KR102378455B1 - 진균의 엔지니어링된 숙주로부터 유래된 복합 글리칸의 생성 수단 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 단백질에서 매우 동종 형태의 복합 N-글리칸을 생성하기에 최적화된, 글리코-엔지니어링, 보다 특히 글리코실화-엔지니어링 진균 세포, 보다 특히 글리코실화-엔지니어링 효모 세포의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 특히 동종 형태의 복합 N-글리칸을 갖는 재조합 당단백질을 포함하는 약학 조성물을 수득하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로부터 유도된 신규 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

진균의 엔지니어링된 숙주로부터 유래된 복합 글리칸의 생성 수단 및 방법

본 발명은 재조합 단백질의 매우 동종 형태의 복합 N-글리칸을 생성하기에 최적화된, 글리코-엔지니어링, 보다 특히 글리코실화-엔지니어링 진균 세포, 보다 특히 글리코실화-엔지니어링 효모 세포의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 특히 동종 형태의 복합 N-글리칸을 갖는 재조합 당단백질을 포함하는 약학 조성물을 수득하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로부터 유도된 신규 약학 조성물에 관한 것이다.

CHO 세포주는 바이오의약품을 위해 선택되는 발현 시스템이고, 예를 들어 리툭산 (Rituxan), 후미라 (Humira) 및 엔브렐 (Enbrel) 과 같은 블록버스터 단일클론 항체를 만들기 위해 사용된다. 그러나, CHO 세포주의 제조 비용은 매우 높으며, 보다 낮은 비용으로 저렴한 의약품을 제조하기 원하는 경우, 대안적인 숙주 유기체로 전환할 필요가 있다. 예를 들어, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 와 같은 글리코-엔지니어링된 진균 유기체는 복합 N-글리코실화 구조를 갖는 재조합 당단백질을 생성할 수 있지만, 진균 유기체의 글리코실화 능력을 추가로 엔지니어링하는 것을 요구한다. 실제로, 여전히 재조합 단백질에 존재하는 효모-유사 당류의 유의한 백그라운드 (background) 가 존재한다. 당단백질을 대부분 Man₈GlcNAc₂ N-글리칸으로 개질시키는 신규한 완전 피키아 파스토리스 OCH1 녹-아웃이 최근 기재되었으나 (Krainer FW et al (2013) Sci Rep 3:3279), 재조합 당단백질이 이러한 돌연변이 균주에서 생성된 경우, 여전히 상당한 양의 효모-형 고 만노오스 글리코개질물 (glycomodification) 의 백그라운드가 존재하였다. OCH1 녹-아웃 균주에 대한 보다 이전의 보고에서, 유사한 관찰이 이루어졌다 (Davidson RC et al (2004) Glycobiology 14(5):399). 이후의 연구에서, 백그라운드는 주로 포스포만노실화에 기인하였고, 여전히 알려지지 않은 만노실트랜스페라아제의 게놈에서의 존재에 기인하였다. 본 출원에서, 복합 글리코-엔지니어링 피키아 파스토리스 균주에서 IL-22 의 상이한 복합 글리코형태를 생성하였다. 광범위한 글리코-엔지니어링에도 불구하고, 상당한, 매우 이종의 백그라운드가 생성된 글리코형태에 여전히 존재했다는 것을 또한 관찰하였다. 이질성의 일부는 복합형 N-글리칸으로 완전 가공되지 않은 샘플의 중간체로부터 유래하지만, 상당한 N-글리칸 분획이 다양한 다른 올리고-만노오스- 및 하이퍼만노실형 N-글리칸으로 이루어졌다는 것을 발견하였다. 녹-인 (knock-in) 구조체의 불안정성으로 인해 균주의 세포의 분획이 야생형 OCH1 으로 되돌아갈 수 있는 가능성이 존재하지만, 다른 내인성 글리코실트랜스페라아제가 원인일 가능성이 보다 높다. 여전히 특징규명되지 않은 글리코실트랜스페라아제가 심지어 복합 글리코-엔지니어링된 균주에서도 글리코형태의 이질성을 야기하고, 피키아 파스토리스에서 Och1p 와 유사한 활성을 가질 수 있다고 여겨진다.

