JP2023554553A - ウイルス特異的ｔ細胞ならびにウイルス感染の治療方法及び予防方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ウイルスペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含む医薬組成物、ウイルスペプチド特異的ＣＴＬの生成方法、及びウイルス感染の治療方法または予防方法に関する。一実施形態では、本開示は、ウイルス感染の治療方法に関する。この方法は、それを必要とするヒト患者に対して、ウイルスペプチドに反応性の細胞が特異的に濃縮されたものであるウイルスペプチド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む細胞を有効量で投与することを含み得る。ヒト患者は、高齢患者または免疫不全患者であり得る。投与することは、静脈内注入によって実施され得る。注入は、中心ラインまたは正中線を介して患者に送達され得る。ウイルスペプチド特異的ＣＴＬは、単一のドナーに由来し得る。【選択図】なし
Description
関連出願
本出願は、２０２０年１２月９日出願の米国仮特許出願第６３／１２３，１０９号及び２０２１年５月８日出願の米国仮特許出願第６３／１８６，０９８号の優先権を主張する。
［０００１．１］
配列表の参照
本出願は、コンピューター可読形態の配列表を含む。当該コンピューター可読形態は、参照によって本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年１２月９日に作成されたものであり、その名称は７６７０９５＿００００２３＿ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは１５，９８２バイトである。
本出願は、２０２０年１２月９日出願の米国仮特許出願第６３／１２３，１０９号及び２０２１年５月８日出願の米国仮特許出願第６３／１８６，０９８号の優先権を主張する。
［０００１．１］
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本出願は、コンピューター可読形態の配列表を含む。当該コンピューター可読形態は、参照によって本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年１２月９日に作成されたものであり、その名称は７６７０９５＿００００２３＿ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは１５，９８２バイトである。
感染性疾患は、その不名誉な地位を非伝染性疾患に明け渡した２０世紀末までは早死及び身体障害の最大の世界的負担の原因であった。感染性疾患の中で、ウイルス感染は、差し迫った世界的流行の脅威の可能性を有する主要な世界的健康問題である。例えば、米国単独でも、ＣＯＶＩＤ－１９の最初の症例が報告された２０２０年１月から２０２０年８月までの間に特定された症例数は少なくとも５，８２１，８１９件に上り、ＣＯＶＩＤ－１９に起因する死亡例は１７９，７０８件であった。（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ，２０２０）。もっとも影響が深刻な患者における感染の治療方法の開発には進捗が見られているものの、ウイルス関連死は引き続き重大な問題であり、特に、感染リスクの高い特定集団ではそうである（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ，０６／２２／２０２０）。高齢者及び免疫不全者、併存疾患（糖尿病または循環器疾患など）を有する者、ワクチン未接種者、ならびにマイノリティーは、残りの集団と比較してウイルス感染に起因する死亡率が高い（Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０、Ｓｔｏｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。
ウイルス感染向けにヒトでの使用が承認されているワクチンプラットホームはいくつか存在するが、ウイルスに対する感染後治療選択肢を強いる要因がいくつか残っている。例えば、ワクチン接種選択肢の欠如、ワクチン忌避、ワクチン接種集団でのブレイクスルー感染、及びウイルス病原体による免疫回避は、現存の抗ウイルス戦略（小分子及びワクチンなど）にはもはや反応しないウイルス集団を生じさせ得るものである。さらに、ウイルス感染及びワクチン接種の後の免疫の永続性については疑問が残る（Ｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。ウイルス感染サイクルを通じて生じる進化的変化に対処するように迅速に適応し得る治療選択肢が依然として求められており、このことは、ＣＯＶＩＤ－１９にも当てはまる。
一実施形態では、本開示は、ウイルス感染の治療方法に関する。この方法は、それを必要とするヒト患者に対して、ウイルスペプチドに反応性の細胞が特異的に濃縮されたものであるウイルスペプチド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む細胞を有効量で投与することを含み得る。ヒト患者は、高齢患者または免疫不全患者であり得る。投与することは、静脈内注入によって実施され得る。注入は、中心ラインまたは正中線を介して患者に送達され得る。ウイルスペプチド特異的ＣＴＬは、単一のドナーに由来し得る。
ＣＴＬは、インビトロでの刺激によって、単一のＨＬＡアレルに対して拘束された複数のペプチドに対して感作され得る。こうしたＣＴＬの少なくとも２０％はウイルスペプチドに反応性であり得、及び／またはこうした細胞は、２．５％未満のナイーブＴ細胞、単球、ＮＫ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
ウイルスペプチド特異的ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ１アレルに対して拘束された１つ以上のペプチド（表１から選択され得る１つ以上のペプチドなど）に対して感作され得る。ウイルスペプチド特異的ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ２アレルに対して拘束された１つ以上のペプチド（表２または表９から選択され得る１つ以上のペプチドなど）に対して感作され得る。ウイルスペプチド特異的ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ｂ７アレルに対して拘束された１つ以上のペプチド（表３から選択され得る１つ以上のペプチドなど）に対して感作され得る。ウイルスペプチド特異的ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ｂ４０アレルに対して拘束された１つ以上のペプチド（表４から選択され得る１つ以上のペプチドなど）に対して感作され得る。ウイルスペプチド特異的ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ｃｗ７アレルに対して拘束された１つ以上のペプチド（表５から選択され得る１つ以上のペプチドなど）に対して感作され得る。ウイルスペプチド特異的ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ１アレル、ＨＬＡ－Ａ２アレル、ＨＬＡ－Ｂ７アレル、ＨＬＡ－Ｂ４０アレル、ＨＬＡ－Ｃｗ７アレルのうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせに結合するウイルスペプチドの組み合わせに対して感作され得る。
ウイルスペプチドは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、ＳＡＲＳ－コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９）ウイルス、またはインフルエンザウイルスに由来し得る。
一実施形態では、本開示は、ウイルスペプチドに反応性の細胞が特異的に濃縮されたものであるウイルスペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の調製方法に関する。この方法は、単球のサブセットを処理して樹状細胞への成熟を誘導し得、樹状細胞を１つ以上のウイルス特異的ペプチドでパルスし、リンパ球と共に少なくとも６日間共培養し得る第１の刺激ステップを含み得る。樹状細胞への成熟の誘導は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、またはこれら２つの組み合わせを用いて行う少なくとも約２４時間の単球の第１の処理と、第１の処理の後にＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６、プロスタグランジンＥ２、またはそれらの任意の組み合わせを用いて行う少なくとも約２４時間の単球の第２の処理と、を含み得る。ウイルスペプチドでの樹状細胞のパルスは、少なくとも約２μｇ／ｍＬの各ウイルスペプチドと共に樹状細胞をインキュベートすることを含み得る。
方法は、単球を使用してウイルス特異的ペプチドを提示させ得、刺激リンパ球を少なくとも７日間培養し得、パルスペプチドを認識するＴ細胞が接着単球層に選択的に接着することに起因してペプチド特異的ＣＴＬを選択し得る第２の刺激ステップを含み得る。刺激リンパ球は、ヒトインターロイキン－１（ＩＬ－１）で共培養物を処理することによってさらに選択され得る。
方法は、単球のサブセットを複数のウイルス特異的ペプチドでパルスし、単一のＨＬＡアレルに対して拘束し得、それによってウイルスペプチド特異的ＣＴＬを生成させる第３の刺激ステップを含み得、ＣＴＬの少なくとも２０％はウイルスペプチドに反応性であり得る。ウイルス反応性ＣＴＬは、単一のドナーから収集された同種異系単核白血球であり得る。
ウイルスペプチド特異的ＣＴＬは、ＨＬＡ－Ａ１アレル、ＨＬＡ－Ａ２アレル、ＨＬＡ－Ｂ７アレル、ＨＬＡ－Ｂ４０アレル、またはＨＬＡ－Ｃｗ７アレルのうちのいずれか１つ以上に対して拘束された１つ以上のペプチドに対して感作され得る。ペプチドの例としては、表１～５及び９に示されるものが挙げられる。
ウイルスペプチドは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、ＳＡＲＳ－コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９）ウイルス、またはインフルエンザウイルスに由来し得る。
一実施形態では、本開示は、ウイルスペプチドに反応性の細胞が特異的に濃縮されたものであり得るウイルスペプチド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む細胞を含み得る医薬組成物に関する。ＣＴＬは、複数のドナーに由来する。ＣＴＬは、インビトロでの刺激によって、単一のＨＬＡアレルに対して拘束された複数のペプチドに対して感作され得る。ＣＴＬの少なくとも２０％はウイルスペプチドに反応性であり得る。細胞は、２．５％未満のナイーブＴ細胞、単球、ＮＫ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
ＣＴＬは、１つ以上の特定のＨＬＡ－Ａ１アレル、ＨＬＡ－Ａ２アレル、ＨＬＡ－Ｂ７アレル、ＨＬＡ－Ｂ４０アレル、またはＨＬＡ－Ｃｗ７アレルに結合する１つ以上のウイルスペプチドに対して感作されたものであり得る。ペプチドの例としては、表１～５及び９に示されるものが挙げられる。
ウイルスペプチド特異的ＣＴＬは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、メタニューモウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ジョン・カニンガムウイルス（Ｊｏｈｎ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｖｉｒｕｓ）（ＪＣＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、及びアデノウイルスからなる群から選択されるウイルスに特異的であり得る。一実施形態では、ウイルスは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、ＳＡＲＳ－コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９）ウイルス、またはインフルエンザウイルスであり得る。
医薬組成物は、ＤＭＳＯ中、ＲＰＭｌ－１６４０中、アルブミン中、もしくはそれらの組み合わせ中で凍結保存されたＣＴＬ、及び／または１つ以上の追加の抗ウイルス剤をさらに含み得る。
医薬組成物は、静脈内投与に適した形態のものであり得る。
出願人は、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、メタニューモウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ジョン・カニンガムウイルス（ＪＣＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、アデノウイルス、またはコロナウイルス）によって重症である患者の免疫学的治療に使用することができるウイルスペプチド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）産物の新規調製物を投与することによる感染患者の治療方法を開発している。ウイルス感染の根絶におけるＴ細胞の役割は、この労力に対して科学的及び臨床的な論理的根拠を与えるものである。
ウイルス特異的ＣＴＬは、急性ウイルス感染の治療に加えて、ウイルス感染関連悪性腫瘍の予防及び／または治療にも使用され得る。例えば、ＥＢＶは、移植後リンパ増殖性障害を含むさまざまなＢ細胞癌と関連している。標的化ＣＴＬは、Ｂ細胞系譜の他のＥＢＶ関連悪性腫瘍ならびに鼻咽頭癌の治療にも使用され得る。
ウイルス感染は将来的ながんの土台にもなり得る。したがって、慢性Ｂ型肝炎感染と肝細胞癌の発症との間には強い関連性が存在する。感染後早期に標的化ＣＴＬを介してウイルスを根絶することは、その後に悪性腫瘍が生じることを回避する上で有望なものである。本明細書に記載の方法は、単なる急性ウイルス感染の治療に限定されるものではなく、抗ウイルスＣＴＬを使用してさまざまな型の癌を治療及び／または予防することができる。
現存する生成方法及び既製産物（例えば、ＡｌｌｏＶｉｒ）は、本明細書に開示の組成物及び方法と比較してはるかに濃縮度の低いＴ細胞混合物を与えるものである。そのような産物は、専門用語（「ウイルス特異的Ｔ細胞」（すなわち、ＶＳＴ）など）を使用して、本明細書に開示のものと同じまたは同様の方法向けに上市されている。商業的に利用可能な産物とは対照的に、本明細書で生成される細胞は、ＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞であることが分かっている。したがって、本明細書に開示の方法は、高純度化によって示されように、当該技術分野で知られているものよりも優れている。理論によって拘束されることを望むものではないが、本明細書に開示の細胞の高純度化は、請求される方法ステップに起因するものと予想され、こうした方法ステップには、例えば、製造の間の再刺激及び長期化培養が含まれ、こうした方法ステップは、最終的に臨床グレードの拡張性を可能にするものである。
