JP3814828B2 - Ｈｉｖに対する免疫応答を誘導できるペプチド及び該ペプチドを含む抗ａｉｄｓ予防・治療剤 - Google Patents
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発明の背景
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、以下「ＨＩＶ」と略称する）タンパクの一部領域のアミノ酸配列をもち、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるペプチド及び該ペプチドを含む抗ＡＩＤＳ予防・治療剤に関する。
後天性免疫不全症候群（Acute Immunodeficiency Disease Syndorome、以下「ＡＩＤＳ」と略称する）は、ＨＩＶの感染によって生じる病気であることはよく知られている。この疾患を治療する薬剤の研究開発は活発に行われており、アジドチミジン（以下「ＡＺＴ」と略称する）、ダイデオキシイノシン（以下「ＤＤＩ」と略称する）などの薬剤が実用に用いられるようになったが、効果や副作用などの問題点があり、ＨＩＶの感染によって生じる病気を完全に治療することができる薬剤は未だに発見されておらず、その見通しも立っていない。一方ＨＩＶ感染予防とＡＩＤＳ発症の抑制手段としてＨＩＶに対する免疫抵抗力を増強させるワクチンもこの病気の急速な世界的広がりを抑制できる切り札として期待され広く研究が進められている。現在までに種々のタイプのワクチンが考案され、一部のものは臨床試験に入っているが、未だにヒトに対し実際に感染予防あるいは発症抑制が証明された例はない。
これまでにワクチンの種類としては以下のものが考えられている。
ｉ）不活化または弱毒化ウィルス粒子を用いるワクチン：ＨＩＶの病原性に関与する遺伝子を変異欠損させる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1434,(1987))、ＨＩＶと共通抗原性を持つサルなどの類縁ウイルスを用いるアプローチ（Science,232, 238,(1987))が考えられるが、潜在的危険性から容易には実用化できない。
ii）ウイルスの一部の抗原タンパクを用いるサブユニットワクチン：ウイルス粒子のうちの一部抗原性タンパクのみを遺伝子組換え法などで生産し免疫原として用いるというアプローチ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 6924,(1987)、Ann. Int. Med., 114,119,(1991)、Nature, 355,728,(1992)）。最も広く試みられており、臨床試験例も多い。しかしながら中和抗体価が上がらなかったり、抗体価の持続性など克服すべき問題点が多い。またこのアプローチでは抗体産生など体液性免疫の増強には効果があると考えられるが、感染細胞を殺す細胞性免疫の活性化にはつながりにくく、ＨＩＶの感染様式から考えてこのアプローチのみの感染予防への効果は必ずしも期待できない。
iii)ワクシニアウィルスやＢＣＧ菌などの組換え生ワクチン：ヒトの細胞内で増殖可能なワクシニアウイルス（Nature, 332,728,(1988)）やＢＣＧ菌（Nature, 351,479,(1991)）の遺伝子にＨＩＶ由来の一部遺伝子配列を組み込み発現させる方法で、理論的には細胞性免疫増強効果が期待できる。問題点としては免疫力の低下した患者では通常無害なワクシニアウイルスなどでも重篤な感染がおこったりする可能性（Lancet 337,1034,(1991)）と、少なくとも今までに作られたワクシニアの組換え生ワクチンでは充分な免疫応答を起こしていない点等がある。
iv)抗イディオタイプ抗体：ウイルス抗原のかわりに抗イディオタイプ抗体を免疫原として用いる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,2546,(1992)）が報告されている。
v)合成ペプチドワクチン：中和抗体の決定領域のペプチド配列を化学合成したものなどが検討されている。特にエンベロープの糖タンパクgp120のＶ３領域は主要中和決定領域でありＶ３領域合成ペプチドをワクチンとする試みが行われている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,6768,(1989)）。
これらのワクチンの研究開発状況については、例えば高橋秀実、実験医学１１巻６５５−８６６１頁（１９９３）、奥田研爾・山川正、臨床と微生物２０巻５５−６２頁、Ａ．Ｔ．Ｐｒｏｆｙ；ＢＩＯmedica ８巻１３３−１３９頁に記載される。
上記のような現在までのワクチンの研究開発は中和抗体を誘導する体液性免疫増強型のものが主であったが、ＨＩＶがフリーのウイルス粒子としてよりも感染細胞と非感染細胞との融合によって伝播しやすいということから、中和抗体による体液性免疫よりも感染細胞を障害する細胞障害性Ｔ細胞（cytotoxic T cell、以下「ＣＴＬ」と略称する）による細胞性免疫が感染防御に重要と考えられる。実際、ＨＩＶ感染の機会にさらされながら感染が成立しなかった個体について調べてみると血中抗体は検出されないが高頻度でＣＴＬをもっており、早期のＣＴＬ誘導が感染予防に重要であることが報告されている（J. Infec. Dis.,164,178,(1992)）。
そこで本願発明者らは、ＨＩＶが感染した細胞を特異的に障害するＣＴＬを誘導できるペプチドを探索し、これを抗ＡＩＤＳ治療あるいは予防に利用することをめざした。
ＨＩＶ感染細胞に対するＣＴＬを効果的に誘導するにはＣＴＬが認識する抗原エピトープを同定しこれをワクチンに応用することがきわめて重要である。今までははじめにＨＩＶに特異的なＣＴＬクローンを作製し、そのＣＴＬクローンが認識する抗原エピトープを同定するという方法をとっていた（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,3105,(1988)）。この方法では、数多くのヒト白血球抗原（以下「ＨＬＡ」と略称する）クラスＩ抗原によってＣＴＬに提示されるＨＩＶ抗原エピトープを同定するのに非常に多数のペプチド合成を要するため多大な時間と費用がかかると考えられ、エピトープの同定も進んでいなかった。
ＣＴＬは標的細胞表層に発現される主要組織適合性抗原複合体（以下「ＭＨＣ」と略称する）クラスＩ抗原によって抗原提示されたエピトープペプチドを認識して標的細胞を攻撃するが、最近、特定のＭＨＣクラスＩ抗原に結合して抗原提示されるエピトープペプチドは９鎖長内外のペプチドであってそのアミノ酸配列には一定の法則性（モチーフ）があることが判明してきた（Nature, 351,290,(1991)、Eur. J. Immunol.,22,2453,(1992)、Nature,353,326,(1991)、Nature,360,434,(1992)、Immunogenetics, 38,161,(1993)）。
発明の開示
本発明は、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるペプチドを提供することを目的とする。
本発明は、又、上記ペプチドをコードするＤＮＡを提供することを目的とする。
本発明は、又、上記ペプチドを含有する抗ＡＩＤＳ予防・治療剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるペプチドの採取方法を提供することを目的とする。
本発明の上記及び他の目的は、以下の記載から明らかとなるであろう。
本発明は、それぞれのＨＬＡクラスＩ抗原に結合する自己抗原ペプチドのモチーフから、そのＨＬＡクラスＩ抗原に結合する可能性のあるＨＩＶペプチドを推定し、推定したＨＩＶペプチドを合成し、ペプチドが結合していないＨＬＡクラスＩ抗原を多量に発現している形質転換細胞を用いて、形質転換細胞上に多量に発現しているＨＬＡクラスＩ抗原と実際に結合する合成ペプチドを選択し、次いで選択した合成ペプチドのうち、ＨＬＡクラスＩ抗原に結合した該合成ペプチドが患者の末梢血リンパ球を刺激してＣＴＬを誘導できるものが抗ＡＩＤＳ予防・治療剤として有用であるとの知見に基づいてなされたのである。
すなわち、本発明は、ＨＩＶの全たんぱくの断片であって、該断片が８個〜１１個のアミノ酸の連続する配列を含むペプチドであり、ＨＬＡ結合モチーフに相当し、実際にＨＬＡに結合し、かつＨＩＶ感染細胞を標的とするキラー細胞を誘導しえるペプチドを提供する。
本発明は、又、上記ペプチドをコードするＤＮＡを提供する。
本発明は、又は、上記ペプチド及び医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む抗ＡＩＤ予防・治療剤を提供する。
本発明は、又、ＨＩＶの全たんぱくの断片であって、８個〜１１個のアミノ酸の連続する配列を含み、ＨＬＡ結合モチーフに相当するペプチドを合成し、合成ペプチドのうち実際にＨＬＡに結合するものを選択し、次いで選択した合成ペプチドのうちＨＬＡクラスＩ抗原に結合してＨＩＶ疾患患者の末梢リンパ球を刺激してキラー細胞を誘導するものを採取することを特徴とするＨＩＶ感染細胞を標的とするキラー細胞を誘導しえるペプチドを採取する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞上におけるＨＬＡ−Ｂ*3501抗原の発現レベルの変化を示す。図中、△はＨＬＡ−Ｂ*3501抗原結合性のある自己抗原ペプチド２８Ｈ（LPGPKFLQY）、○は３７Ｆ（LPFDFTPGY）、□は結合性のないペプチドＭＰ−１（KGILGKVFTLTV）の添加によるＨＬＡ−Ｂ*3501発現レベルの変化を示す。
図２は、ペプチドとしてHIV(B35)-16を用いたときの特異的細胞傷害活性を示す。図中、●は標識標的細胞がＴ２−Ｂ*3501細胞の場合、○は標識標的細胞がＴ２細胞の場合でありコントロールである。ペプチドで刺激して培養した患者末梢リンパ球は、１×１０5、２.５×１０4あるいは６.２５×１０3個の３段階の細胞数を用いたが、図に示される特異的細胞傷害活性の値は１×１０5個の細胞を用いたときのものである。