이와 더불어, 본 출원에서는, 또한 매우 예상하지 못한 구조를 갖는 4당류 개질물을 갖는, Man₅GlcNAc₂ N-글리칸을 포함하는, OCH1 돌연변이 형성된 피키아 균주에서 생성된 인간 IL-22 에 대한 신규한 유형의 네오글리칸을 특징규명하였다. 이러한 4당류 (Glcα1-2Manβ1-2Manβ1-3Glucα-) 치환물은 만노실 코어의 가장 안쪽의 α-1,3 암 (arm) 에 부착되어 있을 가능성이 높다. 또한, 글리코-엔지니어링 뮤린 IL-22 에 대한 유사한 N-글리칸이 관찰되었다 (데이터는 나타나지 않음). 상기 확인된 구조가 C. 알비칸스 (C. albicans) 의 기재된 면역원성 에피토프인 β-1,2-만노오스 잔기를 함유하기 때문에, 상기 N-글리칸의 존재는 치료적 사용을 위한 잠재성을 저해할 수 있다. 이러한 특정 N-글리칸은 이전에 기재된 네오글리코형태와 이의 구조가 다르며 (Gomathinayagam S. et al. (2011).Glycobiology. 21(12): 1606-15), 이는 N-글리코실화 경로 및 내인성 글리코실트랜스페라아제에 대한 우리의 이해가 여전히 제한되어 있다는 것을 보여준다. 나아가, 다른 것은 그렇지 않은 반면, 특정한 당단백질이 왜 추가의 개질을 일으키는 경향이 있는지가 또한 이해되지 않았다.

P. 파스토리스 (P. pastoris) 의 게놈 서열이 이용가능함에도 불구하고, 어떤 글리코실트랜스페라아제가 이러한 특정 네오글리코형태를 발생시키는지 알려져 있지 않다. 따라서, 특정 추가적인 내인성 글리코실트랜스페라아제의 녹-아웃은 간단하지 않다. 추가의 엔지니어링이 내인성 글리코실트랜스페라아제를 앞서 나감으로써 (outcompeting) 치환을 부분적으로 해결할 수 있지만, 엔지니어링의 후반부에서, 현재 기술로 구조를 측정하는 것이 어려운 올리고만노오스 백그라운드뿐 아니라 혼성 N-글리칸, Man₅GlcNAc₂ 를 비롯한 다수의 중간체가 재등장할 수 있었다. 또한, 심지어 고도로 글리코-엔지니어링된 균주에서도, 네오글리코형태가 또한 재조합 당단백질 상에서 형성될 수 있다. 네오글리코형태 형성을 방지 또는 해결하기 위한 유일한 방법은 모든 잠재적인 글리코실트랜스페라아제/글리코시다아제를 특징규명하고, 이러한 효소가 일부 바람직하지 않은 활성을 나타낼 수 있는 경우, 이를 녹-아웃시키는 것일 수 있다. 후자는 비실용적인 접근법일 수 있고, 심지어 네오글리코형태 형성에 대한 효과는 예측불가능할 수 있다. 백그라운드, 재등장 중간체 및 네오글리코형태-형성의 가능성으로 인해, 글리코-엔지니어링 진균 유기체에서 생성된 당단백질에 존재하는 복합 N-글리칸으로부터 잔류하는 진균형 글리코실화 백그라운드를 제거하는 것을 허용하는 전략을 설계하기 위한 분명한 요구가 존재한다.

