CN109312368B - 用于产生衍生自真菌工程化宿主的复合聚糖的手段和方法 - Google Patents

用于产生衍生自真菌工程化宿主的复合聚糖的手段和方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及糖工程化领域，更具体地涉及糖基化工程化的真菌细胞，更具体地涉及糖基化工程化的酵母细胞，其被优化以在重组蛋白上产生高度同源形式的复合N‑聚糖。本发明特别涉及获得包含重组糖蛋白的药物组合物的方法，所述重组糖蛋白具有同源形式的复合N‑聚糖。此外，本发明涉及由本发明方法产生的新型药物组合物。

Description

用于产生衍生自真菌工程化宿主的复合聚糖的手段和方法
发明领域
本申请涉及糖工程领域，更具体地涉及糖基化工程化的真菌细胞，更具体地涉及糖基化工程化的酵母细胞，其被优化以在重组蛋白上产生高度同源形式的复合N-聚糖。本发明具体涉及获得包含重组糖蛋白的药物组合物的方法，所述重组糖蛋白具有同源形式的复合N-聚糖。此外，本发明涉及由本发明方法产生的新型药物组合物。
背景
CHO细胞系是用于生物药物选择的表达系统，并且例如用于制备像Rituxan、Humira和Enbrel的重磅炸弹单克隆抗体。然而，CHO细胞系中的制造成本极高，如果想要以较低的成本制造能承受的药物，则需要转向替代的宿主生物体。糖基化工程化的真菌生物体，例如巴斯德毕赤酵母，能够产生具有复合的N-糖基化结构的重组糖蛋白，但是需要进一步工程化真菌生物体的糖基化能力。实际上，重组蛋白上存在酵母样糖的重要背景。虽然最近描述了一种新的完整巴斯德毕赤酵母OCH1敲除，其主要用Man8GlcNAc2N-聚糖修饰其糖蛋白(Krainer FW等人(2013)Sci Rep 3：3279)，但当在该突变菌株中产生重组糖蛋白时仍有相当数量的酵母型高甘露糖糖修饰背景存在。在早期关于OCH1敲除菌株的报道中进行了类似的观察(Davidson RC等人(2004)Glycobiology 14(5)：399)。在后一项研究中，背景主要归因于磷酸甘露糖基化，并归因于在基因组中存在仍然未知的甘露糖基转移酶。在本申请中，在复合的糖工程化巴斯德毕赤酵母菌株中产生了不同的IL-22复合糖型。尽管进行了广泛的糖工程化，还观察到在生成的糖型中仍然存在相当大的、高度异质的背景。尽管异质性的一部分源自样品中未完全加工成复合型N-聚糖的中间体，但发现相当多的N-聚糖部分是由一系列其他寡甘露糖和高甘露糖型N-聚糖组成。尽管由于敲入构建体的不稳定性，存在菌株中的一小部分细胞可能恢复为野生型OCH1的可能性，但更可能的是其他内源糖基转移酶是有责任的。相信仍未表征的糖基转移酶可能与巴斯德毕赤酵母中的Och1p具有相似的活性，并导致糖型的异质性，即使在复合的糖工程菌株中也是如此。
除此之外，在本申请中，我们还表征了在OCH1突变的毕赤酵母菌株中产生的人IL-22上的新型神经聚糖，其包含Man5GlcNAc2N-聚糖，具有非常出乎意料的结构的四糖修饰。该四糖(Glcα1-2Manβ1-2Manβ1-3Glucα-)取代最可能附接在甘露糖基核心的最内侧α-1,3臂上。还在糖工程化的鼠IL-22上观察到类似的N-聚糖(数据未示出)。因为鉴定的结构含有β-1,2-甘露糖残基，即白色念珠菌(C.albicans)的已描述的免疫原性表位，所以这种N-聚糖的存在会阻碍治疗用途的可能性。这种特定的N-聚糖在其结构上偏离先前描述的新糖型(Gomathinayagam S.等人(2011).Glycobiology.21(12)：1606-15)，表明对N-糖基化途径和内源糖基转移酶的理解仍然有限。此外，还不清楚为什么某些糖蛋白倾向于进一步修饰，而其他糖蛋白则不然。
尽管巴斯德毕赤酵母的基因组序列是可获得的，但是不知道哪种糖基转移酶负责产生这种特定的新糖型。因此，特定的额外内源糖基转移酶的敲除不是直截了当的。尽管进一步的工程化可以部分地解决被竞争胜出的内源糖基转移酶的替代，但在工程化的后期阶段，很可能会再次出现许多中间体，包括杂合N-聚糖，Man5GlcNAc2以及结构难以用现有技术来确定的寡甘露糖背景。此外，即使在高度糖工程化的菌株中，也可能在重组糖蛋白上形成新糖型。预防或补救新糖型形成的唯一方法是表征所有潜在的糖基转移酶/糖苷酶，并且如果它们可能显示出一些不希望的活性，则敲除这些酶。后者将是一种不切实际的方法，即使这样，新糖型形成的影响也是不可预测的。由于背景、重新出现的中间体和新糖型形成的可能性，显然需要设计策略，其允许从存在于糖工程化真菌生物中产生的糖蛋白上的复合N-聚糖中去除剩余的真菌型糖基化背景。
发明概述
到目前为止，复合的糖工程化真菌细胞系统的使用主要集中在详尽的工程化过程，而不是在生产糖蛋白后进行酶处理(例如使用特定的糖苷酶)以去除背景，因为目的是保留N-聚糖并且不使糖蛋白去糖基化。为了去除在巴斯德毕赤酵母的复合N-聚糖工程化菌株中产生的糖蛋白的背景，使用里氏木霉(T.reesei)内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶EndoT测试其整合体外酶促去糖基化。已显示重组EndoT能够释放人类高尔基体型寡甘露糖N-聚糖，但人类复合N-聚糖不是该酶的底物(参见Stals I.等人(2012)PLOS One 7(7)e40854)。然而，尚不清楚许多不同类型的酵母N-聚糖，包括由OCH1突变引发的一些糖型，是否是合格的底物并形成新糖型。令人惊讶的是，EndoT在这项任务中表现非常好，因为超过90％的背景由杂合N-聚糖，酵母高甘露糖N-聚糖和意外的新糖型组成，该新糖型在治疗后消失，而可以保留糖蛋白的生物活性。
此外，发现体外反应与纯化过程中硫酸铵级分中存在的高盐浓度相容，并且令人惊讶的是该反应可在4℃下进行。由于观察到EndoT能够在这些不利条件下工作，因此它扩展了其适用性。
使用复合的N-糖基化糖工程化毕赤酵母菌株，在糖蛋白上产生优势的人类复合型N-糖型，结合体外内切氨基葡糖苷酶清除步骤去除不需要的背景，提供了制造复合型N-聚糖的高纯度的定制化的N-糖型的强大工具。
因此，当在复合的N-糖基化工程化真菌生物体中产生的重组糖蛋白具有一个功能性N-糖基化受体位点时，当从培养基中纯化该重组糖蛋白并与适量的内切氨基葡糖苷酶外源接触时，产生多种糖型。这些糖型的产生是因为在复合的N-糖基化工程化的真菌生物体中形成了多种N-聚糖：i)杂合N-聚糖，ii)高甘露糖型N-聚糖，iii)不可预测的N-聚糖新糖型(参见下文实施例部分)和iv)如特定复合N-糖基化工程化真菌生物体所预期的期望的复合N-聚糖。与内切氨基葡糖苷酶接触(例如外源施用并添加到培养基中，或在纯化条件下添加或在重组糖蛋白纯化后添加)将消除超过90％的杂合N-聚糖和高甘露糖型N-聚糖并且还消除了不可预测的N-新糖型，这将导致由单个GlcNAc聚糖结构组成的N-聚糖的形成。注意，具有单个GlcNAc聚糖的糖型将不会通过实施例2和3中概述的方法可视化(或不能确定)，而只能通过质谱分析方法检测。得到的复合N-聚糖在与内切氨基葡糖苷酶接触时不会被消化。结果，将获得重组糖蛋白的“多个糖型”(通过可视化复合N-糖基化工程化真菌生物体中产生的重组糖蛋白上存在的所有N-聚糖的总量来估计)。因此，多个是指复合类型的N-聚糖，由单个GlcNAc组成的N-聚糖，以及小于20％，优选小于15％，小于10％，小于5％或甚至小于1％的杂合型N-聚糖或高甘露糖型N-聚糖或N-聚糖新糖型。
WO2010/015722描述了内切氨基葡糖苷酶、哺乳动物糖基转移酶和异源糖蛋白的共表达。在后一种工程化细胞系统中，内切葡糖苷酶靶向高尔基体中的特定区室。当后一种系统应用于包含外源糖蛋白的真菌时，则产生包含由单一GlcNAc组成的N-聚糖的重组糖蛋白。后者与本发明的方法形成对比，本发明的方法在体外应用并且其中复合的糖工程化真菌细胞不共表达内切氨基葡糖苷酶，并且其中产生具有复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖的混合物的重组糖蛋白。为了进一步澄清这一点，甚至当在复合的糖工程化真菌生物体中产生仅具有一个N-糖基化受体位点的糖蛋白时，并且在生产之后，所得糖蛋白随后用内切氨基葡糖苷酶在体外处理(或接触)，然后存在于所得糖蛋白上的糖型是由复合N-聚糖和由单一GlcNAc组成的N-聚糖的混合物组成。当具有两个N-糖基化受体位点的糖蛋白在复合的糖工程化真菌生物体中产生时，在生产后，所得糖蛋白随后在体外用内切氨基葡糖苷酶处理(或接触)，然后存在于单个糖蛋白上的N-糖基化位点可以由i)一种复合N-聚糖和另一种单一GlcNAc组成，或ii)两者可以是单一GlcNAc或iii)两者都可以是复合N-聚糖。
内切氨基葡糖苷酶如EndoH通常用于使糖蛋白去糖基化，作为SDS-PAGE凝胶分析物的一部分，类似于PNGaseF消化。然而，后者的消化是在变性蛋白质上进行的，以确定SDS-PAGE上的N-糖基化谱，目的是使蛋白质去糖基化。类似地，对于结晶学目的，糖蛋白也经常去糖基化。然而，消化必须在不变性的情况下进行，或者必须进行复性/重折叠步骤以确定蛋白质结构。为了进一步将所获得的糖蛋白用于药物用途，使用内切氨基葡糖苷酶作为体外清除工具(发酵后，例如在纯化过程中或纯化后)，尚未在本领域中进行研究。迄今尚未报道在复合的糖工程化酵母平台上的内切葡糖苷酶清除，产生具有复合N-聚糖的糖蛋白，并且用内切氨基葡糖苷酶的体外温育步骤甚至被认为是违反直觉的。
附图简述
图1.在4℃下溶解的Gal2Gn2M3IL-22WT硫酸铵级分的EndoT剂量剂量发现。将硫酸铵沉淀的级分溶解，并在4℃下用增加量的重组EndoT过夜消化等量的总蛋白质(μg/mg总蛋白质)。对照补充有等体积的25mM MES pH5.5但没有EndoT。示出了提出的N-聚糖结构。上图(葡聚糖)和下图是葡聚糖参考标准，和来自RNAseB的Man5GlcNAc2(M5-9)参照N-聚糖。图例中的符号未考虑核心Man1GlcNAc2N-聚糖的单糖。*代表未鉴定的N-聚糖。
图2.在4℃下溶解的Gal2Gn2M3IL-22N21硫酸铵级分的EndoT剂量发现。溶解硫酸铵沉淀的级分，并在4℃下用增加量的重组EndoT(μg EndoT/mg总蛋白)过夜消化等量的总蛋白质。对照补充有等体积的25mM MES pH5.5但没有EndoT。示出了提出的N-聚糖结构。上图(葡聚糖)和下图是葡聚糖参考标准，和来自RNAseB的Man5GlcNAc2(M5-9)参照N-聚糖。图例中的符号未考虑核心Man1GlcNAc2N-聚糖的单糖。*标志着未鉴定的N-聚糖。
图3.刀豆(Jack Bean)α-甘露糖苷酶消化显示残留背景。从预先在4℃用EndoT消化的Gal2Gn2M3IL-22WT样品的硫酸铵级分释放的APTS标记的N-聚糖(以μg EndoT/mg表示)与刀豆α-甘露糖苷酶一起短暂温育。对照样品既不用EndoT消化也不用α-甘露糖苷酶消化并反映未处理的硫酸铵级分的N-聚糖谱。当用α-甘露糖苷酶消化对照样品的N-聚糖时，核心Man1GlcNAc2作为寡甘露糖N-聚糖水解的结果出现。上图是葡聚糖参照梯度(Dextran)。图例中的符号未考虑核心Man1GlcNAc2N-聚糖的单糖。
图4.刀豆α-甘露糖苷酶消化显示次要背景。从预先在4℃用EndoT(以μg/mg表示)消化的Gal2Gn2M3IL-22N21样品释放的APTS标记的N-聚糖与刀豆α-甘露糖苷酶一起短暂温育。对照样品既不用EndoT消化也不用α-甘露糖苷酶消化并反映未处理的硫酸铵级分的N-聚糖谱。当用α-甘露糖苷酶消化对照样品的N-聚糖时，核心Man1GlcNAc2表现为寡-甘露糖N-聚糖水解的结果。上图是葡聚糖参照梯度(Dextran)。图例中的符号未考虑核心Man1GlcNAc2N-聚糖的单糖。
图5.EndoT处理的hIL-22WT的SDS-PAGE分析。通过SDS-PAGE分析来自EndoT处理的硫酸铵级分的样品。图a.在4℃下进行的剂量发现(以μg EndoT/mg总蛋白显示)的考马斯染色的凝胶。箭头表示对应于重组EndoT的条带。未糖基化的IL-22WT标记为“0”，携带多达三个N-聚糖的糖型标记为1至3。由寡聚甘露糖背景引起的不清晰的成片条带用星号表示。图b.针对与前一组中相同的样品上的hIL-22的蛋白质印迹。图c.过度曝光清楚地可视化任何剩余的背景，如明显的不清晰的成片条带所证明。指示分子标记(MM)，分子量以kDa表示。
图6.EndoT处理的hIL-22N21的SDS-PAGE分析。通过SDS-PAGE分析来自EndoT处理的Gal2Gn2M3-IL22N21的硫酸铵级分的样品。图a.在4℃下进行的剂量发现实验(以μg/mg总蛋白显示)的考马斯染色凝胶。箭头表示重组EndoT。未糖基化的IL-22标记为“0”，单个N-糖型标记为“1”。潜在的降解用Δ标记。图b.针对与前一组中相同的样品上的hIL-22的蛋白质印迹。分子量标记(MM)以kDa表示。
图7.EntoT处理的hIL-22WT的纯化。将来自Gal2Gn2M3-hIL-22WT的硫酸铵级分掺入0.5μg EndoT/(mg总蛋白)并在4℃下保持过夜，然后在SephadexG25柱(左上)上脱盐。将脱盐的样品加载到Q-Sepharose上并收集流穿液，在柱上留下大量污染物和重组EndoT(右上)。然后在S15来源(左下)的洗脱期间分离IL-22糖型。合并纯的IL-22糖型，并在Superdex75柱(右下)上精制。含有IL-22的级分用灰色表示。黑色实线：280nm处的吸光度(mAU)，灰色线：电导率(mS/cm)，灰色虚线：用于洗脱色谱柱的NaCl梯度(0-100％缓冲液B，未在轴上指示)。
