Ｔ細胞応答は、細胞障害性アッセイ、増殖アッセイ及びサイトカイン放出アッセイを含む当業者に知られる種々の方法によって検出できるが、これらに限定されるものではない。

本発明はまた、免疫原性キメラタンパク質または免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成を指令し得る核酸配列を含有する発現ベクターを含有する医薬組成物を治療的に有効な量で適用することからなる、癌、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染または自己免疫疾患を治療する方法に関する。ワクチンの場合と同様、複数の発現ベクターを同時に適用しても良い。治療に用いる場合、免疫原性キメラタンパク質または免疫原性キメラタンパク質をエンコードする発現ベクターは感染初期（または直後）に、あるいは癌、ウイルス、細菌、寄生虫または自己免疫疾患によって引き起こされる感染または疾患の何らかの症状の始まった時に投与する。免疫原性キメラタンパク質または免疫原性キメラタンパク質をエンコードする発現ベクターの治療としての適用により、感染または疾患の程度を弱くすることができる。

好ましい具体例は、免疫原性キメラタンパク質をエンコードする核酸配列を含有するワクシニアウイルスを哺乳動物に治療学的に有効な量で適用することからなる治療方法である。腫瘍ペプチドまたはウイルスペプチドを含有する免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成を指令し得るワクシニアウイルスベクターはこれらのペプチドに対するＴ細胞応答を引き出すことができることが既に報告されている（実施例２−５参照）ことから、疾患を治療する有用性は示されている。

本発明はまた、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる、癌、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染または自己免疫疾患を治療する方法に関する：
（ａ）特異的なＴ細胞応答を引き出すのに有効な量の免疫原性キメラタンパク質または免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成を指令し得る発現ベクターで哺乳動物を免疫化し；
（ｂ）該Ｔ細胞を該免疫化された哺乳動物から単離し；そして
（ｃ）該Ｔ細胞を該免疫化された哺乳動物または免疫化されていない哺乳動物に治療学的に有効な量で適用する。
免疫原性キメラタンパク質に含有される他のペプチド（例えば腫瘍ペプチド）に対して反応するＴ細胞集団は、免疫原性キメラタンパク質で免疫後約３から約３０日後に、免疫化されたドナーの末梢血試料または脾細胞から単離することができる。エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）はヒトリンパ球を不死にするために用いられ、またヒト融合パートナーはヒトーヒトハイブリドーマをつくるために用いられる。免疫原性キメラタンパク質を用いてのインビトロでの最初の免疫化は、免疫原性ペプチドに反応するＴ細胞の生成のためにも用いることができる。

Ｔ細胞は約７から約９０日間培養され（Yanelli, J. R. J. Immunol. Methods 139: 1-16（1991））、その後Ｔ細胞活性をアッセイする既知の方法を用いて免疫原性キメラタンパク質に含有される他のペプチドに対して目的の活性を有するクローンを決定するためにスクリーニングされる；目的の活性を有するＴ細胞がこうして選択される。

上記のＴ細胞は、約１０⁷から約１０¹¹個のＴ細胞を哺乳動物に静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下投与することによって、癌、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染または自己免疫疾患にり患した患者の治療にインビボで用いることができる。好ましい投与形態は静脈内または腹腔内投与である。

ここに引用した論文または特許は参考のために入れたものである。以下の実施例は本発明の種々の面を説明するものであるが、決してその範囲を制限することを意味するものではない。