현재까지, 복합 글리코-엔지니어링 진균 세포 시스템의 사용은, 목적이 당단백질을 탈글리코실화하는 것이 아닌 N-글리칸을 유지하는 것이기 때문에, 백그라운드를 제거하기 위해 당단백질을 생성한 후의 효소적 처리 (예를 들어, 특정 글리코시다아제 효소에 의한) 가 아닌 집중적 엔지니어링 방법에 대부분 초점이 맞춰져 있다. 피키아 파스토리스의 복합 N-글리칸 엔지니어링 균주에서 생성된 당단백질의 백그라운드를 제거하기 위해, T. 레세이 (T. reesei) 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 엔도T 를 사용하여 시험관 내 효소적 탈글리코실화를 통합하는 것이 시험되었다. 재조합 엔도T 는 인간 골지형 올리고-만노오스 N-글리칸을 방출할 수 있는 것으로 나타났지만, 인간 복합 N-글리칸은 이러한 효소를 위한 기질이 아니다 (Stals I. et al (2012) PLOS One 7(7) e40854 참조). 그러나, OCH1 의 돌연변이에 의해 유발된 일부 글리코형태를 비롯하여, 다수의 상이한 유형의 효모 N-글리칸이 바람직한 기질일 수 있고, 네오글리코형태를 형성할 수 있는지 여부는 알려져 있지 않다. 놀랍게도, 당단백질의 바이오활성이 유지될 수 있으면서, 혼성 N-글리칸, 효모 고 만노오스 N-글리칸 및 예상되지 않은 네오글리코형태로 이루어지는 90% 초과의 백그라운드가 처리 후 소멸됨에 따라, 이러한 작업에서 엔도T 는 매우 잘 수행되었다.

나아가, 시험관 내 반응이 정제 중 암모늄 술페이트 분획에 존재하는 높은 염 농도와 양립할 수 있고, 놀랍게도 이러한 반응이 4℃ 에서 수행될 수 있다는 것을 발견하였다. 엔도T 가 이러한 바람직하지 않은 조건에서 작동될 수 있는 것을 관찰하였기 때문에, 이의 적용가능성은 확장된다.

바람직하지 않은 백그라운드를 제거하기 위한 시험관 내 엔도글루코사미니다아제 클린-업 (clean-up) 단계와 함께, 당단백질 상에 우성 인간 복합형 N-글리코형태를 생성하는 복합 N-글리코실화 글리코-엔지니어링된 피키아-균주를 사용하는 것은, 복합형 N-글리칸의 매우 순수한, 맞춤형의 N-글리코형태를 제조하기 위한 강력한 도구를 제공한다.

따라서, 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체에서 생성된 재조합 당단백질이 하나의 기능적 N-글리코실화 수용체 부위를 갖는 경우, 이러한 재조합 당단백질이 배지로부터 정제되고, 적합한 양의 엔도글루코사미니다아제와 외인적으로 접촉되는 경우 복수의 글리코형태가 생성된다. 이러한 글리코형태는 하기 다양한 N-글리칸이 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체에서 형성되기 때문에 나타난다: i) 혼성 N-글리칸, ii) 고 만노오스형 N-글리칸, iii) 예측불가능한 N-글리칸 네오글리코형태 (추가로 실시예 섹션 참조) 및 iv) 특정 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체에 대해 예측된 바와 같은 의도된 복합 N-글리칸. 엔도글루코사미니다아제와의 접촉 (예를 들어, 재조합 당단백질의 배지에 외인적으로 적용 및 첨가되거나, 정제 조건 중 첨가되거나, 정제 후 첨가됨) 은 90% 초과의 혼성 N-글리칸 및 고만노오스형 N-글리칸을 제거할 것이고, 또한 예측불가능한 N-네오글리코형태를 제거할 것이며, 이는 단일 GlcNAc 글리칸 구조로 이루어지는 N-글리칸의 형성을 유도할 것이다. 참고로, 단일 GlcNAc 글리칸을 갖는 글리코형태는 실시예 2 및 3 에 개괄된 방법으로 시각화되지 않을 것이고 (또는 측정될 수 없음), 단지 질량 분광계 분석 방법으로만 검출될 수 있다. 수득된 복합 N-글리칸은 엔도글루코사미니다아제와 접촉시 분해되지 않을 것이다. 그 결과, 재조합 당단백질의 "복수의 글리코형태" 가 수득될 것이다 (복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체에서 생성된 재조합 당단백질에 존재하는 모든 N-글리칸 전체의 시각화에 의해 추정됨). 따라서, 복수 개는 복합형의 N-글리칸을 지칭하고, N-글리칸은 단일 GlcNAc 및 20% 미만, 바람직하게는 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 심지어 1% 미만의, 혼성형 N-글리칸 또는 고만노오스형 N-글리칸 또는 N-글리칸 네오글리코형태의 N-글리칸으로 이루어진다.

