ES2332532T3 - Epitopos de vih y composicion farmaceutica que los contiene. - Google Patents

Abstract

Péptido que comprende un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3, estando dicho péptido asociado a un complejo biotinilado compuesto por una cadena alfa (DRalfa) y una cadena ß (DRß) de un HLA de tipo II, por un brazo espaciador, y por estreptavidina para formar un tetrámero de clase II.

Description

Epítopos de VIH y composición farmacéutica que los contiene.

La presente invención se refiere a unos epítopos derivados de antígenos víricos capaces de enlazarse específicamente a las moléculas HLA-DR1 y de inducir una respuesta inmunitaria en unos sujetos de fenotipos HLA-DR1, así como a sus análogos funcionales.

La presente invención se refiere asimismo a unas composiciones farmacéuticas que contienen unos péptidos que comprenden estos epítopos y/o a sus análogos funcionales, así como a unos métodos de diagnóstico para determinar el estado inmunitario de un individuo susceptible de presentar una infección vírica que comprenden la utilización de estos péptidos.

Más precisamente, la presente invención se refiere a unos epítopos inmunógenos derivados de un antígeno del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), la proteína p24, que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3.

Los virus del tipo VIH son unos virus que provocan una infección crónica, es decir, que no inducen una respuesta inmunitaria suficiente para eliminar la infección.

Esta infección puede desembocar en la aparición de un síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Esta enfermedad se caracteriza en particular por una susceptibilidad aumentada a las infecciones por unos agentes patógenos oportunistas, o por la aparición de formas agresivas del sarcoma de Kaposi, o por la aparición de linfomas de célula B, asociada a una disminución importante del número de células T CD4+.

Numerosas estrategias vacunales han sido desarrolladas con el fin de luchar contra esta infección. La mayoría de estas estrategias recurren a unos medios que prevén mejorar la producción de anticuerpos con el fin de prevenir la infección en caso de exposición al VIH, o a unos medios que prevén activar unos linfocitos T citotóxicos (o CD8+ o CTL) con el fin de detectar y destruir las células infectadas, y así controlar y eliminar la infección.

Diferentes proteínas de la cápsida vírica del VIH han sido utilizadas con el fin de producir unos anticuerpos. Así, a partir del documento US nº 6.593.079, se conoce utilizar unos péptidos del antígeno p24 de la proteína Gag del VIH con el fin de producir unos anticuerpos.

Parece que la respuesta que depende de las células T CD4+ o linfocitos T-auxiliares (o HTL) interviene de manera importante en el mantenimiento de las funciones celulares T CD8+ adecuadas y en el control de la viremia.

Sin embargo, las células T CD4+ que responden específicamente al VIH parecen ser preferentemente infectadas y eliminadas por el VIH, limitando así la capacidad de las vacunas potenciales para activar las células T auxiliares después del inicio de la infección (Douek et al., Nature, 2002, 417: 95-98). Los pacientes infectados crónicamente son incapaces de iniciar una respuesta celular de tipo T tanto contra unos antígenos del VIH como contra unos antígenos de agentes patógenos oportunistas. Así, la pérdida de la respuesta HTL desempeña una función central durante el desarrollo de una infección con VIH.

A pesar de la función central de estas células en el control de la infección con el VIH, sólo un pequeño número de epítopos limitados CD4+ inmunogénicos han sido identificados hasta ahora (Wilson et al., J. Virol, 2001, 75:4195-207; Kaufmann et al., J. Virol., 2004, 78: 4463-77).

Así, existe una necesidad de nuevos epítopos limitados CD4+ que permitan activar una respuesta dependiente de los linfocitos T CD4+ dirigida contra unos antígenos del VIH.

Existe asimismo una necesidad de disponer de composiciones farmacéuticas, en particular de vacunas, destinadas a prevenir y/o tratar unas infecciones con el VIH.

Por otro lado, es importante poder calificar la respuesta inmunitaria y/o el estado inmunitario de un paciente susceptible de padecer una infección con VIH con el fin de poder determinar su sensibilidad a la enfermedad y ajustar lo mejor posible el tratamiento a administrar.

Así, existe la necesidad de disponer de un marcador que permita caracterizar el estado inmunitario de un paciente.

Existe asimismo la necesidad de disponer de un método de diagnóstico que permita calificar el estado inmunitario de un sujeto susceptible de padecer una infección con VIH, así como, llegado el caso, evaluar la respuesta de su sistema inmunitario a un tratamiento.

La presente invención tiene en particular por objetivo satisfacer estas necesidades.

Los inventores han identificado tres epítopos derivados del antígeno p24, procedentes de la proteína Gag del VIH, específicos del fenotipo HLA-DR1.

Según uno de sus primeros aspectos, la presente invención se refiere a un péptido que comprende por lo menos un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3, y a unos análogos funcionales de ésta.

Los inventores han observado que estos epítopos eran capaces de inducir la proliferación, in vitro, de células T CD4+ procedentes de ratones transgénicos HLA-DR1 invalidados H-2 clase II (IA\beta^{b}) (Pajot et al, Int. Immunol, 2004, 16: 1275-1282) vacunados con la ayuda de la proteína p24. Por otro lado, estos péptidos son capaces de inducir una respuesta celular de tipo T CD4+ a partir de células que proceden de pacientes que padecen el VIH, en particular el VIH-1, o de individuos seronegativos, a consecuencia de la activación de estas células por unas células presentadoras de antígeno. Las células T CD4+ que proliferan en respuesta a los péptidos según la invención se caracterizan por un fenotipo HLA-DR1 y la respuesta biológica se caracteriza por la secreción de una citoquina, la IFN-\gamma\gamma medida por ELISPOT.

En el sentido de la presente invención, se entiende designar mediante la expresión "análogos funcionales" cualquier péptido o análogo peptídico capaz de imitar la actividad inmunogénica de los péptidos según la invención, a saber, en particular, de presentar la capacidad de enlazarse a las moléculas HLA-DR1, e inducir una respuesta biológica en unos linfocitos T CD4+.

HLA significa "Human Leukocyte Antigen" y es equivalente a CMH, "complejo Mayor de Histocompatibilidad". Los HLA (o CMH) corresponden a un conjunto de genes divididos en clases I y II, que presentan un polimorfismo muy alto, y que codifican para unas moléculas cuya función es presentar unos fragmentos peptídicos en la superficie de las células.

En el sentido de la presente invención, se entiende designar mediante el término "inmunógeno", cualquier sustancia susceptible de provocar una respuesta inmunitaria. Un inmunógeno, o una sustancia inmunogénica, es funcionalmente distinto de un antígeno. Un antígeno se define como cualquier sustancia susceptible de enlazarse a un anticuerpo específico. Por consiguiente, todos los antígenos son considerados como susceptibles de inducir una respuesta de tipo anticuerpo, pero algunos deben ser enlazados a un inmunógeno con el fin de poder actuar de esta forma. Así, aunque todos los inmunógenos sean unos antígenos, todos los antígenos no son inmunogénicos.

Según otro de sus aspectos, la presente invención se refiere a un péptido que comprende un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3, y a unos análogos funcionales de ésta, y que presenta una longitud inferior o igual a 24 aminoácidos.

Según otro de sus aspectos, la presente invención se refiere a un péptido multiepítopo que comprende por lo menos un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3, y a unos análogos funcionales de ésta.