材料および方法
以下の実施例において用いた材料および方法は次のとおりである：
方法以下の実施例において用いたワクチニアウイルス（ＶＶ）構築物は次のものである：ＶＶ−ＮＰは、インフルエンザウイルスＡ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８）（Ｙｅｗｄｅｌｌ，Ｊ．Ｗ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：１７８５−１７８９（１９８５）の全長核蛋白質（ＮＰ）遺伝子をコードする；ＶＶ−ＮＰ１４７−１５５は、ＮＰ遺伝子の９アミノ酸の「最少決定因子（ｍｉｎｉｍａｌｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）」（Ｒｏｔｚｓｃｈｋｅ，Ｏ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８：２５２−２５４（１９９０））をコードする；ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５は、ＰＲ８のＮＰ遺伝子からの９アミノ酸長さの「最少決定因子」を用いるが、アデノウイルス５型Ｅ３／１９ＫからのＥＲシグナル配列の後に配置されている；ＶＶ−ＮＰ１４７−１５５ＥＳでは、ＥＲシグナル配列が最少決定因子の下流に配置されている；ＶＶ−ＥＳＯＶＡ２５７−２６４は、同一のＥＲシグナル配列からなるが、その後に卵白アルブミンの最少決定因子を有する；ＶＶ−ＥＳＶＳＶ５２−５９は、同一のＥＲシグナル配列からなるが、その後に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の核蛋白質遺伝子からの最少決定因子（ＶａｎＢｌｅｅｋｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８：２１３−２１５（１９９０）を有する；ＶＶ−ＥＳＰ１Ａは、同一のＥＲシグナル配列からなるが、その後にＰ１Ａ腫瘍抗原（Ｌｅｔｈ６，Ｂ．，ＥｗＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：２２８３−２２８８（１９９２））を有する。ＮＰ、ＥＳＮＰ１４７−１５５およびＮＰ１４７−１５５をコードするワクチニアウイルス構築物は既に記載されている（Ｙｅｗｄｅｌｌ，Ｊ．Ｗ．ｅｔａｌ（１９８５）；Ｅｉｓｅｎｌｏｈｒ，Ｌ．Ｃ．ｅｔａｌ（１９９２）；およびＷｅｉＭ．Ｌ．ｅｔａｌ（１９９２））。ＶＶ−ＥＳＯＶＡ２５７−２６４は、ＯＶＡ２５７−２６４ペプチド（Ｃａｒｂｏｎｅ，Ｆ．Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：６０３−６１０（１９８９））に対応する二本鎖合成オリゴヌクレオチドを、プラスミド中のＥ３／１９Ｋリーダー配列をコードし追加のＡｌａコドンを含むヌクレオチドのすぐ下流に挿入したことを除き、ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５について記載されているように構築した。ＶＶ−ＮＰ１４７−１５５ＥＳを構築するためには、Ｅ３／１９ＫＥＲシグナル配列に対応し、５’コーディング末端にＮｄｅＩ部位を、３’コーディング末端に二重の終止コドンをコードするように改変した二本鎖オリゴヌクレオチドを、改変ｐＳＣ１１（Ｅｉｓｅｎｌｏｈｒｅｔａｌ（１９９２））のＳａｌＩおよびＮｏｔＩ部位に挿入した。次に、この中間体プラスミド（ｐＳＣ１１−ＥＳ）をＳａｌＩおよびＮｄｅＩで切断し、適当なオーバーハング、開始ＭｅｔおよびＮＰ１４７−１５５に対応する残基をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドと連結した。ＶＶ−ＥＳＶＳＶ５２−５９およびＶＶ−ＥＳＰ１Ａは、実施例１に略述されるプロトコールにしたがって構築した。外来遺伝子を、ＣＶ−１細胞内での同種組み換え（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３４０３−３４０９（１９８５））によりＶＶチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子中に挿入し、ブロモデオキシウリジンの存在下で、ＴＫ^-ヒト１４３Ｂ骨肉腫細胞株（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）中で３プラーク精製を３ラウンド実施した後、同一の細胞内で成長させた。ＶＶ−ＮＰは、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を欠失するプラスミド（同種組み換えの後、プラスミド挿入物を有するｒＶＶ（組み換えワクチニアウイルス）を同定するために用いた）を用いて製造した。

Ｔ細胞活性のための ⁵¹ Ｃｒ放出アッセイ
８−１０週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０⁶プラーク形成単位（ＰＦＵ）のｒＶＶを静注（ｉ．ｖ．）した。６日後、牌臓を除去し、ダウンスホモジナイザーを用いて、７．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むイスコーブ（Ｉｓｃｏｖｅ）改変ＤＭＥＭ（ＩＤＭＥＭ）中で分散させて単一細胞懸濁物とした。脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）Ｔ細胞の細胞毒性をアッセイするために用いた標的細胞は、Ｐ８１５肥満細胞腫細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）、ＣＴ２６繊維肉腫細胞、またはＲＭＡ−Ｓ腫瘍細胞（Ｌｊｕｎｇｒｅｎ，Ｈ．Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２：１７４５−１７５９（１９８５））であった。標的細胞は、標的細胞をＮａ⁵¹ＣｒＯ₄および適当な実施例において示されるペプチド１μＭとともに３７℃において１時間共インキュベートすることにより、抗原特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞による溶解に感受性にさせた。ＨＰＬＣ精製ペプチドＮＰ１４７−１５５、ＯＶＡ２５７−２６４、ＶＳＶ５２−５９およびＰ１Ａは、ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓＢｒａｎｃｈ，ＮＩＡＩＤ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤより提供された。実施例２−４においては、Ｐ８１５細胞を、１０ＰＦＵ／細胞の多重度で、野生型ＶＶに１時間感染させ、次にＮａ⁵¹ＣｒＯ₄（⁵¹Ｃｒ）（Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．Ｐ．（１９９３））を用いて３７℃において１時間標識した。標的細胞（適当なペプチドでパルスした、またはワクチニアウイルスに感染させた）を脾臓細胞とともに、種々のエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）（特定の比率については実施例を参照のこと）で３７℃において６時間インキュベートした。放出された⁵¹Ｃｒの量を、ガンマ計数により決定し、特異的溶解のパーセンテージを次のようにして計算した：
［（実験ｃｐｍ−自然ｃｐｍ）／（最大ｃｐｍ−自然ｃｐｍ）］×１００。

実施例１
免疫原性キメラ蛋白質の発現に用いるワクチニアウイルス構築物の構築
図１に示すプラスミドｐＳＣ１１（Ｄｒ．ＢｅｒｎａｒｄＭｏｓｓ，ＮＩＡＩＤ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄより寄贈）を、同種組み換え（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉｅｔａｌ．，１９８５）によりワクチニアウイルス中に挿入されうる免疫原性キメラ蛋白質をコードする核酸配列を含むプラスミドの構築のための出発材料とした。この実施例は、免疫原性キメラ蛋白質ＥＳＮＰ１４７−１５５をコードする核酸配列を含むプラスミドの製造のプロトコールを記載するが、このプロトコールは他の免疫原性キメラ蛋白質をコードするプラスミドの製造にも容易に用いることができる。配列番号９：