図３は、ペプチドとしてHIV(B35)-18を用いたときの特異的細胞傷害活性を示す。●は標識標的細胞がＴ２−Ｂ*3501細胞の場合、○は標識標的細胞がＴ２細胞の場合でありコントロールである。ペプチドで刺激して培養した患者末梢リンパ球は、１×１０5、２.５×１０4あるいは６.２５×１０3個の３段階の細胞数を用いたが、図に示される特異的細胞傷害活性の値は１×１０5個の細胞を用いたときのものである。
図４は、ペプチドとしてHIV(B35)POL-20を用いたときの特異的細胞傷害活性を示す。●は標識標的細胞がＴ２−Ｂ*3501細胞の場合、○は標識標的細胞がＴ２細胞の場合でありコントロールである。ペプチドで刺激して培養した患者末梢リンパ球は、１×１０5、２.５×１０4あるいは６.２５×１０3個の３段階の細胞数を用いたが、図に示される特異的細胞傷害活性の値は１×１０5個の細胞を用いたときのものである。
発明を実施するための最良の形態
ＨＩＶの全たんぱくは、例えば、Nature Vol. 313, p277-283(1985)やProc. Natl., Acad. Sci. USA Vol. 83, p2209-2213(1986)などに記載されている。本発明のペプチドは、上記ＨＩＶの全たんぱくの断片であって、該断片が８個〜１１個、好ましくは９個〜１１個のアミノ酸の連続する配列を含むペプチドである。本発明のペプチドは、さらに、ＨＬＡ結合モチーフに相当し、実際にＨＬＡに結合することが必要である。ここで、ＨＬＡ結合モチーフとしては、８個〜１１個のアミノ酸配列であって、２番目がＰｒｏ、Ｃ末端がＴｙｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＡｌａからなる群から選ばれるアミノ酸であるもの、２番目がＰｒｏ、Ａｌａ及びＧｌｙからなる群から選ばれるアミノ酸であり、Ｃ末端がＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ及びＭｅｔからなる群から選ばれるアミノ酸であるもの、２番目がＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ及びＰｈｅからなる群から選ばれるアミノ酸であり、Ｃ末端がＡｒｇであるものがあげられる。本発明においては、ＨＬＡ結合モチーフに相当ペプチドが実際にＨＬＡに結合するか否かは、ＨＬＡクラスＩ抗原をもつ細胞をもちいて確認することができる。このような細胞としては、ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞、ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*5101細胞及びＲＭＡ−Ｓ−Ａ*3101細胞などがあげられ、これらは、ＨＬＡ−Ｂ*3501遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ*5101遺伝子やＨＬＡ−Ａ*3101遺伝子を、ＲＭＡ−Ｓ細胞に導入することにより容易に得ることができる。尚、ＲＭＡ−Ｓ細胞は、Ljunggren et al., J. Immu-nol., 142,2911,(1989)に記載されている。
本発明では、さらに、ＨＬＡクラスＩ抗原に結合した合成ＨＩＶペプチドが実際に患者の末梢血リンパ球を刺激してＣＴＬを誘導できること、つまりＨＩＶ感染細胞を標的とするキラー細胞を誘導しえることが必要である。
このようなペプチドとしては、配列番号１から６３のペプチドを例示することができる。
配列番号１から２４のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ3501抗原に結合するペプチドであって、ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞を利用して得られたものである。配列番号２５から４６のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ51抗原に結合するペプチドであって、ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*5101細胞を利用して得られたものである。又、配列番号４７から６３のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＬＡ−Ａ3101抗原に結合するペプチドであって、ＲＭＡ−Ｓ−Ａ*3101細胞を利用して得られたものである。本発明のペプチドを得る手段は、後述の実施例で詳しく述べる。
配列番号１から６３のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドは、当業者間で周知の方法により合成又は製造できる。近年はペプチドシンセサイザーが発達したため、数十の残基よりなるペプチドも容易に製造できる。あるいは、配列番号１から６３のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに接続し、これによって形質転換されたエシェリヒア属細菌等の細胞を培養することによっても製造できる。このような、遺伝子組換え技術をもちいたタンパク質やペプチドの製造法は当業者間でよく知られている。
配列番号１から６３のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号１から６３のうちいずれかのアミノ酸配列より演繹できる。各アミノ酸残基に対応するコドンは当業者において周知である。該ＤＮＡを細胞に導入して発現させる場合には、各細胞において好まれるコドンが異なる場合があるのでこれを参考にする。たとえばエシェリヒア属細菌細胞内で好まれるコドンを用いる場合には、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡの例としては、配列番号６４の塩基配列を有するＤＮＡがある。配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡの例としては、配列番号６５の塩基配列を有するＤＮＡがある。配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡの例としては、配列番号６６の塩基配列を有するＤＮＡがある。
配列番号１から６３のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドは、Ｔ細胞エピトープとしてＨＩＶ特異的ＣＴＬを誘導することができるのでワクチンとして非常に有用である。実際のワクチンとしての使用はペプチド溶液をそのまま、または適当な補助剤とともに注射器で投与することもできるし、噴霧などの方法で粘膜からの経皮吸収などで投与してもよい結果が得られる。投与量は１回0.1から100mgで単回または繰り返し投与する。また上記に方法で選択した複数のエピトープペプチドを同時に用いるとさらに効果的である場合が多い。製剤としては凍結乾燥、糖などの賦形剤を加えて顆粒にするなどでよく、別段に特別のものを要さない。注射投与する際に注射用蒸留水で溶解して用いる。本剤はペプチド化合物であり上記投与方法で問題となる重篤な急性毒性はない。
ワクチンに添加して免疫原性を高める補助剤としてはＢＣＧ菌などの菌体成分、Moreinらにより開発されたＱｕｉｌｌＡという樹皮から抽出したＩＳＣＯＭ（Immunostimulating complex）（Nature, 308,457,(1984)、Nature, 344,873,(1990)）、サポニン系のＱＳ−２１（J. Immunol.,148,1438,(1992)）、リポソーム（J. Immunol.,148,1585,(1992)）、水酸化アルミニウム（アラム）、ＫＬＨ（Keyhole Lympet Hemocyanin）（J. Virol.,65,489,(1991)）などが利用できる。このような方法で生体内にＣＴＬなどの免疫応答を誘導できることは上記記載のそれぞれの先行文献やScience, 255,333,(1992)などにも述べられている。
患者から採取した細胞または同ハプロタイプのＨＬＡクラスＩ抗原をもつ細胞に試験管内で当該エピトープペプチドを与えて抗原提示させたのち患者血管中に投与し、患者体内で効果的にＣＴＬを誘導させる方法、患者末梢血リンパ球に同ペプチドを加えて試験管内で培養、試験管内でＣＴＬを誘導増殖させたのち患者にもどす方法も本発明で明らかにされたエピトープペプチドを使うことにより有効に適用することができる。従って、ＨＬＡ−Ｂ*3501抗原を有する末梢血リンパ球を、配列番号１から２４のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド存在下で培養して得られる細胞障害性Ｔ細胞を抗ＡＩＤＳワクチンとして用いることもできる。実際には患者末梢血リンパ球１０7から１０9個に当該ペプチド0.01から1mgを加えて数時間から１日培養した後患者静脈中に投与するか、あるいはさらに組換えインターロイキン２（recombinant ＩＬ−２）を50U/mlと当該ペプチド１μg/mlを加えた培養液で数週間培地交換しながら培養を継続して試験管内でＣＴＬを誘導してから患者静脈より注入する。培養の方法は当業者間でよく知られている通常の方法でよく、培養後は遠心分離等で培地成分を洗浄後生理食塩水等で懸濁して投与する。このような細胞注入による治療はすでに癌治療法として実施されており、当業者間ではよく知られている方法である（New Eng. J. Med., 313,4185,(1985)、Science,233,1318,(1986)）。