高いレベルでは、本開示は、必要な患者にウイルス特異的Ｔ細胞を投与することによるウイルス感染の治療方法、ウイルス特異的ＣＴＬの生成方法、及びウイルス特異的ＣＴＬの医薬組成物に関する。そのようなウイルス反応性ＣＴＬは、ヒトウイルス（例えば、数あるウイルスの中でもとりわけ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、メタニューモウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＢＫＶ、ＪＣＶ、ＨＨＶ、アデノウイルス、及びコロナウイルス）に対してプライミングされたウイルス特異的Ｔ細胞を使用して生物学的試料中のウイルスまたはウイルス産物の存在を検出するための診断方法に使用され得る。本明細書に記載の方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対してＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮し、特定のＨＬＡアレル－ウイルスペプチド関連性を同定し、従来の方法よりもウイルス特異的ＣＴＬの細胞傷害効率を約４０倍に高めることによって、ウイルスペプチド特異的Ｔ細胞の生成に用いられる現存の方法論を実質的に改善するものである。
本明細書に記載の組成物及び方法を使用することで、多様な標的に応答を集め、それによって、変異に起因するウイルス回避を防止する安全ネットを提供することができる。例えば、多くのウイルスワクチンは、表面に露出した糖タンパク質（「Ｓタンパク質」など）を標的としている。Ｓタンパク質にウイルス変異が生じた場合、免疫応答は損なわれ得る。現存のＴ細胞ベースの治療的治療及び予防的治療は合理的に設計されておらず、一般に、ＣＤ４及びＣＤ８が混ざったものを含んでおり、それによって、不可能ではないにせよ、応答を誘発する特異的なウイルスゲノム部分を同定することが困難になっている。対照的に、本発明は、免疫の獲得に特異的なエピトープに加えて、当該エピトープの起源がウイルスゲノムのどの部分であるかも当業者が同定することを可能にするものである。したがって、ペプチドレパートリー全体の中でさまざまなウイルスペプチドに対する応答を個別に評価すると共に、抗原性標的の多様性に由来するウイルスを攻撃することが可能である。本発明に含まれる多様性の結果として、単一の抗原（Ｓタンパク質など）に焦点が当てられた場合と比較してウイルスが免疫学的検出を回避する可能性は低い。
現在のところ、感染性疾患は、主な世界的死因の１つであり、コロナウイルス単独でも２０２０～２０２１年の死者数は２００万人を超える。ウイルスゲノムは、数ある要因の中でもとりわけ、そのゲノムが比較的小さいこと、拡散が急速であること、子孫の数、及び選択圧力が強いことに起因して、他の遺伝物質と比較して非常に高い変異率を誇る。通常のウイルス治療は、例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の症例では、表面に露出したスパイク糖タンパク質に焦点を当てている。ＣＯＶＩＤ－１９バリアントでは、こうした糖タンパク質に変異が生じることが多く、こうした変異によってスパイクタンパク質のフォールディングが大きく変化し、理論上は抗体結合が変化する。このことは、現在の治療、及び新たなＣＯＶＩＤ－１９バリアントに対する予防的対策の有効性を損ない得るものである。同様に、ワクチンによって誘導された免疫（特に、単一の変異可能なウイルス要素に対するもの）が持続する期間は不確かである。新たに出現したウイルス（コロナウイルスなど）に対する自然免疫は、いくつかの報告によれば持続期間が短いものである（Ｅｌｄｒｉｄｇｅ，ＡＷＤ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０２０，２６：１６９１－１６９３）。
本明細書では、新規のウイルスペプチド特異的ＣＴＬを用いてウイルス感染患者を治療する方法について記載される。本明細書に記載の最終ＣＴＬ産物を生成させるためのインビトロでの刺激－増殖サイクルを含む３つのステップ（任意選択で４つのステップ）プロセスを使用して製造されたウイルスペプチド特異的ＣＴＬが感染患者に注入され得る。ウイルスペプチド特異的ＣＴＬは、標準的な白血球アフェレーシス手法を使用して一人以上のドナーから収集された同種異系単核白血球を起源とし得る。
定義
本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、有効量のウイルスペプチド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む製剤を指す。医薬組成物は、少なくとも１つ以上の医薬的に許容可能な医薬品添加物をさらに含み得る。
本明細書で使用される「投与」または「投与すること」という用語は、ウイルスペプチド特異的Ｔ細胞を患者に血液に導入することを指す。ウイルス特異的ＣＴＬの医薬組成物は、例えば、静脈内投与を介して患者に投与され得る。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の効果の達成に必要な薬剤の量を指す。特定用途のための実際の有効量は、投与様式及び患者の生理学的パラメーター（とりわけ、患者の年齢、体重、総体的な健康、治療されている症状または状態の重症度を含む）に応じて異なり得る。特定の患者に対するウイルスペプチド特異的ＣＴＬの適切な投与量及び投与スケジュールは、こうした考慮事項及び他の考慮事項に基づいて、通常の技能を有する臨床医によって決定され得る。
本明細書で使用される「医薬的に許容可能な医薬品添加物」という用語は、顕著な有害毒性作用を伴わずに投与することが可能な医薬品添加物を指す。そのような医薬品添加物は、米国食品医薬品局によって一般に安全であると見なされている（ＧＲＡＳ）。
本明細書で使用される「ウイルス様疾病」または「ウイルス感染」という用語は、ウイルス様に見られる症状（ウイルスによって引き起こされる感染に見られる症状を意味する）を呈する任意の疾病または疾患を指す。
本明細書で使用される「ＣＤ８＋Ｔ細胞」または「ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）」という用語は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合するＣＤ８共受容体を有するＣＴＬを指す。ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞は異なる役割を有する：ＣＤ８＋Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合した非自己エピトープを提示する細胞の死滅を媒介する一方で、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した異なる非自己エピトープセットを認識することによって免疫応答を制御する。ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との間の注目すべき差異は、ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞の方が抗原提示の効率に優れていることである。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、テトラマーアッセイまたはテトラマー染色を使用して不均一なＴ細胞集団を含む試料の中から検出され得る。
本明細書で使用される「ペプチド」または「ウイルスペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して共有結合で連結された少なくとも２つの連続アミノ酸を指す。本明細書に記載のウイルスペプチドは、所与のＨＬＡアレルに対する高親和性リガンドとなる長さが短いアミノ酸配列（アミノ酸数が約５～２０のオーダーのもの）を含み得る。「ウイルスペプチド」という用語は、ペプチドがウイルス中の天然起源のペプチド配列と同一であることを指す。ウイルスペプチドはウイルスから単離される必要はなく、ペプチド合成、組換えＤＮＡベースのペプチド発現系、または当業者に知られる他のペプチド生成手法によって生成され得る。本明細書では、ウイルス中の天然起源のペプチド配列と同一のウイルスペプチドは、そうしたウイルスペプチドがそのウイルスから単離されたものでないとしても、そのウイルス「由来」であると称され得る。
本明細書で使用される「ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）」という用語は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子によってコードされるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体を指す。ＨＬＡ複合体は、短いペプチドに結合し、それをディスプレイするように機能する、細胞表面にディスプレイされる受容体である。ＨＬＡ分子は、それが提示可能なペプチド配列に関して非常に特異的である。ＨＬＡクラスＩ分子は、典型的には、８～１２個のアミノ酸（ａａ）の長さのペプチドに結合する。ＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）分子及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）分子は、それぞれＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞によって典型的には複合体として認識されるペプチドを提示する。
治療方法、予防方法、及び伝染低減方法
一態様では、本発明は、ウイルス（例えば、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、メタニューモウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ジョン・カニンガムウイルス（ＪＣＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、アデノウイルス、コロナウイルス、及び同様のもの）の治療方法及び伝染低減方法に関する。方法は、有効量のウイルスペプチド特異的Ｔ細胞を、それを必要とする患者に対して、好ましくは静脈内注入によって、投与することを含む。ウイルスペプチド特異的Ｔ細胞は、患者への静脈内送達によって投与することができ、この静脈内送達は、例えば、中心ライン、正中線、または末梢ＩＶを介する投与によって行われる。
ほとんどのウイルス感染は、細胞傷害性Ｔ細胞に特に重点が置かれてＴ細胞によって根絶される。ウイルス感染に対する治療の大半は、ウイルス複製を遅延させ、及び／または症状を十分に緩和して時間を稼いで内因性免疫を獲得できるようにし、ウイルスを根絶する対策に依存している。対照的に、ウイルス特異的ＣＴＬは、ウイルス、移植後特徴、免疫抑制治療の持続性、及び他の臨床的可変要因によって異なる特定の応答パーセントで有効である。本明細書に開示のＣＴＬパネルは、最も一般的なＨＬＡアレルのいくつかを包含しており、これによって集団のほとんどに治療機会が与えられる。
いくつかの実施形態では、ウイルスペプチド特異的ＣＴＬの投与前に、患者は完全なＨＬＡタイピングを受け、その後に適切なＣＴＬで治療されることになる。
一実施形態では、ウイルスペプチド特異的ＣＴＬの投与前に、患者は、高解像度ＰＣＲ配列特異的プライマー（ＳＳＰ）を補足使用する迅速な低解像度ＨＬＡタイピングのための血液検査を受けることで、潜在的に治療に適したＨＬＡ抗原（ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ７、ＨＬＡ－Ｂ４０、ＨＬＡ－Ｃｗ７）を患者が有するかどうかが決定されることになる。高解像度の補足使用によって患者がＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２適合性であり、それ故に、１つ以上のアレルについてＣＴＬとマッチすることが確かめられることになる。ＣＴＬとＨＬＡアレル（複数可）とのマッチングには、正しいウイルス抗原性ペプチド（複数可）（表１～５及び１４を参照のこと）のマッチ／選択を行い、注入細胞が、その導入先の患者の感染細胞上に存在する可能性のあるウイルス標的を確実に認識するようにすることが必要である。
ウイルスペプチド特異的ＣＴＬの投与前に、前投薬が行われ得る。いくつかの実施形態では、患者に前投薬（ジフェンヒドラミン及びアセトアミノフェンなど）が行われ得る。ジフェンヒドラミン用量は約１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、または３０ｍｇであり得る。アセトアミノフェン用量は約５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、または７５０ｍｇであり得る。
患者は、ウイルスペプチド特異的ＣＴＬの投与前、投与と同時、または投与後に、抗ウイルス薬（例えば、レムデシビル）または他の標準治療医薬製剤でも治療され得る。
ウイルスペプチド特異的ＣＴＬの有効用量は体重に基づくものであり、１×１０５個総細胞／ｋｇ～３×１０６個総細胞／ｋｇであり得る。１×１０５個総細胞／ｋｇ、２×１０５個総細胞／ｋｇ、３×１０５個総細胞／ｋｇ、４×１０５個総細胞／ｋｇ、５×１０５個総細胞／ｋｇ、６×１０５個総細胞／ｋｇ、７×１０５個総細胞／ｋｇ、８×１０５個総細胞／ｋｇ、９×１０５個総細胞／ｋｇ、１×１０６個総細胞／ｋｇ、２×１０６個総細胞／ｋｇ、３×１０６個総細胞／ｋｇ、４×１０６個総細胞／ｋｇ、５×１０６個総細胞／ｋｇ、６×１０６個総細胞／ｋｇ、７×１０６個総細胞／ｋｇ、８×１０６個総細胞／ｋｇ、または９×１０６個総細胞／ｋｇの用量が投与され得る。いくつかの実施形態では、用量は、総量の代わりにウイルス反応性細胞の数によって測定されることになる。例えば、有効用量は、１×１０５個ウイルス反応性細胞／ｋｇ～３×１０６個ウイルス反応性細胞／ｋｇであり得る。１×１０５個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、２×１０５個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、３×１０５個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、４×１０５個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、５×１０５個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、６×１０５個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、７×１０５個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、８×１０５個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、９×１０５個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、１×１０６個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、２×１０６個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、３×１０６個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、４×１０６個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、５×１０６個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、６×１０６個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、７×１０６個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、８×１０６個ウイルス反応性細胞／ｋｇ、または９×１０６個ウイルス反応性細胞／ｋｇの用量が投与され得る。いくつかの実施形態では、有効用量は、実際の体重に基づくことになる。ある特定の実施形態では、実際の体重が理想体重よりも重い場合、用量は補正体重（理想体重＋実際の体重と理想体重との差異の４０％）に基づくことになる。身長ごとの理想体重は、ＢＪ Ｄｅｖｉｎｅ（１９７４）の式から計算される：男性：５０．０ｋｇ＋５フィートを超える各インチにつき２．３ｋｇ、女性４５．５ｋｇ＋５フィートを超える各インチにつき２．３ｋｇ。