WO2010/015722 는 엔도글루코사미니다아제, 포유류 글리코실트랜스페라아제 및 이종 당단백질의 공동-발현을 기재한다. 후자의 엔지니어링된 세포 시스템에서, 엔도글루코시다아제 효소는 골지의 특정 구획을 표적으로 한다. 후자의 시스템이 외인성 당단백질을 포함하는 진균에서 적용되는 경우, 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸을 포함하는 재조합 당단백질이 생성된다. 후자는 시험관 내 적용되고, 복합 글리코-엔지니어링 진균 세포가 엔도글루코사미니다아제를 공동-발현하지 않고, 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸의 혼합물을 갖는 재조합 당단백질이 생성되는 본 발명의 방법과 대조적이다. 이를 더욱더 명확하게 하기 위해, 단지 하나의 N-글리코실화 수용체 부위를 갖는 당단백질이 복합 글리코-엔지니어링 진균 유기체에서 생성되고, 생성 후 수득된 당단백질이 후속하여 시험관 내에서 엔도글루코사미니다아제와 처리 (또는 접촉) 되는 경우, 수득된 당단백질에 존재하는 글리코형태는 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸의 혼합물로 이루어진다. 2 개의 N-글리코실화 수용체 부위를 갖는 당단백질이 복합 글리코-엔지니어링 진균 유기체에서 생성되고, 생성 후 수득된 당단백질이 후속하여 시험관 내에서 엔도글루코사미니다아제와 처리 (또는 접촉) 되는 경우, 단일 당단백질에 존재하는 N-글리코실화 부위는 i) 하나는 복합 N-글리칸이고, 다른 하나는 단일 GlcNAc 로 이루어질 수 있거나, ii) 둘 모두가 단일 GlcNAc 일 수 있거나, iii) 둘 모두가 복합 N-글리칸일 수 있다.

엔도H 와 같은 엔도글루코사미니다아제는 일반적으로 PNGaseF 분해와 유사한 SDS-PAGE 겔에서의 분석의 일부로서 당단백질을 탈글리코실화하기 위해 사용된다. 그러나, PNGaseF 분해는 단백질을 탈글리코실화하기 위한 의도와 함께, SDS-PAGE 에서 N-글리코실화 프로파일을 측정하기 위해 변성된 단백질에서 수행된다. 유사하게, 결정학 목적을 위해, 당단백질은 흔히 또한 탈글리코실화된다. 그러나, 분해는 단백질 구조를 측정하기 위해 변성 없이 수행되어야 하거나, 복원/리폴딩 (renaturation/refolding) 단계가 수행되어야 한다. 수득된 당단백질을 약학적 용도로 추가로 사용하려는 목적을 갖는 시험관 내 클린-업 도구로서 엔도글루코사미니다아제의 사용 (후-발효, 예를 들어 정제 중 또는 정제 후) 은 당업계에서 연구되지 않았다. 복합 N-글리칸을 갖는 당단백질을 생성하는 복합 글리코-엔지니어링 효모 플랫폼에 대한 엔도글루코시다아제 클린-업은 아직까지 보고되지 않았고, 엔도글루코사미니다아제를 이용한 생체 외 인큐베이션 단계는 심지어 반직관적인 것으로 간주된다.