および配列番号１０：

として示される相補オリゴヌクレオチドを合成し（ＳｕｒｇｅｒｙＢｒａｎｃｈ，ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、リン酸化し、一緒にアニーリングして、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限部位を含む二本鎖ＤＮＡポリリンカーを形成した。次に、このポリリンカーＤＮＡを、ＳｍａＩで切断したｐＳＣ１１に平滑末端ライゲーションにより挿入し、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩポリリンカープラスミドを有するｐＳＣ１１プラスミド（ｐＳＣ１１リンカープラスミド）を作成した。配列番号１１：

および配列番号１２：

に示される相補オリゴヌクレオチドを合成し、リン酸化し、一緒にアニーリングして、アデノウイルスＥ３／１９Ｋシグナル配列およびＮｏｔＩおよびＳｔｙＩ制限部位をコードする二本鎖ＤＮＡを形成した。次に、このＥ３／１９Ｋシグナル配列ＤＮＡを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで切断した上述のｐＳＣ１１リンカープラスミド中にサブクローニングして、Ｅ３／１９Ｋシグナルプラスミドと称されるプラスミドを作成した。配列番号１３：

および配列番号１４：

に示される相補オリゴヌクレオチドを合成し、リン酸化し、一緒にアニーリングして、ＮＰ１４７−１５５ペプチドおよび二重の終止コドンおよびＮｏｔＩおよびＳｔｙＩ制限部位をコードする二本鎖ＤＮＡを形成した。次に、ＮＰ１４７−１５５ＤＮＡを、ＮｏｔＩおよびＳｔｙＩで切断したＥ３／１９Ｋシグナルプラスミド中にサブクローニングした。得られたプラスミドは、ＥＳＮＰ１４７−１５５をコードしており、これを上述のようにワクチニアウイルスに挿入して、ワクチニアウイルス構築物ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５を製造した。

実施例２
Ｔ細胞応答発生におけるワクチニアウイルス構築物ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５の効力
ＥＲシグナル配列の後に配置されたペプチドを含む免疫原性キメラ蛋白質を用いることにより抗原提示の有効性が最適化されるという見解を試験するために、５×１０⁶プラーク形成単位（ｐｆｕ）の、上述のワクチニアウイルス構築物：ＶＶ−ＮＰ、ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５、ＶＶ−ＮＰ１４７−１５５ＥＳまたはＶＶ−ＥＳＯＶＡ２５７−２６４の１つをマウスに静脈内投与した。

静注から６日後、マウスを殺して脾臓を回収した。脾臓細胞を⁵¹ＣＲ放出アッセイにおいて、Ｐ８１５標的細胞のみ（左パネル）、ＮＰ（インフルエンザウイルス核蛋白質）のアミノ酸残基１４７−１５５に対応する合成ペプチドでパルスしたＰ８１５細胞（中パネル）またはワクチニアウイルスに感染させたＰ８１５細胞（右パネル）に対する細胞毒性について試験した。免疫したマウスから得た脾臓細胞（すなわち、エフェクター細胞）を、一定の数のＰ８１５標的細胞とともに、図２の横軸（ｘ）に示される種々の比でインキュベートした。⁵¹Ｃｒ標識標的細胞に対する脾臓細胞の毒性を、ｙ軸に示されるように、特異的⁵¹Ｃｒ放出（％）として測定した。予期されたように、試験したすべてのワクチニアウイルス構築物は、ワクチニアウイルス感染Ｐ８１５細胞に対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を同様に引き出すことができ（右パネル）、非感染対照Ｐ８１５細胞に対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を同様に引き出すことができなかった（右パネル）ことを示した。しかし、ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５で免疫したマウスから得た脾臓細胞のみが、ＮＰ残基１４７−１５５に対応する合成ペプチドとプレインキュベートしたＰ８１５標的細胞を溶解（ｌｙｓｅ）させる能力を有することによって示されるように、ＮＰ特異的活性を示した（中パネル）。さらに、ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５で免疫したマウスから得た脾臓細胞のみが、インフルエンザウイルス感染Ｐ８１５細胞を、ＮＰ１４７−１５５ペプチドでパルスしたＰ８１５細胞について観察されたもの（中パネル、図２）とほぼ同じレベルで特異的に溶解させることが観察された（データ示さず）。その上、ＶＶ−ＥＳＯＶＡ２５７−２６４で免疫したマウスから得た脾臓細胞が、ペプチドＮＰ１４７−１５５でパルスした細胞を特異的に溶解することができなかった（中パネル）ことは、ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５の増強された免疫原性が、Ｅ３／１９Ｋシグナル配列の非特異的効果に起因するものではないことを示した。最後に、ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５またはＶＶ−ＮＰ１４７−１５５ＥＳのいずれかにより免疫したマウスから得た脾臓細胞の、ペプチドＮＰ１４７−１５５でパルスしたＰ８１５細胞に対する細胞毒性活性の大きな相違（中パネル）は、Ｅ３／１９Ｋシグナル配列が単にペプチドの疎水性を増加させることにより作用したのではないことを示した。