ウイルスペプチド特異的ＣＴＬを含む医薬組成物の「有効量」は、それを必要とする個体（ウイルス感染を有する個体、ウイルス様疾病を有する個体、ウイルス様症状を有する個体、またはウイルスによる感染を受けるリスクがある個体など）に投与される。有効量は、所望の治療効果または予防効果の達成に十分な量であり、こうした量は、ウイルス、ウイルス様疾病、もしくはウイルス様症状の低減に十分な量、疾病の持続期間の低減に十分な量、個体におけるウイルス力価の低減に十分な量、感染個体がウイルス様症状を発症し、及び／またはいずれかの手段によって酸素が必要な日数の低減に十分な量、ウイルス関連サイトカイン放出症候群を発症する患者の数の低減に十分な量、及び／またはウイルス感染の発生率もしくは速度の低減に十分な量などである。通常の技能を有する臨床医なら、適切な用量及び任意選択の抗ウイルス剤を決定することができ、この決定は、例えば、個体の年齢、感受性、耐性、及び健康全般に基づいてなされる。ウイルスペプチド特異的ＣＴＬは、示されるように単一用量または複数用量で投与され得る。
ＣＴＬの静脈内送達（例えば、末梢ライン、中心ライン、または正中線を介する注入）にかける時間は１０分未満にすべきである。いくつかの実施形態では、ＣＴＬの注入時間は、約１０分、約９分、約８分、約７分、約６分、約５分、約４分、約３分、約２分、または約１分である。
一実施形態では、方法は、ウイルスを有することが疑われる個体、ウイルスが確認された個体、またはウイルスのリスク（例えば、コロナウイルス、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、メタニューモウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＢＫＶ、ＪＣＶ、ＨＨＶ、アデノウイルス、及び同様のものによる感染を受けるリスク）を有する個体に対して有効量の医薬組成物を投与することを含む。方法は、ウイルス様疾病を有する個体に対して有効量の医薬組成物を投与することも含む。
医薬組成物は、患者の血液への投与が意図されるものであり得、任意の適切な形態（静脈内用のものなど）で投与され得る。
いくつかの態様では、治療方法は、ウイルスを有することが疑われる個体またはウイルスを有するリスクを有する個体に対して本発明の医薬組成物を有効量で投与することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、個体は、ウイルス（例えば、コロナウイルス、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、メタニューモウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＢＫＶ、ＪＣＶ、ＨＨＶ、アデノウイルス、及び同様のもの）を有することが疑われ、ウイルスの症状を１つ以上有し得る。ウイルスの症状はよく知られており、そうした症状には、特定のウイルスに応じて、例えば、発熱、咳、及び息切れ、下痢、膀胱炎／血尿、肝炎が含まれ得る。いくつかのウイルス感染の追加の症状には、呼吸困難、胸部の持続的な痛みまたは圧迫感、錯乱、昏睡、唇または顔の青みが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、方法は、ウイルス感染を治療するためのものであり、それを必要とする個体に対して本発明の医薬組成物を有効量で投与することを含む。他の実施形態では、方法は、ウイルス感染を予防するためのものであり、ウイルス（例えば、コロナウイルス、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、メタニューモウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＢＫＶ、ＪＣＶ、ＨＨＶ、アデノウイルス）による感染のリスクを有する個体に対して本発明の医薬組成物を有効量で投与することを含む。他の実施形態では、方法は、ウイルス感染の拡大を低減するためのものであり、ウイルス（例えば、コロナウイルス、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、メタニューモウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＢＫＶ、ＪＣＶ、ＨＨＶ、アデノウイルス）による感染を受けた個体またはウイルス（例えば、コロナウイルス、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、メタニューモウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＢＫＶ、ＪＣＶ、ＨＨＶ、アデノウイルス）による感染を受けるリスクを有する個体に対して本発明の医薬組成物を有効量で投与することを含む。
所望の治療効果を与える用量の間の適切な間隔は、状態（例えば、感染）の重症度、患者の健康全般、及び医薬組成物に対する患者の耐性、ならびに他の考慮事項に基づいて決定され得る。こうした考慮事項及び他の考慮事項に基づいて、臨床医なら用量の間の適切な間隔を決定することができる。一般に、医薬組成物は一度に投与されるが、必要に応じて１～４日ごとまたは１週間に１回投与され得る。
個体がウイルスを有することが疑われる場合、個体がウイルスを有することが確認された場合、個体がウイルス感染のリスクを有する場合（例えば、６０歳越の個体、重度の慢性病状（心疾患、糖尿病、肺疾患など）を有する個体、免疫不全個体、最近がん治療を受けた患者）、または個体が、ウイルス様疾病に加えて肺疾患（喘息（例えば、アレルギー性／アトピー性、小児性、遅発性、咳型、または慢性閉塞性のもの）、気道過敏、アレルギー性鼻炎（季節性または非季節性のもの）、気管支拡張症、慢性気管支炎、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、若年期喘鳴、及び同様のものなど）も有する場合、本発明の治療方法及び使用は特定の利益をもたらす。こうした患者集団は、ウイルス及び他の呼吸器感染に対して特に感受性であり、こうした感染は、基礎肺疾患の急性増悪の原因になることが多い。したがって、本明細書に記載の方法及び治療的使用は、基礎肺疾患の急性増悪の発生、持続期間、及び／または重症度を低減することによってこうした患者集団に追加の利益をもたらし得る。
投与後、ウイルス診断、ＣＴＬ存続性、内在性ＣＴＬの形成、及びウイルスに対する抗体応答について患者血液、尿、もしくは糞便試料、及び／または鼻腔もしくは鼻咽頭スワブ検体を検査することによって治療の成功が決定されることになる。治療に対する応答は、例えば、注入から４日後、７日後、１４日後、２８日後、２ヶ月後、３ヶ月後、及び６ヶ月後に検査され得る。
ウイルスペプチド特異的ＣＴＬの調製方法
本明細書で提供される治療方法において使用されるウイルスペプチド特異的ＣＴＬは、任意の適切な方法を使用して調製することができ、例えば、標準的な白血球アフェレーシス手法を使用して同種異系単核白血球をドナーから収集し、その後にウイルスペプチドで感作させることができる。目的のＨＬＡ拘束要素に結合することが知られている限定数のペプチドにリンパ球を曝露することができる。例えば、リンパ球は、目的のＨＬＡ拘束要素に結合することが知られる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、２～５、２～１０、２～１５、２～２０、５～１０、５～１５、５～２０、１０～２０、または１５～２０個のペプチドで刺激され得る。ウイルス特異的ＣＴＬは、末梢血リンパ球に由来し得る。
例えば、目的のＨＬＡ拘束要素は、ヒトのすべての有核細胞に発現する３つの古典的ＨＬＡ－Ｉ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ）から選択され得る。ＨＬＡ－Ｉ分子は、細胞内タンパク質由来のペプチドを提示する。細胞内抗原提示経路は、プロテアソームによるサイトゾル中のウイルスタンパク質の切断、小胞体（ＥＲ）内腔への転位、ＥＲ内在性アミノペプチダーゼによるトリミング、ＨＬＡ上へのロード、及び細胞表面での提示を含み得る。ＨＬＡ－ＩＩ遺伝子（ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、及びＨＬＡ－ＤＱ）は、抗原提示に特化した細胞サブセット（樹状細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージなど）のみに構成的に発現するが、追加の細胞型においても、例えばサイトカイン刺激に反応して、発現が誘導され得る。ＨＬＡ－ＩＩ分子は、エンドサイトーシス及び食作用を介して細胞内に取り込まれた細胞外タンパク質に由来するペプチドと、オートファジーを介するＨＬＡ－ＩＩプロセシング経路にアクセスする細胞内タンパク質に由来するペプチドと、を提示する。
ＨＬＡ－Ｉ分子は、典型的には、８～１２個のアミノ酸（ａａ）の長さのペプチドに結合する。ＨＬＡ－Ｉのペプチド結合クレフトはＮ末端及びＣ末端の両末端において閉じており、約９マーのペプチドに結合するように長さの至適選択性が偏っていることが多い。ほとんどのＨＬＡ－Ｉアレルで、長さの選択性はアレル間で異なる。所与のＨＬＡアレルに対する高親和性リガンドは、通常、比較的厳密な選択性を有する共通のアミノ酸モチーフをアンカー位置（ＨＬＡ－Ｉについては通常は２番目（Ｐ２）及び最後（ＰΩ）、ＨＬＡ－ＩＩについてはＰ１、Ｐ４、Ｐ６、及びＰ９）に共有しており、こうしたアンカー位置において、対応するＨＬＡ結合ポケットの残基との特異的相互作用が形成される。ＨＬＡ遺伝子座は、ヒトゲノムにおいて最も多型であり、これまでに報告されたアレルは数万に上る。ペプチド接触残基が異なるＨＬＡバリアントは、そうしたＨＬＡバリアントが提示するペプチドのレパートリーが異なる。集団におけるＨＬＡアレルの多様性は、多様な病原体（例えば、すぐに変異するウイルス、新たに出現したウイルス、及び同様のもの）に対する重要な進化的防御機構である。ＨＬＡアレルは、ウイルス感染の重症度及び予後と関連し得る。例えば、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２アレルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１からの保護と関連しており、ＨＬＡ－Ｂ５７は、ＨＩＶ－１制御が効率的であること、及び抗レトロウイルス治療を行わなくても感染が長期的に非進行性であることと高度に関連している。
この方法において使用される特異的ペプチドはウイルスごとに異なり、新たなペプチドが発見され、現存のペプチドが誘発するＣＴＬ成果が不十分であることが実験的に実証されるに伴って、時間と共に変わることになる。本出願において提供されるペプチドのリストは網羅的なものではなく、動的リストとして進化し続けるものであり、非限定的な例示リストとして提供されるものである。
本明細書に記載の、ウイルスペプチド特異的ＣＴＬの生成方法、ウイルスペプチド特異的ＣＴＬを使用するウイルス感染の治療方法及び予防方法、ならびにウイルスペプチド特異的ＣＴＬの医薬組成物において使用されるペプチドは、任意のウイルスを起源とし得る。例えば、Ｔ細胞エピトープは、免疫エピトープデータベース及び解析リソース（Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）（ＩＥＤＢ）において幅広い範囲のウイルスについて同定、収集、及び報告されている。
一態様では、リンパ球は、３回のインビトロでの刺激－増殖サイクルに供されることで、本明細書に記載の治療方法において使用される最終ＣＴＬ産物となる。これら３回の刺激－増殖サイクルはそれぞれ、生成プロセス全体の中で異なる目的を有しており、それ故に、それぞれが、異なる手順に従うものである。任意選択で、第４の再刺激が実施され得る。第４の再刺激は、（１）出荷基準をわずかに満たしておらず、一連の刺激及び増殖を追加実施することでこうした基準を満たすことが見込まれる産物に対して実施されるか、または（２）追加の細胞増殖が望まれ、一連の刺激及び増殖を追加実施することで、そのバッチから得ることが可能な治療用量の数が大幅に増加する可能性があると考えられる場合に実施され得る。そのような任意選択の第４の再刺激はいずれも、第３の刺激と同一のプロセスに従って実施され得る。
一実施形態では、健康なボランティアドナーに由来する単核細胞が、エルトリエーションによってリンパ球画分及び単球画分へと分離される。リンパ球は、ウイルスゲノムの既知配列に由来し、特定のＨＬＡアレルに結合することが予測／実証されているペプチドで刺激される。ウイルス由来の産物は利用されない。第１の刺激では、収集された単球のサブセットが、樹状細胞へのその成熟が誘導されるように処理される。その後、１つ以上のウイルス特異的ペプチドで樹状細胞がパルスされ、リンパ球と共に７日間共培養される。第２の刺激及び第３の刺激では、単球を利用してペプチドを提示させ、刺激リンパ球を７～１２日間再び成長／増殖させる。第２の刺激は、ペプチド特異的ＣＴＬの選択（パルスペプチドを認識するＴ細胞が接着単球層に選択的に接着することによるもの）及びドナー由来の他の非特異的「バイスタンダー」リンパ球または他の免疫細胞の含量の低減に役立つ濃縮ステップも含み得る。第３の刺激では単球及びペプチドが再び使用されるが、この選択ステップが繰り返されることはない。
本明細書に記載の手順のほとんどが、熱非働化ＡＢ血清を１０％含むＲＰＭＩ－１６４０培地において実施される。培地中のＡＢ血清の量は、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％にまで低減され得る。無血清培地及び自己血漿が代替として使用され得る。これは「完全培地」またはＣＭと称される。当業者によって決定される任意の適切な培地を使用することができ、こうした培地は、ＡＩＭ Ｖ培地または他の無血清培地調製物（単独のもの、プールされた血清または自己血清または血漿の１０％含有物または低濃度含有物）、血清代替物を含むＲＰＭＩ－１６４０（プールされた血清または自己血清または血漿の含有物または低濃度含有物）などである。