Según todavía otro objeto, la presente invención se refiere a la utilización de por lo menos un péptido según la invención y/o un ácido nucleico que codifica para dicha secuencia para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención y/o al tratamiento de una infección por un virus de la inmunodeficiencia humana en unos pacientes de fenotipo HLA-DR1.

Según todavía otro objeto, la presente invención se refiere a un péptido según la invención asociado a un complejo biotinilado compuesto por una cadena \alpha (DR\alpha) y por una cadena \beta (DR\beta) de un HLA de tipo II, por un brazo espaciador y por estreptavidina para formar un tetrámero de clase II.

Según todavía otro de sus aspectos, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene por lo menos una cantidad eficaz de por lo menos un péptido según la invención, en combinación con un vehículo, un excipiente, un diluyente y/o un adyuvante farmacéuticamente aceptables.

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Péptidos

Los péptidos según la invención son unos péptidos aislados que comprenden por lo menos un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3, y unos análogos funcionales de ésta.

En el sentido de la presente invención, se entiende mediante el término "péptido" una cadena de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y que pueden comprender unos aminoácidos de tipo D o L, y asimismo cualquier derivado de aminoácidos, tales como la citrulina, la ornitina, o el ácido \beta-aminobutírico, así como unos aminoácidos no naturales que convendrían para la invención. Habitualmente, un péptido puede comprender de 2 a 30 aminoácidos, en particular de 6 a 25, y en particular de 12 a 20 aminoácidos.

En el sentido de la presente invención, se entiende mediante el término "epítopo" una región de un antígeno reconocido por un anticuerpo o un receptor para antígenos. Los epítopos se denominan asimismo "determinantes antigénicos". Un epítopo de célula T es un péptido corto (de 6 a 10 aminoácidos para las células T CD8+, y de 12 a 24 aminoácidos para las células T CD4+) derivado de un antígeno proteico.

En particular, los péptidos según la invención son unos péptidos aislados que comprenden un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3, y unos análogos funcionales de ésta, y que presentan una longitud inferior o igual a 24 aminoácidos.

Más particularmente, los péptidos según la invención son unos péptidos aislados, que consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3, y unos análogos funcionales de ésta.

Los análogos funcionales, o equivalentes funcionales biológicos, son entendidos, por el experto en la materia, como unos péptidos que comprenden unas modificaciones estructurales con relación a los péptidos según la invención pero que conservan, por el contrario, las características inmunogénicas (o propiedades biológicas funcionales) de los péptidos según la invención, que están definidas por la capacidad de interacción de estos péptidos con las moléculas HLA-DR1 y la inducción de una respuesta biológica en los linfocitos T CD4+.

Las diferentes modificaciones que se pueden prever se pueden introducir mediante medios físicos, químicos y/o biológicos como, por ejemplo, la sustitución de uno o varios aminoácidos por otros, la inserción de uno o varios aminoácidos y/o la deleción de uno o varios aminoácidos.

Según una variante ventajosa, los análogos funcionales de los péptidos según la invención se seleccionan de entre los que presentan unas propiedades biológicas funcionales mejoradas.

Debido a su tamaño relativamente pequeño, los péptidos según la invención se pueden obtener mediante cualquier técnica de síntesis peptídica conocida por el experto en la materia, tal como, por ejemplo, los métodos de síntesis en disolución o los métodos de síntesis en fase sólida.

Aparte de la síntesis peptídica, se puede prever asimismo obtener los péptidos según la invención mediante otros métodos, en particular unas técnicas de ADN recombinante, tales como las que se describen a continuación.

Según otro modo de realización, los péptidos de la presente invención, o unos análogos de éstos pueden ser asociados asimismo a otros péptidos con el fin de aumentar sus propiedades inmunogénicas. Por ejemplo, los péptidos según la invención se pueden asociar, en particular mediante un brazo espaciador, a otros péptidos que comprenden unos epítopos que tienen, por ejemplo, una actividad estimuladora frente a la respuesta de los linfocitos T citotóxicos. A título de ejemplo de péptido que comprende unos epítopos derivados de antígenos del VIH susceptibles de activar una respuesta a linfocitos T citotóxicos, se pueden mencionar los péptidos citados en la solicitud WO 00/29008.

El brazo espaciador puede comprender unas moléculas de tamaño relativamente pequeño, tales como unos aminoácidos o análogos, y que son sustancialmente neutras en unas condiciones fisiológicas.

Cuando está presente, el brazo espaciador puede comprender por lo menos uno o dos aminoácidos, idénticos o diferentes, y en particular de tres a quince aminoácidos, y en particular de seis a diez aminoácidos.

Según otra variante, el péptido de acuerdo con la invención puede estar unido a otro péptido sin brazo espaciador.

Según otro modo de realización de la invención, por lo menos uno de los péptidos de acuerdo con la invención puede estar comprendido en una construcción peptídica multi-epítopo.

Un polipéptido o péptido o proteína poli-epítopo o multi-epítopo puede comprender, por ejemplo, de 2 a 50 péptidos inmunogénicos combinados en un poli-péptido único mediante técnicas recombinantes o sintéticas, en particular de 4 a 20, y más particularmente de 8 a 12 péptidos inmunogénicos.

Los péptidos multi-epítopos pueden ser lineales o ramificados. Pueden ser producidos por medio de métodos de síntesis química o por medio de técnicas de ADN recombinante.

La construcción multi-epitópica puede ser de tipo hetero-polímero u homo-polímero.

Puede comprender unos epítopos que estimulan la actividad de los linfocitos T-auxiliares y/o de los linfocitos T citotóxicos.

Los péptidos de acuerdo con la invención se usan ventajosamente tal cual o son formulados en una composición farmacéutica como, por ejemplo, la definida a continuación para la prevención y/o el tratamiento de una infección con VIH, y en particular con VIH-1.

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Ácidos nucleicos y vectores de expresión

El experto en la materia, para obtener unos péptidos de acuerdo con la invención según unos procedimientos a base de ADN recombinante, puede, por ejemplo, utilizar el manual "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" (2ª edición), Sambrook et al., 1989, Vol. I-III, Coldspring Harbor Laboratory, Coldspring Harbor Press, NY, (Sambrook).

Debido la degenerescencia del código genético, se aprecia que numerosas variaciones conservadoras de construcciones de ácidos nucleicos permiten obtener unas secuencias de aminoácidos funcionalmente idénticas.

La consecuencia de la introducción de una modificación en una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención se puede evaluar en particular por la determinación de las propiedades inmunogénicas de los péptidos codificados por las secuencias de ácidos nucleicos mediante cualquier ensayo inmunológico conocido, y que comprende eventualmente la comparación de los resultados obtenidos con unos péptidos modificados con los obtenidos con los péptidos no modificados.

La obtención de las construcciones multi-epitópicas mencionadas anteriormente puede realizarse mediante la unión de secuencias de ácidos nucleicos recombinantes, o sintéticos, que codifican para cada uno de los péptidos que comprenden un epítopo o bien mediante unas enzimas (por ejemplo de tipo ligasa), o bien mediante síntesis química.

Así, la presente invención se refiere a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican por lo menos para un péptido de acuerdo con la invención, así como para sus análogos funcionales.

Según todavía otro modo de realización, por lo menos una de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención puede ser introducida en cualquier vector de expresión apropiado.