実施例３
ワクチニアウイルス構築物により免疫したマウスから得た脾臓細胞の応答の速度論
ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５の、他のＶＶ構築物と比較して見かけ上増強された免疫原性が、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の速度論における相違に起因するという可能性を試験するために、マウスに５×１０⁶ｐｆｕのＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５（図３Ａ）またはＶＶ−ＮＰ（図３Ｂ）を注入し、１から１９日後に、これらの脾臓細胞を、ペプチドでパルスしたＰ８１５（ペプチドＮＰ１４７−１５５）標的細胞を用いて、ＮＰ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞活性について試験した（図３Ａおよび３Ｂ）。使用したエフェクター対標的比は２００：１であった。ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５で免疫してから５から９日後のマウスから得た脾臓細胞を用いて、ＮＰペプチド特異的活性のピーク（すなわち、ＮＰ１４７−１５５ペプチドでパルスしたＰ８１５細胞、白三角により示される）を観察した。このＮＰ特異的活性は、ＶＶ特異的活性ピークに匹敵した（黒丸、ワクチニアウイルスに感染させたＰ８１５細胞）。ＶＶ−ＮＰ免疫マウスから得た脾臓細胞は、実験の全期間にわたり、無視しうるＮＰ特異的溶解活性を示した。ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５によりひき出されたものと同様の程度のＶＶ特異的応答が観察されたため、この結果は、このワクチニアウイルス構築物がＣ８⁺Ｔ細胞応答を引き出すことができなかったためではない。

実施例４
種々の用量のワクチニアウイルス構築物により免疫したマウスにおいて引き出されたＣＤ８ ⁺ Ｔ細胞応答
増加する用量のＶＶ構築物に対するマウスの一次ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を比較した（図４、与えられた用量は図の下部の記号により示される）（上のパネルは、ペプチドＮＰ１４７−１５５でパルスしたＰ８１５標的細胞を用い、下のパネルは、ワクチニアウイルスに感染させたＰ８１５標的細胞を用いる）。免疫感作の６日後、マウスを殺しその脾臓を回収した。⁵¹Ｃｒ放出アッセイの結果は、マウスが５×１０⁶ｐｆｕのＶＶ−ＮＰを注入した後の有意のＮＰ特異的応答を示さなかった（左パネル）のに対し、５×１０⁴ｐｆｕのＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５による免疫感作が、容易に検出しうるＮＰ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を誘導したこと（右パネル）を示す。アッセイされたエフェクター対標的比は、図の下部に示される。すなわち、ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５は、一次ＮＰ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の誘導において、他のＶＶ構築物より少なくとも１００倍有効性が高い。抗ＶＶＣＤ８⁺Ｔ細胞応答（下のパネル、ワクチニアウイルスに感染させたＰ８１５標的細胞）を、それぞれの用量の試験したワクチニアウイルス構築物において試験した。下のパネルに示される結果から、全てのＶＶ構築物が類似する応答を誘導することができ、したがって免疫原性の相違は、ＮＰ決定因子の側方の残基（すなわちＥＳシグナル配列）に関係していることが確認された。

図２のウイルス性ペプチドＮＰ１４７−１５５において観察される、５×１０⁶ｐｆｕの、ＶＶ−ＥＳＰ１Ａ、ＶＶ−Ｐ１ＡまたはＶＶ−ＥＳＮＰをマウスに投与した。静注の６日後に脾臓を回収し、脾臓細胞を静注によりＰ１Ａペプチドとともに６日間培養し、次に⁵¹Ｃｒ放出アッセイにおいてＣＴ２６腫瘍細胞（左パネル）、Ｐ１ＡペプチドでパルスしたＣＴ２６細胞（中パネル）、またはＰ８１５細胞（右パネル）に対する細胞毒性について試験した。エフェクター脾臓細胞の源は図５の下部に示され、⁵¹Ｃｒ放出アッセイは、２００：１、およびそれに続く２倍希釈列のエフェクター対標的比で実施した。予期されたように、試験した３つ全てのＶＶ構築物は、ＣＴ２６標的細胞に対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を引き出さなかった（左パネル）。さらに、ＶＶ−ＥＳＰ１Ａで免疫したマウスから得た脾臓細胞は、ＶＶ−Ｐ１Ａで免疫したマウスから得た脾臓細胞について観察されたものよりもはるかに高いＰ１Ａ特異的活性を示した（中および右パネル）。これらの結果は、免疫原性ペプチドのアミノ末端のＥＲシグナル配列を含むＥＲキメラ蛋白質を使用することが、クラスＩＭＨＣ分子との相互作用を介してプロセシングされたそのペプチドの抗原提示を増強させるのに一般に有用であろうことを示唆する。

実施例６
ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５またはＶＶ−ＮＰのいずれかで免疫したマウスから得た脾臓細胞の二次ＮＰ特異的応答
「ＥＳ」構築物（ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５）がＶＶ−ＮＰよりも効果的にＣＤ８⁺Ｔ細胞の二次応答をプライミングするか否かを決定するために、次の用量（ｐｆｕ）のＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５（丸）またはＶＶ−ＮＰ（三角）でマウスを免疫した：５×１０¹、５×１０²、５×１０³、５×１０⁴、５×１０⁵、５×１０⁶。次に、３０日間経過させてマウスに「記憶」応答を発生させ、この時点において、マウスを殺し、脾臓細胞を除去して、インフルエンザウイルスによりインビボで７日間刺激した。次に、⁵¹ＣＲ放出アッセイにおいて、二次的に刺激された脾臓細胞集団を、種々の希釈率で（各パネル、左から右へ、１：１、１：３、１：９、１：２７、１：８１および１：２３４）、ペプチドＮＰ１４７−１５５でパルスしたＰ８１５細胞に対してアッセイした。結果は、試験した低用量では、２つのＶＶ構築物の二次ＮＰペプチド特異的応答をプライミングする能力にはほとんど差がなかった（５００ｐｆｕという低いプライミングが観察された）ことを示す。しかし、５×１０⁴ｐｆｕまたはそれ以上の用量においては、ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５によるプライミングにより、脾臓細胞はＶＶ−ＮＰプライムマウスから得た脾臓細胞の約１０倍の活性に回復した。この結果は、最少免疫原性決定因子またはペプチドにシグナル配列を付加することにより、二次および一次ＮＰ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の両方が増強されることを示す。