特定の実施形態では、第１の刺激（初回インビトロ感作と称される）において、所与のＨＬＡアレル向けのペプチドを、個々のペプチドとしてではなく、プールとして用いてリンパ球の刺激が行われる。後述の実施例１～２０には、５つのＨＬＡアレル向けのペプチドの初回リスト例が示される（表１～５を参照のこと）。このリストは、コロナウイルスに適したペプチドを含んでおり、新たな情報が継続的に利用可能になるに伴って拡大されることが予想され、本明細書に記載の方法において使用するための追加のペプチドを当業者なら同定できるであろう。初回リストからいくつかのペプチドを除去することも可能である。
実施例１３～１４、表９では、ＨＬＡ－Ａ２アレル向けのペプチドの別のリスト例が示される。表９は、インフルエンザに適したペプチドのリストである。このリストは、新たな情報が継続的に利用可能になるに伴って拡大されることが予想される。本明細書に記載の方法において使用するための追加のペプチドを当業者なら同定できるであろう。表９に示されるペプチドのいくつかが有効でないことが判明し得ることもあり得る。
初回インビトロ感作については、樹状細胞が抗原提示細胞として使用される。こうした細胞は、エルトリエーションに供された単球から調製される。新鮮な単球または新鮮に解凍された単球は、プラスチックに接着させることによって濃縮され得る。適切な数の単球が培地中に再浮遊された後、細胞が組織培養プレートに移される。最初に使用されるすべての単球のうちの約半分が、方法に使用可能な抗原提示樹状細胞（ＤＣ）へと成熟するものと予想される。その後、細胞を適切な時間（例えば、少なくとも６０分、少なくとも９０分、少なくとも１２０分）インキュベートすることで、単球が培養プレートに接着するようになる。インキュベート後、培養プレートから上清が吸引される。その後、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）及びＩＬ－４が添加された培地を用いて接着細胞を適切な時間（例えば、２４時間）培養し得、その時点で成熟サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６、及び／またはプロスタグランジンＥ２）が添加され得る。このプロセスを使用することで、単球が強制的に抗原提示ＤＣに分化するようにされる。２４時間のインキュベート後、樹状細胞を剥がすことができ、吸引及び遠心分離による収集の準備が整う。成熟サイトカイン中での培養時間は、必要に応じて、２４時間を超えて約３０時間、約３６時間、約４２時間、または約４８時間に至るまで伸ばすことができる。
樹状細胞には、その収集後に、適切な長さの時間（例えば、約６０分間、７５分間、９０分間、または１２０分間）ペプチド（例えば、各濃度が２マイクログラム／ｍＬ［μｇ／ｍＬ］のもの）がパルスされる。その後、こうした樹状細胞はウイルスペプチドを提示し、その後に組織培養フラスコ（例えば、７５ｃｍ２）において培地（例えば、ＣＭ）中でリンパ球と共に共培養されることになる。培養におけるリンパ球と樹状細胞との比は１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、または２５：１であり得る。その後、リンパ球（例えば、８０×１０６個総細胞、１００×１０６個総細胞、または１２０×１０６個総細胞）が各フラスコに添加される。これはＣＴＬ培養プロセスの０日目と見なされる。この７日間の刺激の間、培養を妨げないことで、細胞間相互作用が形成されるようになる。
約７日後、第２の刺激濃縮及びその後のウイルス特異的ＣＴＬの増殖が行われる。初回の感作から７日後、ペプチド特異的ＣＴＬの選択、及びドナー由来の他の非特異的「バイスタンダー」リンパ球または他の免疫細胞の含量の低減に役立つ濃縮ステップの一部としてＣＴＬが再刺激される。濃縮は、初回の感作に使用された特異的ウイルスペプチドがパルスされている単球層にペプチド特異的ＣＴＬが選択的に接着することに基づいている。適切なＨＬＡアレルによって提示されるペプチドのいずれかを認識するＣＴＬが、免疫シナプスの創出を介してペプチドパルス単球層に選択的に接着することとは対照的に、「バイスタンダー」リンパ球は、そのような相互作用が生じないことから、穏やかに洗い流され得る。「バイスタンダー」リンパ球によっては非特異的に接着することがあり得るが、これによって、典型的には、出発材料に対してペプチド特異的ＣＴＬを約１０倍以上に濃縮することが可能である。この濃縮ステップを実施するために、単球（例えば、１０×１０６個細胞／ｍＬ）が組織培養プレートに添加される。ペプチド（例えば、それぞれの最終濃度が２μｇ／ｍＬとなるもの）が添加され、単球と共に（例えば、約９０分間）インキュベートされる。その後、リンパ球（例えば、６０×１０６個細胞／ｍＬ、７０×１０６個細胞／ｍＬ、８０×１０６個細胞／ｍＬ、９０×１０６個細胞／ｍＬ、１００×１０６個細胞／ｍＬ、１１０×１０６個細胞／ｍＬ、または１２０×１０６個細胞／ｍＬ、典型的には、７５ｃｍ２組織培養フラスコの１つの含量）がウェルに添加される。適切な長さの時間（例えば、約５分、７．５分、１０分、または１２分）が経過した後にＰＢＳで穏やかに洗浄することによって「バイスタンダー」リンパ球がウェルから除去される。接着リンパ球をペプチドパルス単球と一晩接触したままにすることで活性化／再刺激プロセスが完了する。
翌日、リンパ球が単球層から除去される。前の段階から得られた接着リンパ球が取り出され、組換えヒトＩＬ－２が（例えば、濃度が５０Ｕ／ｍｌとなるように）添加された培地を入れた組織培養フラスコに移される。ＩＬ－２が経時的に添加されることで（例えば、４８時間ごとに５０Ｕ／ｍＬ）、刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞の最適な増殖が促進される。代謝老廃物が蓄積することによってフラスコの酸性度が高まる変化（培養物の色がフェノールレッドから変化してオレンジ色／黄色が強まること）が見られた場合は培地が交換される。グルコースレベルが６０ｍｇ／ｄｌを下回った場合、または乳酸濃度が上昇して１１．５ｍｍｏｌ／Ｌを上回った場合もまた、培地が交換され得る。その後、第２の刺激から合わせて７日間細胞が培養される。この第２の刺激の一部としての単球層上での濃縮は非常に重要であり、これまでのＣＴＬ培養方法を上回る真の有益性をもたらすものである。単球層上での濃縮は、総Ｔ細胞の中で純度レベルを顕著に高めることを担うものであると考えられ、この純度レベルの高まりは、本発明以前は達成されていない。この精製ステップに伴って、ＣＤ４＋リンパ球及び他の非特異的バイスタンダーリンパ球と比較してウイルスペプチド特異的ＣＤ８＋ＣＴＬが選択されることが増え、その結果、純度が９０％超の均一試料を含む最終産物が得られる。
その後、第３の刺激が実施されることで、ウイルスペプチド特異的ＣＴＬがさらに増やされる。第２の刺激の一部として実施される濃縮ステップは、典型的には、第３の刺激の一部として繰り返されることはない。しかしながら、計画された第３の刺激の当日中にウイルス反応性リンパ球のパーセント（細胞内サイトカインアッセイまたはテトラマーアッセイによって測定される）の評価がある特定の限界値（例えば、約１２～１８％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、または１８％）を下回った場合、第３の刺激のための通常の手順の代わりに第２の刺激のための手順が繰り返され得る。ＣＴＬ生成プロセス全体の中で、濃縮ステップがほとんどの操作を含んでおり、汚染の混入に最も脆弱な点であることから、これが実現可能な限りにおいてはこのステップを複数回繰り返すことは避けることが望ましい。濃縮ステップを繰り返さなかったとしても、第３の刺激の後にはウイルスペプチド特異的ＣＴＬのパーセントはさらに濃縮されることが見込まれる。これは、刺激細胞はＩＬ－２含有培地中で増殖することになる一方で、非刺激「バイスタンダー」細胞が増殖することはないという事実を考慮したものである。非刺激「バイスタンダー」細胞は培養中に時間と共に死滅し、これによってウイルス特異的ＣＴＬ産物の濃縮度が高まることになる。第２の刺激に由来する濃縮ステップを繰り返し得る場合についての上記の閾値を設定することによって、当該濃縮ステップが繰り返されることは稀になり、製造プロセスに必要不可欠な場合にのみ繰り返されるようになることが見込まれる。
組織培養フラスコ中での約７日間の濃縮培養後（例えば、ＣＴＬ刺激／培養全体の２２日目、２３日目、または２４日目）、細胞の数が数えられ、細胞の生存率が試験され、単球及びペプチドを用いて細胞培養フラスコ（Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）またはＴ７５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）のブランド名で商業的に利用可能な細胞培養フラスコなど）中で細胞が再刺激される。リンパ球：単球比は、４：１～５：１、４：１、４．１：１、４．２：１、４．３：１、４．４：１、４．５：１、４．６：１、４．７：１、４．８：１、４．９：１、または５：１であり得る。２μｇ／ｍＬの濃度で各ペプチドが再び添加される。リンパ球（１．５×１０７個細胞）は、この第２の再刺激のための各細胞培養フラスコに添加される。感作は、ＩＬ－２（例えば、５０Ｕ／ｍＬ）が添加された培地（例えば、４０ｍＬの完全培地）中で実施される。
第３の刺激後、ＣＴＬは再び培養される（例えば、７日間）。培地及びＩＬ－２の交換は、培地の色変化がいつ認められるかに応じて３～４日ごとに実施され得る。
０日目から数えて丸３週間半の期間の刺激及び増殖が終了した後、必要な基準をＣＴＬが満たすかどうかに関してＣＴＬの評価が行われることになり、満たす場合には、（例えば、その後２４時間以内に）凍結保存用として収集される。任意選択で、状況次第では、第３の刺激の指針後に第４の刺激が実施され得る。これは、典型的には、生成されているＣＴＬの用量の数を増やすには細胞をさらに増殖させることが望ましいと見なされる場合、または産物が出荷基準をわずかに満たさず、一連の刺激／増殖を追加実施することで、産物がすべての基準を満たすことが可能になると考えられる場合に実施されることになる。再刺激ステップは、６～１０日間隔（例えば、６日間隔、７日間隔、８日間隔、９日間隔、１０日間隔）で実施され得るが、こうしたステップは、必要に応じて、この典型的な７日間隔よりも１日縮めてまたは１日延ばして行われ得る。
３回のインビトロでの刺激－増殖サイクルの完了後、細胞含量、機能、生存率、及び無菌性が適切であるかどうかについて産物のスクリーニングが行われる。テトラマー分析（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を利用するもの）を使用して細胞含量をスクリーニングすることで、試料中のＣＤ８＋及び／またはＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＴＬの濃度ならびに試料の全体的な不均一性が決定され得る。
適切な細胞含量は、細胞内サイトカイン（ＩＣＣ）染色またはテトラマー結合に基づいて細胞の少なくとも２０％（例えば、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％）がウイルスペプチドに反応すること、ならびに産物中のナイーブＴ細胞、単球、及びＮＫ細胞の含量が２．５％未満（例えば、約２．４％、約２．３％、約２．２．％、約２．１％、約２．０％、約１．９％、約１．８％、約１．７％、約１．６％、約１．５％、約１．４％、約１．３％、約１．２％、約１．１％、約１．０％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、または約０．１％）であることを意味する。好ましくは、細胞の少なくとも７０％が、テトラマー結合に基づいてウイルスペプチドに反応することになる。
本明細書に記載の、ウイルス特異的ＣＴＬの生成方法、ウイルス特異的ＣＴＬを使用するウイルス感染の治療方法及び予防方法、ならびにウイルス特異的ＣＴＬの医薬組成物において使用するためのＣＴＬは、細胞含量に基づいて実質的にＣＤ８＋Ｔ細胞である。本明細書に記載のＣＴＬは、総細胞含量に基づいて少なくとも約６０％のＣＤ８＋Ｔ細胞、少なくとも約７０％のＣＤ８＋Ｔ細胞、少なくとも約８０％のＣＤ８＋Ｔ細胞、少なくとも約８５％のＣＤ８＋Ｔ細胞、少なくとも約９０％のＣＤ８＋Ｔ細胞、少なくとも約９５％のＣＤ８＋Ｔ細胞、または少なくとも約９９％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。ＣＴＬの始まりはＣＤ８＋濃縮細胞組成物であり得、この組成物では、その他のリンパ球型はすべて枯渇されている。ＣＤ８＋Ｔ細胞含量は、抗ＣＤ８抗体を用いるフローサイトメトリーを使用して決定され得る。
ＣＴＬを構成するＣＤ８＋Ｔ細胞集団のうち、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞含量に基づいて、少なくとも約６０％がペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、少なくとも約７０％がペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、少なくとも約８０％がペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、少なくとも約８５％がペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、少なくとも約９０％がペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、少なくとも約９５％がペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、少なくとも約９９％がペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。
本明細書に記載の、ウイルス特異的ＣＴＬの生成方法、ウイルス特異的ＣＴＬを使用するウイルス感染の治療方法及び予防方法、ならびにウイルス特異的ＣＴＬの医薬組成物において使用するためのＣＴＬは、細胞含量に基づいてＣＤ４＋Ｔ細胞が実質的に枯渇されている。本明細書に記載のＣＴＬは、総細胞含量に基づいて少なくとも約３０％以下のＣＤ４＋Ｔ細胞、少なくとも約２０％以下のＣＤ４＋Ｔ細胞、少なくとも約１５％以下のＣＤ４＋Ｔ細胞、少なくとも約１０％以下のＣＤ４＋Ｔ細胞、少なくとも約５％以下のＣＤ４＋Ｔ細胞、少なくとも約２．５％以下のＣＤ４＋Ｔ細胞、少なくとも約２．０％以下のＣＤ４＋Ｔ細胞、少なくとも約１．５％以下のＣＤ４＋Ｔ細胞、少なくとも約１．０％以下のＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。