图8.EndoT处理的hIL-22的纯化。在通过SephadexG25柱(左上)脱盐之前，将Gal2Gn2M3hIL-22N21硫酸铵级分掺加1μg EndoT/(mg总蛋白)。将脱盐的样品加载到Q-Sepharose上并收集流穿液。包括重组EndoT的大量污染物保留在柱上，直到它们用1M NaCl洗脱(右上)。然后在S15来源(左下)的洗脱期间分离IL-22糖型。合并纯的IL-22糖型，并在Superdex75柱(右下)上精制。含有IL-22的级分用灰色表示。黑色实线：280nm处的吸光度(mAU)，灰色线：电导率(以mS/cm计)，灰色虚线：用于洗脱柱的梯度(0-100％缓冲液B，未在轴上指示)。
图9.在EndoT处理的hIL-22的纯化过程中的糖型分离。图a.显示了Gal2GlcNAc2hIL-22WT的S15Source洗脱曲线的细节。不同的峰编号为1-3，分别代表携带1-3个N-聚糖的糖型。未糖基化的级分用“0”表示。收集的级分如图所示。黑色实线：280nm处的吸光度(mAU)，灰色线：电导率(单位为mS/cm)，灰色虚线：用于洗脱色谱柱的NaCl-梯度(未在轴上指示)。图b.对S15Source洗脱级分，携带1-3个或不含N-聚糖的糖型的SDS-PAGE分析进行相应编号。与分解产物相关的峰标记为Δ。图c.基于S-Source柱的洗脱，合并样品并在Superdex75柱上精制，产生具有不同糖基化程度的三个高纯度级分(N-糖基化，混合级分和大部分未糖基化的级分)。图d.在还原(+DTT)和非还原条件(-DTT)下比较来自N-糖基化级分的样品。图e.用PNGaseF(<)并且用EndoH(*)差别消化N-糖基化的库，PNGaseF可以去除寡-甘露糖和复合N-聚糖，并且EndoH仅切割寡-甘露糖或杂合N-聚糖而不是复合N-聚糖。具有不同数量的N-聚糖的糖型如前所述(0，1-3和Δ用于分解)。分子量标记(MM)，质量以kDa给出。
图10.在EndoT处理的hIL-22N21的纯化过程中的糖型分离。图a.显示了Gal2Gn2M3-hIL-22N21的S15Source洗脱曲线的细节。未糖基化的IL-22N21标记为“0”。单个糖型用“1”注释。假定的分解产物用“Δ”表示。收集的级分如图所示。蓝色线：280nm处的吸光度(mAU)，棕色线：电导率(单位为mS/cm)，绿色线：用于洗脱柱的梯度(未在轴上指示)。图b.对S15Source洗脱级分，携带1个或不含N-聚糖的糖型的SDS-PAGE分析进行相应编号。分解产物标记为“Δ”和“Δ2”。图c.基于S-Source柱的洗脱，合并样品并在Superdex75柱上精制，产生具有不同糖基化程度的三个高纯度级分(N-糖基化，混合级分和大部分未糖基化的级分)。图d.在还原(+DTT)和非还原条件(-DTT)下比较来自大部分N-糖基化级分的样品。图e.用除去寡-甘露糖和复合N-聚糖的PNGaseF(<)差别消化N-糖基化的库并与仅消化寡-甘露糖或杂合N-聚糖但不消化复合N-聚糖的EndoH(*)进行比较。具有不同数量的N-聚糖的糖型如前所述编号(0，1和用于分解的Δ)。分子量标记(MM)，质量以kDa给出。
图11.EndoT处理的hIL-22WT上的对照消化物。图a.来自未处理的含有硫酸铵级分的hIL-22(泳道2和3)或EndoT处理的纯化hIL-22(泳道4和5)的APTS标记的N-聚糖用刀豆α-甘露糖苷酶消化以显示存在的任何寡甘露糖背景(泳道3和5)。当用α-甘露糖苷酶消化对照样品的N-聚糖时，核心Man1GlcNAc2作为寡甘露糖N-聚糖水解的结果出现。图b.在EndoT处理后，来自纯化的hIL-22的APTS标记的N-聚糖上的外切糖苷酶对照消化。未消化的样品显示除了残留的GlcNAc2Man3GlcNAc2之外的代表Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2和次要GalGlcNAc2Man3GlcNAc2异构体的谱中的优势峰(泳道2)。用β-1,4-半乳糖苷酶消化除去了非还原末端的半乳糖残基，仅留下GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖(泳道3)。用β-N-乙酰基己糖胺酶进一步消化除去了末端GlcNAc部分，仅留下三甘露糖基Man3GlcNAc2-核心(泳道4)。用刀豆α-甘露糖苷酶进一步消化，将N-聚糖修剪成核心。对照样品既不用EndoT消化也不用α-甘露糖苷酶消化并反映未处理的硫酸铵级分的N-聚糖谱。上图是葡聚糖参照梯度(Dextran)。下图表示来自RNaseB的参考Man5-9GlcNAc2N-聚糖(M5-9)。*代表未鉴定的N-聚糖。另一个无法解释的信号用“？”标记。图例中的符号没有考虑核心Man1GlcNAc2N-聚糖的单糖。
图12.EndoT处理的hIL-22N21上的对照消化物。图a.来自未处理的含有hIL-22的硫酸铵级分(泳道2和3)或EndoT处理的纯化hIL-22(泳道4和5)的APTS标记的N-聚糖用刀豆α-甘露糖苷酶消化以显示任何寡甘露糖背景的存在(泳道3和5)。图b.来自EndoT处理的纯化hIL-22的APTS标记的N-聚糖上的外切糖苷酶对照消化物。未消化的样品显示除了残留的GlcNAc2Man3GlcNAc2之外，假定代表Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2和次要GalGlcNAc2Man3GlcNAc2异构体的谱中的优势峰(泳道2)。用β-1,4-半乳糖苷酶消化除去了非还原末端的半乳糖残基，仅留下GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖(泳道3)。用β-N-乙酰基己糖胺酶进一步消化除去了末端GlcNAc部分，仅留下三甘露糖基Man3GlcNAc2-核心(泳道4)。用刀豆α-甘露糖苷酶进一步消化将N-聚糖修剪成核心。对照样品既不用EndoT消化也不用α-甘露糖苷酶消化并反映未处理的硫酸铵级分的N-聚糖谱。当用α-甘露糖苷酶消化对照样品的N-聚糖时，核心Man1GlcNAc2作为寡甘露糖N-聚糖水解的结果出现。上图是葡聚糖参照梯度(Dextran)。图例中的符号未考虑核心Man1GlcNAc2N-聚糖的单糖。
图13.Coli-205细胞中IL-22依赖性IL-10分泌。用10倍系列稀释的纯化的Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2-hIL22N21或从大肠杆菌纯化的商业标准品刺激结肠癌Colo-205细胞系过夜。第二天通过ELISA测量IL-10分泌。拟合剂量反应曲线并测定EC50。
图14.EndoT切割N-聚糖新糖型。泳道2显示了使用平板法制备的纯化的Man5GlcNAc2的N-聚糖，显示了预期的Man5GlcNAc2以及Man8-9GlcNAc2N-聚糖。作为N-聚糖工程化过程的结果，后者被鉴定为新结构。当用重组EndoT预处理相同的样品时，当根据平板法制备样品时，我们不再获得任何信号(泳道3)。然而，如果直接标记EndoT消化的样品，则可以分析EndoT释放的N-聚糖(泳道4)。EndoT消化的N-聚糖具有与PNGaseF消化的N-聚糖类似的特征，但缺少还原性GlcNAc残基。泳道5显示直接标记后EndoT的N-聚糖谱。泳道1显示葡聚糖参考标准，泳道6显示来自RNaseB(M5-9)的Man5-9GlcNAc2参照N-聚糖。hIL-22上取代的单糖残基尚未完全表征。因此，类似地描绘了所有单糖成分。
图15.毛细管电泳图谱GlcNAc3Man3GlcNAc2ProDerp1。图1显示了Dextrane标准品。图2显示了纯化的GlcNAc3Man3GlcNAc2ProDerp1的概况。图3显示了RNaseB标准品。
图16.用EndoT处理的GlcNAc3Man3GlcNAc2ProDerp1的毛细管电泳图谱。图1显示了Dextrane标准品。图2显示了用EndoT处理以去除高甘露糖背景的GlcNAc3Man3GlcNAc2ProDerp1的概况。通过进行以下外切糖苷酶消化来确认峰的身份：β-N-乙酰己糖胺酶(图3)，α-1,2-甘露糖苷酶(图4)，α-1,2/3/6-甘露糖苷酶(图5)，β-N-乙酰己糖胺酶和α-1,2/3/6-甘露糖苷酶的组合(图6)。图7显示了RNaseB标准品。
图17.毛细管电泳图谱GalNAc3GlcNAc3Man3GlcNAc2ProDerp1。图1显示了Dextrane标准品。图2显示了GalNAc3GlcNAc3Man3GlcNAc2ProDerp1的概况。图3显示了RNaseB标准品。
图18.用EndoT处理的GalNAc3GlcNAc3Man3GlcNAc2ProDerp1的毛细管电泳图谱。图1显示了Dextrane标准品。图2显示了用EndoT处理以去除高甘露糖背景的GalNAc3GlcNAc3Man3GlcNAc2ProDerp1的毛细管电泳图谱。通过进行以下外切糖苷酶消化来确认峰的身份：α-1,2-甘露糖苷酶(图3)，β-N-乙酰己糖胺酶(图4)，β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(图5)，α-1,2/3/6-甘露糖苷酶(图6)，β-N-乙酰己糖胺酶和α-1,2/3/6-甘露糖苷酶的组合(图7)。为了检测GalNAc和GlcNAc之间的差异，我们进行了β-N-乙酰己糖胺酶消化，其能够去除末端GalNAc和GlcNAc残基，而β-N-乙酰氨基葡糖苷酶仅能够去除末端GlcNAc残基。图8显示了RNaseB标准品。
图19.N-聚糖定量。在产生IL-22糖蛋白后进行的N-聚糖定量和内切氨基葡糖苷酶清除步骤的效果。数据显示在清除程序后复合N-聚糖结构的显著增加。
图20.重组产生的IL-22的半乳糖基化糖型的定量。在内切氨基葡糖苷酶清除步骤后计算特异性复合N-聚糖定量。
详细说明
如本文所用，以下术语中的每一个具有与本节中相关的含义。这里使用的冠词“一”和“一个”是指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个要素”表示一个要素或多于一个要素。当提及诸如量、时间持续期等可测量值时，本文所用的“约”意味着包括从指定值±20％或±10％的变化，更优选±5％，甚至更优选±1％，并且还更优选±0.1％，因此，这些变化适合于执行所公开的方法。当在生物、组织、细胞或其组分的情境中使用时，术语“异常”是指在至少一种可观察或可检测的特征(例如，年龄、治疗、天数等)方面不同于显示“正常”(预期)各自特征的那些生物、组织、细胞或其组分的那些生物、组织、细胞或其组分。对于一种细胞或组织类型而言正常或预期的特征对于不同的细胞或组织类型可能是异常的。所描述的附图仅是示意性的而非限制性的。在附图中，为了说明的目的，一些元件的尺寸可能被夸大并且未按比例绘制。当在本说明书和权利要求中使用术语“包含”时，不排除其他要素或步骤。此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分相似要素，而不一定用于描述相继顺序或时间顺序。应理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或说明的顺序操作。除非本文中具体定义，否则本文使用的所有术语具有与本发明领域技术人员相同的含义。关于本领域的定义和术语，从业者可具体参考Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor Press，Plainsview，NewYork(2012)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement100)，John Wiley&Sons，New York(2012)。本文提供的定义不应被解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。
如本文所用，术语“核苷酸序列”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。核苷酸序列可以具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。核苷酸序列的非限制性实例包括基因，基因片段，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转移RNA，核糖体RNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，支链多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的DNA，对照区，任何序列的分离的RNA，核酸探针和引物。核苷酸序列可以是线性或环状的。
如本文所用，术语“多肽”是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可包括编码和非编码氨基酸，化学或生物化学修饰或衍生化氨基酸，和具有修饰肽主链的多肽。多肽序列可以用单字母(或一字母)氨基酸代码或三字母氨基酸代码描述，如下所示：
本文所用的术语“表达载体”包括本领域技术人员已知的任何载体，包括质粒载体，粘粒载体，噬菌体载体，如λ噬菌体，病毒载体，如腺病毒，AAV或杆状病毒载体，或人工染色体载体如细菌人工染色体(BAC)，酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC)等。表达载体通常含有所需的编码序列和在特定宿主生物(例如高等真核生物、低等真核生物、原核生物)中表达有效连接的编码序列所必需的适当启动子序列。