実施例７
２以上の組み換えワクチニアウイルス構築物の単一用量での投与は、それぞれの構築物に特異的なＴ細胞応答を引き出す
同時に投与したとき、２つの異なるワクチニアウイルス構築物がＣＤ８⁺細胞応答を引き出すことができるか否かを決定するために、２×１０⁶ｐｆｕのＶＶ−ＥＳＶＳＶ５２−５９単独（上パネル）、５×１０⁶ｐｆｕのＶＶ−ＥＳＯＶＡ２５７−２６４単独（中パネル）または２×１０⁶ｐｆｕのそれぞれの構築物を一緒に（下パネル）をマウスに静注し、これらの脾臓細胞を単離した。免疫感作から６日後、マウスを殺して脾臓を回収した。次に、脾臓細胞を⁵¹Ｃｒ放出アッセイにおいて、対照ＲＭＡ−Ｓ細胞（左カラム）、ペプチドＶＳＶ５２−５９でパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞（中カラム）またはペプチドＯＶＡ２５７−２６４でパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞（右カラム）を溶解させる能力についてアッセイした（図７）。

アッセイは、５０：１Ｅ：Ｔ比（それぞれのパネルの最も右の点）、および連続する２倍希釈（すなわち、１００：１、２００：１等）を用いて実施した。予期されたように、試験したいずれの脾臓細胞も対照ＲＭＡ−Ｓ細胞を溶解しないが（左パネル）、ＶＶ−ＥＳＯＶＡ２５７−２６４で免疫したマウスから得た脾臓細胞は、ペプチドＯＶＡ２５７−２６４でパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞を特異的に溶解し（中列、右パネル）、ＶＶ−ＥＳＶＳＶ５２−５９で免疫したマウスから得た脾臓細胞は、ペプチドＶＳＶ５２−５９でパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞を特異的に溶解した（上列、中央パネル）。さらに、ＶＶ−ＥＳＯＶＡ２５７−２６４およびＶＶ−ＥＳＶＳＶ５２−５９の両方で免疫したマウスから得た脾臓細胞は、ＶＶ−ＥＳＶＳＶ５２−５９（上列、中央パネル）またはＶＶ−ＥＳＯＶＡ２５７−２６４（中列、右パネル）のいずれかで免疫したマウスから得た脾臓細胞について観察されたものに匹敵するレベルで、ＶＳＶ−特異的溶解（下列、中央パネル）およびＯＶＡ特異的溶解（下列、右パネル）を示した。すなわち、これらの結果は、それそれの構築物に対する特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を刺激する能力を失うことなく、２以上のワクチニアウイルス構築物を一緒に投与しうることを示す。

実施例８
Ｐ８１５腫瘍細胞による抗感染ワクチン
免疫原性キメラ蛋白質または免疫原性キメラ蛋白質をコードするワクチニアウイルス構築物は、ヒトおよび動物の両方において、癌、感染性疾患または自己免疫疾患を予防するために用いることができる。例えば、雌ＤＢＡ／２マウスに１０⁴−１０⁸ｐｆｕのワクチニアウイルスＶＶ−ＥＳＰ１Ａまたは０．１μｇから１．０ｍｇの対応するＥＲキメラペプチドを静脈内に与える。免疫感作から３日から６ヶ月後（免疫応答を生じさせるため）、マウスに１０²から１０⁶個のＰ８１５腫瘍細胞を、静脈内または腹腔内または皮下に与えてチャレンジする。次に、チャレンジ用量のＰ８１５の投与の直後から始めて、皮下腫瘍の測定またはマウスの死亡、または肺および／または肝および／または脾臓転移の視覚または顕微鏡検査による監視により、腫瘍の発達についてマウスを監視する。

実施例９
腫瘍Ｐ８１５を有する哺乳動物の治療方法
免疫原性キメラ蛋白質または免疫原性キメラ蛋白質をコードするワクチニアウイルス構築物は、癌、感染性疾患または自己免疫疾患を有する哺乳動物を治療する上で有効であろう。例えば、雌ＤＢＡ−２マウスに１０²から１０⁶個のＰ８１５腫瘍細胞を、静脈内または腹腔内または皮下に与える。腫瘍を確立させるために１から２１日経過した後、１０⁴−１０⁸ｐｆｕのワクチニアウイルスＶＶ−ＥＳＰ１Ａまたは０．１μｇから１．０ｍｇの対応するＥＲキメラ蛋白質をマウスに与える。次に、マウスの死亡、または肺および／または肝および／または脾臓転移の視覚または顕微鏡検査による監視のいずれかにより、腫瘍サイズの減少または腫瘍の完全な消失についてマウスを監視する。