Estos vectores se pueden utilizar, a continuación, para transformar unas células hospedantes y producir los péptidos recombinantes deseados.

De manera que se permita la expresión de por lo menos un péptido recombinante en las células hospedantes, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para éste se puede enlazar, en un vector de expresión, de manera funcional, respectivamente a nivel de sus codones de partida y stop, con una región promotora y una región terminadora, y habitualmente un sistema de replicación.

Se puede prever asimismo en el ámbito de la presente invención la utilización de células hospedantes, tales como las bacterias, las levaduras, las células de insecto, de mamífero, o de planta para la producción de los péptidos de acuerdo con la invención utilizando los vectores de expresión definidos anteriormente.

Ventajosamente, las células de mamífero en las que es posible hacer que se exprese un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden ser, por ejemplo, unas células presentadoras de antígenos.

Los vectores de expresión que contienen las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para los péptidos según la presente invención se pueden utilizar para transformar unas células hospedantes mediante cualquier técnica apropiada, tal como, por ejemplo, la transfección con fosfato de calcio, o la electroporación.

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Anticuerpos

Según otro modo de realización, la presente invención se refiere asimismo a por lo menos un anticuerpo susceptible de ser obtenido mediante por lo menos un péptido de acuerdo con la presente invención. Este anticuerpo presenta la capacidad de unirse específicamente a un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3.

Así, los péptidos de acuerdo con la invención se pueden utilizar para producir unos anticuerpos por medio de diferentes técnicas conocidas por el experto en la materia (tales como las descritas en Current Protocols in Immunology, Willey/Greene NY; y Antibodies: Laboratory Manual Harlow, Harlow y Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Los anticuerpos así obtenidos se pueden utilizar, por ejemplo, a título de herramientas de diagnóstico, y/o terapéuticas en unos individuos susceptibles de padecer una infección con VIH.

Los péptidos de acuerdo con la invención se pueden utilizar tal cual para la obtención de anticuerpos monoclonales o policlonales, o se pueden asociar con otros agentes inmunógenos, por ejemplo con otros fragmentos de proteínas bacterianas que tienen unas propiedades inmunogénicas, tales como la hemaglutinina A del virus de la influenza, o con otros epítopos en unas construcciones peptídicas multi-epítopos o en asociación con una molécula HLA-DR1 o un fragmento de ésta.

Según un modo de realización, un anticuerpo de acuerdo con la invención puede ser de tipo complejo específico, y unirse específicamente a un complejo que comprende un epítopo de acuerdo con la invención y una molécula HLA-DR1.

Los anticuerpos según la invención comprenden los fragmentos de anticuerpo que tienen la capacidad de unirse a los péptidos de acuerdo con la invención (por ejemplo los fragmentos Fab), así como unos anticuerpos de tipo cadena única recombinante (por ejemplo unos anticuerpos scFv).

Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener a partir de células que segregan el anticuerpo deseado, tales como unos linfocitos B en cultivo, o unos hibridomas.

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Tetrámeros

Según todavía otro modo de realización, los péptidos de acuerdo con la invención se pueden utilizar para preparar unos tetrámeros.

La preparación y la utilización de tetrámeros son bien conocidos por el experto en la materia (véanse en particular Novak et al., J. Clin. Invest., 1999, 104:R63-R67; Cochran et al., Immunity, 2000, 12:241-250).

Un tetrámero que comprende un péptido de acuerdo con la invención se puede obtener de la siguiente manera: unas cadenas pesadas \alpha y \beta que corresponden a la molécula HLA-DR1, se repliegan en presencia de péptidos capaces de unirse a las mismas para generar unos complejos.

Según otro modo de realización, es posible utilizar un péptido unido mediante ingeniería genética al extremo N-terminal de la cadena DR\beta tal como se detalla por Iyasere et al., (J. Virol., 2003).

El complejo se biotinila a continuación en el extremo C-terminal de la cadena pesada DR\beta de la molécula HLA-DR1, que comprende un sitio de biotinilación añadido, por ejemplo, mediante unas técnicas de ADN recombinante. La formación del tetrámero se induce a continuación por adición de estreptavidina.

Las dos cadenas pesadas DR\alpha y DR\beta de la molécula HLA-DR1 se pueden producir o bien en células de insectos, por ejemplo unas células de drosofila, y unidas, por ejemplo, mediante un dominio Leu Zipper, y por interacción biotina-estreptavidina-PE (ficoeritrina) (Novak et al., J. Clin. Invest., 1999), o bien producidas en unas bacterias, por ejemplo Escherichia coli (Cochran JR et al., Immunity, 2000, 12:241-250).

Cuando se utiliza una estreptavidina marcada mediante una sonda fluorescente, el complejo tetramérico se puede utilizar para identificar unas células específicas de un antígeno, por ejemplo, mediante citometría de flujo.

Dichos procedimientos se pueden utilizar con fines de diagnóstico y/o de pronóstico del estado inmunitario de un individuo de fenotipo HLA-DR1, antes, durante y/o después de un tratamiento terapéutico y/o profiláctico.

Las células identificadas mediante los procedimientos descritos anteriormente se pueden utilizar con fines terapéuticos, en particular después de la amplificación in vitro, y de la inyección en un individuo.

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Células

Según un modo de realización, unos clones de linfocitos T-auxiliares (o CD4+) aislados y activados mediante unos péptidos de acuerdo con la presente invención o unos análogos funcionales de éstos, se pueden utilizar a título de agente profiláctico y/o terapéutico frente a una infección con VIH, y en particular de una infección con VIH-1.

Así, según uno de sus objetos, la presente invención se refiere asimismo a por lo menos un clon de linfocito T-auxiliar aislado, que comprende un receptor que reconoce específicamente un complejo que contiene una molécula HLA-DR1 y un péptido de acuerdo con la invención.

La presente invención se refiere asimismo a un método de tratamiento y/o de prevención de una infección por un virus de la inmunodeficiencia humana que comprende por lo menos una etapa que consiste en administrar a un individuo una cantidad eficaz de por lo menos un clon de linfocito T-auxiliar de acuerdo con la invención.

En el sentido de la presente invención, se entiende mediante el término "clon" o mediante la expresión "población clonal" un grupo de células genéticamente idénticas, derivadas de una célula única. El receptor de las células T (o TcR) presente en la superficie de cada una de las células T de la población clonal es idéntico y reconoce de manera específica una porción precisa de un antígeno determinado.

Los linfocitos T-auxiliares se pueden obtener a partir de células mononucleadas de la sangre periférica (PBMC) extraídas mediante una citaféresis.

Los linfocitos T-auxiliares activados se pueden obtener por cultivo de células precursoras en presencia de una fuente de células presentadoras de antígeno, tales como unas células dendríticas, y unos péptidos inmunogénicos apropiados. Las células presentadoras de antígeno se pueden, ventajosamente, volver incapaces de multiplicarse después de la irradiación (por ejemplo mediante exposición a aproximadamente 5.000 rads). Llegado el caso, unas células nutritivas (tales como unas células B autólogas irradiadas) pueden asimismo estar presentes. Después de un periodo de incubación apropiado (por ejemplo, aproximadamente 7 a 28 días), durante el cual las células precursoras son activadas y proliferan en forma de células efectoras, las células obtenidas, a saber, los linfocitos T-auxiliares activados, se pueden reperfundir en el individuo a partir del cual éstas han sido extraídas, con el fin de inducir una respuesta inmunitaria contra el virus de la inmunodeficiencia humana.