本明細書に記載の、ウイルス特異的ＣＴＬの生成方法、ウイルス特異的ＣＴＬを使用するウイルス感染の治療方法及び予防方法、ならびにウイルス特異的ＣＴＬの医薬組成物において使用するためのＣＴＬは、ナイーブＴ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞（ＤＣ）、及び／またはＢ細胞が実質的に枯渇されている。本明細書に記載の治療方法において使用するためのＣＴＬが有するナイーブＴ細胞、ＮＫ細胞、単球、ＤＣ、及び／またはＢ細胞の総細胞含量は、個別または総体のいずれかとして、総細胞含量の少なくとも約２．５％以下（例えば、約２．４％、約２．３％、約２．２．％、約２．１％、約２．０％、約１．９％、約１．８％、約１．７％、約１．６％、約１．５％、約１．４％、約１．３％、約１．２％、約１．１％、約１．０％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、または約０．１％）である。こうした細胞集団は、数ある細胞療法合併症の中でもとりわけ、移植片対宿主病の誘発（例えば、ナイーブＴ細胞）、ＨＬＡ同種免疫、白血球性病原体の移入、または免疫疲弊の誘発に関する懸念があるものと考えられていた。
機能は、エフェクター：標的比を４０：１とした場合にＣＴＬがペプチドパルス標的に対して少なくとも約４０％の細胞溶解活性を示すことに基づく。いくつかの実施形態では、機能は、エフェクターと標的との比を３０：１、１０：１、及び最大で３：１とした場合にＣＴＬがペプチドパルス標的に対して約８０％の細胞溶解活性を示すことに基づく。
生存率は７０％を超えるべきであり、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の生存率が適切であり得る。ウイルス特異的ＣＴＬは凍結保存することが可能であり得る。
手法は、実験、治療、または臨床試験に十分な細胞が得られるように規模が調整され得る。例えば、本発明者らが計画した第Ｉ～ＩＩ相試験では、試験を支持するために約３．５×１０９個のＣＴＬ（総細胞数）を要した。本明細書に記載の方法では、ドナーから単離された２．９×１０９個のリンパ球で始まり、９．２×１０９個のリンパ球が得られ、そのうちの少なくとも７６％は、テトラマー分析からＣＤ８＋として検出可能なものであり、これは臨床試験に十分な材料であった。
無菌性は、所定の細菌培養及び真菌培養、ならびにマイコプラズマ及びエンドトキシンのアッセイを通じて評価され得る。ＣＴＬは、任意の所望の濃度（例えば、約２×１０６個生存細胞／ｍＬの濃度）でｃｒｙｏｂａｇ中に凍結保存され、本明細書に開示の方法において後に使用するために保存され得る。
ウイルスペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含む医薬組成物
一態様では、本発明は、ウイルスペプチド特異的ＣＴＬを含む静脈内送達のための医薬組成物に関する。医薬組成物は、それを必要とする個体に静脈内送達するためのものであり、この静脈内送達は、例えば、末梢ＩＶ、中心ライン、または正中線カテーテルを介する注入によるものである。医薬組成物は、典型的には、凍結保存されたＣＴＬの送達に適した１つ以上の担体または医薬品添加物（ＤＭＳＯなど）、及び同様のものも含み得る。
一実施形態では、医薬組成物は、特定のＨＬＡ－Ａ２アレルに結合するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、またはそれらの組み合わせ）に対して感作されているウイルス特異的ＣＴＬを含む。
一実施形態では、医薬組成物は、特定のＨＬＡ－Ａ１アレルに結合するＣＯＶＩＤ－１９ペプチド（例えば、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、またはそれらの組み合わせ）に対して感作されているウイルス特異的ＣＴＬを含む。
一実施形態では、医薬組成物は、特定のＨＬＡ－Ｂ７アレルに結合するＣＯＶＩＤ－１９ペプチド（例えば、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、またはそれらの組み合わせ）に対して感作されているウイルス特異的ＣＴＬを含む。
一実施形態では、医薬組成物は、特定のＨＬＡ－Ｂ４０アレルに結合するＣＯＶＩＤ－１９ペプチド（例えば、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、またはそれらの組み合わせ）に対して感作されているウイルス特異的ＣＴＬを含む。
一実施形態では、医薬組成物は、特定のＨＬＡ－Ｃｗ７アレルに結合するＣＯＶＩＤ－１９ペプチド（例えば、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、またはそれらの組み合わせ）に対して感作されているウイルス特異的ＣＴＬを含む。
一実施形態では、医薬組成物は、特定のＨＬＡ－Ｃｗ７アレルに結合するＣＯＶＩＤ－１９ペプチド（例えば、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、またはそれらの組み合わせ）に対して感作されているウイルス特異的ＣＴＬを含む。
別の実施形態では、医薬組成物は、特定のＨＬＡ－Ａ２アレルに結合するインフルエンザウイルスペプチド（例えば、配列番号７８～８７またはそれらの組み合わせ）に対して感作されているウイルス特異的ＣＴＬを含む。
別の実施形態では、医薬組成物は、ＨＬＡ－Ａ１アレル、ＨＬＡ－Ａ２アレル、ＨＬＡ－Ｂ７アレル、ＨＬＡ－Ｂ４０アレル、ＨＬＡ－Ｃｗ７アレルのうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせに結合する１つ以上のウイルスペプチドに対して感作されているウイルス特異的ＣＴＬを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、アレルの組み合わせに結合するウイルスペプチドの組み合わせに対して感作されているウイルス特異的ＣＴＬ（例えば、半分用量のＡ２ ＣＴＬと半分用量のＢ７ ＣＴＬとを組み合わせたもの）を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＤＭＳＯ中、ＲＰＭＩ－１６４０中、アルブミン中、またはそれらの組み合わせ中で凍結保存されたＣＴＬを含む。
望まれる場合、本明細書に記載の医薬組成物は、１つ以上の追加の抗ウイルス剤（レムデシビルなど）も含み得る。静脈内注射に適した抗ウイルス剤には、アシクロビル、ペラミビル、ザナミビル、オセルタミビル、ガンシクロビル、ホスカルネット、及び同様のものが含まれ得るか、静脈内注射に適した抗ウイルス剤は、患者が使用するためのＣＴＬの医薬組成物中にも含められ得るか、または静脈内注射に適した抗ウイルス剤は、併用治療として提供され得る。
医薬組成物は、静脈内投与に適した任意の形態のものであり得る。
実施例１：治療前期間／スクリーニング
ウイルス感染の診断書を有する患者に対して、高解像度ＰＣＲ ＳＳＰを補足使用する迅速な低解像度ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイピングのための血液検査を実施し、潜在的に試験に適したＨＬＡ抗原（ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ７、ＨＬＡ－Ｂ４０、ＨＬＡ－Ｃｗ７）を患者が有するかどうかを調べる。高解像度の補足使用によって、患者がＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２であり、それ故に、１つ以上のアレルについてＣＴＬとマッチすることを確かめる。
ウイルス感染の診断書を有する患者に対して、高解像度ＰＣＲ ＳＳＰを補足使用する迅速な低解像度ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイピングのための血液検査を実施し、潜在的に試験に適したＨＬＡ抗原（ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ７、ＨＬＡ－Ｂ４０、ＨＬＡ－Ｃｗ７）を患者が有するかどうかを調べる。高解像度の補足使用によって、患者がＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２であり、それ故に、１つ以上のアレルについてＣＴＬとマッチすることを確かめる。
年齢及び併発状態（複数可）に基づいて試験の適格基準を患者が満たし、凍結保存ＣＴＬ産物と共通する少なくとも１つのＨＬＡアレルを患者が有する場合、そうした患者にウイルス特異的ＣＴＬを投与する。高解像度タイピングによる確認用の血液を収集及び分析する。ウイルス感染の重症度から、中央検査室での高解像度確認ＨＬＡタイピングの結果を待ちながらＣＴＬ治療を保留することしない。凍結保存ＣＴＬと共通するＨＬＡアレルを有さない患者は同時ウイルス比較群とする。
実施例２：ペプチドの調製
特定のＨＬＡアレルに結合するＣＯＶＩＤ－１９ペプチドを文献から選別し、ペプチド表に加える。この表にペプチドを順次加えていき、その結合相手のＨＬＡアレルを反映するラボ表記をペプチドに付与し、この表記には、ダッシュの後に拡張２桁を付け加える。例えば、Ａ＊０２：０１－０３は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に結合する表中の第３のペプチドを指す。臨床的に使用することになるＣＴＬの刺激に使用するペプチドは、ＣＳ Ｂｉｏまたはインビボグレードの材料を調製可能な同様のベンダーから購入する。
特定のＨＬＡアレルに結合するＣＯＶＩＤ－１９ペプチドを文献から選別し、ペプチド表に加える。この表にペプチドを順次加えていき、その結合相手のＨＬＡアレルを反映するラボ表記をペプチドに付与し、この表記には、ダッシュの後に拡張２桁を付け加える。例えば、Ａ＊０２：０１－０３は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に結合する表中の第３のペプチドを指す。臨床的に使用することになるＣＴＬの刺激に使用するペプチドは、ＣＳ Ｂｉｏまたはインビボグレードの材料を調製可能な同様のベンダーから購入する。
実施例３：単球からの樹状細胞の調製
特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成に役立つように樹状細胞を調製する。典型的には、１×１０７個の単球またはその倍数で始める。遠心分離後、上清をデカントし、ＤＮａｓｅと共に完全培地（熱非働化正常ＡＢ血清を１０％添加したＲＰＭＩ１６４０）中への再浮遊を行う。トリパンブルーによって細胞数及び生存率を調べ、記録する。６ウェルプレートに移した後、３７℃でインキュベートし、その後に洗浄する。ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４を添加した完全培地を添加する。ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４中で単球の培養を始める日を手順の＋１日目と称する。翌日（＋２日目）に４つの成熟サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１ベータ、ＴＮＦアルファ、ＰＧＥ２）を添加する。成熟サイトカインの最終濃度は変わるが、１つの実例では下記の通りである：
特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成に役立つように樹状細胞を調製する。典型的には、１×１０７個の単球またはその倍数で始める。遠心分離後、上清をデカントし、ＤＮａｓｅと共に完全培地（熱非働化正常ＡＢ血清を１０％添加したＲＰＭＩ１６４０）中への再浮遊を行う。トリパンブルーによって細胞数及び生存率を調べ、記録する。６ウェルプレートに移した後、３７℃でインキュベートし、その後に洗浄する。ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４を添加した完全培地を添加する。ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４中で単球の培養を始める日を手順の＋１日目と称する。翌日（＋２日目）に４つの成熟サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１ベータ、ＴＮＦアルファ、ＰＧＥ２）を添加する。成熟サイトカインの最終濃度は変わるが、１つの実例では下記の通りである：
６ウェルプレートを３７℃のインキュベーター内に戻す。＋３日目に樹状細胞をコニカルチューブに移し、遠心分離し、上清をデカントし、各ペプチドの濃度が２マイクログラム／ｍＬになるようにペプチドを添加した完全培地中への再浮遊を行った後、インキュベートを行う。この時点で、樹状細胞はリンパ球との共培養の準備が整った状態となる。単球は樹状細胞へと成熟するにつれてその形状及び脱離性に変化が生じる。出発単球数と比較して約半分の数の樹状細胞が回収される。
実施例４：樹状細胞とリンパ球との共培養
濃度が各２マイクログラム／ｍＬのペプチドを含むペプチド含有完全培地中に、実施例３で調製した樹状細胞を１×１０６個／ｍＬの細胞濃度で再浮遊させる。樹状細胞にペプチドをパルスしている間にリンパ球を調製する。１億個のリンパ球を解凍する。トリパンブルーを用いて細胞数及び生存率の試験を実施する。目標は、リンパ球：単球（ＤＣ）比を２０：１（１億個：５００万個）とすることである。リンパ球の生存率は９５％超であるべきである。遠心分離後、解凍したリンパ球を、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む完全培地中に再浮遊させ、培養フラスコに移した後、インキュベートする。樹状細胞をペプチドと共にインキュベートした後、インキュベーターから取り出し、再び遠心分離した後に、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む完全培地中に再浮遊させる。リンパ球を含むフラスコに樹状細胞浮遊液を添加する。この混合物をインキュベートした後、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む追加の完全培地を添加する。共培養から７日（６～８日の範囲）後、細胞は分析及び再刺激の準備が整った状態となる。
濃度が各２マイクログラム／ｍＬのペプチドを含むペプチド含有完全培地中に、実施例３で調製した樹状細胞を１×１０６個／ｍＬの細胞濃度で再浮遊させる。樹状細胞にペプチドをパルスしている間にリンパ球を調製する。１億個のリンパ球を解凍する。トリパンブルーを用いて細胞数及び生存率の試験を実施する。目標は、リンパ球：単球（ＤＣ）比を２０：１（１億個：５００万個）とすることである。リンパ球の生存率は９５％超であるべきである。遠心分離後、解凍したリンパ球を、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む完全培地中に再浮遊させ、培養フラスコに移した後、インキュベートする。樹状細胞をペプチドと共にインキュベートした後、インキュベーターから取り出し、再び遠心分離した後に、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む完全培地中に再浮遊させる。リンパ球を含むフラスコに樹状細胞浮遊液を添加する。この混合物をインキュベートした後、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む追加の完全培地を添加する。共培養から７日（６～８日の範囲）後、細胞は分析及び再刺激の準備が整った状態となる。