また本発明で明らかにされたＣＴＬエピトープはワクシニアウイルスやＢＣＧ菌組換え生ワクチンなどでも有効に活用できる。すなわちこれらの組換え生ワクチンにおいて発現させる組換え抗原タンパク遺伝子中に配列番号１から６３のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡを組み込んでおけば、該ペプチド配列が抗原タンパクの一部として発現したのち細胞内でプロセスされてＨＬＡクラスＩ抗原により提示され、これを認識するＣＴＬを誘導することができる。ＢＣＧ菌における外来遺伝子の発現方法は国際特許公開ＷＯ８８／０６６２６に詳しい。ＢＣＧ菌組換え生ワクチンについてはJ. Exp. Med., 178,197,(1993)に詳しい。投与量、投与方法は通常の種痘やＢＣＧワクチンに準じて行うことができる。急性毒性等も通常の種痘やＢＣＧワクチンと変わるところはない。ただしワクシニアウイルスの場合ＡＩＤＳが発症し、免疫能が低下している患者には重篤感染の危険性があり、治療用ワクチンとしては慎重に行う必要がある。ＢＣＧワクチンについてはこのような事例はまだない。このような方法で生体にＣＴＬなどの免疫応答を誘導できることはNature,332,728,(1988)やNature,351,479,(1991)などに示されている。
ＨＩＶワクチンの大きな問題点はＨＩＶが容易に変異を起こして宿主免疫を逃れる点にある。したがって免疫原として一つのエピトープのみを担ったワクチンはやがて効力失う可能性が大である。その点、本発明により明らかになった多数のエピトープを免疫原とするワクチンの有用性はきわめて高い。
次に実施例により本発明を説明する。
実施例１
(1)ＨＬＡ−Ｂ*3501結合自己抗原ペプチドのモチーフよりＨＬＡ−Ｂ*3501結合のＨＩＶペプチドの推定
ＨＬＡ−Ｂ*3501結合自己抗原ペプチドのモチーフは以前に明らかにされており（Nature,360,434,(1992)、Immunogenetics, 38,161(1993)）、その結果よりＨＩＶタンパク由来ペプチドのうち自己抗原ペプチドと同様に８から１２個のアミノ酸からなるペプチドであって、２番目がＰｒｏ、Ｃ末端がＴｙｒ、Ｌｅｕ、Ｕｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅのうち一つをもったものがＨＬＡ−Ｂ*3501に結合しやすいと推定された。ＨＩＶを構成する全タンパク質のアミノ酸配列はすでに報告がされているので、この配列の中からＨＬＡ−Ｂ*3501結合自己抗原ペプチドのモチーフと合致するものを選び出した。ＡＲＶ−２株ＨＩＶのタンパク配列のうちこれに合致するペプチドは表１に示した５８種類のものである。これらのペプチドを島津製作所製のペプチドシンセサイザーで合成し、ＨＬＡ−Ｂ*3501抗原への結合測定実験に供した。
(2)ＨＬＡ−Ｂ*3501抗原との合成ＨＩＶペプチドの結合測定
合成したＨＩＶペプチドが結合するかを、ＨＬＡ−Ｂ*3501を発現しているマウス細胞株ＲＭＡ−Ｓ株を用いて測定した。
2-1. ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞の作製
ＨＬＡ−Ｂ*3501遺伝子はこの抗原をもっているヒトの末梢血リンパ球の染色体ＤＮＡから以前に報告されている方法（Ooba et al., Immunogenetics,30,76,(1989)）によりクローニングすることができる。すなわちＨＬＡ−Ｂ*3501抗原をもつヒトの末梢血リンパ球より常法により染色体ＤＮＡを調製、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後ショ糖密度勾配遠心により6.0-8.5kbの断片を得た。このＤＮＡ断片をファージベクターλＺＡＰ（東洋紡社より購入）に挿入しゲノムライブラリーを作成した。このライブラリーをＨＬＡ−Ｂ７ｃＤＮＡ（Coppin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82,8614,(1985)）をプローブとしてスクリーニングしＨＬＡ−Ｂ*3501遺伝子をもつクローンを得た。得られた遺伝子をＲＭＡ−Ｓ細胞（Ljunggren et al., J. Immunol.,142,2911,(1989)）にelectroporation法により遺伝子移入し、発現細胞を抗ＨＬＡ−Ｂｗ６単クローン抗体、ＳＦＲ８・Ｂ６（ATCC HB152）を用いてflowcytometryによって選択した。ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞は通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、受託番号FERM BP-4727が付与されている。
2-2. ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞を用いたＨＩＶ合成ペプチドのＨＬＡ−Ｂ*3501抗原への結合測定
ＲＭＡ−Ｓ細胞はＴＡＰ（Transporter Associated Protein）抗原が欠損したマウスの細胞株である。このため、細胞表面上にＭＨＣクラスＩ抗原が３７℃で培養した時には低レベルでしか細胞表面上には発現しない。しかし低温（２６℃）で培養するとペプチドをとりこんでいないクラスＩ抗原が高レベルで細胞表面上に発現することが知られている（Ljunggren et al., Nature, 346,476,(1990)）。
ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞でも同様にＨＬＡ−Ｂ*3501抗原は２６℃で培養した時には高レベルで細胞表面上に発現するが、３７℃で培養するとその発現は低下する。また２６℃で培養しておいたＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞上のＨＬＡ−Ｂ*3501抗原の発現は３７℃に３時間おくことにより、３７℃で培養した場合と同じに発現量は低くなる。しかしながらペプチドが結合していないＨＬＡ−Ｂ*3501抗原に外から加えたペプチドが結合すると、ペプチドの結合したＨＬＡ−Ｂ*3501抗原は３７℃に置いても消失せず高発現量が保たれる。図１はＨＬＡ−Ｂ*3501抗原結合性のある自己抗原ペプチド２８Ｈ（LPGPKFLQY：グラフ中△で表現される）、３７Ｆ（LPFDFTPGY：グラフ中○で表現される）と、結合性のないペプチドＭＰ−１（KGILGKVFTLTV：グラフ中□で表現される）の添加によるＨＬＡ−Ｂ*3501発現レベルの変化について調べたもので、ＨＬＡ−Ｂ*3501抗原の発現量が結合活性のあるペプチドの添加量に依存しているという結果が得られた。ＨＬＡ−Ｂ*3501抗原結合性のある自己抗原ペプチド２８Ｈ、３７Ｆと、結合性のないペプチドＭＰ−１についてはNature,360,434,(1992)、Immunogenetics, 38,161(1993)に記載されている。従ってこの実験系を用いることによりはじめて、外から加えたペプチドのＨＬＡ−Ｂ*3501への結合活性をＨＬＡ−Ｂ*3501抗原の細胞表層発現量を指標として容易に評価することができるようになった。実際の被検ペプチドの結合測定操作は２６℃で培養したＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞に該ペプチドを加えて２６℃で１時間、その後３７℃に３時間置いた後に抗ＨＬＡ−Ｂｗ６単クローン抗体、ＳＦＲ８・Ｂ６とflow cytometryを用いてＨＬＡ−Ｂ*3501抗原の発現レベルを測定することにより行った。なお、▲はペプチド非添加のコントロール、●はペプチド非添加でありかつ２６℃でのみ培養を行ったコントロール、■はペプチド非添加でありかつ３７℃でのみ培養を行ったコントロールである。
５８種類のＨＩＶペプチドのＨＬＡ−Ｂ*3501抗原に対する結合を測定したところ、表２に示すように２６種類のペプチドが結合した。
(3)ＨＬＡ−Ｂ*3501結合ペプチドを用いたＨＩＶ感染患者からのＣＴＬの誘導ＨＬＡ−Ｂ*3501をもった３人のＨＩＶ感染患者、患者Ａ（ＨＬＡ−Ａ２４／３１，Ｂ３５／６１，Ｃｗ３／−）、患者Ｂ（ＨＬＡ−Ａ２４／２６，Ｂ３５／６１，Ｃｗ３／−）および患者Ｃ（ＨＬＡ−Ａ２４／２６，Ｂ３５／５１，Ｃｗ３／−）からリンパ球を分離した。リンパ球の分離は通常のFicoll-Conray比重遠心法（矢田純一、藤原道夫編著、”新リンパ球機能検索法”、中外医学社(1987)、新生化学実験講座12”分子免疫学Ｉ”東京化学同人(1989)）によった。すなわちヘパリン加注射器で採血後、生理食塩水で希釈、Ficoll-Paque分離液（Pharmacia社）上に重層後４００ｘｇ３０分室温で遠心した。中間層のリンパ球画分をピペットで回収、洗浄して以下に用いた。２４穴培養プレートの各wellに２×１０6個のリンパ球を入れさらにヒトのrecombinantＩＬ２および合成ペプチドの最終濃度が５０Ｕ／mlおよび１μＭになるように調製したＲＰＭＩ1640（１０％ＦＣＳ含）培養液で培養する。２日−３日おきに、５０Ｕ／ml濃度のＩＬ２が入っているＲＰＭＩ 1640培養液を半量かえる。１週間後に、ＰＨＡで刺激したのち放射線照射した自己リンパ球（１×１０6）と１μＭの合成ペプチドをそれぞれ加えて特異的ＣＴＬ細胞を再刺激し増殖させた後、さらに１週間培養し、ＣＴＬ活性を測定した。
(4)ＨＬＡ−Ｂ*3501結合ペプチドを用いて誘導されたＣＴＬによる細胞障害活性の測定
4-1. Ｔ２−Ｂ*3501細胞の作製
ＴＡＰ抗原遺伝子欠損ヒトリンパ細胞株Ｔ２細胞（Salter et al.,EMBO J.,5,943,(1986)）にＨＬＡ−Ｂ*3501遺伝子をelectroporation法により遺伝子移入し、発現細胞をＳＦＲ・Ｂ６単クローン抗体を用いてflowcytometryによって選択した。この細胞をＴ２−Ｂ*3501細胞と命名した。Ｔ２−Ｂ*3501細胞は通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、受託番号FERM BP-4726が付与されている。
ＨＬＡ−Ｂ３５の患者がＨＩＶに感染した発病した場合、ＨＩＶに感染したリンパ細胞はＨＬＡ−Ｂ*3501抗原を細胞表面に発現しＨＩＶペプチドを提示する。Ｔ２−Ｂ*3501細胞は、（２）で示したＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞と同様に、２６℃培養ではペプチドを結合していないＨＬＡ−Ｂ*3501抗原を多量に発現する。そこで、この条件下でペプチドを結合させ、いわばＨＩＶに感染したリンパ細胞を人為的に創り出し、ＣＴＬの細胞障害活性を測定する標的細胞として用いた。
4-2. ＣＴＬの細胞障害活性の測定