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Según otra variante, las células así obtenidas se pueden reperfundir en un individuo diferente del que ha suministrado las células, pero compatible o hecho compatible a nivel del HLA.

Las células presentadoras de antígeno pueden ser unas células dendríticas, unos linfocitos B o cualquier otra célula que contiene en la superficie unas moléculas HLA-DR1.

A título de ejemplo de procedimiento que permite obtener unos linfocitos que convienen para la realización de la invención, se puede mencionar el procedimiento descrito en la solicitud de patente WO 01/29190.

Por otro lado, las células presentadoras de antígeno se pueden utilizar asimismo como medio que permite obtener una respuesta inmunitaria. Estas células se pueden cargar por medio de los péptidos de acuerdo con la invención y/o de sus análogos funcionales y/o de las construcciones multi-epitópicas, y/o de las secuencias de ácidos nucleicos según la invención.

Así, la presente invención tiene asimismo por objeto por lo menos una célula presentadora de antígeno aislada, que contiene en la superficie unas moléculas HLA-DR1, asociada a por lo menos un péptido y/o por lo menos un ácido nucleico según la invención.

Las células presentadoras de antígeno que convienen para la realización de la invención pueden ser, por ejemplo, las células dendríticas, los linfocitos B, los macrófagos, así como las células presentadoras de antígeno denominadas artificiales.

A título de ejemplo de procedimientos que permiten obtener unas células presentadoras de antígeno, se pueden mencionar las técnicas descritas en las solicitudes de patente WO 97/44441, WO 03/089629, WO 93/20185 y WO 97/29182 o las descritas por Brossart et al., (Blood, 1998, 92:4238-47).

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Composiciones farmacéuticas

Los péptidos de acuerdo con la presente invención y los análogos funcionales de éstos, se pueden utilizar asimismo para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas a la prevención y/o al tratamiento de una infección por el virus de la inmunodeficiencia humana en unos pacientes HLA-DR1. En particular, el virus de la inmunodeficiencia humana puede ser VIH-1.

Según un modo particular de realización, la composición farmacéutica es ventajosamente una vacuna.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden comprender, en combinación con un vehículo, un excipiente, un diluyente y/o un adyuvante farmacéuticamente aceptables, un péptido de acuerdo con la invención, un análogo funcional de éste, un péptido multi-epítopo tal como se ha definido anteriormente, una secuencia de ácidos nucleicos tal como se ha definido anteriormente, llegado el caso, en un vector de expresión, un anticuerpo tal como se ha definido anteriormente, y sus mezclas. Estos elementos se designarán a continuación mediante la expresión "agente(s) activo(s)".

Los excipientes susceptibles de convenir para la realización de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención pueden ser, a título de ejemplo, unos agentes tamponantes y de ajuste del pH, unos agentes de ajuste de la tonicidad del medio, y unos agentes humectantes.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se pueden administrar por vía local, por vía oral, por vía tópica o por vía parenteral, tal como, por ejemplo, la vía intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular.

Así, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden comprender un agente activo tal como se ha definido anteriormente, ventajosamente disuelto o suspendido en un vehículo estéril farmacéuticamente aceptable, tal como, por ejemplo, un medio acuoso.

La disolución acuosa así obtenida se puede acondicionar después para una utilización tal cual o liofilizada. La
preparación liofilizada se combina a continuación con una disolución acuosa estéril, antes de su administra-
ción.

En el marco de una aplicación terapéutica, las composiciones de acuerdo con la invención se pueden administrar a un individuo ya infectado con el VIH en una cantidad suficiente para detener la propagación del virus en el organismo o, por lo menos parcialmente, detener los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones.

Con respecto al SIDA, el término "tratamiento" se refiere a una disminución de la severidad de la enfermedad, por ejemplo, reduciendo la desaparición de los linfocitos T CD4+.

Con respecto al SIDA, el término "prevenir" se refiere al hecho de prevenir la aparición del SIDA, por ejemplo administrando una composición farmacéutica de acuerdo con la invención antes del desarrollo de la enfermedad. Esto indica que las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar a título de agente profiláctico para impedir, en particular, la reducción del número de linfocitos T CD4+.

Una cantidad adecuada de uno de los agentes activos que permite realizar esto se define como una cantidad eficaz.

La cantidad eficaz de agente activo se debe ajustar según la naturaleza de dicho agente, la severidad de la enfermedad, la composición a inyectar, el peso y el estado general del paciente.

A título de ejemplo, para un paciente de aproximadamente 70 kg, la cantidad eficaz, por ejemplo en el marco de un péptido según la invención, podrá estar comprendida entre aproximadamente 100 \mug/inyección/día y aproximadamente 3.000 \mug/inyección por día, y ser en particular de aproximadamente 1.500 \mug/inyección por día en una o varias
dosis.

Según un modo de realización, el modo de administración puede comprender una primera inyección, seguida de uno o varios recuerdos.

Según otra variante de realización, los agentes activos tal como se han definido anteriormente se pueden asociar a unos vectores de administración (o vehículos) tales como unos liposomas, unos exosomas, o unas células presentadoras de antígeno, tal como se han definido anteriormente (tales como las células dendríticas o los macrófagos), o una mezcla de éstos. Los agentes activos asociados a los vectores se pueden disponer en el interior y/o en la superficie de
éstos.

La administración por medio de liposomas puede permitir que los agentes activos apunten hacia unos tejidos particulares, tales como los tejidos linfoides. Los liposomas pueden permitir asimismo, ventajosamente, aumentar la semi-vida de los agentes activos.

En las composiciones farmacéuticas que comprenden a título de vector de administración unos liposomas, los agentes activos se pueden incorporar en los liposomas, solos o en combinación con una molécula que favorece la unión con, por ejemplo, unas células linfoides y/o mieloides, tales como unos anticuerpos monoclonales que se unen a unos marcadores de superficie, tales como, por ejemplo, CD45, CD83 o CD86, o DC-SIGN o L-SIGN. Así, los liposomas asociados a unos agentes activos según la invención se pueden dirigir hacia los tejidos que comprenden unas células linfoides y/o mieloides y liberar así el agente activo de manera más eficaz.

Numerosos métodos son conocidos por el experto en la materia para preparar unos liposomas, tales como, por ejemplo, los métodos descritos en US nº 4.235.971 o US nº 4.837.028.

Se puede administrar una suspensión de liposoma por vía intravenosa, localmente, o de manera tópica según una cantidad que depende en particular del agente activo a suministrar, y del estado del individuo a tratar.

Los agentes activos pueden ser administrados asimismo en forma de exosomas. Los exosomas son unas vesículas de aproximadamente 50 a 90 nm obtenidas a partir de células dendríticas durante su maduración. Estas vesículas poseen una composición característica en proteínas, que comprende en particular unas moléculas HLA de tipo I y II, así como otras moléculas de co-estimulación, que permiten así la activación de la respuesta inmunitaria innata y adaptativa.

Los exosomas se pueden obtener a partir de células dendríticas derivadas de células mononucleadas de la sangre periférica, extraídas, por ejemplo, mediante citaféresis, y cultivadas a continuación en medio que comprende IL4 y GM-SCF, o según las condiciones definidas en la solicitud WO 97/44441.