通常，载体包含核苷酸序列，其中可表达的启动子或调节核苷酸序列与编码mRNA的核苷酸序列或DNA区域有效连接或相关，使得调节核苷酸序列能够调节相关核苷酸序列的转录或表达。通常，载体的调节核苷酸序列或启动子不与天然存在的相关核苷酸序列有效连接，因此与有效连接的DNA区域的编码序列是异源的。如本文所用，术语“可操作地”或“有效”“连接”是指可表达的启动子序列与目的DNA区域或基因之间的功能性连接，使得启动子序列能够启动目的基因的转录，并且是指目的基因和转录终止序列之间的功能性连接，以确保真核细胞中转录的充分终止。“诱导型启动子”是指响应于外部刺激(例如但不限于温度、pH、某些营养素、特定细胞信号等)可以“开启”或“关闭”(从而调节基因转录)的启动子。它用于区分“组成型启动子”，其中启动子意指连续地“开启”，即基因转录是组成型活性的。
如本文所用的“聚糖”通常是指糖苷键连接的单糖、寡糖和多糖。因此，糖缀合物的糖类部分，例如糖蛋白，糖脂或蛋白聚糖，在本文中称为“聚糖”。聚糖可以是单糖残基的均聚物或杂聚物，并且可以是直链或支链的。N-连接的聚糖可以由GalNAc、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、甘露糖和其他单糖组成，这也在本文中进一步举例说明。
在真核生物中，O-连接的聚糖在高尔基体中的肽链的丝氨酸或苏氨酸残基上一次组装一个糖。与N-连接的聚糖不同，没有已知的共有序列，但相对于丝氨酸或苏氨酸，-1或+3处的脯氨酸残基的位置有利于O-连接的糖基化。
“糖工程化细胞”是指经遗传修饰使其表达与野生型背景相比具有改变的N-聚糖结构和/或O-聚糖结构的蛋白质的细胞。通常，通过参与糖基化途径的酶的基因工程化改变了对糖蛋白的天然存在的修饰。通常，N-连接糖基化中的糖链可以分为三种类型：高甘露糖(通常是酵母)，复合物(通常是哺乳动物)和杂合型糖基化。除此之外，存在多种O-聚糖模式，例如具有与哺乳动物细胞中的粘蛋白型O-糖基化不同的酵母寡聚甘露糖基聚糖。不同类型的N-和O-糖基化均为技术人员所熟知并在文献中定义。已经致力于鉴定和优化用于工程化真核细胞的策略，所述真核细胞产生具有所需N-和/或O-糖基化模式的糖蛋白并且是本领域已知的(例如De Pourcq，K.等人，Appl Microbiol Biotechnol.87(5)，2010)。这种糖工程化表达系统的一个非限制性实例描述于专利申请WO2010015722中，并且涉及表达内切氨基葡糖苷酶和靶蛋白的(高等或低等)真核细胞，并且其中重组分泌的靶蛋白的特征在于均一的N-糖基化模式(特别是一个单一的GlcNAc残基(在低等真核生物中)或其修饰如用半乳糖(LacNAc)或唾液酸-LacNAc修饰的GlcNAc(在哺乳动物细胞中)。还包括经过基因修饰的细胞以便它们表达蛋白质或糖蛋白，其中糖基化模式是人样的或人源化的(即复合型糖蛋白)。这可以通过提供具有灭活的内源糖基化酶和/或包含至少一种编码复合糖基化所需的至少一种酶的其他外源性核酸序列的细胞，特别是低等真核细胞来实现。可被灭活的内源糖基化酶包括α-1,6-甘露糖基转移酶Och1p，Alg3p，Mnn1p家族的α-1,3-甘露糖基转移酶，β-1,2-甘露糖基转移酶。复合的糖基化所需的酶包括但不限于：N-乙酰葡糖胺基转移酶I，N-乙酰葡糖胺基转移酶II，甘露糖苷酶II，半乳糖基转移酶，岩藻糖基转移酶和唾液酸转移酶，以及参与供体糖核苷酸合成或转运的酶。本文设想的其他糖工程化细胞，特别是酵母细胞的特征在于，不表达参与高甘露糖结构(高甘露糖型聚糖)产生的至少一种酶。参与高甘露糖结构生产的酶通常是甘露糖基转移酶。特别是，可能不表达α-1,6-甘露糖基转移酶Och1p，Alg3p，Mnn1p家族的α-1,3-甘露糖基转移酶，β-1,2-甘露糖基转移酶。因此，可以另外或替代地改造细胞以表达一种或多种酶或酶活性，这使得能够以高产率产生特定的N-聚糖结构。这种酶可以靶向宿主亚细胞细胞器，其中酶例如，通过通常不与酶结合的信号肽将具有最佳活性。应该清楚的是，本文所述的酶及其活性在本领域中是众所周知的。
本申请中使用的“糖蛋白”是指在其正常生理环境和/或其功能形式中含有与其多肽侧链共价连接的寡糖链(聚糖)的蛋白质。另外，糖蛋白是具有人工引入的糖基化位点的任何蛋白质。通常，糖蛋白，通常是重组糖蛋白，例如异源重组糖蛋白(其通常不存在于真菌或酵母生物中)，当其在糖基化工程化的真菌或酵母生物中制备时，以几种糖型产生。由于N-糖基化过程的本质，发生不同的糖型(甚至源自(重组)糖蛋白上的一个特定的功能性N-糖基化位点)。本质上，复合N-糖基化聚糖(特别是在复合的N-糖基化工程化真菌生物体中)的形成从未100％有效，因此在糖蛋白上存在的特定N-聚糖位置上发生不同的糖型。因此，有可能在糖蛋白(例如具有2个N-聚糖受体位点的糖蛋白)中，一个N-聚糖是复合N-聚糖，而另一个N-聚糖是杂合聚糖或高甘露糖型聚糖。特别地，本文使用的糖蛋白是以其生理活性形式显示N-糖基化的蛋白质。因此，糖蛋白通常在至少一个天冬酰胺残基上含有糖链。在说明书中提供了糖蛋白的非限制性列表。术语“糖蛋白”不是指氨基酸链的长度，'糖肽'包括在'糖蛋白'的定义内。
本申请中使用的术语“(糖)蛋白”和“酶”(例如内切氨基葡糖苷酶，糖基转移酶，甘露糖苷酶，甘露糖基转移酶)也旨在涵盖天然存在的蛋白质的功能活性片段和变体。实际上，对于许多(例如治疗性)蛋白质，部分蛋白质可能足以实现(例如治疗性、酶促)效应。这同样适用于变体(即其中一个或多个氨基酸已经被其他氨基酸取代但保留功能或甚至显示出改善的功能的蛋白质)，特别是对于酶活性优化的酶的变体。在本申请的上下文中，糖蛋白是指蛋白质本身；糖蛋白可以是其糖基化形式或非糖基化形式。“糖基化”蛋白质是携带至少一个寡糖链的(糖)蛋白。N-糖基化蛋白质，特别是N-糖基化重组糖蛋白，是在N-聚糖上携带至少一个寡糖链的糖蛋白。
本发明中使用的'糖型'是糖基化糖蛋白的变体，其中变异是存在于所述糖蛋白上的N-聚糖组合物中。
如本文所用的“糖链”、“寡糖链”或“碳水化合物链”在权利要求中称为N-聚糖(其中N-指N-糖基化)。糖链可以是支链的或不支化的，并且可以包含一种或多种类型的寡糖。通常，N-连接糖基化中的糖链可以分为三种类型：高甘露糖、复合型和杂合型糖基化。这些术语是本领域技术人员公知的并且在文献中定义。简而言之，高甘露糖型糖基化通常是指包含两个N-乙酰葡糖胺的寡糖链，其具有(可能许多)甘露糖和/或甘露糖磷酸酯残基(但通常没有其他单糖)。
复合糖基化通常是指通常具有一个、两个或更多个(例如多达六个)外部分支的结构，其最常与内部核心结构Man3GlcNAc2连接。例如，复合N-聚糖可具有至少一个分支，或至少两个交替的GlcNAc和任选的半乳糖(Gal)残基，其可以多种寡糖终止，但通常不会以甘露糖残基终止。在复合的N-糖基化工程化真菌生物中制备的复合N-聚糖的几个实例在所附的实施例部分中示出。为清楚起见，存在于糖蛋白的N-糖基化位点上的单个GlcNAc不被认为是复合N-聚糖。
杂合型糖基化包括中间形式，即除了两个N-乙酰葡糖胺残基外还携带末端甘露糖和末端非甘露糖残基的那些糖基化蛋白质。与复合的糖基化相反，杂合型糖基化结构的至少一个分支以甘露糖残基结束。杂合N-聚糖可源自复合的N-糖基化工程化真菌生物中存在的异源糖基转移酶的低效糖基化。
本申请中使用的“复合N-糖基化工程真菌生物体”是真菌细胞，其表达至少一种外源核酸序列，其编码在野生型真菌生物体中不表达的复合的N-糖基化所需的酶，和/或不表达参与通常在野生型真菌中表达的高甘露糖型结构产生的至少一种酶。特别地，复合的N-糖基化工程化的真菌生物是复合的N-糖基化工程化的酵母。可以针对复合的N-糖基化工程酵母进行工程化的酵母的非限制性实例包括酵母属物种(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))，汉逊酵母(Hansenula)物种(例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))，Arxula物种(例如Arxula adeninivorans)，耶氏酵母(Yarrowia)物种(例如，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)物种(例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))或Komagataella phaffii(Kurtzman，CP(2009)J IndMicrobiol Biotechnol.36(11)，其先前在旧命名法中被命名为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)并且巴斯德毕赤酵母更出名，并且还在本文中被进一步使用。根据一个具体实施方案，低等真核细胞是毕赤酵母属细胞，并且在最具体的实施方案中是巴斯德毕赤酵母细胞。还有其他'复合的N-糖基化工程真菌生物包括嗜热毁丝霉(也被公司Dyadic称为C1)，曲霉属物种(如构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，日本曲霉(Aspergillus japonicus))，镰刀菌属种(如Fusariumvenenatum)，肉座菌属和木霉属物种(例如里氏木霉(Trichoderma reesei)。
根据具体实施方案，复合N-糖基化所需的酶是甘露糖苷酶或除甘露糖基转移酶之外的糖基转移酶。根据进一步的具体实施方案，复合糖基化所需的至少一种酶选自N-乙酰葡糖胺基转移酶I，N-乙酰葡糖胺基转移酶II，甘露糖苷酶II，半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶。
根据具体实施方案，复合N-糖基化酵母细胞(或简称糖基化工程酵母细胞或糖工程酵母细胞)的特征可在于至少一种参与高甘露糖结构产生的酶(高甘露糖型)聚糖)不表达(或在细胞中不如在野生型细胞中那样具有功能活性)。根据进一步的具体实施方案，至少一种甘露糖基转移酶不在糖工程化的酵母细胞中表达。通常，在糖工程酵母细胞中不表达的甘露糖基转移酶在酵母细胞的野生型对应物中表达。根据更进一步的具体实施方案，甘露糖基转移酶是α-1,2-甘露糖基转移酶，α-1,3-甘露糖基转移酶，α-1,6-甘露糖基转移酶或β-1,4-甘露糖基转移酶。这些蛋白质通常在酵母中具有特定的名称(例如Alg，Och，Mnn)，但它们的活性在本领域中是众所周知的。或者或另外，至少一种甘露糖磷酸转移酶在复合N-糖基化工程化的酵母细胞中不具有功能活性。
本文所用的“内切氨基葡糖苷酶”是指水解糖蛋白或糖脂的寡糖中的非末端β-连接的N-乙酰葡糖胺残基的异头碳与其糖苷配基之间的键，从而从糖蛋白或糖脂或糖聚合物释放单糖或寡糖的酶。内切氨基葡糖苷酶是糖苷酶的子集，并且可以具有或不具有其他酶活性(例如糖基转移酶活性)。一类特定的内切氨基葡糖苷酶由内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶或甘露糖基糖蛋白内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶形成，在国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)命名法中以EC 3.2.1.96表示。这类特殊的酶能够催化高甘露糖糖肽中的N，N'-二乙酰基壳二糖基单元和含有-[Man(GlcNAc)2]Asn-结构的糖蛋白的内切水解。一个N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)残基保持附着在蛋白质上；其余的寡糖完整释放。因此，结果是存在于糖蛋白上的单个GlcNAc修饰的N-糖基化位点。具有修饰的GlcNAc残基的糖蛋白仍将被称为单个GlcNAc修饰的蛋白质，因为在GlcNAc残基的4位上没有第二个糖残基(即没有典型的糖链)。在本申请中进一步提供了内切氨基葡糖苷酶的非限制性列表。
特别是关于N-糖基化工程化的真菌或酵母细胞，本文所用的“复合糖基化所需的酶”是指宿主真菌或酵母细胞中非天然存在的任何酶，其可能参与复合聚糖的合成，如在高等真核生物中发现的，特别是在哺乳动物中发现的，尤其是在人类中发现的。最特别地，这种酶是从糖链去除甘露糖残基的酶(即甘露糖苷酶)或糖基转移酶，特别是除甘露糖基转移酶(即转移在高甘露糖聚糖中未发现的单糖的糖基转移酶)和/或磷酸甘露糖基转移酶之外的糖基转移酶。
本申请中使用的'糖基转移酶'是催化生化反应中糖基转移的一组酶中的任何一种，特别是糖基转移至天冬酰胺连接的糖残基以产生N-连接的糖蛋白。在IUBMB命名法中，糖基转移酶属于EC 2.4，特定类别的糖基转移酶是己糖基转移酶(EC 2.4.1)。在将肽加工成糖蛋白的各种这些翻译后酶中，有酶，例如但不限于N-乙酰葡糖胺基转移酶，N-乙酰半乳糖胺基转移酶，唾液酸转移酶，岩藻糖基转移酶，半乳糖基转移酶和甘露糖基转移酶。
注意，对于本申请中描述的N-糖基化工程酵母细胞的具体实施方案，排除了外源甘露糖基转移酶。本申请中使用的“甘露糖基转移酶”是指在高尔基体中催化甘露糖基转移至受体分子(通常是另一种碳水化合物)的酶。甘露糖基转移酶通常是真菌和酵母中的内源酶，并且参与高甘露糖型聚糖的合成。
值得注意的是，酶可以在其内切氨基葡糖苷酶活性旁边具有糖基转移酶活性。虽然有可能使用一种酶来发挥这两种活性，但通常使用的酶只能实现一种功能。因此，设想使用已经修饰或突变以确保它们仅执行一种功能，或者已经修饰或突变以确保它们更有效地执行特定功能的酶。这种修饰的酶在本领域中是已知的。