実施例１０
Ｐ８１５腫瘍を有する哺乳動物の養子免疫療法による治療
雌ＤＢＡ／２マウスに、１０⁴−１０⁸ｐｆｕのワクチニアウイルスＶＶ−ＥＳＰ１Ａまたは０．１μｇから１．０ｍｇの対応する免疫原性キメラ蛋白質を静脈内に与える。免疫感作から約３日から６ヶ月後（免疫応答を生じさせるため）、マウスの脾臓または腫瘍を回収し、ドウンスホモジナイザーを用いて脾臓または腫瘍中に含まれるリンパ球を単離する。次に、これらのリンパ球を１０⁷−１０¹¹細胞で、Ｐ８１５誘導性腫瘍を有するマウスに静脈内または腹腔内投与する。処置は、１０²−１０⁶個のＰ８１５腫瘍細胞をマウスに静脈内または腹腔内または皮下に投与することによりＰ８１５腫瘍を誘導した後、１から２１日で実施することができる。次に、処置されたマウスを、マウスの死亡、または肺および／または肝および／または脾臓転移の視覚または顕微鏡検査による監視のいずれかにより、腫瘍サイズの減少または腫瘍の完全な消失について監視する。

上述の開示にかんがみて当業者には明らかなように、本発明の実施において、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの変更、改変および置換が可能である。

図１はアデノウイルスＥ３／１９Ｋシグナル配列ペプチド及び選択されたもう１つのペプチドを含有する免疫原性キメラタンパク質を発現させるために用いられるワクシニアウイルス（ＶＶ）構造物（construct）の構造を示す。図２は種々のワクシニアウイルス（図の右手）で免疫化されたマウスの脾細胞を、Ｐ８１５標的細胞（左図）、合成ペプチドＮＰ１４７−１５５でパルスしたＰ８１５細胞（中図）または野生型ワクシニアウイルス（ＶＶ）に感染したＰ８１５細胞（右図）といろいろなエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率でインキュベートして行った⁵¹Ｃｒ遊離アッセイの結果を示す。図３Ａ及び３ＢはワクシニアウイルスＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５（図３Ａ）またはＶＶ−ＮＰ（図３Ｂ）で（ＣＤ８⁺Ｔ細胞の活性を１つのアッセイで測定できるように）続けて免疫化したマウスの脾細胞を、合成ペプチドＮＰ１４７−１５５でパルスしたＰ８１５標的細胞（白三角）または野生型ワクシニアウイルス（ＶＶ）に感染したＰ８１５細胞（黒丸）と種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率でインキュベートして行った⁵¹Ｃｒ遊離アッセイの結果を示す。図４は種々の量のワクシニアウイルスＶＶ−ＮＰ（左図）またはＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５（右図）で免疫化したマウスの脾細胞を、ＶＶ−ＮＰ（上図）または野生型−ＶＶ（下図）に感染したＰ８１５細胞と種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率でインキュベートして行った⁵¹Ｃｒ遊離アッセイの結果を示す。図５はワクシニアウイルスＶＶ−ＥＳＰＩＡ（黒丸）、ＶＶ−ＰＩＡ（白三角）またはＶＶ−ＥＳＮＰ（黒三角）で免疫化したマウスの脾細胞を、ＣＴ２６標的細胞（左図）、ＰＩＡペプチドでパルスしたＣＴ２６細胞（中図）またはＰ８１５細胞（右図）と種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率でインキュベートして行った⁵¹Ｃｒ遊離アッセイの結果を示す。図６は組換えワクシニアウイルスＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５（黒丸）またはＶＶ−ＮＰ（白三角）で免疫化したマウスの脾細胞を、これらの脾細胞を合成ペプチドＮＰ１４７−１５５でパルスしたＰ８１５標的細胞で希釈してインキュベートする前にインフルエンザウイルスに感染した自家細胞（Restifo, N. P. et al. J. of Immunol. 47: 1453-1459（1991））と共に培養して行った⁵¹Ｃｒ遊離アッセイの結果を示す。図７はワクシニアウイルスＶＶ−ＥＳＶＳＶ５２−５９（最上列）、ＶＶ−ＥＳＯＶＡ２５７−２６４（中央列）またはこれらのウイルスを共に混合したもの（最下列）で免疫化したマウスの脾細胞を、ＲＭＡ−Ｓ標的細胞（左欄）、ペプチドＶＳＶ５２−５９でパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞（中欄）またはペプチドＯＶＡ２５７−２６４でパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞（右欄）とインキュベートして行った⁵¹Ｃｒ遊離アッセイの結果を示す。