Los exosomas que convienen para la realización de la presente invención se pueden preparar, por ejemplo, según el procedimiento descrito en la patente US nº 6.812.023.

La presente invención tiene asimismo por objeto la utilización de por lo menos un agente activo tal como se ha definido anteriormente, tal como un péptido y/o un ácido nucleico de acuerdo con la invención, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención y/o al tratamiento de una infección mediante virus de la inmunodeficiencia humana, y en particular el VIH-1, en unos pacientes de fenotipo HLA-DR1.

La presente invención se refiere asimismo a un método de tratamiento y/o de prevención de una infección por un virus de la inmunodeficiencia humana que comprende por lo menos una etapa que consiste en administrar a un individuo una cantidad eficaz de por lo menos un agente activo tal como se ha definido anteriormente tal como un péptido y/o un ácido nucleico de acuerdo con la invención.

El péptido y/o el ácido nucleico de acuerdo con la invención utilizado en este método puede estar comprendido en una composición farmacéutica tal como se ha definido anteriormente.

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Método de diagnóstico

Según otro modo de realización, la presente invención se refiere asimismo a un método de diagnóstico para determinar el estado inmunitario de un individuo susceptible de presentar una infección por un virus de la inmunodeficiencia humana, en particular el VIH-1, que comprende por lo menos las etapas que consisten en:

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poner en contacto in vitro unos linfocitos T-auxiliares aislados de dicho individuo con un péptido de acuerdo con la presente invención o un análogo funcional de éste, y

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evaluar una respuesta biológica.

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La puesta en contacto, in vitro, de linfocitos T-auxiliares aislados con un péptido de acuerdo con la invención o unos análogos funcionales de éste, puede llevarse a cabo directamente o por medio de células presentadoras de antígeno, tal como se han definido anteriormente.

Según un modo de realización, el individuo es de fenotipo HLA-DR1.

La respuesta biológica evaluada puede ser, por ejemplo, un índice de proliferación (o de estimulación), la secreción de una o varias moléculas biológicas en el medio extracelular o en el citoplasma, la aparición y/o la desaparición de una o varias moléculas asociadas a las células, y una combinación de estas respuestas.

A título de ejemplo, las respuestas biológicas obtenidas en los linfocitos T-auxiliares se pueden evaluar según los procedimientos descritos en la parte experimental de la presente memoria o en la solicitud de patente WO 04/050909.

Las moléculas biológicas asociadas a los linfocitos T-auxiliares susceptibles de ser detectadas pueden ser, por ejemplo, unas citoquinas y/o unas quimioquinas y/o unas enzimas yo unos determinantes de superficie que permiten caracterizar un fenotipo de una población de células T-auxiliares particulares. Entre las citoquinas, se pueden citar a título de ejemplo la IFN-\gamma\gamma, la IL-2, IL-4, IL-5, e IL-10.

Las moléculas biológicas segregadas por los linfocitos T-auxiliares, tras su activación, pueden ser detectadas asimismo mediante la técnica ELISPOT.

Por ejemplo, la IFN-\gamma\gamma se puede detectar mediante un ensayo ELISPOT, después de la incubación de las células T (en presencia o no de otras células mononucleadas de la sangre periférica) con unos péptidos de acuerdo con la invención, tal como se describe en Forsthubert et al., (Science, 1996, 271:1728-30).

A título de ejemplo de determinantes de superficie cuya aplicación o desaparición (o la presencia o la ausencia) se puede medir, se pueden mencionar CD4, CD28, CD69, CTLA-4, CD45-RA, CD45-RO, CD62-L.

La detección de los determinantes de superficie puede llevarse a cabo mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia, en particular por medio de citometría de flujo, después del marcado de las moléculas a detectar por medio de sondas fluorescentes, por ejemplo de anticuerpos fluorescentes.

A título de respuesta biológica, es posible asimismo medir el índice de proliferación (o de estimulación) de los linfocitos T-auxiliares después de la puesta en contacto, in vitro, con uno o varios péptidos de acuerdo con la invención, o unos análogos funcionales de éstos.

La medición de la proliferación (o de la estimulación) puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la medición de la incorporación de la [^{3}H]-timidina (tal como se describe en la parte experimental de la presente memoria) o mediante el método de la dilución de una sonda fluorescente, tal como se describe en la solicitud WO 04/050909, o por Lyons, (J. Immunol. Methods, 2000, 243:147-154) o Givan et al., (J. Immunol. Methods, 1999, 230:99-112).

La presente invención se refiere asimismo a un método de diagnóstico que permite determinar el estado inmunitario de un sujeto susceptible de presentar una infección por un virus de la inmunodeficiencia humana, que comprende por lo menos la etapa que consiste en cuantificar, in vitro, en una población de linfocitos aislados de dicho sujeto, unos linfocitos susceptibles de ser activados mediante la puesta en contacto con un complejo que contiene una molécula HLA-DR1 y un péptido de acuerdo con la invención, o unos análogos funcionales de éste.

Esta cuantificación puede llevarse a cabo con o sin etapa previa de estimulación de las células linfocitos aislados del sujeto.

Así, después de la extracción de los linfocitos T en un sujeto, la detección puede llevarse a cabo a continuación, por ejemplo, mediante citometría de flujo, con la ayuda de anticuerpos marcados por una sonda fluorescente y específicos de este receptor.

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Según otra variante, es posible detectar estos linfocitos T-auxiliares por medio de un tetrámero, por ejemplo, tal como se ha descrito anteriormente, marcado por una sonda fluorescente, por ejemplo, según el protocolo descrito por Novak et al., J. Clin. Invest., 1999, 104:R63-R67 o por Cochran et al., Immunity, 2000, 12: 241-250.

La presente invención se refiere asimismo a un kit de diagnóstico que permite, en particular, llevar a cabo los métodos descritos anteriormente y que comprende por lo menos un péptido de acuerdo con la presente invención, o unos análogos funcionales de éste.

La presente invención se refiere asimismo a un kit de diagnóstico que permite, en particular, la realización de los métodos descritos anteriormente, y que comprende por lo menos un tetrámero tal como se ha definido anteriormente.

La invención descrita en la presente memoria es susceptible de variaciones y de modificaciones. La invención incluye estas variaciones y modificaciones.

La invención se pondrá más claramente de manifiesto a partir de la lectura de los siguientes ejemplos. Éstos, sin embargo, no se deben interpretar como limitativos del alcance de la invención.

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Leyenda de las figuras

Figura 1: Se representa en esta figura el índice de estimulación de linfocitos T CD4+ procedentes de ratones transgénicos HLA-DR1, invalidados H-2 - clase II (IA\beta^{bo}) e inmunizados mediante la proteína p24 del VIH. Las células T CD4+ han sido reestimuladas in vitro por unos blastos activados por LPS y cargadas con péptido Gag_{291-310}, Gag_{301-320}, Gag_{321-340}, Gag_{331-350} y RT_{171-190} como péptido de control. El índice de estimulación representa la relación de la radioactividad medida después de la incorporación de [^{3}H]-timidina por los linfocitos T, en presencia de péptidos específicos, sobre la radioactividad medida por la incorporación de la [^{3}H]-timidina por los linfocitos T, en presencia del péptido de control.