本发明的目的是提供包含均质形式的N-聚糖，特别是存在于重组糖蛋白上的复合N-聚糖的组合物，特别是药物组合物。这种重组糖蛋白在复合的N-糖基化工程化的真菌生物中产生。
在一个实施方案中，本发明提供了包含多种重组糖蛋白的组合物，其中存在于所述糖型上的N-聚糖包含复合N-聚糖和由单一GlcNAc组成的N-聚糖结构的混合物，并且其中所述组合的复合N-聚糖和由单一GlcNAc组成的N-聚糖以高于所述组合物中总N-聚糖的90％的水平存在。
在再一个实施方案中，本发明提供了包含多种重组糖蛋白糖型的组合物，其中存在于所述糖型上的N-聚糖包含复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖结构的混合物，并且其中所述复合N-聚糖以高于所述组合物中总N-聚糖的90％的水平存在。
在再一个实施方案中，本发明提供了包含多种重组糖蛋白的纯化组合物，其中存在于所述糖型上的N-聚糖包含复合N-聚糖和由单一GlcNAc组成的N-聚糖结构的混合物，并且其中所述组合的复合N-聚糖和由单一GlcNAc组成的N-聚糖以高于所述组合物中总N-聚糖的90％的水平存在。
在再一个实施方案中，本发明提供了纯化的组合物，其包含重组糖蛋白的多种糖型，其中存在于所述糖型上的N-聚糖包含复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖结构的混合物，并且其中所述复合N-聚糖以高于所述组合物中总N-聚糖的90％的水平存在。
根据一个具体方面，通过提供具有编码糖蛋白的外源核酸序列的复合的N-糖基化工程化的真菌生物体并将分泌的糖蛋白在体外(例如通过添加到发酵培养基中或通过添加到纯化的糖蛋白或通过在糖蛋白的纯化过程中的添加)接触适量的内切氨基葡糖苷酶中来实现。通常，所述内切氨基葡糖苷酶在合适的宿主细胞中重组产生、放大并纯化，并加入存在于复合N-糖基化工程化真菌生物的生长培养基中的分泌糖蛋白中。重要的是，所述内切氨基葡糖苷酶不是由也表达目的糖蛋白的相同细胞产生的。在一个具体实施方案中，在重组糖蛋白的纯化过程中将所述内切氨基葡糖苷酶应用于重组糖蛋白。在另一个具体实施方案中，在纯化重组糖蛋白后，将所述内切氨基葡糖苷酶应用于重组糖蛋白。
在再一个实施方案中，本发明提供了包含重组糖蛋白的多种糖型的组合物，其中存在于所述糖型上的N-聚糖包含复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖结构的混合物，其中所述组合的复合N-聚糖和由单一GlcNAc组成的N-聚糖以高于所述组合物中总N-聚糖的90％的水平存在，其中所述组合物通过在复合N-糖基化工程真菌生物中产生所述糖蛋白而获得，包含在表达所述糖蛋白的条件下，培养包含编码所述糖蛋白的外源遗传构建体的所述重组复合N-糖基化工程化真菌生物，并用内切氨基葡糖苷酶的添加接触所述重组糖蛋白。
在再一个实施方案中，本发明提供了包含多种重组糖蛋白糖型的组合物，其中存在于所述糖型上的N-聚糖包含复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖结构的混合物，其中所述复合N-聚糖以高于所述组合物中总N-聚糖的90％的水平存在，其中所述组合物是通过在复合的N-糖基化工程化的真菌生物中产生所述糖蛋白而获得的，包括在其中表达所述糖蛋白的条件下培养所述重组复合N-糖基化工程化的真菌生物，其包含编码所述糖蛋白的外源遗传构建体，并且用内切氨基葡糖苷酶的添加接触所述重组糖蛋白。
糖蛋白的性质对于本发明并不关键，但糖蛋白通常是与医学和/或工业相关的蛋白质，其中同源N-糖基化是重要的。非限制性实例包括许多激素，生长因子，细胞因子及其相应的受体，例如促卵泡激素(FSH)，促黄体激素(LH)，促甲状腺激素(TSH)，表皮生长因子(EGF)，人表皮生长因子受体-2(HER-2)，成纤维细胞生长因子-α(FGF-α)，成纤维细胞生长因子-β(FGF-β)，转化生长因子-α(TGF-α)，转化生长因子-β(TGF-β)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，胰岛素样生长因子-2(IGF-2)，神经生长因子(NGF)，神经生长因子-β(NGF-β)；上述的受体，生长激素(例如，人生长激素，牛生长激素)；胰岛素(例如，胰岛素A链和胰岛素B链)，胰岛素原；促红细胞生成素(EPO)；集落刺激因子(例如，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF))；白细胞介素(例如，IL-1至IL-33)；血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGF-R)；干扰素(例如，IFN-α，β或γ)；肿瘤坏死因子(如TNF-α和TNF-β)及其受体TNFR-1和TNFR-2；血小板生成素(TPO)；凝血酶；脑利钠肽(BNP)；凝血因子(例如，因子VIII，因子IX，范维勒布兰德因子等)；抗凝血因子；组织纤溶酶原激活物(TPA)，例如尿激酶或人尿或组织型TPA；降钙素；CD蛋白(例如CD3，CD4，CD8，CD28，CD19等)；CTLA蛋白(例如，CTLA4)；T细胞和B细胞受体蛋白；抗体，骨形态发生蛋白(BMP，例如BMP-1，BMP-2，BMP-3等)；神经营养因子，例如骨源性神经营养因子(BDNF)；神经营养蛋白，例如NT3-6；肾素；类风湿因子；RANTES；白蛋白；松弛素；巨噬细胞抑制蛋白(例如，MIP-1，MIP-2)；病毒蛋白或抗原；表面膜蛋白；离子通道蛋白；酶；碱性磷酸酶；凝集素；调节蛋白；抗体；免疫调节蛋白(例如，HLA，MHC，B7家族)；归巢受体；转运蛋白；超氧化物歧化酶(SOD)；G蛋白偶联受体蛋白(GPCR)；神经调节蛋白；阿尔茨海默病相关蛋白和肽(例如A-β)和本领域已知的其他蛋白和肽，包括上述的融合蛋白或嵌合蛋白。
内切氨基葡糖苷酶的性质取决于所需的糖蛋白糖基化。例如，可以选择内切氨基葡糖苷酶的底物特异性。一些内切氨基葡糖苷酶，例如Endo H和Endo T，水解高甘露糖型糖链和杂合型糖，但保持复合的碳水化合物结构完整。这些酶是理想的，例如用于获得由复合N-聚糖组成的N-聚糖和用于从产生的糖蛋白中除去不需要的高甘露糖和/或杂合型糖，并且如我们在本发明的实施例中已经出乎意料地观察到也用于去除在复合的N-糖基化工程真菌生物体中表达的重组糖蛋白上的N-聚糖新糖型。根据具体实施方案，内切氨基葡糖苷酶水解高甘露糖型糖链、杂合型聚糖、N-聚糖新糖型，但不水解复合型聚糖。
内切氨基葡糖苷酶也可以对糖蛋白(而不仅仅是糖链)具有底物特异性，一些内切氨基葡糖苷酶例如与其他内切氨基葡糖苷酶(例如Endo T)相比，从(特别是紧密折叠的)蛋白质水解糖链方面更成功，其他内切氨基葡糖苷酶可能(也)特别成功地从糖肽或不紧密折叠的蛋白质(例如Endo H，Endo T)水解糖链。重要的是，由于这通常与接近或获得底物而不是内切氨基葡糖苷酶的特异性有关，这并不排除某些酶用于特定蛋白质，但一些内切氨基葡糖苷酶可能需要更多时间来完成所有N-连接的糖结构的水解。在复合的糖工程化真菌细胞(如毕赤酵母)中产生的N-糖基化蛋白上存在的Endo T或Endo H水解高甘露糖N-聚糖或杂合N-聚糖导致由单个GlcNAc组成的N-聚糖。特别优选的一类内切氨基葡糖苷酶由甘露糖基-糖蛋白内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶形成，在IUBMB命名法中表示为EC3.2.1.96。这些酶可以去除糖链(杂合N-聚糖，高甘露糖N-聚糖和如本文所示的N-聚糖的新糖型)，同时在蛋白质上留下一个GlcNAc残基。这些的实例包括但不限于Endo A，Endo BH，Endo CE，Endo D，Endo F1，Endo H，Endo M，Endo T(也参见WO2006/050584)和ENGase。其他实例是本领域技术人员已知的，并且可以例如在www.cazy.org上找到，特别是在糖苷水解酶家族85和18下。特别设想的是来自在WO2006/050584中描述的红褐肉座菌(Hypocrea jecorina，以前称为里氏木霉)的Endo T酶(参见例如SEQ ID 9-12)的用途。
'新糖型'可以是预料不到的N-聚糖，由于通过异源表达、基因缺失或其他过程干预N-糖基化途径，甚至可以在高度工程化的菌株中形成。必须确定负责的糖基转移酶以启动它们的敲除。
在本发明中，我们显示新糖型可通过内切氨基葡糖苷酶除去，并且它们的去除导致糖蛋白，其提供更均匀的糖基化谱或提供更高的纯度，同时减少酵母特异性背景的存在。
新糖型可以例如包含具有四糖修饰的Man5GlcNAc2N-聚糖。Man5GlcNAc2N-聚糖的四糖(Glcα1-2Manβ1-2Manβ1-3Glucα-)取代最可能附着在甘露糖核心的最内侧α-1,3臂上。新糖型可以包含许多重新出现的中间体，并且重新出现的中间体可以包含Man5GlcNAc2。Man5GlcNAc2N-聚糖可以被含有β-甘露糖和/或葡萄糖的线性己糖基糖取代。新糖型可包含Hex6-9GlcNAc2N-聚糖和甚至Hex6-11GlcNAc2N-聚糖。另外，某些新糖型可含有一个或多个磷酸甘露糖残基。
在一个具体实施方案中，本发明提供了包含多种重组糖蛋白糖型的组合物，其中存在于所述糖型上的N-聚糖由复合N-聚糖和由单一GlcNAc组成的N-聚糖结构的混合物组成。
在复合N-聚糖的混合物中获得一种主要的糖型可能是有利的。这种主要的糖型通常由复合的N-糖基化工程化的真菌生物体中糖蛋白的产生引起。
在一个具体实施方案中，所述组合物包含多种重组糖蛋白的糖型，其中存在于所述糖型上的N-聚糖由复合N-聚糖的混合物组成，并且由单个GlcNAc组成的N-聚糖结构基本上缺乏高-甘露糖型N-聚糖结构，缺乏杂合聚糖结构和缺乏N-聚糖新糖型。措辞“缺乏高甘露糖型N-聚糖结构，缺乏杂合聚糖结构和缺乏N-聚糖新糖型”意味着重组糖蛋白上存在的N-聚糖基本上是复合型N-聚糖。在一个具体实施方案中，所述组合物包含多种重组糖蛋白的糖型，其中所述糖蛋白在复合N-糖基化工程化的真菌生物中产生，其中存在于所述糖型上的N-聚糖由复合N-聚糖的混合物组成并且由单个GlcNAc组成的N-聚糖结构基本上缺乏高甘露糖型N-聚糖结构，缺乏杂合聚糖结构并且缺乏N-聚糖新糖型。
在再一个具体实施方案中，本发明提供了包含重组糖蛋白多种糖型的组合物，其中存在于所述糖型上的N-聚糖包含复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖结构的混合物，其中所述复合N-聚糖和由单一GlcNAc组成的N-聚糖的总和是以高于所述糖蛋白上存在的总N-聚糖的90％的水平存在。措辞“所述复合N-聚糖和由单一GlcNAc组成的N-聚糖的总和”等同于“组合的复合N-聚糖和由单一GlcNAc组成的N-聚糖”并且指的是本发明的过程(或方法)不能排除所有非复合N-聚糖的完全去除(即杂合N-聚糖和高甘露糖N-聚糖，源自复合N-糖基化工程化真菌生物)的事实。在任何情况下，相对于重组糖蛋白上存在的N-聚糖的总量，复合N-聚糖和由单一GlcNAc组成的N-聚糖的总和以高于90％，高于93％，在许多情况下甚至高于98％的水平存在。
在再一个具体实施方案中，本发明提供了包含重组糖蛋白多种糖型的组合物，其中所述糖蛋白在复合N-糖基化工程化真菌生物中产生，其中存在于所述糖型上的N-聚糖包含复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖结构的混合物，其中所述复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖的总和是以高于90％，高于93％或甚至高于98％的存在于所述糖蛋白上的总N-聚糖的水平存在。
在再一个具体实施方案中，本发明提供了包含重组糖蛋白多种糖型的药物组合物，其中存在于所述糖型上的N-聚糖包含复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖结构的混合物，所述复合N-聚糖和由单一GlcNAc组成的N-聚糖在所述混合物中以高于90％，高于93％或甚至高于98％的水平存在。
在再一个具体实施方案中，本发明提供了包含重组糖蛋白多种糖型的药物组合物，其中所述糖蛋白在复合N-糖基化工程化真菌生物中产生，其中存在于所述糖型上的N-聚糖包含复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖结构的混合物，其中所述复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖以高于所述混合物中90％，高于93％或甚至高于98％的水平存在。
在另一具体实施方案中，其中在复合N-糖基化工程化真菌生物中产生的重组糖蛋白具有至少两个功能性N-糖基化接纳体位点，然后当从培养基中纯化该重组糖蛋白并与适量的内切氨基葡糖苷酶外源接触时，也产生多种糖型。在这种情况下，该重组糖蛋白的糖型也将在由单个GlcNAc组成的相同重组糖蛋白和由复合N-聚糖组成的N-聚糖上发生。因此，在糖蛋白上存在2个功能性N-糖基化位点的情况下，理论上会发生许多不同混合的糖型(例如单个GlcNAc N-聚糖和复合N-聚糖的混合物)。应当理解，相对于存在于所述重组糖蛋白上的总N-聚糖，复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖的总和将高于90％。
因此，在再一个实施方案中，本发明提供了具有至少两个N-糖基化位点的重组糖蛋白的糖型，其中存在于所述糖蛋白上的至少一个N-糖基化位点由单个GlcNAc组成并且所述相同的糖蛋白上的至少一个N-糖基化位点由复合N-聚糖组成。