実施例５：単球単層上での刺激及び濃縮
この手順は、特定のペプチドに反応するＴ細胞を単球単層上で濃縮するためのものである。こうしたＴ細胞を濃縮し、活性化し、培養で増殖させることができる。１０×１０６個の単球で開始し、細胞数を検証し、生存率を評価する。生存率は９２％以上であるべきである。単球をＤＮａｓｅと共に完全培地中に再浮遊させる。インキュベートを行い、その後に培地を慎重に除去する。単球膜をＰＢＳですすぎ、その後にウェルからＰＢＳを除去する。ＰＢＳを除去後、ペプチドを含む完全培地（各ペプチドの濃度を２マイクログラム／ｍＬとする）を添加し、インキュベートを行う（このインキュベートの間にリンパ球を調製する）。インキュベート後、未結合ペプチドを除去する。ペプチドの除去は下記のように行う：記載の培地を除去した後、ＰＢＳでの洗浄を行う。
この手順は、特定のペプチドに反応するＴ細胞を単球単層上で濃縮するためのものである。こうしたＴ細胞を濃縮し、活性化し、培養で増殖させることができる。１０×１０６個の単球で開始し、細胞数を検証し、生存率を評価する。生存率は９２％以上であるべきである。単球をＤＮａｓｅと共に完全培地中に再浮遊させる。インキュベートを行い、その後に培地を慎重に除去する。単球膜をＰＢＳですすぎ、その後にウェルからＰＢＳを除去する。ＰＢＳを除去後、ペプチドを含む完全培地（各ペプチドの濃度を２マイクログラム／ｍＬとする）を添加し、インキュベートを行う（このインキュベートの間にリンパ球を調製する）。インキュベート後、未結合ペプチドを除去する。ペプチドの除去は下記のように行う：記載の培地を除去した後、ＰＢＳでの洗浄を行う。
培養リンパ球を収集し（穏やかにフラスコを撹拌してすべてのリンパ球を底から回収するように注意する）、遠心分離し、上清をデカントし、完全培地中への再浮遊を行い、細胞数及び生存率の試験を実施する。インキュベーター内に戻す。
単球を洗浄後、完全培地中に移した活性化リンパ球を、単球を含むウェルに穏やかに添加し、インキュベーター内に入れる。プレートをインキュベーター内に入れた時点がＴ細胞選択の開始である。インキュベーターに入れた時点で、選択の間は決して細胞を乱さないようにする。
使用すべき選択時間は、選択プロセスに供されているリンパ球の数に基づく。リンパ球数が９０００万未満である場合は、選択時間を１０分とする。リンパ球数が９０００万以上である場合は、選択時間を７．５分とする。タイマーが鳴った時点で選択時間の終了とし、細胞をインキュベーターから取り出す。
非接着細胞を含む培地を除去する。培地を除去後、上記のようにＰＢＳでの洗浄を行う。前述同様に、この時点でも穏やかにすることが非常に重要であり、これはリンパ球が単球に接着しているためであり、さらには、単球が死に始めるに伴ってリンパ球が緩くなるためである。３回目の洗浄後にはプレートの底に白色のフィルムが存在することに気が付くはずである。これは良好なサイン（リンパ球が単球に接着している証拠）であり、底を見通すことが不可能なほど不透明であり得る。細胞を乾燥させないように注意を払う。
ペニシリン／ストレプトマイシンを含む完全培地を添加し、インキュベーター内に入れる。インキュベーターからプレートを取り出し、顕微鏡下でウェルを見る。過剰な浮遊細胞が見える場合は培地を除去し、温かいＰＢＳで再度洗浄を行う。観察される浮遊細胞が少ないまたは皆無の場合はインキュベートを一晩行う。４回目の洗浄（必要な場合）後、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む完全培地を添加し、インキュベートを一晩行う。
Ｔ細胞の増殖
翌日、トランスファーピペットを使用して、プレート中に残っているすべての細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＩＬ－２含有完全培地を入れた組織培養フラスコに移す。２日ごとにＩＬ－２を培養物に添加すべきである。
実施例６：フラスコ中での単球での刺激
この手順は、Ｔ細胞濃縮／選択ステップ（実施例５で利用したものなど）は行わずに、ペプチドをパルスした単球でリンパ球を刺激するものである。
この手順は、Ｔ細胞濃縮／選択ステップ（実施例５で利用したものなど）は行わずに、ペプチドをパルスした単球でリンパ球を刺激するものである。
典型的には、１０００万個の単球が必要である。利用可能な単球及び刺激後のリンパ球増殖のペースに基づいてリンパ球と単球との比は幾分か変わり得るが、この比は、典型的には、５：１に近いものとなる。培地にはＤＮａｓｅを添加すべきである。
計数及び生存率の確認後、各２マイクログラム／ｍＬの濃度でペプチドが添加されているＤＮａｓｅ含有完全培地中に単球を再浮遊させる。細胞はコニカルチューブ中に再浮遊させるべきである。チューブを簡潔にボルテックスし、インキュベーター内に入れる。インキュベートを行い、遠心分離を行い、その後に上清をデカントする。完全培地を添加し、ボルテックスして再浮遊させる。ペプチドを単球にパルスしている間に、単球で刺激すべきリンパ球を数え、生存率を確認すべきである。リンパ球を完全培地中に再浮遊させ、組織培養フラスコ中に入れる。単球をリンパ球に添加し、その後にインキュベートする。
単球及びリンパ球を上記のようにインキュベート後、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＩＬ－２含有完全培地を添加する。フラスコをインキュベーターに戻す。ＩＬ－２を２日ごとに培養物に添加すべきである。
実施例７：細胞内サイトカイン（ＩＣＣ）アッセイ
この手順は、染色及びフローサイトメトリーの実施に先立ってＩＣＣ細胞の調製を実施するためのものである。リンパ球との共培養前に単球を調製する。細胞解凍ＳＯＰに記載のように単球を解凍する。トリパンブルーによって細胞を数え、生存率を確認する。単球は、リンパ球の添加前にペプチド（複数可）でプライミングしなくてはならない（陰性対照を除く）。いずれのペプチドでもプライミングされていない単球である陰性対照を平行して常に含める。
この手順は、染色及びフローサイトメトリーの実施に先立ってＩＣＣ細胞の調製を実施するためのものである。リンパ球との共培養前に単球を調製する。細胞解凍ＳＯＰに記載のように単球を解凍する。トリパンブルーによって細胞を数え、生存率を確認する。単球は、リンパ球の添加前にペプチド（複数可）でプライミングしなくてはならない（陰性対照を除く）。いずれのペプチドでもプライミングされていない単球である陰性対照を平行して常に含める。
５または１０ｍＬのチューブに入れた３７℃の完全培地２ｍＬ中に５０万個の単球を再浮遊させる。ペプチドを添加する（陰性対照についてはペプチドを添加しない）。各ペプチドの最終濃度を２マイクログラム／ｍＬとする。複数のペプチドをチューブに添加する場合、各ペプチドは２マイクログラム／ｍＬの濃度で存在すべきである。３７℃でのインキュベートを９０分行って「単球のプライミング」を行う。これは、キャップを緩めて横倒しにし、６ウェルプレートの上にバランスをとって置いた５ｃｃまたは１０ｃｃのチューブを用いて３７℃で実施する。９０分後、室温、４８２ｇで１０分間の遠心分離を行う。単球をデカントしないように、かつデカント後に単球を乾燥させないように注意しながら上清をデカントする。２００万個のリンパ球を各チューブに添加する（リンパ球の調製については以下を参照のこと）。この例ではリンパ球と単球との比は４：１であり、この比は、ペプチド特異的リンパ球の頻度が低い場合（２０％未満）に適する。このことは、初回のペプチドプライミング後に当てはまることが想定される。連続的なプライミングによってリンパ球集団中のペプチド反応性細胞の頻度が上昇するに伴ってこの比は下げるべきである。例えば、ペプチド特異的Ｔ細胞の純度が８０％超に近づいた場合、リンパ球：単球比は１：１に近づけるべきである。
リンパ球の調製
典型的には、これは、ペプチドを単球にパルスし、ペプチドとの９０分間のインキュベートを開始した後に始める。各「リンパ球培養物」を数える。各ＩＣＣ実験（「反応」）には２００万個のリンパ球が必要である。２００万個のリンパ球に適した体積分量をとり、室温、４８２ｇで１０分間遠心分離する。デカント及び３７℃の２ｍＬのＣＭ中への再浮遊を行う。単球（上記）から上清をデカントした後、これら２ｍＬを単球チューブに添加する。穏やかにボルテックスすることによってすべての細胞が確実に混合されるようにする。キャップを緩めて横倒しにし、６ウェルプレートの上にバランスをとって置いた５ｃｃまたは１０ｃｃのチューブ中、３７℃で２時間のインキュベートを行う。２時間の終了時点でブレフェルジンＡを添加し、３７℃で４時間のインキュベートを行う。
ＩＣＣを染色する。ペプチドと反応する細胞の数は非常に少ないであろうが（初回の感作後は、場合によっては１％以下）、刺激を繰り返すことで遥かに高いレベルに上昇するはずである。
実施例８：第三者ウイルス特異的ＣＴＬの製造
目的のＨＬＡ拘束要素に結合することが知られている限定数（最大で２０）のペプチドにリンパ球を曝露する。ペプチドパルス樹状細胞でリンパ球を最初に刺激し、ペプチドパルス単球でさらに２回刺激する。第１の単球－ペプチド再刺激の一部として、目的ＣＴＬが単球－ペプチド単層に選択的に結合することに起因して目的ＣＴＬを濃縮する。文献中の報告で本発明者らが知り得たウイルス反応性リンパ球の最高頻度は２％未満（Ｌｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）である一方で、本発明者らの出荷基準は少なくとも２０％のウイルス反応性ＣＴＬを必要とするものである。産物は、フィラデルフィアのＪｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって生成されることになる。出荷基準は以下の通りである：（１）産物は、ＩＣＣアッセイにおいてＣＴＬの少なくとも２０％がウイルスペプチドに反応するものであることが実証されなくてはならない（ペプチドに対する反応性は、テトラマーアッセイではＩＣＣアッセイでのものと比較して常に高くなることから、後者はより厳密な尺度であることに留意されたい）。（２）エフェクター：標的比を２０：１とした場合に、適切な標的細胞の４０％が溶解される。（３）細胞産物の単球含量が２．５％以下、ＮＫ細胞含量が２．５％以下、ナイーブＴ細胞含量が２．５％以下であることがフローサイトメトリーによって明らかにされなくてはならない。これらの後者集団は、ＢＭＴ研究においてＧＶＨＤを誘発する懸念があると考えられていた。本発明者らはこれらの後者集団がウイルス集団に対して重要なものであるとは考えていないが、安全性に関して利用可能なデータが増えるまで、そうした集団は本発明者らの出荷基準に含められる。
目的のＨＬＡ拘束要素に結合することが知られている限定数（最大で２０）のペプチドにリンパ球を曝露する。ペプチドパルス樹状細胞でリンパ球を最初に刺激し、ペプチドパルス単球でさらに２回刺激する。第１の単球－ペプチド再刺激の一部として、目的ＣＴＬが単球－ペプチド単層に選択的に結合することに起因して目的ＣＴＬを濃縮する。文献中の報告で本発明者らが知り得たウイルス反応性リンパ球の最高頻度は２％未満（Ｌｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）である一方で、本発明者らの出荷基準は少なくとも２０％のウイルス反応性ＣＴＬを必要とするものである。産物は、フィラデルフィアのＪｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって生成されることになる。出荷基準は以下の通りである：（１）産物は、ＩＣＣアッセイにおいてＣＴＬの少なくとも２０％がウイルスペプチドに反応するものであることが実証されなくてはならない（ペプチドに対する反応性は、テトラマーアッセイではＩＣＣアッセイでのものと比較して常に高くなることから、後者はより厳密な尺度であることに留意されたい）。（２）エフェクター：標的比を２０：１とした場合に、適切な標的細胞の４０％が溶解される。（３）細胞産物の単球含量が２．５％以下、ＮＫ細胞含量が２．５％以下、ナイーブＴ細胞含量が２．５％以下であることがフローサイトメトリーによって明らかにされなくてはならない。これらの後者集団は、ＢＭＴ研究においてＧＶＨＤを誘発する懸念があると考えられていた。本発明者らはこれらの後者集団がウイルス集団に対して重要なものであるとは考えていないが、安全性に関して利用可能なデータが増えるまで、そうした集団は本発明者らの出荷基準に含められる。
図１Ａ～１Ｃは、提唱された実験室プロセスを適用することによるウイルスＣＴＬの増殖を示す。これらのグラフは、バックグラウンドレベル（左パネル；図１Ａ）、インビトロ培養の第１週後のＣＤ８＋Ｔ細胞小集団の検出（図１Ｂ）、ならびに選択及びさらなる増殖後の１５％までの濃縮（右パネル；図１Ｃ）を示す。ｘ軸は、Ｔ細胞の細胞傷害性サブセットを同定するＣＤ８マーカーでの染色を反映する。ｙ軸は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に結合することが可能なウイルスペプチドでの刺激に反応したインターフェロン－ガンマ産生を反映する。本発明者らのプロセスにおけるその後の刺激／増殖ステップに伴ってさらなる濃縮が一貫して生じることが予想される。
実施例９：テトラマーアッセイ
テトラマーアッセイを使用してＣＴＬの純度及び濃縮を定量化した。ＣＴＬ試料を最初に染色して抗ＣＤ８ ｐＭＨＣテトラマーを同定することで、どのＣＴＬが抗原特異的Ｔ細胞集団（ウイルスペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）に変換されたものであるかを同定した。これによって、機能ベースのプロファイリングと関連することが多い歪みを伴わずに抗原特異的Ｔ細胞と、分かれて生じたさまざまな表現型集団とを同時に染色することが可能になる。これまでに試験したすべての回復期ドナーからＣＴＬが生成されている。ＣＯＶＩＤ－１９ゲノム由来の２０個の試験ペプチドのうちの７個のみがＣＴＬを刺激することが実証されている。標準的なインターフェロン産生アッセイ（他のウイルスモデルで使用されたが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）ではリードアウトが不十分である（Ｈａｂｅｌ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０２０，１１７：２４３８４－２４３９１．、Ｋｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０２０，１３６：２９０５－２９１７．））の代替としてテトラマーアッセイを使用してＣＴＬの純度及び濃縮を定量化した。生成されたＣＴＬは、９０％超がＣＤ３＋ＣＤ８＋であり、テトラマーアッセイにおいて６０％超が陽性であった。テトラマー分析（図２Ａ）では、第１回目のペプチド刺激の後のＣＤ８＋Ｔ細胞を測定し、総細胞の少なくとも約２．３％がウイルスペプチド特異的ＣＤ８＋ＣＴＬであることが示された。テトラマー分析（図２Ｂ）によって、最終刺激（第３の刺激）の後には試料中の細胞の７５％超がＣＤ８＋ＣＴＬであることがさらに実証された。さらに、最終刺激後には、細胞産物は、９０％以上がＣＤ８＋及び／またはＣＤ３＋ＣＤ８＋であった。