Figura 2: Se representan en esta figura los índices de estimulación de linfocitos CD4+ aislados de pacientes HLA-DR1 seronegativos e iniciados por unas células dendríticas cargadas con el antígeno p24 del VIH-1 (Figura 2A) o del VIH-1 MN inactivado por el aldritiol-2 (MNAT2) (Figura 2B). Las células han sido estimuladas a continuación por el péptido Gag_{331-350} o el péptido de control SM 28GST_{190-211}.

Figura 3: Tabla 1: Se representan en esta tabla las secuencias de los epítopos Gag_{301-320}, Gag_{321-340}, Gag_{331-350}, y Gag_{291-310}, así como su frecuencia en los virus VIH-1 del grupo B.

Tabla 2: Se representan en esta tabla el número de ratones que responden a los epítopos Gag_{301-320}, Gag_{321-340}, Gag_{331-350}, y Gag_{291-310}, así como la intensidad de las respuestas de proliferación observadas.

Figura 4: Tabla 3: Se representan en esta tabla las respuestas de secreción de la IFN-\gamma\gamma por unas células T CD4+ aisladas de pacientes HLA-DR1 infectados por el VIH-1. Las respuestas de las células T CD4+ humanas específicas del VIH-1 han sido evaluadas por un ensayo ELISPOT tal como se describe en la sección "Materiales y métodos". Las respuestas han sido evaluadas con y sin eliminación de las células T CD8+. Los péptidos utilizados para estimular las PBMC eran o bien un conjunto de péptidos solapantes de 15 aminoácidos de longitud (conjunto de 11 péptidos consecutivos), o bien un péptido de 20 aminoácidos de longitud.

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Materiales y métodos Análisis de secuencia

La proteína Gag del VIH-1 ha sido analizada con la ayuda del programa TEPITOPE (Hammer et al., Adv. Immunol., 1997, 66:67-100) para buscar la presencia de secuencias peptídicas de 20 aminoácidos de longitud que contienen un motivo de unión a la molécula HLA-DR1. El umbral de predicción se fijó a 4%.

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Síntesis de péptido

Unos péptidos solapantes de 15 a 20 meros que cubren el conjunto de la molécula Gag han sido sintetizados y suministrados por el Instituto Nacional de la Salud Americana (National Institute of Health-NIH USA). Los péptidos han sido puestos en disolución a razón de 1 mg/ml en un tampón PBS (Phosphate Buffered Saline) que contiene 10% de DMSO.

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Ratón transgénico

Se han utilizado durante diferentes experimentos unos ratones transgénicos HLA-DR1, e invalidados H-2 de clase II (IA\beta^{bo}), cuya línea ha sido previamente establecida por Pajot et al., (Int. Immunol., 2004, 16:1275-1282).

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Ensayos de inmunización y de proliferación

La proteína recombinante p24 del VIH-1 utilizada durante diferentes experimentos ha sido obtenida en AB-CYSS (Paris, Francia).

Los ratones anestesiados con 75 mg/kg de pentobarbital (Ceva, Santé Animale, Libourne, Francia) han recibido 4 \mug de proteínas recombinantes asociadas a un adyuvante alumbre.

Doce días después de la última inmunización, los esplenocitos, separados de los glóbulos rojos mediante purificación sobre Ficoll (5.10^{6} células/25 cm^{2} de frasco de cultivo (TECHNO PLASTIC PRODUCT, TPP, Trasadingen, Suiza)) han sido co-cultivados en presencia de células blásticas activadas por LPS (5.10^{6} células/frasco de cultivo), cargadas con péptidos (20 \mum/ml) e irradiadas por unos rayos \gamma (180 Gy), en medio RPMI complementado con 10% de SVF (suero de ternera fetal), HEPES 10 mM, 1 mM de piruvato de sodio, 5.10^{-5} M de mercapto-2-etanol, 100 U.I./ml de penicilina y 100 \mug de estreptomicina, tal como se describe en Loirat et al, (Journal of Immunology, 2000, 165:4748-4755).

Las células blásticas han sido cargadas respectivamente con uno de los péptidos de ensayo Gag_{301-320}, Gag_{321-340}, Gag_{331-350}, o con un péptido de control negativo derivado de un antígeno del VIH, el péptido RT_{171-190}, o con un péptido de control positivo derivado del antígeno p24 del VIH, el péptido Gag_{291-310}.

Después de siete días de cultivo, los ensayos de proliferación han sido llevados a cabo después de la distribución de 5.10^{-5} células/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano de las células (obtenidas de TTP), en presencia de células blásticas estimuladas por LPS, irradiadas y cargadas con péptidos (a razón de 2.10^{5} células/pocillo). Los ensayos de proliferación han sido llevados a cabo en un periodo de 72 horas, en medio RPMI completo complementado con 3% de SVF.

Las células han sido incubadas durante las 16 últimas horas, con 1 \muCi de [^{3}H]-timidina por pocillo antes de ser recuperadas sobre filtros con un colector TOMTEC (Perkin Elmer Applied Biosystem). La radioactividad incorporada ha sido medida con la ayuda de un contador micro-\beta (Perkin Elmer Applied Biosystem).

Los resultados se expresan como índice de estimulación (IS) igual a la relación de cpm medidas después de la incubación con los péptidos ensayados sobre las cpm medidas después de la incubación con el péptido de control.

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Estudio sobre población

Los individuos seronegativos para el VIH-1 han sido seleccionados con respecto a su perfil HLA-DE1.

Los individuos infectados por el VIH-1 han sido seleccionados de entre la cohorte francesa ALT y seleccionados con respecto a su perfil HLA-DR1. La condición de no-progresor a largo plazo de estos pacientes se definió como una infección con VIH asintomático durante por lo menos 8 años, con un recuento de células T CD4+ estable a un nivel superior o igual a 600 células/mm^{3}, y sin ninguna terapia anti-retroviral (Candotti et al., J. Med. Virol., 1999, 58: 256-63).

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Ensayo ELISPOT

La respuesta de las células T CD4+ humanas específicas para el VIH-1 frente a diferentes péptidos ha sido cuantificada mediante el ensayo ELISPOT sobre unas células mononucleadas de la sangre periférica (PBMC: Peripheral blood mononuclear cells) congeladas, tal como se ha descrito anteriormente (Forsthubert et al., Science, 1996, 271:1728-30).

Unas placas de 96 pocillos ELISPOT (Millipore, Molsheim, Francia) han sido recubiertas por un anticuerpo dirigido contra la IFN-\gamma\gamma humana (IgG1/B-B1, Diaclone, Estrasburgo, Francia).

Después de una etapa de bloqueo en presencia de un medio que contiene 10% de SVF, 1.10^{5} PBMC han sido distribuidas en los pocillos. El experimento ha sido realizado por triplicado. Las células han sido cultivadas durante la noche tras su descongelación. Después, las placas han sido incubadas a 35ºC durante 18 horas en presencia de 2 \mug/ml de péptidos derivados de la proteína Gag de VIH-1 (péptido solapante de 15-mero o 20-mero; véase la tabla 3).

La fitohemaglutinina (Murex, Paris, Francia, 1 \mug/nl) y el medio solo han sido respectivamente utilizados como control positivo y negativo.