１×１０6個のＴ２−Ｂ*3501細胞あるいはＴ２細胞を１００μＣｉのNa2 51CrO4に２６℃で９０分間混和し、その後１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ1640培養液で３回洗浄し標識標的細胞とする。９６穴プレートの各穴に５０μｌの培養液中に浮遊させた５×１０3個の標識標的細胞（Ｔ２あるいはＴ２−Ｂ*3501細胞）を加える。さらに４μＭから４×１０-4μＭまで希釈した合成ペプチドの溶液を５μｌ加え３０分間、ＣＯ2インキュベーターに放置した後、前項のペプチドで刺激して培養した患者末梢リンパ球を１×１０5、２.５×１０4あるいは６.２５×１０3個（１００μｌの培養液に浮遊させる）加え、３７℃のＣＯ2インキュベーターに４時間放置した。その後各穴の半量の培養液（１００μｌ）をとり、ガンマーカウンターにて培養患者末梢リンパ球の細胞障害活性によって標的細胞から遊離された51Ｃｒを測定した。特異的細胞障害活性を次のとおり計算した。
ただし、最小放出値は標的細胞のみはいっている穴の測定値で標的細胞からの51Ｃｒの自然遊離値、最大放出値は標的細胞に界面活性剤トリトンｘ−１００を加えて細胞を破壊した際の標識遊離値を示している。
結果を図２、３及び４に示す。図２はHIV(B35)-16（配列番号３）、図３はHIV(B35)-18（配列番号４）、図４はHIV(B35)POL-20（配列番号６）の結果である。合成ペプチドが結合したＴ２−Ｂ*3501細胞を傷害するＣＴＬの誘導にこれら合成ペプチドが有効であることが確認された。
同様の方法により表２に記載のペプチドについて、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるか否かについて調べた。このうちＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるペプチドをまとめて表３に示す。
同様にＭＮ株、ＮＤＫ株、ＨＸＢ２株ＨＩＶ配列について検索し、表４に示すペプチドが選択された。
実施例２
ＨＬＡ結合モチーフとして、８個〜１１個のアミノ酸配列であって、２番目がＰｒｏ、Ａｌａ及びＧｌｙからなる群から選ばれるアミノ酸であり、Ｃ末端がＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ及びＭｅｔからなる群から選ばれるアミノ酸であるＨＬＡ−Ｂ51結合抗原ペプチドのモチーフを用い、かつＳＦ−２株ＨＩＶのタンパク配列及びＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞を用いた以外は実施例１と同様にして、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるペプチドを得た。このペプチドをまとめて表５に示す。尚、ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、受託番号FERM BP-4834が付与されている。
実施例３
ＨＬＡ結合モチーフとして、８個〜１１個のアミノ酸配列であって、２番目がＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ及びＰｈｅからなる群から選ばれるアミノ酸であり、Ｃ末端がＡｒｇであるＨＬＡ−Ａ*3101結合抗原ペプチドのモチーフを用い、かつＭＮ株ＨＩＶのタンパク配列又はＳＦ−２株ＨＩＶのタンパク配列及びＲＭＡ−Ｓ−Ａ*3101細胞用いた以外は実施例１と同様にして、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるペプチドを得た。このペプチドをまとめて表６に示す。ＲＭＡ−Ｓ−Ａ*3101細胞は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、受託番号FERM BP-4833が付与されている。
産業上の利用分野
本発明のペプチドは、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるので、抗ＡＩＤＳ予防・治療剤として有効に利用することができる。具体的には、上記ペプチドを含有する抗ＡＩＤＳワクチン、上記ペプチドをコードするＤＮＡ含む組換えＤＮＡを有するワクシニアウイルス及びＢＣＧ菌を含有する抗ＡＩＤＳワクチンとして利用することができる。又、上記ペプチドの存在下で、ＨＬＡ−Ｂ抗原を有する抹消血リンパ球を培養して得られる細胞障害性Ｔ細胞を含有する抗ＡＩＤＳ治療剤として利用することができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：２
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：３
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：４
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：５
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：６
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：７
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：８
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：９
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：１０
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：１１
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：１２
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：１３
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：１４
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：１５
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：１６
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：１７
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：１８
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：１９
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：２０
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：２１
配列の長さ：８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：２２
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：２３
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：２４
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：２５
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：２６
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：２７
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：２８
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：２９
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：３０
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：３１
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：３２
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：３３
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：３４
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：３５
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：３６
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：３７
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：３８
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：３９
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：４０
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：４１
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：４２
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：４３
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：４４
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：４５