在再一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含具有至少两个N-糖基化位点的重组糖蛋白的糖型，其中存在于所述糖蛋白上的至少一个N-糖基化位点由单个GlcNAc组成和所述相同糖蛋白上的至少一个N-糖基化位点由复合N-聚糖组成。
在再一个实施方案中，本发明提供了包含重组糖蛋白的多种糖型的组合物，其中存在于所述糖型上的N-聚糖包含复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖结构的混合物，其中所述复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖在所述混合物中以高于90％的水平存在，其中所述组合物是通过在复合的N-糖基化工程化的真菌生物中产生所述糖蛋白而获得的，包括在表达所述糖蛋白的条件下培养重组复合N-糖基化工程化的真菌生物，所述真菌生物包含含有编码所述糖蛋白的遗传构建体的表达载体，并使所述重组糖蛋白在其产生后与内切氨基葡糖苷酶接触。
在再一个实施方案中，本发明提供了包含重组糖蛋白的多种糖型的药物组合物，其中存在于所述糖型上的N-聚糖包含复合N-聚糖和由单个GlcNAc组成的N-聚糖结构的混合物，其中在所述混合物中，所述复合N-聚糖和由单一GlcNAc组成的N-聚糖以高于90％的水平存在，其中所述组合物是通过在复合的N-糖基化工程化的真菌生物中产生所述糖蛋白而获得的，包括在表达所述糖蛋白的条件下培养重组复合N-糖基化工程化的真菌生物，并使所述重组糖蛋白在其产生后与内切氨基葡糖苷酶接触并纯化，以及用适当的药物赋形剂(或载体)配制所得的重组蛋白的多种糖型，其中所述重组复合N-糖基化工程化的真菌生物包含表达载体，所述表达载体包含编码所述糖蛋白的遗传构建体。
含有根据本发明产生的特定糖蛋白的组合物或糖型的药物组合物可用于通过给予有需要的患者而达到所需的药理学效果。出于本发明的目的，患者是需要治疗特定病症或疾病的哺乳动物，包括人。因此，本发明包括药学组合物，其由药学上可接受的载体和药学有效量的本发明的特定糖蛋白的组合物或糖型或其盐组成。药学上可接受的载体优选是对患者而言相对无毒且无害的载体，其浓度与活性成分的有效活性一致，使得由载体引起的任何副作用不会损害活性成分的有益效果。药学有效量的特定糖蛋白的组合物或糖型优选是对所治疗的特定病症产生结果或产生影响的量。本发明的特定糖蛋白的组合物或糖型可以使用任何有效的常规剂型(包括立即、缓慢以及定时释放的制剂)，与本领域熟知的药学上可接受的载体一起，口服，胃肠外，局部，鼻内，眼科，鞘内，脑室内，舌下，直肠，阴道等途径施用。
如本文中的复合N-糖基化工程化真菌细胞可产生多种重组糖蛋白的糖形。在重组糖蛋白上仅发生一个功能性N-糖基化位点的情况下，一种主要的糖型将携带复合的N-聚糖，而另一种糖型将携带单个的GlcNAc。在一个具体方面，分离这两个聚糖群可能是有利的。例如，在某些情况下，可能需要使用仅携带复合N-聚糖的重组糖蛋白。在这些情况下，仅携带单个GlcNAc的糖型可以容易地与携带复合N-聚糖的糖型分离。
根据备选的具体实施方案，所述重组糖蛋白具有一个或多个N-糖基化位点，所述N-糖基化位点在所述糖蛋白的相同N-糖基化位点上呈现单个GlcNAc和多个复合N-聚糖。
根据具体实施方案，重组糖蛋白具有两个或更多个N-糖基化位点，其中存在于所述糖蛋白上的一个或多个N-糖基化位点由单个GlcNAc组成，并且所述相同糖蛋白上的一个或多个N-糖基化位点由多个复合N-聚糖组成。
根据具体实施方案，所述重组糖蛋白的所述糖型具有至少三个糖基化位点，其中所述糖蛋白上的至少一个N-糖基化位点由单个GlcNAc组成，并且至少另一个N-糖基化位点由多个复合N-聚糖组成。
根据具体实施方案，在复合N-糖基化工程化真菌生物体中产生后外源添加至分泌的糖蛋白的内切氨基葡糖苷酶是甘露糖基-糖蛋白内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，即其具有IUBMB命名法中EC 3.2.1.96的活性，暗示它可以去除糖链，同时留下蛋白质上的一个GlcNAc残基。根据备选实施方案，内切氨基葡糖苷酶对不同类型的糖基化结构具有不同的亲和力。后者的典型实例是内切氨基葡糖苷酶，其能够水解杂合型糖和/或高甘露糖，但不能切割复合型聚糖。根据进一步的具体实施方案，内切氨基葡糖苷酶是甘露糖基-糖蛋白内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，其对不同类型的糖基化结构具有不同的亲和力。根据更进一步的具体实施方案，内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶能够切割杂合型糖和/或高甘露糖，但不能切割复合型聚糖。根据甚至更具体的实施方案，内切氨基葡糖苷酶是EndoH或EndoT。根据大多数特定实施方案，内切氨基葡糖苷酶是Endo T。
根据具体实施方案，工程化复合N-糖基化工程化的真菌(例如酵母)生物体所需的至少一种酶是多于一种酶。更具体地，至少一种酶是形成复合的糖基化途径所需的酶的数量。最特别地，靶向复合的糖基化所需的这些酶中的每一种，使得它们依次并以正确的顺序起作用(通常，一种酶将糖链修饰为下一种酶的底物)。根据一个具体实施方案，复合的糖基化所需的至少一种酶是至少一种N-乙酰葡糖胺基转移酶(例如GnT I，GnT II，GnT III，GnTIV，GnT V，GnT VI)，至少一种甘露糖苷酶(特别是甘露糖苷酶II)，至少一种岩藻糖基转移酶，至少一种半乳糖基转移酶，至少一种唾液酸转移酶，或这些酶的任何组合。
本领域广泛描述了其中已经改造了复合糖基化途径的糖工程化酵母的实例(参见例如Choi等，5022 2003；Hamilton等人；Science 1244；Wildt等人，119 2005；Hamilton等人。，387 2007；EP1211310；WO02/000879；US2006148039)。此外，还可以在本文所述的糖工程化酵母细胞中转化许多其他基因，以确保复合型糖基化糖蛋白的最佳产生，例如ER和高尔基体特异性转运蛋白(例如UDP-半乳糖的同向-和反向运输转运蛋白和其他前体)，或参与合成活化的寡糖前体，例如UDP-半乳糖和CMP-N-乙酰神经氨酸的酶。实际上，与复合的糖基化所需的至少一种酶的接触可以在特定糖基供体(例如糖核苷酸供体)的存在下发生，以确保有效和正确的糖基化。
本文所述的方法可进一步适于确保糖蛋白和内切氨基葡糖苷酶之间的接触在最佳情况下发生(即确保内切氨基葡糖苷酶对糖蛋白的最佳活性，例如取决于具体的pH、温度、盐和缓冲条件)。
如本文所用，“接触的”或“接触”确实是指所产生的重组糖蛋白和内切氨基葡糖苷酶之间的物理接近。本发明中的“接触”在体外发生。
本文所述的方法可进一步适于确保糖蛋白和内切氨基葡糖苷酶之间的接触在最佳情况下发生(即确保糖蛋白上的内切氨基葡糖苷酶的最佳活性或确保在与内切氨基葡糖苷酶接触期间和之后保留糖蛋白自身的生物活性)。
内切氨基葡糖苷酶和糖蛋白之间的接触可以是外源性的。内切氨基葡糖苷酶和糖蛋白之间的接触可能在糖蛋白分泌后在细胞外发生。然而，取决于所使用的细胞和内切氨基葡糖苷酶，细胞的最佳生长和生产条件(例如pH、温度)可能与酶活性的最佳条件不同。因此，可以调节糖蛋白和内切氨基葡糖苷酶之间发生细胞外接触的培养基，以获得糖蛋白的最佳生物活性。可以调节培养基的温度以保持糖蛋白的最佳生物活性。根据本发明的一个具体实施方案，将内切氨基葡糖苷酶和糖蛋白发生接触的培养基的温度调节至4-37℃。将培养基的温度调节至4℃可能是有利的。在其他实施方案中，将温度保持在37℃以上可能是有利的。
根据另一个具体实施方案，内切氨基葡糖苷酶活性保持在培养基的高盐浓度下。即使内切氨基葡糖苷酶与糖蛋白发生接触的培养基的盐浓度高，内切氨基葡糖苷酶也能够对糖蛋白发挥作用。
在一个具体实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含重组N-糖基化IL-22或其具有至少97％氨基酸同一性的重组N-糖基化IL-22，其中所述IL-22包含复合N-聚糖Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其以存在于所述重组IL-22上的总复合N-聚糖的高于65％存在。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含重组N-糖基化IL-22或其具有至少97％氨基酸同一性的重组N-糖基化IL-22的组合物，其中所述IL-22包含复合N-聚糖Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其以存在于所述重组IL-22上的总复合N-聚糖的高于85％，高于86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％或100％存在。
“至少一个突变的N-糖基化接纳体位点”是指N-糖基化接纳体位点中的突变。本领域众所周知，潜在的N-糖基化接纳体位点对共有序列Asn-Xaa-Ser/Thr具有特异性。必须指出的是，共有三肽的存在不足以得出天冬酰胺残基(Asn)是糖基化的结论，这是由于蛋白质的折叠在N-糖基化的调节中起重要作用。还显示Asn和Ser/Thr之间存在脯氨酸将抑制N-糖基化。在糖蛋白IL-22中，通常(取决于哺乳动物物种来源)存在3个不同的N-糖基化接纳体位点。
在再一个实施方案中，本发明提供了包含具有一个功能性N-糖基化接纳体位点的重组N-糖基化IL-22，或其具有至少97％氨基酸同一性的重组N-糖基化IL-22的组合物，其中所述IL-22包含复合N-聚糖Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其以所述重组IL-22上存在的总复合N-聚糖的高于85％存在。
在再一个实施方案中，本发明提供了包含重组N-糖基化的人IL-22或其具有至少97％氨基酸同一性的重组N-糖基化的人IL-22的组合物，所述前一重组N-糖基化的人IL-22具有存在于SEQ ID NO：1所示序列中N21位的一个功能性N-糖基化接纳体位点，其中所述人IL-22包含复合N-聚糖Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其以存在于所述重组IL-22上的总复合N-聚糖的高于85％，高于86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％或100％存在。
SEQ ID NO：1描绘了仅具有一个功能性糖基化位点(下划线)的人IL-22的氨基酸序列，即糖基化接纳体位点N21(hIL-22N21突变体)。将另外两个糖基化接纳体位点(标记在SEQ ID NO：1中)突变为非功能性N-糖基化接纳体位点。
SEQ ID NO：1
hIL-22N21
氨基末端-APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADQNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLQFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI－羧基末端
SEQ ID NO：2描绘了具有两个功能性糖基化位点(下划线)的人IL-22的氨基酸序列，即糖基化接纳体位点N21和N35(hIL-22N21-N35突变体)。将另一个糖基化接纳体位点(标记在SEQ ID NO：2中)突变为非功能性N-糖基化接纳体位点。
SEQ ID NO：2
hIL-22N21-N35
氨基末端-APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLQFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI-羧基末端
SEQ ID NO：3描绘了具有三个功能性糖基化位点的野生型人IL-22(hIL-22WT)氨基酸序列(下划线)
SEQ ID NO：3
hIL-22WT
氨基末端-APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI-羧基末端
在另一个实施方案中，本发明提供了制备组合物的方法，所述组合物包含重组N-糖基化IL-22或其具有至少97％氨基酸同一性的重组N-糖基化IL-22，其中所述IL-22包含复合N-聚糖Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其以存在于如上文所述的所述重组IL-22上存在的总复合N-聚糖的高于65％存在，其中所述组合物在复合N-糖基化工程化的真菌生物中产生，包括i)在表达IL-22的条件下培养包含编码IL-22的遗传构建体的重组复合N-糖基化工程化真菌生物，并在生产后通过添加内切氨基葡糖苷酶接触所述IL-22。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含重组N-糖基化IL-22或其具有至少97％氨基酸同一性的重组N-糖基化IL-22，其中所述IL-22包含复合N-聚糖Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其以存在于所述重组IL-22上的总复合N-聚糖的高于65％存在，其中所述组合物是通过在复合N-糖基化工程化真菌生物中产生所述重组IL-22而获得的，包括在表达所述IL-22的条件下培养包含表达载体的重组复合N-聚糖基化工程化真菌生物，所述表达载体包含编码IL-22的遗传构建体，并通过内切氨基葡糖苷酶的添加接触所述重组IL-22。