Los pocillos han sido lavados a continuación y las manchas han sido detectadas después de la adición del anticuerpo de detección dirigido contra la IFN-\gamma\gamma humana y marcado con biotina (B-G1-Diaclone) (4 horas, 37ºC), seguida por la adición de la fosfatasa alcalina fijada sobre la estreptavidina (1 hora, 37ºC) y del sustrato (5-bromo-4-3-indolil-fosfato/4-nitroblutetrazolio; Sigma, Saint-Quentin Falavier, Francia). La incubación se ha mantenido a temperatura ambiente, hasta la aparición de los puntos azules. La frecuencia de las células que forman estos puntos (SFC) específicos de los antígenos se ha medido con la ayuda de un sistema de microscopía automatizada (ZEISS, Munich, Alemania) y contada como positiva si se detectaba un mínimo de 50 SFC/1.10^{6} de PBMC por encima del ruido de fondo. Los ensayos ELISPOT han sido repetidos después de la eliminación de las células T CD8+ con la ayuda de bolas magnéticas anti-CD8 (Dynabeads CD8, Dynal). El hecho de que más de 99,8% de las células CD8+ estaban eliminadas de las PBMC, se ha podido verificar mediante citometría de flujo (EPICS, XL COULTER).

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Preparación de las células dendríticas (DC) y carga con antígenos

Las células dendríticas han sido preparadas a partir de las PBMC tal como se han descrito anteriormente por Brossart et al., (Blood, 1998, 92:4238-47). Las PBMC han sido aisladas a partir de la sangre de donantes sanos HLA-DRB1*01+ mediante centrifugación sobre gradiente Ficoll-Hypaque.

Las PBMC han sido cultivadas en placas de 6 pocillos (10-15.10^{6} células/pocillo) y se han dejado adherir durante 1 hora a 37ºC. Las células no adherentes han sido eliminadas y los monocitos adherentes han sido cultivados en RPMI que contiene 10% de SVF, penicilina/estreptomicina (50 unidades/ml - 50 \mug/ml), Hepes 10 mM, glutamina 10 mM, IL-4 1.000 unidades/ml (R&D, Francia) y GM-CSF 500 unidades/ml (Leucomax, Aventis, Francia). Las DC de la preparación presentaban un fenotipo de células inmaduras: CD1a^{+}, CD4^{+}, CD14^{-}, CD83^{+} low, CD86^{+} low, HLA-DR^{+}, DC-SIGN^{+}. A continuación, las DC han sido congeladas (en PBS que contiene 4% de albúmina humana, LFB, Francia) o cargadas con unos antígenos.

Las DC han sido cargadas con la proteína p24 recombinante de VIH (10 g/ml, Sigma, Francia) o VIH-1 MN inactivado por aldritiol-2 (AT-2) (1.000 ng de p24/ml) con los agentes de maduración Ribomunyl® (1 \mug/ml) e IFN-\gamma\gamma (500 unidades/ml) durante dos horas a 37ºC.

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Cebado de las células T

Las células T CD4+ han sido aisladas a partir de la fracción no adherente de las PBMC, mediante eliminación negativa utilizando las bolas magnéticas (Miltenyi Biotec, Francia). Se han conservado congeladas, y se han descongelado a continuación antes de la estimulación de las células T.

Las células T CD4+ purificadas han sido incubadas en presencia de DC autólogas maduras, irradiadas (5.000 rad) y cargadas con antígenos (en una relación de 5/1), así como en presencia de células B autólogas irradiadas (5.000 rad) (en una relación de 1/2) en medio RPMI que contiene 10% de suero humano (Instituto Jacques BOY, Francia), que contiene unos aminoácidos no esenciales (GIBCO, Francia), piruvato de sodio (GIBCO, Francia) 1 mM, 10 mM de Hepes, 10 mM de glutamina.

Se añadió rhIL-2, en una cantidad de 100 unidades/ml (Proleukin, Chiron, Francia) 5 días después de la estimulación.

Diez días después de la estimulación, los cultivos de células T han sido reestimulados con DC irradiadas, en una relación de 1/20, cargadas con el péptido Gag_{331-350} o el péptido de control SM 28GST_{190-211} (epítopo 190 a 211 del antígeno de Schistosoma mansoni 28 kDa glutatión S-transferasa) así como en presencia de células nutritivas autólogas según una relación de 1/5.

Los cultivos de células T CD4+ han sido reestimulados a continuación cada 10-15 días con unas células B autólogas transformadas con EBV (Epstein-Barr Virus, células B-EVB) irradiadas y cargadas con péptidos, según una relación de 1/2, y con PBMC alogénicas irradiadas, según una relación de 1/4.

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Ensayo de proliferación de las células T humanas

Las células T en cultivo han sido puestas en contacto con el péptido Gag_{331-350} o el péptido SM 28GST_{190-211} a razón de 50 \mug/ml durante 3 horas a 37ºC, y después se han distribuido en unas placas de 96 pocillos de fondo plano (5-10^{5} células/pocillo). Las células han sido cultivadas en medio para célula T en ausencia de rhIL-2 durante 3 días antes de ser pulsadas con 1 \muCi [^{3}H]-timidina durante 20 horas.

Las células han sido recuperadas sobre unos filtros utilizando un colector TOMTEC (Perkin Elmer Applied Biosystem), y la radioactividad incorporada ha sido medida con la ayuda de un contador micro-\beta (Perkin Elmer Applied Biosystem).

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Los resultados se expresan en forma de un índice de estimulación (SI) que representa la relación entre las cpm medidas después de la incubación con el péptido ensayado y las cpm medidas después de la incubación con el péptido de control.

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Ejemplo I Identificación y antigenicidad de nuevos epítopos HLA-DR1 en unos ratones transgénicos HLA-DR1

Para identificar nuevos péptidos que tienen una especificidad HLA-DR1, la secuencia de aminoácidos de la proteína Gag ha sido escaneada para buscar motivos específicos HLA-DR1 con la ayuda del algoritmo TEPITOPE.

Se han seleccionado unos péptidos de 20 aminoácidos que contienen una región núcleo de 9 aminoácidos que comprende un motivo HLA-DR1 y unos aminoácidos N y C-terminales suplementarios, entre los cuales se encuentran tres nuevos péptidos Gag_{301-320}, Gag_{321-340}, Gag_{331-350} y un péptido conocido Gag_{291-310} (lyasere et al., J. Virol., 2003, 77:10900-9) (Tabla 1). La tabla 1 indica asimismo la frecuencia según la cual las secuencias identificadas están presentes en la cepa VIH-1 del grupo B. Esta frecuencia, que traduce el porcentaje de conservación, se determina sobre el número de cepa VIH que presenta la misma secuencia en aminoácidos que pertenecen al grupo B (VIH databases, Los Alamos National Library and National Institutes of Health, http://hiv-web.lani.gov/cgi-bin/EPILIGN/epilign.cgi).

Para evaluar la inmunogenicidad de los epítopos restringidos HLA-DR1, Gag_{301-320}, Gag_{321-340} y Gag_{331-350}, los ratones transgénicos HLA-DR1 e invalidados H-2 clase II han sido inmunizados con la proteína p24 del VIH. A continuación, las células T procedentes del bazo han sido reestimuladas in vitro con los péptidos a ensayar o un péptido de control positivo Gag_{291-310}, o un péptido de control negativo RT_{171-190}.