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：４６
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：４７
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：４８
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：４９
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：５０
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：５１
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：５２
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：５３
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：５４
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：５５
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：５６
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：５７
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：５８
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：５９
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：６０
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：６１
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：６２
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：６３
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：６４
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
鎖の数：二本鎖
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：６５
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
鎖の数：二本鎖
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：６６
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
鎖の数：二本鎖
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：６７
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：６８
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：６９
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：７０
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：７１
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：７２
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：７３
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列番号：７４
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、以下「ＨＩＶ」と略称する）タンパクの一部領域のアミノ酸配列をもち、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるペプチド及び該ペプチドを含む抗ＡＩＤＳ予防・治療剤に関する。
後天性免疫不全症候群（Acute Immunodeficiency Disease Syndorome、以下「ＡＩＤＳ」と略称する）は、ＨＩＶの感染によって生じる病気であることはよく知られている。この疾患を治療する薬剤の研究開発は活発に行われており、アジドチミジン（以下「ＡＺＴ」と略称する）、ダイデオキシイノシン（以下「ＤＤＩ」と略称する）などの薬剤が実用に用いられるようになったが、効果や副作用などの問題点があり、ＨＩＶの感染によって生じる病気を完全に治療することができる薬剤は未だに発見されておらず、その見通しも立っていない。一方ＨＩＶ感染予防とＡＩＤＳ発症の抑制手段としてＨＩＶに対する免疫抵抗力を増強させるワクチンもこの病気の急速な世界的広がりを抑制できる切り札として期待され広く研究が進められている。現在までに種々のタイプのワクチンが考案され、一部のものは臨床試験に入っているが、未だにヒトに対し実際に感染予防あるいは発症抑制が証明された例はない。
これまでにワクチンの種類としては以下のものが考えられている。
ｉ）不活化または弱毒化ウィルス粒子を用いるワクチン：ＨＩＶの病原性に関与する遺伝子を変異欠損させる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1434,(1987))、ＨＩＶと共通抗原性を持つサルなどの類縁ウイルスを用いるアプローチ（Science,232, 238,(1987))が考えられるが、潜在的危険性から容易には実用化できない。
ii）ウイルスの一部の抗原タンパクを用いるサブユニットワクチン：ウイルス粒子のうちの一部抗原性タンパクのみを遺伝子組換え法などで生産し免疫原として用いるというアプローチ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 6924,(1987)、Ann. Int. Med., 114,119,(1991)、Nature, 355,728,(1992)）。最も広く試みられており、臨床試験例も多い。しかしながら中和抗体価が上がらなかったり、抗体価の持続性など克服すべき問題点が多い。またこのアプローチでは抗体産生など体液性免疫の増強には効果があると考えられるが、感染細胞を殺す細胞性免疫の活性化にはつながりにくく、ＨＩＶの感染様式から考えてこのアプローチのみの感染予防への効果は必ずしも期待できない。
iii)ワクシニアウィルスやＢＣＧ菌などの組換え生ワクチン：ヒトの細胞内で増殖可能なワクシニアウイルス（Nature, 332,728,(1988)）やＢＣＧ菌（Nature, 351,479,(1991)）の遺伝子にＨＩＶ由来の一部遺伝子配列を組み込み発現させる方法で、理論的には細胞性免疫増強効果が期待できる。問題点としては免疫力の低下した患者では通常無害なワクシニアウイルスなどでも重篤な感染がおこったりする可能性（Lancet 337,1034,(1991)）と、少なくとも今までに作られたワクシニアの組換え生ワクチンでは充分な免疫応答を起こしていない点等がある。
iv)抗イディオタイプ抗体：ウイルス抗原のかわりに抗イディオタイプ抗体を免疫原として用いる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,2546,(1992)）が報告されている。
v)合成ペプチドワクチン：中和抗体の決定領域のペプチド配列を化学合成したものなどが検討されている。特にエンベロープの糖タンパクgp120のＶ３領域は主要中和決定領域でありＶ３領域合成ペプチドをワクチンとする試みが行われている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,6768,(1989)）。
これらのワクチンの研究開発状況については、例えば高橋秀実、実験医学１１巻６５５−８６６１頁（１９９３）、奥田研爾・山川正、臨床と微生物２０巻５５−６２頁、Ａ．Ｔ．Ｐｒｏｆｙ；ＢＩＯmedica ８巻１３３−１３９頁に記載される。
上記のような現在までのワクチンの研究開発は中和抗体を誘導する体液性免疫増強型のものが主であったが、ＨＩＶがフリーのウイルス粒子としてよりも感染細胞と非感染細胞との融合によって伝播しやすいということから、中和抗体による体液性免疫よりも感染細胞を障害する細胞障害性Ｔ細胞（cytotoxic T cell、以下「ＣＴＬ」と略称する）による細胞性免疫が感染防御に重要と考えられる。実際、ＨＩＶ感染の機会にさらされながら感染が成立しなかった個体について調べてみると血中抗体は検出されないが高頻度でＣＴＬをもっており、早期のＣＴＬ誘導が感染予防に重要であることが報告されている（J. Infec. Dis.,164,178,(1992)）。
そこで本願発明者らは、ＨＩＶが感染した細胞を特異的に障害するＣＴＬを誘導できるペプチドを探索し、これを抗ＡＩＤＳ治療あるいは予防に利用することをめざした。
ＨＩＶ感染細胞に対するＣＴＬを効果的に誘導するにはＣＴＬが認識する抗原エピトープを同定しこれをワクチンに応用することがきわめて重要である。今までははじめにＨＩＶに特異的なＣＴＬクローンを作製し、そのＣＴＬクローンが認識する抗原エピトープを同定するという方法をとっていた（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,3105,(1988)）。この方法では、数多くのヒト白血球抗原（以下「ＨＬＡ」と略称する）クラスＩ抗原によってＣＴＬに提示されるＨＩＶ抗原エピトープを同定するのに非常に多数のペプチド合成を要するため多大な時間と費用がかかると考えられ、エピトープの同定も進んでいなかった。