应理解，尽管本文已针对根据本发明的细胞和方法讨论了特定实施方案、特定构型以及材料和/或分子，但可在不脱离本发明的范围和精神的情况下对形式和细节进行各种改变或修改。提供以下实施例以更好地说明特定实施方案，并且它们不应被视为限制本申请。本申请仅受权利要求的限制。
材料和方法
特别用于实施例1：内切氨基葡糖苷酶清除以富集复合的糖型的材料和方法
菌株和培养基
巴斯德毕赤酵母GS115(his4)用作野生型表达宿主(De Schutter，K等人，Nat.Biotechnol.27,561-566(2009))。为构建Gal2Gn2M3-hIL-22N21和-IL-22WT菌株，N-聚糖工程化起始于M5-(Man5)和GnM5-菌株(GnMan5)，它们分别主要用Man5GlcNAc2和GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖修饰它们的糖蛋白(Vervecken，W等，Appl.Environ.Microbiol.70,2639-2646(2004))。在EcoRI-线性化后，用pGAPKanMnn2DmMan-II转化具有最均质的杂合型GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的GnM5-菌株的克隆，以表达用复合型GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖修饰的糖蛋白。pGAPKanMnn2DmMan-II载体编码来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的甘露糖苷酶-II，其通过酿酒酵母Mnn2p早期高尔基体定位的糖基转移酶的N-末端结构域靶向高尔基体。来自GnM3-菌株的具有最均质GlcNAc3Man3N-聚糖的克隆通过转化编码来自褐家鼠(Rattus norvegicus)的高尔基体定位的β-N-乙酰葡糖胺基转移酶-II的BglI-线性化pGAPHygMnn2rGnT-II用于进一步工程化以获得表达具有双触角、复合型GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖(Gn2M3-菌株)的糖蛋白的菌株。然后用EcoRV-线性化的pGAPNorMnn2SpGal10GalT转化具有最均质的GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的Gn2M3-菌株的克隆。该载体编码Mnn2p-高尔基体定位结构域、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)UDP-葡萄糖/β-半乳糖-4-差向异构酶和人β-1,4半乳糖基转移酶-I(GalT-1)的三部分融合体。所得菌株用Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2修饰其糖蛋白。载体和构建体已在(Jacobs，P.P等人，Nat.Protocols 4,58-70(2008))中描述。该方法在Laukens，B等人，Methods Mol.Biol.1321,103-22(2015)中广泛描述。
将菌株保持在-80℃的甘油储备液中。在实验之前，通过在补充有BlasticidinS-HCl(100μg/mL)，(100μg/mL)，G418(500μg/mL)，潮霉素(100μg/mL)和诺尔丝菌素(100μg/mL)的YPD上铺板从甘油储备液开始新鲜培养物。所有培养物在28℃下生长并在4℃下储存，等待进一步的实验。
重组生产EndoT
对于EndoT的重组产生，构建了在AOX1-启动子控制下表达全长大小的成熟EndoT的野生型菌株(NRRL-Y11430)。在带挡板的摇瓶中以6升(24×250ml/2升烧瓶)的水平进行大规模生产(Schoonooghe，S.，Leoen，J.&Haustraete，J.，Pichia pastoris.MethodsMol.Biol.Clifton NJ 907,325-340(2012))。在诱导结束时，通过在4℃以18,000×g离心30min收集培养基并渗滤至20mM Tris pH 7.5。将澄清的上清液应用于用20mM Tris pH7.5平衡的138ml Q sepharose FF柱XK26×26(GE Healthcare)。在相同缓冲液中用5倍柱体积的梯度洗脱柱至1M NaCl。在SDS-PAGE上分析洗脱级分，并将含EndoT的级分合并在一起。最后，将蛋白质注射到Superdex 75凝胶过滤柱XK26x 52上，用PBS作为用于配制的运行溶液并除去少量污染物。通过SDS-PAGE分析获得的级分，使用Micro-BCA测定法(Pierce)测定浓度，并测量LPS含量(Endosafe-PTS)(<1EU/ml)。
纯化后的最终产量为0.183g/L，纯度>95％。
IL-22糖型的生产和纯化
将hIL-22表达菌株的预培养物接种于补充有适当抗生素的10mL YPD中并生长过夜。第二天，使用预培养物在2L带挡板的摇瓶中接种8×250mL BMGY(pH5.5)。生长培养物并用BMMY补充培养基。诱导培养物48小时后，收获上清液并进行硫酸铵沉淀。简而言之，为了除去聚集的蛋白质和残余细胞，通过加入高达30％的硫酸铵盐使上清液饱和。将样品以16,800g离心并弃去所得的沉淀。在连续搅拌下将上清液进一步饱和至80％。通过离心收获含有hIL-22的沉淀物。弃去剩余的上清液，将沉淀物储存在-20℃直至进一步纯化。
为了纯化，将hIL-22硫酸铵沉淀溶解在25mM MES pH 5.5中，并在0.22μm瓶顶过滤器(Millipore)上过滤，以在溶解后除去杂质。将滤液在25mM MES pH 5.5上运行的Sephadex G25XK26/80柱(GE Healthcare)上脱盐，并预先用相同的缓冲液平衡。为了除去大量的毕赤酵母宿主蛋白并除去潜在的内毒素(LPS)，合并脱盐的级分并加载到用25mMMES pH5.5作为运行缓冲液平衡的Q-Sepharose XK16/32柱(GE Healthcare)上。收集含有hIL-22的流穿液，并在用25mM MES pH 5.5中的1M NaCl洗脱之前彻底洗涤柱。然后将Q-Sepharose流穿液加载到用相同的运行缓冲液平衡的Source 15S柱上。加载后，用运行缓冲液充分洗涤柱，用在25mM MES pH5.5中的0-1M NaCl逐步线性梯度洗脱hIL-22。将主要含有N-糖基化的hIL-22的级分在用设定为pH8.0的PBS平衡的Superdex75柱(GE Healthcare)上精制。精制后，使用10kDa分子量截留(MWCO)的Amicon离心柱(Millipore)浓缩含hIL-22的级分，用Millex低蛋白结合0.22μm注射器过滤器(Millipore)灭菌，并由BCA(Pierce)测定浓度。将样品分成等分试样并储存在-80℃。使用Akta Explorer或Akta Pure纯化平台(GEHealthcare)进行纯化步骤。在Unicorn 5.11中分析层析图，然后在CorelDraw 11中进行格式化。
蛋白质分析技术
在15％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上分析蛋白质。在加载之前，样品补充有Laemli加载染料(200mM Tris-HCl，pH 6.8，含有40％甘油，10％SDS，0.8％溴酚蓝和30mM DTT，除非另有明确说明)，并在98℃下加热变性10分钟。作为分子量梯，包括Precision Plus蛋白质全蓝标准品(Bio-Rad)。为了可视化，将凝胶用考马斯染色或通过半干法Western印迹(1mA/cm2)转移至硝酸纤维素膜上。使用在PBST-3％乳中1：1000稀释的抗hIL-22小鼠单克隆抗体(Abcam，ab134035)使人IL-22可视化。使用在具有Lightning ECL增强化学发光底物(Perkin Elmer)的PBST-3％乳中1：5000稀释的抗小鼠HRP偶联的IgG(GE Healthcare)显示印迹。
使用EndoH或PNGaseF(New England Biolabs)的蛋白质去糖基化按照制造商的说明进行。简言之，将5-10μg纯化的蛋白质在1x糖蛋白变性缓冲液(0.5％SDS，40mM DTT)中热变性(5分钟，98℃)。冷却样品后，用1％NP-40和1×缓冲液G7补充用于PNGaseF消化的样品，并加入1000个NEB单位PNGaseF(相当于15.4IUB mU/μl，内部产生)。用于EndoH消化的样品补充有1x缓冲液G5和500单位EndoH(NEB)。在加载到SDS-PAGE上之前，将所有消化物在37℃下保持2-4小时。
通过毛细管电泳的糖基化分析
对于通过毛细管电泳的N-聚糖分析，按照Laroy，W.，Contreras，R.和Callewaert，N.,Nat.Protoc.1,397-405(2006)描述的平板法制备50μl硫酸铵级分或10μg纯化的hIL-22。
将溶液内EndoT消化物的样品在25mM MES pH5,5中稀释，然后加入100ng重组纯化的EndoT。将样品温育过夜并干燥。如前所述进行标记。如前所述(Laroy，W.，Contreras，R。和Callewaert，N.，Nat.Protoc.1,397-405(2006))在ABI 3130毛细管DNA测序仪上分析APTS衍生的N-聚糖。牛RNase B的N-聚糖(Man5-9GlcNAc2，M5-9)和由α-1,6-连接的葡萄糖残基(葡萄糖单位，G.U)组成的葡聚糖梯都包括在内作为参考。用Genemapper软件(AppliedBiosystems)分析数据。
对于外切糖苷酶测序，用肺炎链球菌β-1,4-半乳糖苷酶或β-N-乙酰己糖胺酶(Prozyme，每次消化用4mU)，里氏木霉α-1,2-甘露糖苷酶(在本实验室中生产，每次消化用0.33μg)和刀豆α-1,2/-3/-6-甘露糖苷酶(Sigma，每次消化用20mU)进行标记的聚糖的外切糖苷酶处理。所有反应均在37℃下在20mM乙酸钠(pH5.0)中过夜进行。
用于N-糖型清除的EndoT剂量发现
为了确定EndoT处理的影响，将单个硫酸铵沉淀(相当于250mL培养物)重新溶解在25mL的25mM MES pH 5.5中，并通过0.22μm SteriTop/SteriCup瓶顶过滤器(Millipore)过滤。通过BCA(Pierce)测定滤液的总蛋白质浓度。将蛋白质在无菌eppendorf管上分成两个系列，使得每个eppendorf管含有1mg总蛋白质。通过在25mM MES pH 5.5中稀释重组EndoT并掺入含有IL-22的硫酸铵级分中来制备稀释系列的重组EndoT。每个系列(从10μg EndoT/mg总蛋白质至0.001μg/mg)一式两份制备，并将样品在4℃或37℃下温育过夜(～14小时)。第二天，评估样品的沉淀。为了评估EndoT处理的影响，将1μL两个系列的每个样品加载到SDS-PAGE上以通过蛋白质印迹转移。对于考马斯分析，将5μl每种反应加载到SDS-PAGE上。
对于N-糖基化分析，如上所述制备50μl每种样品用于毛细管电泳(DSA-FACE)。使用改良的刀豆α-甘露糖苷酶消化显示N-聚糖谱中的寡-甘露糖背景。因此，用刀豆α-1,2/-3/-6-甘露糖苷酶(Sigma，每次消化用10mU)消化1μL的APTS标记的N-聚糖样品。在通过毛细管电泳分析之前，在37℃下在20mM乙酸钠(pH5.0)中进行消化2小时。由于商业刀豆制备中低水平的污染性β-N-乙酰己糖胺酶和半乳糖苷酶，较长的温育导致复合型N-聚糖的降解。
EndoT处理的IL-22糖型的纯化
为了纯化hIL-22，将硫酸铵沉淀溶解在pH 5.5的25mM MES中至终体积100mL，并在0.22μm瓶顶过滤器上过滤。通过BCA测定滤液的总蛋白质浓度。接下来，将滤液掺加重组EndoT(0.5-1.0μg/mg总蛋白质)。将反应物保持在4℃(过夜)，同时在振荡器平台上轻轻搅拌。第二天，评估反应的沉淀。在0.22μm SteriTop/SteriCup瓶顶过滤器上除去沉淀物，并如上所述纯化滤液。
体外Colo-205测定IL-22生物活性
人类Colo-205结肠癌细胞从美国典型培养物保藏中心(ATCC)订购，并根据数据表中提供的指导进行培养。简言之，将细胞系在37℃，5％CO2下在补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640(Gibco)中培养为半贴壁细胞。为了传代，收集悬浮生长的细胞，并按照标准组织培养程序对贴壁细胞进行胰蛋白酶消化。对于Colo-205测定，将细胞以3.0×105个细胞/mL(100μl/孔)接种在96孔U形底板中。在用稀释系列的hIL-22刺激细胞之前，允许细胞适应24小时。允许所有刺激过夜进行。作为对照，使用稀释系列的市售重组hIL-22(无载体)产生的大肠杆菌(BioLegend)。第二天，将板在4℃下在400g下离心10分钟并收集上清液。使用hIL-10DuoSet ELISA(R&D systems)测定上清液的IL-10。在GraphPad Prism6中分析数据。基于用于确定EC 50的剂量-反应曲线确定比活性。
特别用于实施例2：使用EndoT清除ProDerp1糖型的材料和方法