La figura 1 muestra que los ratones transgénicos HLA-DR1 e invalidados H-2 clase II son capaces de desarrollar una respuesta celular proliferativa contra unos péptidos restringidos HLA-DR1 Gag_{291-310}, identificados anteriormente por lyasere et al. (J. Virol., 2003, 77: 10900-9) como un péptido inmunodominante restringido HLA-DR1 capaz de inducir una respuesta en unas células T CD4+ aisladas de individuo HLA-DR1 infectado por el VIH, así como contra los péptidos Gag_{301-320}, Gag_{321-340} y Gag_{331-350}.

Ninguna respuesta ha podido ser inducida en las células T CD4+ estimuladas mediante el péptido de control derivado del antígeno RT del VIH-1.

La tabla 2 muestra que dos ratones transgénicos HLA-DR1 e invalidados H-2 clase II de 11 responden a los péptidos Gag_{301-320}, 4 ratones de 11 responden a los péptidos Gag_{321-340}, y 3 ratones de 11 responden a los péptidos Gag_{331-350} con un índice de estimulación comprendido entre 2 y 3.

Además, un recuerdo suplementario in vitro con estos péptidos permite aumentar el índice de proliferación de 3 a 5, confirmando así la especificidad de la respuesta.

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Ejemplo II Reconocimiento de los epítopos Gag_{321-340} y Gag_{331-350} de p24 VIH-1 por unos pacientes HLA-DR1+ infectados por el VIH

El reconocimiento de los epítopos identificados por unas células CD4+ aisladas de pacientes HLA-DR1+ infectados por el VIH ha sido evaluado usando el ensayo ELISPOT. Unas PBMC han sido aisladas en un grupo de pacientes que responden todos al antígeno entero p24 y/o a un conjunto de péptidos solapantes de 15 meros que recubren la proteína p24 (Tabla 3).

Así, tal como lo muestra la tabla 3, el epítopo Gag_{291-310}, descrito anteriormente como un epítopo HLA-DR1, es capaz de estimular las células T CD4+ en el paciente 11.020/4, y de inducir una respuesta positiva y no alterada después de la eliminación de las células CD8+.

El péptido Gag_{331-350} es reconocido por las células T CD4+ del paciente 5.002/1 tanto como el conjunto de los péptidos de 15 meros que comprenden el epítopo Gag_{331-350}.

El péptido Gag_{321-340} induce una respuesta en el límite del umbral de detección por las células T CD4+ en el paciente 9.002/1, que reconocen asimismo el conjunto de los péptidos con el mismo orden de tamaño.

Así, los dos nuevos epítopos restringidos HLA-DR1, Gag_{321-340} y Gag_{331-350}, que son inmunogénicos en el ratón transgénico HLA-DR1, invalidados H-2 clase II, pueden inducir asimismo una respuesta en unos pacientes HLA-DR1 infectados por el VIH.

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Ejemplo III Estimulación de células CD4+ aisladas de un individuo HLA-DR1 seronegativo por el epítopo Gag_{331-350}

Las PBMC de un individuo HLA-DR1 (individuo BRE) seronegativo VIH-1 han sido aisladas y cebadas, in vitro, con unas DC autólogas (cargadas con la proteína p24 del VIH o el virus entero MN inactivado por aldritiol-2 (MNAT2) y las células T CD4+ han sido separadas de las demás células y puestas en cultivo.

Las células T CD4+ han sido cultivadas a continuación in vitro durante 2 semanas en presencia de células presentadoras de antígenos, las células B-EBV autólogas irradiadas y cargadas con la ayuda del péptido p24 de VIH o del virus MNAT2.

Las células T CD4+ han sido ensayadas a continuación frente a una respuesta proliferativa específica inducida por el péptido Gag_{331-350} o el péptido de control SM 28GST_{190-211}.

Después de tres días de incubación con el antígeno, se ha medido la incorporación de [^{3}H]-timidina. Un índice de estimulación superior a 2 se consideró como significativo.

Así, tal como lo muestra la figura 2, las células T CD4+ del individuo BRE han proliferado en respuesta al péptido Gag_{331-350}, pero no se ha observado ninguna respuesta en presencia del péptido de control SM 28GST_{190-211} o del medio solo. El índice de estimulación es igual a 10.

Así, el epítopo Gag_{331-350}, asimismo inmunogénico en los ratones transgénicos HLA-DR1 e invalidado H-2 clase II es capaz de iniciar una respuesta de células T CD4+ en un donante HLA-DR1 seronegativo VIH-1.

Claims (13)

1. Péptido que comprende un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3, estando dicho péptido asociado a un complejo biotinilado compuesto por una cadena \alpha (DR\alpha) y una cadena \beta (DR\beta) de un HLA de tipo II, por un brazo espaciador, y por estreptavidina para formar un tetrámero de clase II.

2. Anticuerpo capaz de enlazar específicamente un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3 o un complejo que comprende dicho epítopo y una molécula HLA-DR1.

3. Utilización de por lo menos un péptido que comprende por lo menos un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3 y/o un ácido nucleico que codifica para dicha secuencia, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención y/o al tratamiento de una infección por un virus de la inmunodeficiencia humana en unos pacientes de fenotipo HLA-DR1.

4. Utilización según la reivindicación anterior, en la que el péptido y/o el ácido nucleico está asociado a un vehículo seleccionado de entre un liposoma, un exosoma, y una célula presentadora de antígeno que contiene en la superficie unas moléculas HLA-DR1.

5. Utilización según la reivindicación anterior, en la que la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica o un macrófago.

6. Célula presentadora de antígeno aislada, que contiene en la superficie unas moléculas HLA-DR1, asociadas a por lo menos un péptido que comprende por lo menos un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3 y/o un ácido nucleico que codifica para dicha secuencia.

7. Clon de linfocito T-auxiliar aislado, que comprende un receptor que reconoce específicamente un complejo que contiene una molécula HLA-DR1 y un péptido que comprende un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3.

8. Método de diagnóstico para determinar el estado inmunitario de un individuo susceptible de presentar una infección por un virus de la inmunodeficiencia humana que comprende por lo menos unas etapas que consisten en:

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poner en contacto in vitro unos linfocitos T-auxiliares aislados de dicho individuo con por lo menos un péptido que comprende por lo menos un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3, y

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evaluar una respuesta biológica.

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9. Método según la reivindicación anterior, en el que la respuesta biológica se selecciona de entre la proliferación, la secreción de moléculas biológicas, la aparición y/o la desaparición de moléculas asociadas a dichas células y una combinación de estas respuestas.

10. Método de diagnóstico para determinar el estado inmunitario de un individuo susceptible de presentar una infección por un virus de la inmunodeficiencia humana que comprende por lo menos la etapa que consiste en cuantificar, in vitro, unos linfocitos aislados de dicho individuo susceptibles de ser activados mediante la puesta en contacto con un complejo que contiene una molécula HLA-DR1 y un péptido que comprende un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3.

11. Método según la reivindicación anterior, en el que la etapa de cuantificación comprende la utilización de tetrámeros tales como los definidos según la reivindicación 1.

12. Kit de diagnóstico que comprende por lo menos un péptido que comprende por lo menos un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, y SEC ID nº 3.

13. Kit de diagnóstico que comprende por lo menos un tetrámero tal como el definido según la reivindicación 1.