ＣＴＬは標的細胞表層に発現される主要組織適合性抗原複合体（以下「ＭＨＣ」と略称する）クラスＩ抗原によって抗原提示されたエピトープペプチドを認識して標的細胞を攻撃するが、最近、特定のＭＨＣクラスＩ抗原に結合して抗原提示されるエピトープペプチドは９鎖長内外のペプチドであってそのアミノ酸配列には一定の法則性（モチーフ）があることが判明してきた（Nature, 351,290,(1991)、Eur. J. Immunol.,22,2453,(1992)、Nature,353,326,(1991)、Nature,360,434,(1992)、Immunogenetics, 38,161,(1993)）。
発明の開示
本発明は、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるペプチドを提供することを目的とする。
本発明は、又、上記ペプチドをコードするＤＮＡを提供することを目的とする。
本発明は、又、上記ペプチドを含有する抗ＡＩＤＳ予防・治療剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるペプチドの採取方法を提供することを目的とする。
本発明の上記及び他の目的は、以下の記載から明らかとなるであろう。
本発明は、それぞれのＨＬＡクラスＩ抗原に結合する自己抗原ペプチドのモチーフから、そのＨＬＡクラスＩ抗原に結合する可能性のあるＨＩＶペプチドを推定し、推定したＨＩＶペプチドを合成し、ペプチドが結合していないＨＬＡクラスＩ抗原を多量に発現している形質転換細胞を用いて、形質転換細胞上に多量に発現しているＨＬＡクラスＩ抗原と実際に結合する合成ペプチドを選択し、次いで選択した合成ペプチドのうち、ＨＬＡクラスＩ抗原に結合した該合成ペプチドが患者の末梢血リンパ球を刺激してＣＴＬを誘導できるものが抗ＡＩＤＳ予防・治療剤として有用であるとの知見に基づいてなされたのである。
すなわち、本発明は、ＨＩＶの全たんぱくの断片であって、該断片が８個〜１１個のアミノ酸の連続する配列を含むペプチドであり、ＨＬＡ結合モチーフに相当し、実際にＨＬＡに結合し、かつＨＩＶ感染細胞を標的とするキラー細胞を誘導しえるペプチドを提供する。
本発明は、又、上記ペプチドをコードするＤＮＡを提供する。
本発明は、又は、上記ペプチド及び医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む抗ＡＩＤ予防・治療剤を提供する。
本発明は、又、ＨＩＶの全たんぱくの断片であって、８個〜１１個のアミノ酸の連続する配列を含み、ＨＬＡ結合モチーフに相当するペプチドを合成し、合成ペプチドのうち実際にＨＬＡに結合するものを選択し、次いで選択した合成ペプチドのうちＨＬＡクラスＩ抗原に結合してＨＩＶ疾患患者の末梢リンパ球を刺激してキラー細胞を誘導するものを採取することを特徴とするＨＩＶ感染細胞を標的とするキラー細胞を誘導しえるペプチドを採取する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞上におけるＨＬＡ−Ｂ*3501抗原の発現レベルの変化を示す。図中、△はＨＬＡ−Ｂ*3501抗原結合性のある自己抗原ペプチド２８Ｈ（LPGPKFLQY）、○は３７Ｆ（LPFDFTPGY）、□は結合性のないペプチドＭＰ−１（KGILGKVFTLTV）の添加によるＨＬＡ−Ｂ*3501発現レベルの変化を示す。
図２は、ペプチドとしてHIV(B35)-16を用いたときの特異的細胞傷害活性を示す。図中、●は標識標的細胞がＴ２−Ｂ*3501細胞の場合、○は標識標的細胞がＴ２細胞の場合でありコントロールである。ペプチドで刺激して培養した患者末梢リンパ球は、１×１０5、２.５×１０4あるいは６.２５×１０3個の３段階の細胞数を用いたが、図に示される特異的細胞傷害活性の値は１×１０5個の細胞を用いたときのものである。
図３は、ペプチドとしてHIV(B35)-18を用いたときの特異的細胞傷害活性を示す。●は標識標的細胞がＴ２−Ｂ*3501細胞の場合、○は標識標的細胞がＴ２細胞の場合でありコントロールである。ペプチドで刺激して培養した患者末梢リンパ球は、１×１０5、２.５×１０4あるいは６.２５×１０3個の３段階の細胞数を用いたが、図に示される特異的細胞傷害活性の値は１×１０5個の細胞を用いたときのものである。
図４は、ペプチドとしてHIV(B35)POL-20を用いたときの特異的細胞傷害活性を示す。●は標識標的細胞がＴ２−Ｂ*3501細胞の場合、○は標識標的細胞がＴ２細胞の場合でありコントロールである。ペプチドで刺激して培養した患者末梢リンパ球は、１×１０5、２.５×１０4あるいは６.２５×１０3個の３段階の細胞数を用いたが、図に示される特異的細胞傷害活性の値は１×１０5個の細胞を用いたときのものである。
発明を実施するための最良の形態
ＨＩＶの全たんぱくは、例えば、Nature Vol. 313, p277-283(1985)やProc. Natl., Acad. Sci. USA Vol. 83, p2209-2213(1986)などに記載されている。本発明のペプチドは、上記ＨＩＶの全たんぱくの断片であって、該断片が８個〜１１個、好ましくは９個〜１１個のアミノ酸の連続する配列を含むペプチドである。本発明のペプチドは、さらに、ＨＬＡ結合モチーフに相当し、実際にＨＬＡに結合することが必要である。ここで、ＨＬＡ結合モチーフとしては、８個〜１１個のアミノ酸配列であって、２番目がＰｒｏ、Ｃ末端がＴｙｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＡｌａからなる群から選ばれるアミノ酸であるもの、２番目がＰｒｏ、Ａｌａ及びＧｌｙからなる群から選ばれるアミノ酸であり、Ｃ末端がＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ及びＭｅｔからなる群から選ばれるアミノ酸であるもの、２番目がＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ及びＰｈｅからなる群から選ばれるアミノ酸であり、Ｃ末端がＡｒｇであるものがあげられる。本発明においては、ＨＬＡ結合モチーフに相当ペプチドが実際にＨＬＡに結合するか否かは、ＨＬＡクラスＩ抗原をもつ細胞をもちいて確認することができる。このような細胞としては、ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞、ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*5101細胞及びＲＭＡ−Ｓ−Ａ*3101細胞などがあげられ、これらは、ＨＬＡ−Ｂ*3501遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ*5101遺伝子やＨＬＡ−Ａ*3101遺伝子を、ＲＭＡ−Ｓ細胞に導入することにより容易に得ることができる。尚、ＲＭＡ−Ｓ細胞は、Ljunggren et al., J. Immu-nol., 142,2911,(1989)に記載されている。
本発明では、さらに、ＨＬＡクラスＩ抗原に結合した合成ＨＩＶペプチドが実際に患者の末梢血リンパ球を刺激してＣＴＬを誘導できること、つまりＨＩＶ感染細胞を標的とするキラー細胞を誘導しえることが必要である。
このようなペプチドとしては、配列番号１から６３のペプチドを例示することができる。
配列番号１から２４のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ3501抗原に結合するペプチドであって、ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞を利用して得られたものである。配列番号２５から４６のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ51抗原に結合するペプチドであって、ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*5101細胞を利用して得られたものである。又、配列番号４７から６３のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＬＡ−Ａ3101抗原に結合するペプチドであって、ＲＭＡ−Ｓ−Ａ*3101細胞を利用して得られたものである。本発明のペプチドを得る手段は、後述の実施例で詳しく述べる。
配列番号１から６３のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドは、当業者間で周知の方法により合成又は製造できる。近年はペプチドシンセサイザーが発達したため、数十の残基よりなるペプチドも容易に製造できる。あるいは、配列番号１から６３のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに接続し、これによって形質転換されたエシェリヒア属細菌等の細胞を培養することによっても製造できる。このような、遺伝子組換え技術をもちいたタンパク質やペプチドの製造法は当業者間でよく知られている。
配列番号１から６３のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号１から６３のうちいずれかのアミノ酸配列より演繹できる。各アミノ酸残基に対応するコドンは当業者において周知である。該ＤＮＡを細胞に導入して発現させる場合には、各細胞において好まれるコドンが異なる場合があるのでこれを参考にする。たとえばエシェリヒア属細菌細胞内で好まれるコドンを用いる場合には、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡの例としては、配列番号６４の塩基配列を有するＤＮＡがある。配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡの例としては、配列番号６５の塩基配列を有するＤＮＡがある。配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡの例としては、配列番号６６の塩基配列を有するＤＮＡがある。