Claims

（ａ）小胞体シグナル配列ペプチド；そして
（ｂ）SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4に記載されるウィルスペプチド、または水疱性口内炎（vesicular stomatitis）ウィルス核タンパク質；
を含む、免疫原性キメラタンパク質。
前記小胞体シグナル配列ペプチドがSEQ ID NO: 1に記載の配列を有する、請求項１に記載のキメラタンパク質。
前記ウィルスペプチドがSEQ ID NO: 4の配列を有する、請求項１に記載のキメラタンパク質。
請求項１〜３のいずれか1項に記載のキメラタンパク質をコードする核酸であって、場合により発現ベクターの形状である、前記核酸。
前記発現ベクターが、ワクシニアウィルスに由来する、請求項4に記載の発現ベクター。
本質的に、以下のもの：
（ａ）小胞体シグナル配列ペプチドをコードする第一のコード領域；そして
（ｂ）SEQ ID NO: 6に記載の腫瘍ペプチドをコードする第二のコード領域；
からなる免疫原性キメラタンパク質をコードする核酸であって、場合により発現ベクターの形状である、前記核酸。
前記発現ベクターがワクシニアウィルスに由来する、請求項６に記載の発現ベクター。
本質的に以下のもの：
（ａ）小胞体シグナル配列ペプチドをコードする第一のコード領域；そして
（ｂ）アデノウィルスE1Aペプチド、SV40 T抗原ペプチド、エプスタイン-バーウィルスペプチドそして水疱性口内炎（vesicular stomatitis）ウィルスタンパク質ペプチドからなる群から選択されるウィルスペプチドをコードする第二のコード領域；
からなる免疫原性キメラタンパク質をコードする核酸であって、場合により発現ベクターの形状である、前記核酸。
前記発現ベクターがワクシニアウィルスに由来する、請求項８に記載の発現ベクター。
請求項４〜９のいずれか1項に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
請求項１〜３のいずれか1項に記載のキメラタンパク質を医薬的に許容可能な担体中に含むワクチン。
請求項４〜９のいずれか1項に記載の核酸を医薬的に許容可能な担体中に含むワクチン。
請求項１〜３のいずれか1項に記載のキメラタンパク質および医薬的に許容可能な担体を含む、哺乳動物においてT細胞応答を誘導することができる、医薬組成物。
請求項４〜９のいずれか1項に記載の核酸および医薬的に許容可能な担体を含む、哺乳動物においてT細胞応答を誘導することができる、医薬組成物。
小胞体シグナル配列ペプチドと、腫瘍ペプチド、ウィルスペプチド、細菌ペプチド、寄生虫ペプチド、そして自己免疫疾患ペプチドからなる群から選択される第二ペプチドとを含む免疫原性キメラタンパク質を含むワクチンであって、前記キメラタンパク質が、前記第二ペプチドに対するT細胞応答を誘導するために有効な量である、前記ワクチン。
前記キメラタンパク質が腫瘍ペプチドを含む、請求項１５に記載のワクチン。
前記キメラタンパク質が細菌ペプチドを含む、請求項15に記載のワクチン。
前記キメラタンパク質が寄生虫ペプチドを含む、請求項15に記載のワクチン。
前記キメラタンパク質が自己免疫疾患ペプチドを含む、請求項15に記載のワクチン。
前記キメラタンパク質がウィルスペプチドを含む、請求項15に記載のワクチン。
小胞体シグナル配列ペプチドと、腫瘍ペプチド、ウィルスペプチド、細菌ペプチド、寄生虫ペプチド、そして自己免疫疾患ペプチドからなる群から選択されるペプチドを含む第二の配列とを含む、免疫原性キメラタンパク質をコードする核酸を含む免疫化するためのワクチンであって、前記核酸が、前記第二の配列によりコードされるペプチドに対するT細胞応答を誘導するために有効な量のキメラタンパク質を発現する、前記ワクチン。
小胞体シグナル配列ペプチドと、少なくとも一つのその他のペプチドを含む免疫原性キメラタンパク質とを含む、哺乳動物におけるガン、ウィルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または自己免疫疾患を治療するための医薬組成物であって、前記タンパク質が注射可能な形状であり、そして少なくとも一つのその他のペプチドに対するT細胞応答を誘導する、前記医薬組成物。
前記その他のペプチドが腫瘍ペプチドである、請求項２２に記載の医薬組成物。
前記その他のペプチドが細菌ペプチドである、請求項22に記載の医薬組成物。
前記その他のペプチドが寄生虫ペプチドである、請求項２２記載の医薬組成物。
前記その他のペプチドが自己免疫疾患ペプチドである、請求項２２記載の医薬組成物。
前記その他のペプチドがウィルスペプチドである、請求項２２に記載の医薬組成物。
免疫原性キメラタンパク質により免疫化された哺乳動物から単離されたT細胞を治療的有効量で含む、哺乳動物におけるガン、ウィルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または自己免疫疾患を治療するための医薬組成物であって：当該タンパク質が
（ａ）小胞体シグナル配列ペプチドおよび少なくとも一つのその他のペプチドを含み；
（ｂ）免疫化哺乳動物中で前記その他のペプチドに対するT細胞応答を誘導するために注射可能な形状である；
前記医薬組成物。
前記その他のペプチドが腫瘍ペプチドである、請求項２８に記載の医薬組成物。
前記その他のペプチドが細菌ペプチドである、請求項２８に記載の医薬組成物。