为了获得不同的ProDerp1糖型，将pPIC9ProDerp1巴斯德毕赤酵母表达载体转化到M5-(Man5)OCH1突变的毕赤酵母菌株中，该菌株主要用Man5GlcNAc2N-聚糖修饰其糖蛋白(Jacobs，P.P等人，Nat.Protocols 4，58-70(2008)，Vervecken，W等人，Appl.Environ.Microbiol.70,2639-2646(2004))。
接下来，使用相应的OCH1突变的毕赤酵母菌株载体将下列酶连续转化到该菌株中：N-乙酰葡糖胺基转移酶I，甘露糖苷酶II，N-乙酰葡糖胺基转移酶II和N-乙酰葡糖胺基转移酶IV。在每个转化步骤之间，使用毛细管电泳分析ProDerp1的N-聚糖谱，并分析ProDerp1的表达。最后获得GlcNAc3Man3GlcNAc2ProDerp1表达菌株。
在大规模表达实验后，使用疏水相互作用层析、阴离子交换和凝胶过滤(最终缓冲液：50mM Tris-HCl pH 7.4)的组合纯化GlcNAc3Man3GlcNAc2ProDerp1。在下一步中，使用以下条件进行体外GalNAc转移：150μM末端GlcNAc，10mM UDP-GalNAc，50mM Tris-HCl pH 7.4+10mM MnCl2，0.5μg人β-1,4-半乳糖基转移酶Y285L(比活性>2,000pmol/min/μg，R&DSystems)(Ramakrishnan，B.&Qasba，P.K，J.Biol.Chem.277,20833-20839(2002))，在37℃过夜温育。为了去除GlcNAc3Man3GlcNAc2和GalNAc3GlcNAc3Man3GlcNAc2ProDerp1样品中存在的高甘露糖背景，用EndoT(200ng EndoT处理10μg糖蛋白，在37℃过夜温育)处理两个样品。
实施例
实施例1：用于hIL-22WT和hIL-22N21的复合糖型的内切氨基葡糖苷酶清除
引言和策略
将巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程化以表达用复合型Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖修饰的hIL-22WT(具有3个功能性N-糖基化位点)。还工程化了表达IL-22N21N-糖基化位点突变体(具有一个功能性糖基化位点)的Gal2Gn2M3-菌株，所有这些都在材料和方法部分中描述。
为了去除N-聚糖的结构异质背景，应用来自里氏木霉的重组内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(EndoT)。
结果
1.1 EndoT剂量发现以清除背景N-聚糖
为了将EndoT整合到纯化过程中，研究了是否可以在纯化之前通过在溶解硫酸铵沉淀之后添加内切氨基葡糖苷酶来添加重组酶。由于高盐浓度可能不是酶活性的最佳值，因此首先在4℃进行剂量发现实验，以评估为了解决Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2-hIL-22WT样品中的所有N-聚糖背景需要多少EndoT(图1)。
然后通过毛细管电泳分析N-聚糖，并观察到EndoT对N-聚糖谱的影响类似于在较高温度下温育的样品(数据未示出)。详细地，当温育在4℃发生时，需要更多EndoT才能达到相同的效果。例如，对应于Man5GlcNAc2的峰仅从0.01μg EndoT/mg开始降低，并且需要高达0.1μg的EndoT/mg以完全清除剩余的Man5GlcNAc2。类似地，高甘露糖N-聚糖(M9-10)持续高达0.01μg EndoT/mg。为了除去带电荷的含磷酸甘露糖的N-聚糖，需要高达0.5μg EndoT/mg。然而，当加入1μg EndoT/mg时，N-聚糖谱不含任何含有寡-甘露糖，杂合的或磷酸-甘露糖的N-聚糖。保留的N-聚糖与在较高温度下温育的样品相同，当与在其他条件下比较N-聚糖种类时，峰强度之间没有差异。
表达IL-22N21的菌株的毛细管电泳(图2)显示未用EndoT处理的硫酸铵级分的N-聚糖谱已经看起来相对均匀(参见图2中的对照)。当样品与EndoT一起温育过夜时，可以看出对应于Man5GlcNAc2的峰强度在1ng EndoT/mg总蛋白时已经开始下降，并且任何残留的Man5GlcNAc2在0.05μg EndoT/mg时从N-聚糖谱中完全消失。消化后，对应于高甘露糖和磷酸甘露糖基N-聚糖的任何次要背景峰从0.01μg/mg EndoT消失。在该浓度下，获得了对应于Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的几乎单一的优势峰。此外，可以看到由半乳糖基化不足的GalGlcNAc2Man3GlcNAc2异构体和几乎没有GlcNAc2Man3GlcNAc2组成的次要部分。
总之，观察到N-聚糖异质性与可用的N-糖基化位点的数量相关，因此，还确定了在清除IL-22N-聚糖谱所需的EndoT的量方面是否存在差异。从上述结果可以得出结论，N-聚糖异质性(例如IL-22N21对IL-22WT)的降低与进行清除所需的重组EndoT的量的减少相容，如当前IL-22N21样品仅需要0.05μg EndoT/mg，相比之下，IL-22WT需要0.1μg EndoT/mg总蛋白。
1.2刀豆甘露糖苷酶消化揭示并证实了背景
因为部分背景由精细的高甘露糖N-聚糖组成，所以对应于这种N-聚糖的信号可能非常扩散，并因此难以使用诸如毛细管电泳的方法进行区分。为了避免这种情况，包括先前在4℃下与EndoT温育的样品上的刀豆α-1,2/-3/-6-甘露糖苷酶消化物(图3和图4)。
为了研究Gal2Gn2M3IL-22WT样品，将对照样品(未用EndoT或刀豆甘露糖苷酶处理)与用刀豆甘露糖苷酶消化的相同样品进行比较(图3)。观察到Man5GlcNAc2N-聚糖立即水解成Man1GlcNAc2核心。然而，后一峰的峰强度超过未消化样品中Man5GlcNAc2峰的强度，表明其他N-聚糖也被水解。当消化用EndoT处理的样品时，观察到Man1GlcNAc2核心N-聚糖的峰强度稳定下降。后一峰值的下降与用于预处理硫酸铵样品的EndoT的量成反比。在使用0.5μgEndoT/mg时，在刀豆甘露糖苷酶消化后几乎不再观察到Man1GlcNAc2的核心。
关于Gal2Gn2M3IL-22N21样品的N-聚糖谱，未用EndoT或刀豆α-甘露糖苷酶处理的对照样品已经具有相对均匀的N-聚糖谱(图4)。除了一些少数其他高甘露糖和磷酸化种类外，仅存在一些Man5GlcNAc2。当用α-甘露糖苷酶消化这些对照样品(未用EndoT处理)时，出现了对应于Man1GlcNAc2核心的清晰峰。后一峰的强度远大于在对照样品中观察到的Man5GlcNAc2的量，表明尽管相对清晰的N-聚糖谱，仍然存在一些无法检测的背景。然而，随着EndoT浓度增加至0.2μg/mg EndoT，Man1GlcNAc2峰容易下降。总之，可以证明，从0.5μg/mg开始，核心N-聚糖不再出现，并且只有优势Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2峰，少量GalGlcNAc2Man3GlcNAc2半乳糖基化不足的异构体和痕量的GlcNAc2Man3GlcNAc2保留，均为复合N-聚糖。
1.3在EndoT消化IL-22WT和IL-22N21后通过SDS-PAGE分析监测IL22稳定性。
通过在SDS-PAGE上分析样品来研究过夜EndoT-消化对IL-22稳定性的影响(图5，小图a和图6，小图a)。
可以清楚地区分对应于未糖基化的IL-22WT和具有1-或-2个N-聚糖的糖型的条带(图5的小图a)。在考马斯染色的凝胶上难以区分完全N-糖基化的糖型(3个N-聚糖)。另外，观察到可能对应于蛋白水解修剪的条带(Δ)。随着加入到样品中的EndoT浓度的增加，该条带的量增加。对于去糖基化/非糖基化种类(0)观察到类似的模式。在对照样品中，注意到15-和37kDa之间的弥漫性不清晰的成片条带，其随着EndoT浓度的增加而逐渐消失。在0.5μg EndoT/mg总蛋白质时，不再能观察到不清晰的成片条带。
使用与IL-22反应的抗体通过蛋白质印迹进行的分析显示，观察到的弥漫性不清晰的成片条带实际上是IL-22，并且它随着EndoT浓度增加确实消失(图5的小图b和小图c)。这可以在考马斯染色的凝胶和蛋白质印迹上注意到；除了未糖基化的IL-22(完整和蛋白水解修剪)的增加之外，EndoT的增加导致不清晰的成片条带减少，证实不清晰的成片条带含有IL-22WT的糖形。
通过SDS-PAGE也分析EndoT处理的IL-22N21样品(图6的小图a)。在考马斯染色的凝胶上，可以清楚地识别对应于N-糖基化的IL-22N21的条带，但样品中不存在不清晰的成片条带。通过蛋白质印迹分析样品，但是在这里也没有看到不清晰的成片条带(图6的小图b)。
高糖基化背景的信号不超过印迹的背景信号(未示出)。然而，可以看出，未糖基化的级分随着EndoT剂量的增加而增加，表明去除了一些无法检测到的现有背景。
1.4 EndoT处理的Gal2GlcNac2Man3hIL-22WT的纯化。
研究了EndoT清理程序是否可以整合到纯化实验中，并且测试现有方案是否也允许再次去除重组EndoT。在剂量发现实验中，确定即使在4℃温育时，约0.5μg/mg EndoT(每mg总蛋白质)应足以清除任何寡甘露糖背景。这些发现在相当于2L培养物上实施，并且在确定溶解的硫酸铵级分的总蛋白质浓度后，相应地掺入EndoT。在4℃温育过夜后，根据标准方案纯化样品(图7)。
在SephadexG25上脱盐后(图7，左上)，通过Q-Sepharose柱除去大量污染物。取决于处理，EndoT的pI从4.3-4.4变化(Expasy，Compute MW/pI)；因此，EndoT应保留在pH5.5的Q-Sepharose柱上(未示出)，来自培养基的大量污染物也是如此，而IL-22WT则进入流穿液(图7，右上)。接下来，使用S15Source柱分离混合物中的不同N-糖形。任何剩余的EndoT应该在流穿液中丢失，而IL-22WT保持结合。由于EndoT还具有酸性pI(～4.2)，因此在使用标准层析步骤纯化过程中消除任何残留的EndoT应该相当简单。此外，所需的EndoT的量相当有限并且不应影响纯化过程。即使对于具有相当大的异质性的样品如hIL-22WT，通过添加0.5-1.0μg EndoT/mg总蛋白并在4℃温育来获得高纯度N-糖形。虽然这需要在其他糖蛋白上进行测试，但建议1：1000的比例作为进一步优化的起点。
在来自S15Source的Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2-IL-22WT的洗脱曲线中，可以区分几个峰(图7，左下和图9)。
当从S15Source柱洗脱hIL-22WT时，可以快速检测到任何异质性。在EndoT处理的Gal2GlcNAc2Man3-hIL-22WT的洗脱曲线中，观察到相当离散的峰(图9的小图a)。当在SDS-PAGE上分析洗脱级分时，发现糖形以不同的条带运行，几乎没有不清晰的成片条带，表明强N-聚糖同质性(图9的小图b)。此外，洗脱曲线中的峰与在SDS-PAGE上观察到的不同糖形的洗脱时间一致。然后基于它们的N-聚糖含量合并洗脱级分并在Superdex75柱上精制(图7，右下)。IL-22作为单峰洗脱，没有聚集或大量分解的迹象，并且切换到合适的缓冲液用于储存。在SDS-PAGE上分析最终精制的级分，提供最终库的概述，显示除了混合的和大部分未糖基化的级分之外，可以分离大部分N-糖基化的级分(图9的小图c)。尽管在还原条件下观察到更多降解，但在还原和非还原条件下未观察到寡聚化的迹象(图9的小图d)。为了测试任何剩余的背景，进行了具有PNGaseF和EndoH的差异消化(图9的小图e)。通过PNGaseF将N-糖基化级分完全去糖基化。相反，在EndoH消化后几乎没有观察到效果，表明N-聚糖很大程度上对EndoH顽固，因此一定是复合型N-聚糖。
将粗制的未经处理的上清液的N-糖基化谱与用EndoT处理的新纯化的IL-22的N-糖基化谱进行比较(图11的小图a)。在未处理的样品(泳道2)中，观察到各种峰，其对应于不同途径中间体以及寡甘露糖-和磷酸甘露糖基N-聚糖。刀豆α-甘露糖苷酶消除了大多数异质性并将其降低为单个Man1GlcNAc2-峰。后一个峰甚至超过Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2峰(泳道3)。
相反，EndoT处理的样品更均匀(泳道4)，仅显示对应于预期的复合N-聚糖的峰(Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，GalGlcNAc2Man3GlcNAc2异构体和残留的GlcNAc2Man3GlcNAc2)。值得注意的是，α-甘露糖苷酶消化根本没有显示任何背景(泳道5)，证明了这种方法的效率。
使用顺序外切糖苷酶消化也证实了光谱中主要峰的身份(图11的小图b)。从纯化的EndoT处理的hIL-22WT(泳道2)中消化N-聚糖，用β-1,4-半乳糖苷酶切割非还原末端的半乳糖残基，从而减少Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2峰和GlcNAc2Man3GlcNAc2的半乳糖基化不足的异构体(泳道3)。用β-N-乙酰基己糖胺酶消化产生三甘露糖基核心(泳道4)，其在刀豆α-甘露糖苷酶消化后完全缩小为Man1GlcNAc2核心(泳道5)。
1.5 EndoT处理的Gal2GlcNac2Man3IL-22N21的纯化