配列番号１から６３のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドは、Ｔ細胞エピトープとしてＨＩＶ特異的ＣＴＬを誘導することができるのでワクチンとして非常に有用である。実際のワクチンとしての使用はペプチド溶液をそのまま、または適当な補助剤とともに注射器で投与することもできるし、噴霧などの方法で粘膜からの経皮吸収などで投与してもよい結果が得られる。投与量は１回0.1から100mgで単回または繰り返し投与する。また上記に方法で選択した複数のエピトープペプチドを同時に用いるとさらに効果的である場合が多い。製剤としては凍結乾燥、糖などの賦形剤を加えて顆粒にするなどでよく、別段に特別のものを要さない。注射投与する際に注射用蒸留水で溶解して用いる。本剤はペプチド化合物であり上記投与方法で問題となる重篤な急性毒性はない。
ワクチンに添加して免疫原性を高める補助剤としてはＢＣＧ菌などの菌体成分、Moreinらにより開発されたＱｕｉｌｌＡという樹皮から抽出したＩＳＣＯＭ（Immunostimulating complex）（Nature, 308,457,(1984)、Nature, 344,873,(1990)）、サポニン系のＱＳ−２１（J. Immunol.,148,1438,(1992)）、リポソーム（J. Immunol.,148,1585,(1992)）、水酸化アルミニウム（アラム）、ＫＬＨ（Keyhole Lympet Hemocyanin）（J. Virol.,65,489,(1991)）などが利用できる。このような方法で生体内にＣＴＬなどの免疫応答を誘導できることは上記記載のそれぞれの先行文献やScience, 255,333,(1992)などにも述べられている。
患者から採取した細胞または同ハプロタイプのＨＬＡクラスＩ抗原をもつ細胞に試験管内で当該エピトープペプチドを与えて抗原提示させたのち患者血管中に投与し、患者体内で効果的にＣＴＬを誘導させる方法、患者末梢血リンパ球に同ペプチドを加えて試験管内で培養、試験管内でＣＴＬを誘導増殖させたのち患者にもどす方法も本発明で明らかにされたエピトープペプチドを使うことにより有効に適用することができる。従って、ＨＬＡ−Ｂ*3501抗原を有する末梢血リンパ球を、配列番号１から２４のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド存在下で培養して得られる細胞障害性Ｔ細胞を抗ＡＩＤＳワクチンとして用いることもできる。実際には患者末梢血リンパ球１０7から１０9個に当該ペプチド0.01から1mgを加えて数時間から１日培養した後患者静脈中に投与するか、あるいはさらに組換えインターロイキン２（recombinant ＩＬ−２）を50U/mlと当該ペプチド１μg/mlを加えた培養液で数週間培地交換しながら培養を継続して試験管内でＣＴＬを誘導してから患者静脈より注入する。培養の方法は当業者間でよく知られている通常の方法でよく、培養後は遠心分離等で培地成分を洗浄後生理食塩水等で懸濁して投与する。このような細胞注入による治療はすでに癌治療法として実施されており、当業者間ではよく知られている方法である（New Eng. J. Med., 313,4185,(1985)、Science,233,1318,(1986)）。
また本発明で明らかにされたＣＴＬエピトープはワクシニアウイルスやＢＣＧ菌組換え生ワクチンなどでも有効に活用できる。すなわちこれらの組換え生ワクチンにおいて発現させる組換え抗原タンパク遺伝子中に配列番号１から６３のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡを組み込んでおけば、該ペプチド配列が抗原タンパクの一部として発現したのち細胞内でプロセスされてＨＬＡクラスＩ抗原により提示され、これを認識するＣＴＬを誘導することができる。ＢＣＧ菌における外来遺伝子の発現方法は国際特許公開ＷＯ８８／０６６２６に詳しい。ＢＣＧ菌組換え生ワクチンについてはJ. Exp. Med., 178,197,(1993)に詳しい。投与量、投与方法は通常の種痘やＢＣＧワクチンに準じて行うことができる。急性毒性等も通常の種痘やＢＣＧワクチンと変わるところはない。ただしワクシニアウイルスの場合ＡＩＤＳが発症し、免疫能が低下している患者には重篤感染の危険性があり、治療用ワクチンとしては慎重に行う必要がある。ＢＣＧワクチンについてはこのような事例はまだない。このような方法で生体にＣＴＬなどの免疫応答を誘導できることはNature,332,728,(1988)やNature,351,479,(1991)などに示されている。
ＨＩＶワクチンの大きな問題点はＨＩＶが容易に変異を起こして宿主免疫を逃れる点にある。したがって免疫原として一つのエピトープのみを担ったワクチンはやがて効力失う可能性が大である。その点、本発明により明らかになった多数のエピトープを免疫原とするワクチンの有用性はきわめて高い。
次に実施例により本発明を説明する。
実施例１
(1)ＨＬＡ−Ｂ*3501結合自己抗原ペプチドのモチーフよりＨＬＡ−Ｂ*3501結合のＨＩＶペプチドの推定
ＨＬＡ−Ｂ*3501結合自己抗原ペプチドのモチーフは以前に明らかにされており（Nature,360,434,(1992)、Immunogenetics, 38,161(1993)）、その結果よりＨＩＶタンパク由来ペプチドのうち自己抗原ペプチドと同様に８から１２個のアミノ酸からなるペプチドであって、２番目がＰｒｏ、Ｃ末端がＴｙｒ、Ｌｅｕ、Ｕｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅのうち一つをもったものがＨＬＡ−Ｂ*3501に結合しやすいと推定された。ＨＩＶを構成する全タンパク質のアミノ酸配列はすでに報告がされているので、この配列の中からＨＬＡ−Ｂ*3501結合自己抗原ペプチドのモチーフと合致するものを選び出した。ＡＲＶ−２株ＨＩＶのタンパク配列のうちこれに合致するペプチドは表１に示した５８種類のものである。これらのペプチドを島津製作所製のペプチドシンセサイザーで合成し、ＨＬＡ−Ｂ*3501抗原への結合測定実験に供した。
合成したＨＩＶペプチドが結合するかを、ＨＬＡ−Ｂ*3501を発現しているマウス細胞株ＲＭＡ−Ｓ株を用いて測定した。
2-1. ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞の作製
ＨＬＡ−Ｂ*3501遺伝子はこの抗原をもっているヒトの末梢血リンパ球の染色体ＤＮＡから以前に報告されている方法（Ooba et al., Immunogenetics,30,76,(1989)）によりクローニングすることができる。すなわちＨＬＡ−Ｂ*3501抗原をもつヒトの末梢血リンパ球より常法により染色体ＤＮＡを調製、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後ショ糖密度勾配遠心により6.0-8.5kbの断片を得た。このＤＮＡ断片をファージベクターλＺＡＰ（東洋紡社より購入）に挿入しゲノムライブラリーを作成した。このライブラリーをＨＬＡ−Ｂ７ｃＤＮＡ（Coppin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82,8614,(1985)）をプローブとしてスクリーニングしＨＬＡ−Ｂ*3501遺伝子をもつクローンを得た。得られた遺伝子をＲＭＡ−Ｓ細胞（Ljunggren et al., J. Immunol.,142,2911,(1989)）にelectroporation法により遺伝子移入し、発現細胞を抗ＨＬＡ−Ｂｗ６単クローン抗体、ＳＦＲ８・Ｂ６（ATCC HB152）を用いてflowcytometryによって選択した。ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞は通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、受託番号FERM BP-4727が付与されている。
2-2. ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞を用いたＨＩＶ合成ペプチドのＨＬＡ−Ｂ*3501抗原への結合測定
ＲＭＡ−Ｓ細胞はＴＡＰ（Transporter Associated Protein）抗原が欠損したマウスの細胞株である。このため、細胞表面上にＭＨＣクラスＩ抗原が３７℃で培養した時には低レベルでしか細胞表面上には発現しない。しかし低温（２６℃）で培養するとペプチドをとりこんでいないクラスＩ抗原が高レベルで細胞表面上に発現することが知られている（Ljunggren et al., Nature, 346,476,(1990)）。
ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞でも同様にＨＬＡ−Ｂ*3501抗原は２６℃で培養した時には高レベルで細胞表面上に発現するが、３７℃で培養するとその発現は低下する。また２６℃で培養しておいたＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞上のＨＬＡ−Ｂ*3501抗原の発現は３７℃に３時間おくことにより、３７℃で培養した場合と同じに発現量は低くなる。しかしながらペプチドが結合していないＨＬＡ−Ｂ*3501抗原に外から加えたペプチドが結合すると、ペプチドの結合したＨＬＡ−Ｂ*3501抗原は３７℃に置いても消失せず高発現量が保たれる。図１はＨＬＡ−Ｂ*3501抗原結合性のある自己抗原ペプチド２８Ｈ（LPGPKFLQY：グラフ中△で表現される）、３７Ｆ（LPFDFTPGY：グラフ中○で表現される）と、結合性のないペプチドＭＰ−１（KGILGKVFTLTV：グラフ中□で表現される）の添加によるＨＬＡ−Ｂ*3501発現レベルの変化について調べたもので、ＨＬＡ−Ｂ*3501抗原の発現量が結合活性のあるペプチドの添加量に依存しているという結果が得られた。ＨＬＡ−Ｂ*3501抗原結合性のある自己抗原ペプチド２８Ｈ、３７Ｆと、結合性のないペプチドＭＰ−１についてはNature,360,434,(1992)、Immunogenetics, 38,161(1993)に記載されている。従ってこの実験系を用いることによりはじめて、外から加えたペプチドのＨＬＡ−Ｂ*3501への結合活性をＨＬＡ−Ｂ*3501抗原の細胞表層発現量を指標として容易に評価することができるようになった。実際の被検ペプチドの結合測定操作は２６℃で培養したＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞に該ペプチドを加えて２６℃で１時間、その後３７℃に３時間置いた後に抗ＨＬＡ−Ｂｗ６単クローン抗体、ＳＦＲ８・Ｂ６とflow cytometryを用いてＨＬＡ−Ｂ*3501抗原の発現レベルを測定することにより行った。なお、▲はペプチド非添加のコントロール、●はペプチド非添加でありかつ２６℃でのみ培養を行ったコントロール、■はペプチド非添加でありかつ３７℃でのみ培養を行ったコントロールである。