前記その他のペプチドが寄生虫ペプチドである、請求項２８記載の医薬組成物。
前記その他のペプチドが自己免疫疾患ペプチドである、請求項２８に記載の医薬組成物。
前記その他のペプチドがウィルスペプチドである、請求項２８に記載の医薬組成物。
ガン、ウィルス感染、細菌感染、寄生虫感染または自己免疫疾患に罹患した患者を治療するための医薬の製造のための、小胞体シグナル配列ペプチドと、腫瘍ペプチド、ウィルスペプチド、細菌ペプチド、寄生虫ペプチド、および自己免疫疾患ペプチドからなる群から選択されるペプチドとを含む免疫原性キメラタンパク質の使用方法。
ガン、ウィルス感染、細菌感染、寄生虫感染または自己免疫疾患に罹患した患者を治療するための医薬の製造のための、小胞体シグナル配列ペプチドと、腫瘍ペプチド、ウィルスペプチド、細菌ペプチド、寄生虫ペプチド、および自己免疫疾患ペプチドからなる群から選択されるペプチドを含む第二の配列とを含むキメラタンパク質をコードする核酸の使用方法。
腫瘍ペプチド、ウィルスペプチド、自己免疫疾患ペプチド、細菌ペプチドまたは寄生虫ペプチドに対する応答を示す哺乳動物のT細胞であって、前記腫瘍ペプチド、ウィルスペプチド、自己免疫疾患ペプチド、細菌ペプチド、または寄生虫ペプチドに対してT細胞応答を誘導するために有効な量で、小胞体シグナル配列ペプチドおよび腫瘍ペプチド、ウィルスペプチド、細菌ペプチド、寄生虫ペプチド、および自己免疫疾患ペプチドからなる群から選択される少なくとも一つのその他のペプチドを含むキメラタンパク質を投与した哺乳動物から単離する；
前記T細胞。
前記その他のペプチドが腫瘍ペプチドである、請求項３６に記載の哺乳動物T細胞。
前記その他のペプチドが細菌ペプチドである、請求項３６に記載の哺乳動物T細胞。
前記その他のペプチドが寄生虫ペプチドである、請求項３６に記載の哺乳動物T細胞。
前記その他のペプチドが自己免疫疾患ペプチドである、請求項３６に記載の哺乳動物T細胞。
ペプチド特異的反応性が増大した、請求項36に記載の哺乳動物T細胞であって、前記その他のペプチドに対する反応性が、小胞体シグナル配列ペプチドの不在下で前記その他のペプチドのみに対して曝露したT細胞の反応性ベースラインと比較して少なくとも3倍増大したものであり；前記反応性は、前記その他のペプチドでパルスした標的細胞を使用して、少なくとも50：1のエフェクター：標的細胞比で⁵¹Cr細胞傷害性放出アッセイにおいて測定する、前記哺乳動物T細胞。
免疫化するための医薬の製造における、小胞体シグナル配列ペプチドと、腫瘍ペプチド、ウィルスペプチド、細菌ペプチド、寄生虫ペプチドおよび自己免疫疾患ペプチドからなる群から選択される第二のペプチドとを有するキメラタンパク質の使用方法であって、前記タンパク質が前記第二のペプチドに対するT細胞応答を誘導するために有効な量である、前記方法。
その他のペプチドが腫瘍ペプチドである、請求項４２に記載の方法。
その他のペプチドが細菌ペプチドである、請求項４２に記載の方法。
その他のペプチドが寄生虫ペプチドである、請求項４２に記載の方法。
その他のペプチドが自己免疫疾患ペプチドである、請求項４２に記載の方法。
その他のペプチドがウィルスペプチドである、請求項４２に記載の方法。
免疫化するための医薬の製造における、小胞体シグナル配列ペプチドと、腫瘍ペプチド、ウィルスペプチド、細菌ペプチド、寄生虫ペプチド、および自己免疫疾患ペプチドからなる群から選択されるペプチドをコードする第二のコード領域とをコードする核酸の使用方法であって、前記核酸が、第二の配列によりコードされるペプチドに対するT細胞応答を誘導するために有効な量である、前記方法。
その他のペプチドが腫瘍ペプチドである、請求項４８に記載の方法。
その他のペプチドが細菌ペプチドである、請求項４８に記載の方法。
その他のペプチドが寄生虫ペプチドである、請求項４８に記載の方法。
その他のペプチドが自己免疫疾患ペプチドである、請求項４８に記載の方法。
その他のペプチドがウィルスペプチドである、請求項４８に記載の方法。
哺乳動物におけるガン、ウィルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または自己免疫疾患を治療するための医薬の製造において、小胞体シグナル配列ペプチドと、少なくとも一つのその他のペプチドとを含む免疫原性キメラタンパク質を使用する方法であって、前記タンパク質が前記その他のペプチドに対するT細胞応答を誘導するために注射可能な形状である、前記方法。
その他のペプチドが腫瘍ペプチドである、請求項５４に記載の方法。
その他のペプチドが細菌ペプチドである、請求項５４に記載の方法。
その他のペプチドが寄生虫ペプチドである、請求項５４に記載の方法。
その他のペプチドが自己免疫疾患ペプチドである、請求項５４に記載の方法。
その他のペプチドがウィルスペプチドである、請求項５４に記載の方法。
哺乳動物におけるガン、ウィルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または自己免疫疾患を治療するための医薬の製造において、免疫原性キメラタンパク質により免疫化された哺乳動物から単離されたT細胞を治療的有効量で使用する方法であって、前記タンパク質は：
（ａ）小胞体シグナル配列ペプチドと少なくとも一つのその他のペプチドとを含み；そして
（ｂ）免疫化された哺乳動物中でその他のペプチドに対するT細胞応答を誘導する；
前記方法。