テトラマーアッセイを使用してＣＴＬの純度及び濃縮を定量化した。ＣＴＬ試料を最初に染色して抗ＣＤ８ ｐＭＨＣテトラマーを同定することで、どのＣＴＬが抗原特異的Ｔ細胞集団（ウイルスペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）に変換されたものであるかを同定した。これによって、機能ベースのプロファイリングと関連することが多い歪みを伴わずに抗原特異的Ｔ細胞と、分かれて生じたさまざまな表現型集団とを同時に染色することが可能になる。これまでに試験したすべての回復期ドナーからＣＴＬが生成されている。ＣＯＶＩＤ－１９ゲノム由来の２０個の試験ペプチドのうちの７個のみがＣＴＬを刺激することが実証されている。標準的なインターフェロン産生アッセイ（他のウイルスモデルで使用されたが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）ではリードアウトが不十分である（Ｈａｂｅｌ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０２０，１１７：２４３８４－２４３９１．、Ｋｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０２０，１３６：２９０５－２９１７．））の代替としてテトラマーアッセイを使用してＣＴＬの純度及び濃縮を定量化した。生成されたＣＴＬは、９０％超がＣＤ３＋ＣＤ８＋であり、テトラマーアッセイにおいて６０％超が陽性であった。テトラマー分析（図２Ａ）では、第１回目のペプチド刺激の後のＣＤ８＋Ｔ細胞を測定し、総細胞の少なくとも約２．３％がウイルスペプチド特異的ＣＤ８＋ＣＴＬであることが示された。テトラマー分析（図２Ｂ）によって、最終刺激（第３の刺激）の後には試料中の細胞の７５％超がＣＤ８＋ＣＴＬであることがさらに実証された。さらに、最終刺激後には、細胞産物は、９０％以上がＣＤ８＋及び／またはＣＤ３＋ＣＤ８＋であった。
実施例１０：細胞傷害性アッセイ
ウイルスペプチドパルス標的に対するＣＴＬの細胞傷害性の関数としてウイルス特異的ＣＴＬの機能的分析を実施した。２μｇ／ｍＬのウイルスペプチドをエフェクター細胞にパルスし、３７℃で適切な時間インキュベートした。ウイルスペプチドとのインキュベート後、培地を吸引し、温かいＰＢＳでエフェクター細胞をすすぎ、新鮮な完全培地に交換した。ＣＴＬを３０：１、１０：１、３：１、及び１：１の比となるように、エフェクター細胞を播種したウェルに入れて滴定した（非ウイルスペプチドパルスエフェクター細胞条件を対照として確保した）。溶解を受けた細胞からの放射性トレーサー（５１Ｃｒ）の放出の関数として細胞傷害性を測定した（化学的にすべての細胞を溶解した対照と比較した）。３０：１～３：１のＥ：Ｔ比において認められたＣＴＬ介在性の細胞傷害性は、典型的には、８０％超であった（図３Ａ）。エフェクターと標的との比を１：１とした場合には細胞傷害性は約６０％であった。
ウイルスペプチドパルス標的に対するＣＴＬの細胞傷害性の関数としてウイルス特異的ＣＴＬの機能的分析を実施した。２μｇ／ｍＬのウイルスペプチドをエフェクター細胞にパルスし、３７℃で適切な時間インキュベートした。ウイルスペプチドとのインキュベート後、培地を吸引し、温かいＰＢＳでエフェクター細胞をすすぎ、新鮮な完全培地に交換した。ＣＴＬを３０：１、１０：１、３：１、及び１：１の比となるように、エフェクター細胞を播種したウェルに入れて滴定した（非ウイルスペプチドパルスエフェクター細胞条件を対照として確保した）。溶解を受けた細胞からの放射性トレーサー（５１Ｃｒ）の放出の関数として細胞傷害性を測定した（化学的にすべての細胞を溶解した対照と比較した）。３０：１～３：１のＥ：Ｔ比において認められたＣＴＬ介在性の細胞傷害性は、典型的には、８０％超であった（図３Ａ）。エフェクターと標的との比を１：１とした場合には細胞傷害性は約６０％であった。
実施例１１：拡張性
手法は、臨床試験に十分な細胞が得られるように拡張することができる。例えば、計画した第Ｉ～ＩＩ相試験では、試験を支持するために約３．５×１０９個のＣＴＬが必要である。表７に示されるように、２．９×１０９個のリンパ球をドナーから単離し、９．２×１０９個のリンパ球を得た。その少なくとも７６％は、テトラマー分析からＣＤ８＋として検出可能なものであり、これは臨床試験に十分な材料であった。
手法は、臨床試験に十分な細胞が得られるように拡張することができる。例えば、計画した第Ｉ～ＩＩ相試験では、試験を支持するために約３．５×１０９個のＣＴＬが必要である。表７に示されるように、２．９×１０９個のリンパ球をドナーから単離し、９．２×１０９個のリンパ球を得た。その少なくとも７６％は、テトラマー分析からＣＤ８＋として検出可能なものであり、これは臨床試験に十分な材料であった。
実施例１２：比較データ
限定数のペプチドを用いて刺激の集中度を高めた場合と、ウイルス感染細胞を使用した場合、全長ウイルスタンパク質の遺伝子をトランスフェクトした細胞を使用した場合、または大きなペプチドライブラリーを使用した場合と、を比較した。刺激ウイルスペプチドを使用する選択ステップを追加することで、現存の方法と比較して均一性を高めることが可能になり、ドナー試料中に存在する無関係なリンパ球が排除された。
限定数のペプチドを用いて刺激の集中度を高めた場合と、ウイルス感染細胞を使用した場合、全長ウイルスタンパク質の遺伝子をトランスフェクトした細胞を使用した場合、または大きなペプチドライブラリーを使用した場合と、を比較した。刺激ウイルスペプチドを使用する選択ステップを追加することで、現存の方法と比較して均一性を高めることが可能になり、ドナー試料中に存在する無関係なリンパ球が排除された。
商業的に利用可能なウイルス特異的ＣＴＬ産物は主にＣＤ４＋集団であることが認められたこととは対照的に、本明細書に開示の方法では、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団が統計的に有意に濃縮された。これまでにすべての回復期ドナーからのＣＴＬの生成に成功している。細胞産物は、典型的には、９０％以上がＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、テトラマーアッセイにおいて６０％超が陽性であった（表８）。Ｅ：Ｔ比が３：１の場合、ペプチドパルス標的に対する細胞傷害性は６０％超であった。この手法は、臨床試験向けに拡張することができる。
結果として、ペプチドがパルスされた細胞の細胞傷害性及び溶解応答は、現存の方法と比較してはるかに強いものであった。他のＣＴＬ産物と比較してＴ細胞の使用数が１／１０未満であってもほぼ４倍の死滅（効率としてはほぼ４０倍の増加）が認められた。商業的に利用可能な他のウイルス特異的ＣＴＬ産物は細胞傷害性を誘発し得る一方で、混合物中のどの細胞が治療に重要であるかが未同定なものであることが多い。本明細書に開示の方法は、支配的に存在するウイルス特異的ＣＴＬが完全にＣＤ８＋サブセットであり、細胞傷害性であり、かつＨＬＡ－クラスＩペプチドに的が絞られたものであることが実証された。一方で、現存する産物は、Ｔ細胞組成、純度、及び標的同定において大きく異なるものである。
実施例１３：インフルエンザペプチドの調製
特定のＨＬＡ－Ａ２アレルに結合するインフルエンザペプチドを文献から選別し、ペプチド表に加える。この表にペプチドを順次加えていき、その結合相手のＨＬＡアレルを反映するラボ表記をペプチドに付与し、この表記には、ダッシュの後に拡張２桁を付け加える。例えば、Ａ＊０２：０１－０３は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に結合する表中の第３のペプチドを指す。臨床的に使用することになるＣＴＬの刺激に使用するペプチドは、ＣＳ Ｂｉｏまたはインビボグレードの材料を調製可能な同様のベンダーから購入する。
特定のＨＬＡ－Ａ２アレルに結合するインフルエンザペプチドを文献から選別し、ペプチド表に加える。この表にペプチドを順次加えていき、その結合相手のＨＬＡアレルを反映するラボ表記をペプチドに付与し、この表記には、ダッシュの後に拡張２桁を付け加える。例えば、Ａ＊０２：０１－０３は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に結合する表中の第３のペプチドを指す。臨床的に使用することになるＣＴＬの刺激に使用するペプチドは、ＣＳ Ｂｉｏまたはインビボグレードの材料を調製可能な同様のベンダーから購入する。
実施例２２：第三者インフルエンザ特異的ＣＴＬの製造
目的のＨＬＡ拘束要素に結合することが知られている限定数（最大で２０）のペプチドにリンパ球を曝露する。ペプチドパルス樹状細胞でリンパ球を最初に刺激し、ペプチドパルス単球でさらに２回刺激する。第１の単球－ペプチド再刺激の一部として、目的ＣＴＬが単球－ペプチド単層に選択的に結合することに起因して目的ＣＴＬを濃縮する。文献中の報告で本発明者らが知り得たウイルス反応性リンパ球の最高頻度は２％未満（Ｌｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）である一方で、本発明者らの出荷基準は少なくとも２０％のウイルス反応性ＣＴＬを必要とするものである。産物は、フィラデルフィアのＪｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって生成されることになる。出荷基準は以下の通りである：（１）産物は、ＩＣＣアッセイにおいてＣＴＬの少なくとも２０％がウイルスペプチドに反応するものであることが実証されなくてはならない（ペプチドに対する反応性は、テトラマーアッセイではＩＣＣアッセイでのものと比較して常に高くなることから、後者はより厳密な尺度であることに留意されたい）。（２）エフェクター：標的比を２０：１とした場合に、適切な標的細胞の４０％が溶解される。（３）細胞産物の単球含量が２．５％以下、ＮＫ細胞含量が２．５％以下、ナイーブＴ細胞含量が２．５％以下であることがフローサイトメトリーによって明らかにされなくてはならない。これらの後者集団は、ＢＭＴ研究においてＧＶＨＤを誘発する懸念があると考えられていた。本発明者らはこれらの後者集団がウイルス集団に対して重要なものであるとは考えていないが、安全性に関して利用可能なデータが増えるまで、そうした集団は本発明者らの出荷基準に含められる。
目的のＨＬＡ拘束要素に結合することが知られている限定数（最大で２０）のペプチドにリンパ球を曝露する。ペプチドパルス樹状細胞でリンパ球を最初に刺激し、ペプチドパルス単球でさらに２回刺激する。第１の単球－ペプチド再刺激の一部として、目的ＣＴＬが単球－ペプチド単層に選択的に結合することに起因して目的ＣＴＬを濃縮する。文献中の報告で本発明者らが知り得たウイルス反応性リンパ球の最高頻度は２％未満（Ｌｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）である一方で、本発明者らの出荷基準は少なくとも２０％のウイルス反応性ＣＴＬを必要とするものである。産物は、フィラデルフィアのＪｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって生成されることになる。出荷基準は以下の通りである：（１）産物は、ＩＣＣアッセイにおいてＣＴＬの少なくとも２０％がウイルスペプチドに反応するものであることが実証されなくてはならない（ペプチドに対する反応性は、テトラマーアッセイではＩＣＣアッセイでのものと比較して常に高くなることから、後者はより厳密な尺度であることに留意されたい）。（２）エフェクター：標的比を２０：１とした場合に、適切な標的細胞の４０％が溶解される。（３）細胞産物の単球含量が２．５％以下、ＮＫ細胞含量が２．５％以下、ナイーブＴ細胞含量が２．５％以下であることがフローサイトメトリーによって明らかにされなくてはならない。これらの後者集団は、ＢＭＴ研究においてＧＶＨＤを誘発する懸念があると考えられていた。本発明者らはこれらの後者集団がウイルス集団に対して重要なものであるとは考えていないが、安全性に関して利用可能なデータが増えるまで、そうした集団は本発明者らの出荷基準に含められる。
図４は、提唱された実験室プロセスを適用することによるインフルエンザＣＴＬの増殖を示す。グラフは、第２の刺激後にＣＤ８＋Ｔ細胞集団が検出されていることを示す。ｘ軸は、Ｔ細胞の細胞傷害性サブセットを同定するＣＤ８マーカーでの染色を反映する。ｙ軸は、ＨＬＡ－Ａ２に結合することが可能なインフルエンザペプチドでの刺激に反応したインターフェロン－ガンマ産生を反映する。
本明細書で引用されるすべての文書の教示内容はすべて、参照によって本明細書に組み込まれる。
Claims (53)
- ウイルス感染の治療方法であって、前記方法が、それを必要とするヒト患者に対して、ウイルスペプチドに反応性の細胞が特異的に濃縮されたものであるウイルスペプチド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む細胞を有効量で投与することを含み、前記ＣＴＬが、インビトロでの刺激によって、単一のＨＬＡアレルに対して拘束された複数のペプチドに対して感作され、前記ＣＴＬの少なくとも２０％がウイルスペプチドに反応性であり、前記細胞が、２．５％未満のナイーブＴ細胞、単球、ＮＫ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、前記方法。
- 前記ヒト患者が、高齢患者または免疫不全患者である、請求項１に記載の方法。
- 前記投与することが、静脈内注入によって実施される、請求項１に記載の方法。