５８種類のＨＩＶペプチドのＨＬＡ−Ｂ*3501抗原に対する結合を測定したところ、表２に示すように２６種類のペプチドが結合した。
(4)ＨＬＡ−Ｂ*3501結合ペプチドを用いて誘導されたＣＴＬによる細胞障害活性の測定
4-1. Ｔ２−Ｂ*3501細胞の作製
ＴＡＰ抗原遺伝子欠損ヒトリンパ細胞株Ｔ２細胞（Salter et al.,EMBO J.,5,943,(1986)）にＨＬＡ−Ｂ*3501遺伝子をelectroporation法により遺伝子移入し、発現細胞をＳＦＲ・Ｂ６単クローン抗体を用いてflowcytometryによって選択した。この細胞をＴ２−Ｂ*3501細胞と命名した。Ｔ２−Ｂ*3501細胞は通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、受託番号FERM BP-4726が付与されている。
ＨＬＡ−Ｂ３５の患者がＨＩＶに感染した発病した場合、ＨＩＶに感染したリンパ細胞はＨＬＡ−Ｂ*3501抗原を細胞表面に発現しＨＩＶペプチドを提示する。Ｔ２−Ｂ*3501細胞は、（２）で示したＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞と同様に、２６℃培養ではペプチドを結合していないＨＬＡ−Ｂ*3501抗原を多量に発現する。そこで、この条件下でペプチドを結合させ、いわばＨＩＶに感染したリンパ細胞を人為的に創り出し、ＣＴＬの細胞障害活性を測定する標的細胞として用いた。
4-2. ＣＴＬの細胞障害活性の測定
１×１０6個のＴ２−Ｂ*3501細胞あるいはＴ２細胞を１００μＣｉのNa2 51CrO4に２６℃で９０分間混和し、その後１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ1640培養液で３回洗浄し標識標的細胞とする。９６穴プレートの各穴に５０μｌの培養液中に浮遊させた５×１０3個の標識標的細胞（Ｔ２あるいはＴ２−Ｂ*3501細胞）を加える。さらに４μＭから４×１０-4μＭまで希釈した合成ペプチドの溶液を５μｌ加え３０分間、ＣＯ2インキュベーターに放置した後、前項のペプチドで刺激して培養した患者末梢リンパ球を１×１０5、２.５×１０4あるいは６.２５×１０3個（１００μｌの培養液に浮遊させる）加え、３７℃のＣＯ2インキュベーターに４時間放置した。その後各穴の半量の培養液（１００μｌ）をとり、ガンマーカウンターにて培養患者末梢リンパ球の細胞障害活性によって標的細胞から遊離された51Ｃｒを測定した。特異的細胞障害活性を次のとおり計算した。
結果を図２、３及び４に示す。図２はHIV(B35)-16（配列番号３）、図３はHIV(B35)-18（配列番号４）、図４はHIV(B35)POL-20（配列番号６）の結果である。合成ペプチドが結合したＴ２−Ｂ*3501細胞を傷害するＣＴＬの誘導にこれら合成ペプチドが有効であることが確認された。
同様の方法により表２に記載のペプチドについて、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるか否かについて調べた。このうちＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるペプチドをまとめて表３に示す。
ＨＬＡ結合モチーフとして、８個〜１１個のアミノ酸配列であって、２番目がＰｒｏ、Ａｌａ及びＧｌｙからなる群から選ばれるアミノ酸であり、Ｃ末端がＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ及びＭｅｔからなる群から選ばれるアミノ酸であるＨＬＡ−Ｂ51結合抗原ペプチドのモチーフを用い、かつＳＦ−２株ＨＩＶのタンパク配列及びＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞を用いた以外は実施例１と同様にして、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるペプチドを得た。このペプチドをまとめて表５に示す。尚、ＲＭＡ−Ｓ−Ｂ*3501細胞は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、受託番号FERM BP-4834が付与されている。
ＨＬＡ結合モチーフとして、８個〜１１個のアミノ酸配列であって、２番目がＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ及びＰｈｅからなる群から選ばれるアミノ酸であり、Ｃ末端がＡｒｇであるＨＬＡ−Ａ*3101結合抗原ペプチドのモチーフを用い、かつＭＮ株ＨＩＶのタンパク配列又はＳＦ−２株ＨＩＶのタンパク配列及びＲＭＡ−Ｓ−Ａ*3101細胞用いた以外は実施例１と同様にして、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるペプチドを得た。このペプチドをまとめて表６に示す。ＲＭＡ−Ｓ−Ａ*3101細胞は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、受託番号FERM BP-4833が付与されている。
本発明のペプチドは、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるので、抗ＡＩＤＳ予防・治療剤として有効に利用することができる。具体的には、上記ペプチドを含有する抗ＡＩＤＳワクチン、上記ペプチドをコードするＤＮＡ含む組換えＤＮＡを有するワクシニアウイルス及びＢＣＧ菌を含有する抗ＡＩＤＳワクチンとして利用することができる。又、上記ペプチドの存在下で、ＨＬＡ−Ｂ抗原を有する抹消血リンパ球を培養して得られる細胞障害性Ｔ細胞を含有する抗ＡＩＤＳ治療剤として利用することができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：１１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
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配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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配列の長さ：９
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配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
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配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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配列の長さ：２７
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鎖の数：二本鎖
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配列
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
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鎖の数：二本鎖
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
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鎖の数：二本鎖
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
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配列の長さ：９
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
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配列の種類：ペプチド
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・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
・生物名：ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)
配列
Claims (3)
- 配列番号１〜４９、５１〜６３及び６７〜７４のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドであって、ＨＬＡクラスＩ分子と特異的に結合し、かつＣＴＬを誘導できる該ペプチド。
- 請求項１記載のペプチドをコードするＤＮＡ。
- 請求項１記載のペプチド及び医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む抗ＡＩＤＳ予防・治療剤。
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