EndoT清理程序已整合到纯化方案中。现在测试它以分离清晰的Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2IL-22N21。在剂量剂量发现实验中，确定即使在4℃温育时，0.5μgEndoT/(mg总蛋白)应足以清除任何寡甘露糖背景。对于制备性消化，使用2L培养物当量，并且在测定溶解的硫酸铵级分的总蛋白质浓度后，将EndoT以1μg/mg总蛋白质掺入以确保完全消化。在4℃温育过夜后，使用标准方案纯化样品(图8提供了纯化过程的概述)。
首先，将样品在SephadexG25柱上脱盐(图8，左上)，并将洗脱液加载到Q-Sepharose柱上。收集含有IL-22的流穿和洗涤级分，而仅用1M NaCl(未示出)从柱中洗脱大量污染物和EndoT(图8，右上)。然后将含有IL-22的级分加载到S15Source柱上。Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2-IL-22N21的不同N-糖形在100和300mM NaCl之间洗脱，而未糖基化的IL-22N21仅在300mM NaCl洗脱(图8，左下和图10的小图a)。在从S15Source柱洗脱期间，可以区分不同的峰，但它们没有完全分辨(图8，左下和图10的小图a)。在SDS-PAGE上分析洗脱级分显示一组对应于未糖基化的IL-22N21及其单一糖形的清晰条带(图10的小图b)。在洗脱级分中未观察到不清晰的成片条带，表明高度均匀的N-糖形。SDS-PAGE凝胶的结果与洗脱曲线中峰的注释一致。基于N-聚糖含量合并洗脱级分，并在Superdex75柱上精制(图8，右下)。IL-22作为单峰洗脱，没有峰表明聚集或大量分解。还在SDS-PAGE上分析最终精制的级分，显示除了混合的和大部分未糖基化的级分之外的大部分N-糖基化级分的分离(图10的小图c)。然后在还原和非还原条件下比较N-糖基化级分。当在还原条件下分析蛋白质时，除了存在分解产物之外没有差别(图10的小图d)。然后通过使用具有PNGaseF和EndoH的差异消化来测试是否仍然存在寡甘露糖背景(图10的小图e)。在用PNGaseF消化后，N-糖基化级分完全去糖基化，但没有一个条带对EndoH的消化敏感，表明存在复合N-聚糖和仅少数杂合或寡甘露糖N-聚糖。
为了确定EndoT清除如何影响纯化的Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2-hIL22N21的N-聚糖谱，通过毛细管电泳将未处理的硫酸铵级分的N-糖基化谱与纯化的hIL-22N21的N-糖基化谱进行比较(图12的小图a)。在原始样品(泳道2)中，对应于Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，GalGlcNAc2Man3GlcNAc2异构体和残留GlcNAc2Man3GlcNAc2的峰清晰可见，但同时也观察到相当大部分的Man5GlcNAc2，只存在痕量的寡甘露糖和磷酸甘露糖化的N-聚糖。当对未处理的样品进行刀豆α-甘露糖苷酶消化时，将Man5GlcNAc2消化至Man1GlcNAc2-核心。然而，后一峰的大小大于在消化之前我们观察到的Man5GlcNAc2的量，表明样品中存在其他寡甘露糖N-聚糖(泳道3)。相反，用EndoT处理的样品更均匀(泳道4)，仅显示对应于预期的复合N-聚糖的峰(Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，GalGlcNAc2Man3GlcNAc2异构体和残留的GlcNAc2Man3GlcNAc2)。使用α-甘露糖苷酶消化不可能揭示任何剩余的背景，说明清除步骤的效果(泳道5)。根据该结果，商业刀豆制剂的痕量β-半乳糖苷酶活性也可通过半乳糖基化不足的峰的增加而清楚地看到。然而，在该实验中，这没有问题，因为复合型N-聚糖的消化除了GlcNAc2Man3GlcNAc2外没有进一步持续。进一步消化很可能也会产生一些三甘露糖基核心，这在样品中是不存在的。
然后使用外切糖苷酶消化进一步证实糖形的纯度并确认光谱中主要峰的身份(图12的小图b)。在未处理的对照中，观察到主要Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2峰外的几个较小的峰。然而，在β-1,4半乳糖苷酶消化后，仅剩下没有任何污染迹象的单个GlcNAc2Man3GlcNAc2峰。用HexNAc'酶进一步消化使后一峰缩小至Man3GlcNAc2-核心。在刀豆消化后，后一峰值缩小至Man1GlcNAc2-核心。值得注意的是，在复合型中间体之外，在外切糖苷酶消化过程中没有看到污染峰。
1.6 EndoT处理的糖形的生物活性。
为了测定纯化的Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2-hIL-22WT和-hIL-22N21的生物活性，测试了糖形在人Colo-205结肠癌细胞系中诱导IL-10的能力。通过用递增剂量的IL-22刺激，测定EndoT处理的IL-22的EC50，并与从大肠杆菌纯化的商业重组IL-22标准品进行比较(图13)。发现毕赤酵母产生的hIL-22至少与大肠杆菌产生的IL-22一样有活性(hIL-22WT和hIL-22N21分别为0.094±0.15ng/mL和0.082±0.13ng/mL，对比对于大肠杆菌产生的IL-22为0.269±0.14ng/mL(EC50±SE))。
1.7适用于出乎意料的新糖形
在各种hIL-22表达菌株的N-聚糖工程化过程中，遇到了一种不寻常的糖形，其可能是由内源糖基转移酶产生的人工N-聚糖中间体的识别引起的。以前，发现鼠IL-22的Man5GlcNAc2N-聚糖可被含有α1,3-连接的葡萄糖，两个连续的β1,2-连接的甘露糖残基和一个封端α-1,2-葡萄糖的线性四糖取代(数据未示出)。对Man5-菌株中表达的人IL-22进行了类似的观察。然而，N-聚糖取代是一个较小的己糖残基。为了评估EndoT清除是否也对鉴定的新糖形均有效，测试了纯化的Man5GlcNAc2hIL-22WT上EndoT的体外消化(图14)。当使用平板法(Laroy，W.，Contreras，R和Callewaert，N.，Nat.Protoc.1,397-405(2006))将来自纯化的Man5GlcNAc2-hIL-22WT的N-聚糖用PNGaseF释放时，可以鉴定Man5GlcNAc2N-聚糖和对α-甘露糖苷酶消化顽固的Hex8-9GlcNAc2N-聚糖(泳道2)。当在使用平板法制备N-聚糖期间在PNGaseF释放之前用EndoT处理样品时，不再能检测到信号(泳道3)。然而，在电泳图中可以看到一些峰值在早期运行。这些峰似乎是样品中存在的污染聚合物(注意这些峰之间的相等间距)而不是N-聚糖。
在泳道5中也可以看到相同的情况，因此它可以是存在于分析中使用的纯化EndoT中的污染聚合物。使用直接标记分析EndoT消化物的上清液，并且观察到与PNGaseF释放的样品相似的谱，但是残基已经以约1GU向谱的左侧转移(泳道4)。这与内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶如EndoT的切割一致，因为它在壳二糖核心的GlcNAc残基之间切割。除了聚糖谱的转移外，该谱与PNGaseF释放的样品几乎相同，表明除了EndoT的已知底物Man5GlcNAc2外，含有潜在免疫原性β-甘露糖基残基的不寻常的N-聚糖也被消化。另外，使用平板法在重组EndoT上没有检测到N-聚糖(泳道5)。
实施例2：测定IL-22上复合N-聚糖的相对丰度
如Jacobs等人所述，在ABI3130DNA测序仪上进行N-聚糖分离和分析(Jacobs PP等人(2009)Nat.Protoc.4(1)：58-70)。使用ABI GeneMapper软件v3.7(Applied Biosystems)完成峰分配。使用该软件，计算每个数据点的峰值强度和曲线下面积(AUC)。先前使用外切糖苷酶消化分配N-聚糖身份。为了揭示异质背景(包含异质寡-甘露糖N-聚糖)，用刀豆α-甘露糖苷酶消化每个样品。在刀豆α-甘露糖苷酶之后，作为寡-甘露糖N-聚糖水解的结果出现核心Man1GlcNAc2，允许更准确地估计背景。
测定在内切氨基葡糖苷酶清除之前或之后IL-22N21或IL-22WT糖形的N-聚糖谱内的每种糖形的相对量。为了确定相对丰度，在所有指定峰的总AUC上计算由外切糖苷酶消化证实的峰的AUC。背景定义为核心Man1GlcNAc2峰(由刀豆α-甘露糖苷酶消化显示)和外切糖苷酶消化不能确认的峰的总AUC。
特别是对于Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2IL-22WT糖形在内切氨基葡糖苷酶处理之前具有62.15％的复合N-聚糖(相对于37.85％背景)-如从图11的小图3中获得的峰计算。然而，在内切氨基葡糖苷酶处理后，复合N-聚糖含量达到93.44％并且仅剩下6.56％的背景-如从图11的小图5中获得的峰计算。计算的数据显示在图19的下面小图中。
具体地，对于Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2IL-22N21糖形在内切氨基葡糖苷酶处理之前具有80.3％复合N-聚糖(相对于19.7％背景)-如从图12的小图3中获得的峰计算。然而，在内切氨基葡糖苷酶处理后，复合N-聚糖含量达到98.3％并且仅剩下1.7％的背景-如从图12的小图5中获得的峰计算。计算的数据显示在图19的上方小图中。
实施例3.测定IL-22上半乳糖基化糖形的相对丰度
如Jacobs等人(Jacobs等人(2009)Nat.Protoc.4(1)：58-70)所述，在ABI3130DNA测序仪上进行N-聚糖分离和分析。使用ABI GeneMapper软件v3.7(Applied Biosystems)完成峰分配。使用该软件，计算每个数据点的峰值强度和曲线下面积(AUC)。先前使用外切糖苷酶消化分配N-聚糖身份。IL-22WT的N-糖基化谱的峰计算是基于图11的小图4(内切氨基葡糖苷酶清除后的纯化的IL-22WT)。IL-22N21的N-糖基化谱的峰计算是基于图12的小图4(内切氨基葡糖苷酶清除后的纯化的IL-22N21)。在前者和后者的N-聚糖谱和相应的峰计算中，由于在粗制刀豆制剂中报道的痕量β-半乳糖苷酶和己糖胺酶活性，随着半乳糖基化N-聚糖的相对丰度减小，因此不包括刀豆消化。
测定内切氨基葡糖苷酶清除后IL-22N21或IL-22WT糖形的N-聚糖谱内每种糖形的相对量。为了确定相对丰度，计算总AUC上通过外切糖苷酶消化确认的峰的AUC。峰计算是基于图2的小图10(描绘为1.0μg/mg)。
双触角Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2在IL-22N21上的相对量达到总复合N-聚糖库的88.89％，而8.93％携带单末端半乳糖或高达97％的所有复合N-聚糖是携带至少一个末端半乳糖的双触角复合N-聚糖。计算出的数据如图20上图所示。
双触角Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2在IL-22WT上的相对量达到总复合N-聚糖库的66.19％。此外，22.06％携带单一末端半乳糖。总之，高达88.25％是携带至少一个末端半乳糖的双触角复合N-聚糖。计算出的数据如图20下图所示。
实施例4：使用EndoT清除ProDerp1糖形
引言和策略
目的是产生ProDerp1不同的糖形，这是含有末端GalNAc残基的优势屋尘螨变应原Derp1的酶促失活的原形式。
结果
图15显示了纯化的GlcNAc3Man3GlcNAc2 ProDerp1的毛细管电泳图谱。图16显示了用EndoT处理并进行外切糖苷酶消化以注释不同峰的纯化的GlcNAc3Man3GlcNAc2 ProDerp1的毛细管电泳图谱。图17显示了GalNAc3Gn3Man3GlcNAc2 ProDerp1的毛细管电泳图谱。图18显示了用EndoT处理并进行外切糖苷酶消化以注释不同峰的GalNAc3Gn3Man3GlcNAc2ProDerp1的毛细管电泳图谱。

Claims (5)

1.一种制备复合N-聚糖的糖蛋白的方法，包括：
培养包含编码所述糖蛋白的遗传构建体的、复合的N-糖基化工程化的毕赤酵母，所述毕赤酵母表达编码复合的N-糖基化所需的酶的至少一种外源核酸序列、且不表达野生型毕赤酵母中参与高甘露糖型结构产生的至少一种酶，所述培养是在表达所述糖蛋白并分泌到培养基的条件下实施的；和
使所述重组糖蛋白在其产生后在体外与适量的内切氨基葡糖苷酶接触；
所述内切氨基葡糖苷酶为来自重组的里氏木霉内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，其在IUBMB命名法中表示为EC3.2.1.96。
2.根据权利要求1的方法，其中在所述糖蛋白的纯化期间发生所述接触。
3.根据权利要求1的方法，其中在所述糖蛋白纯化后发生所述接触。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中与所述内切氨基葡糖苷酶的接触在高盐浓度下进行。
5.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中与所述内切氨基葡糖苷酶的接触在4℃温育和每mg总蛋白质使用0.5μg所述内切氨基葡糖苷酶进行。
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