- 前記注入が、中心ラインまたは正中線を介して前記患者に送達される、請求項３に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチド特異的ＣＴＬが、単一のドナーに由来する、請求項１に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチド特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ－Ａ１アレルに対して拘束された１つ以上のペプチドに対して感作される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上のペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、及びそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される、請求項６に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチド特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ－Ａ２アレルに対して拘束された１つ以上のペプチドに対して感作される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上のペプチドが、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、及びそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される、請求項８に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチド特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ－Ｂ７アレルに対して拘束された１つ以上のペプチドに対して感作される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上のペプチドが、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、及びそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される、請求項１０に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチド特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ－Ｂ４０アレルに対して拘束された１つ以上のペプチドに対して感作される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上のペプチドが、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、及びそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される、請求項１２に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチド特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ－Ｃｗ７アレルに対して拘束された１つ以上のペプチドに対して感作される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上のペプチドが、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、及びそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される、請求項１４に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチド特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ－Ａ１アレル、ＨＬＡ－Ａ２アレル、ＨＬＡ－Ｂ７アレル、ＨＬＡ－Ｂ４０アレル、ＨＬＡ－Ｃｗ７アレルのうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせに結合するウイルスペプチドの組み合わせに対して感作される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチドが、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスに由来するものである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチドが、ＳＡＲＳ－コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９）ウイルスに由来するものである、請求項１７に記載の方法。
- 前記１つ以上のペプチドが、配列番号７８～８７及びそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される、請求項８に記載の方法。
- ウイルスペプチドに反応性の細胞が特異的に濃縮されたものであるウイルスペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の調製方法であって、前記方法が、
ａ．単球のサブセットを処理して樹状細胞への成熟を誘導し、前記樹状細胞を１つ以上のウイルス特異的ペプチドでパルスし、リンパ球と共に少なくとも６日間共培養する第１の刺激ステップと、
ｂ．単球を使用して前記ウイルス特異的ペプチドを提示させ、刺激リンパ球を少なくとも７日間培養し、前記パルスペプチドを認識するＴ細胞が接着単球層に選択的に接着することに起因してペプチド特異的ＣＴＬを選択する第２の刺激ステップと、
ｃ．単球のサブセットを複数のウイルス特異的ペプチドでパルスし、単一のＨＬＡアレルに対して拘束し、それによってウイルスペプチド特異的ＣＴＬを生成させる第３の刺激ステップと、
を含み、前記ＣＴＬの少なくとも２０％が、ウイルスペプチドに反応性である、前記方法。 - 前記ウイルス反応性ＣＴＬが、単一のドナーから収集された同種異系単核白血球である、請求項２０に記載の方法。
- 樹状細胞への成熟の誘導が、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、またはこれら２つの組み合わせを用いて行う少なくとも約２４時間の前記単球の第１の処理と、前記第１の処理の後にＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６、プロスタグランジンＥ２、またはそれらの任意の組み合わせを用いて行う少なくとも約２４時間の前記単球の第２の処理と、を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
- ウイルスペプチドでの前記樹状細胞のパルスが、少なくとも約２μｇ／ｍＬの各ウイルスペプチドと共に前記樹状細胞をインキュベートすることを含む、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第２の刺激ステップにおける刺激リンパ球が、ヒトインターロイキン－１（ＩＬ－１）で前記共培養物を処理することによってさらに選択される、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチド特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ－Ａ１アレルに対して拘束された１つ以上のペプチドに対して感作される、請求項２０～２４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上のペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、及びそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される、請求項２５に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチド特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ－Ａ２アレルに対して拘束された１つ以上のペプチドに対して感作される、請求項２０～２４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上のペプチドが、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、及びそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される、請求項２７に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチド特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ－Ｂ７アレルに対して拘束された１つ以上のペプチドに対して感作される、請求項２０～２４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上のペプチドが、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、及びそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される、請求項２９に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチド特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ－Ｂ４０アレルに対して拘束された１つ以上のペプチドに対して感作される、請求項２０～２４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上のペプチドが、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、及びそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される、請求項３１に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチド特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ－Ｃｗ７アレルに対して拘束された１つ以上のペプチドに対して感作される、請求項２０～２４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上のペプチドが、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、及びそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される、請求項３３に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチド特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ－Ａ１アレル、ＨＬＡ－Ａ２アレル、ＨＬＡ－Ｂ７アレル、ＨＬＡ－Ｂ４０アレル、ＨＬＡ－Ｃｗ７アレルの組み合わせのうちのいずれか１つ以上に結合するウイルスペプチドの組み合わせに対して感作される、請求項２０～２４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチドが、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスに由来するものである、請求項２０～３５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスペプチドが、ＳＡＲＳ－コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９）ウイルスに由来するものである、請求項３６に記載の方法。
- 前記１つ以上のペプチドが、配列番号７８～８７及びそれらの組み合わせ、からなるリストから選択される、請求項２７に記載の方法。
- ウイルスペプチドに反応性の細胞が特異的に濃縮されたものであるウイルスペプチド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む細胞を含む医薬組成物であって、前記ＣＴＬが、インビトロでの刺激によって、単一のＨＬＡアレルに対して拘束された複数のペプチドに対して感作され、前記ＣＴＬの少なくとも２０％がウイルスペプチドに反応性であり、前記細胞が、２．５％未満のナイーブＴ細胞、単球、ＮＫ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、前記医薬組成物。
- 前記ＣＴＬが、複数のドナーに由来するものである、請求項３９に記載の医薬組成物。
- 前記ＣＴＬが、特定のＨＬＡ－Ａ１アレルに結合する１つ以上のウイルスペプチドに対して感作されており、前記１つ以上のウイルスペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の医薬組成物。
- 前記ＣＴＬが、特定のＨＬＡ－Ａ２アレルに結合する１つ以上のウイルスペプチドに対して感作されており、前記１つ以上のウイルスペプチドが、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の医薬組成物。
- 前記ＣＴＬが、特定のＨＬＡ－Ｂ７アレルに結合する１つ以上のウイルスペプチドに対して感作されており、前記１つ以上のウイルスペプチドが、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の医薬組成物。
- 前記ＣＴＬが、特定のＨＬＡ－Ｂ４０アレルに結合する１つ以上のウイルスペプチドに対して感作されており、前記１つ以上のウイルスペプチドが、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の医薬組成物。
- 前記ＣＴＬが、特定のＨＬＡ－Ｃｗ７アレルに結合する１つ以上のウイルスペプチドに対して感作されており、前記１つ以上のウイルスペプチドが、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の医薬組成物。
- 前記ＣＴＬが、ＨＬＡ－Ａ１アレル、ＨＬＡ－Ａ２アレル、ＨＬＡ－Ｂ７アレル、ＨＬＡ－Ｂ４０アレル、またはＨＬＡ－Ｃｗ７アレルのうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせに結合する１つ以上のウイルスペプチドに対して感作されている、請求項３９または４０に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、ＤＭＳＯ中、ＲＰＭｌ－１６４０中、アルブミン中、またはそれらの組み合わせ中で凍結保存されたＣＴＬを含む、請求項３９または４０に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、１つ以上の追加の抗ウイルス剤を含む、請求項３９または４０に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、静脈内投与に適した形態のものである、請求項３９または４０に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスペプチド特異的ＣＴＬが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、メタニューモウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ジョン・カニンガムウイルス（ＪＣＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、及びアデノウイルスからなる群から選択されるウイルスに特異的である、請求項３９または４０に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスペプチドが、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスに由来するものである、請求項３９または４０に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスペプチドが、ＳＡＲＳ－コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９）ウイルスに由来するものである、請求項５１に記載の医薬組成物。
- 前記ＣＴＬが、配列番号７８～８７及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される特定のＨＬＡ－Ａ２アレルに結合する１つ以上のウイルスペプチドに対して感作されている、請求項３９または４０に記載の医薬組成物。
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