도 1. 4℃ 에서 가용화된 Gal ₂ Gn ₂ M ₃ IL-22 ^WT 암모늄 술페이트 분획에 대한 엔 도T 투여의 투여량-연구 (dose-finding). 암모늄 술페이트 침전 분획을 가용화시키고, 재조합 엔도T 의 양을 증가시키면서 동등한 양의 총 단백질 (㎍/mg 총 단백질) 을 4℃ 에서 밤새 분해시켰다. 대조군에는 엔도T 없이 동등한 부피 25 mM MES pH5.5 를 보충하였다. 제안된 N-글리칸 구조가 나타나 있다. 상부 패널 (덱스트란) 및 하부 패널은 덱스트란 참조 표준물 및 RNaseB 로부터의 Man₅GlcNAc₂ (M5-9) 참조 N-글리칸이다. 범례 중 기호는 코어 Man₁GlcNAc₂ N-글리칸의 단당류를 고려하지 않는다. * 은 미확인 N-글리칸을 나타낸다.
도 2. 4℃ 에서 가 용화된 Gal ₂ Gn ₂ M ₃ IL-22 ^N21 암모늄 술페이트 분획 에 대한 엔도T 투여량-연구 . 암모늄 술페이트 침전 분획을 가용화시키고, 재조합 엔도T 의 양 (㎍ 엔도T/mg 총 단백질) 을 증가시키면서 동등한 양의 총 단백질을 4℃ 에서 밤새 분해시켰다. 대조군에는 엔도T 없이 동등한 부피 25 mM MES pH5.5 를 보충하였다. 제안된 N-글리칸 구조가 나타나 있다. 상부 패널 (덱스트란) 및 하부 패널은 덱스트란 참조 표준물 및 RNaseB 로부터의 Man₅GlcNAc₂ (M5-9) 참조 N-글리칸이다. 범례 중 기호는 코어 Man₁GlcNAc₂ N-글리칸의 단당류를 고려하지 않는다. * 은 미확인 N-글리칸을 나타낸다.
도 3. 잭 빈 (Jack Bean) α-만노시다아제 분해가 잔류 백그라운드를 밝 힘 . 4℃ 에서 엔도T (㎍ 엔도T/mg 로 제시됨) 에 의해 이전에 분해된 Gal₂Gn₂M₃IL-22^WT 샘플로부터의 암모늄 술페이트 분획으로부터 방출된 APTS-라벨링된 N-글리칸을 잭 빈 α-만노시다아제와 함께 잠시 인큐베이팅하였다. 대조 샘플은 엔도T 및 α-만노시다아제 둘 모두로도 분해되지 않으며, 미처리된 암모늄 술페이트 분획의 N-글리칸 프로파일을 반영한다. 대조 샘플의 N-글리칸이 α-만노시다아제로 분해되는 경우, 코어 Man₁GlcNAc₂ 는 올리고-만노오스 N-글리칸의 가수분해의 결과로서 나타난다. 상부 패널은 덱스트란 참조 래더 (ladder) (덱스트란) 이다. 범례 중 기호는 코어 Man₁GlcNAc₂ N-글리칸의 단당류를 고려하지 않는다.
도 4. 잭 빈 α-만노시다아제 분해가 마이너 백그라운드를 밝힘. 4℃ 에서 엔도T (㎍/mg 로 제시됨) 에 의해 이전에 분해된 Gal₂Gn₂M₃ IL-22^N21 샘플로부터 방출된 APTS-라벨링된 N-글리칸을 잭 빈 α-만노시다아제와 함께 잠시 인큐베이팅하였다. 대조 샘플은 엔도T 및 α-만노시다아제 둘 모두로도 분해되지 않으며, 미처리된 암모늄 술페이트 분획의 N-글리칸 프로파일을 반영한다. 대조 샘플의 N-글리칸이 α-만노시다아제로 분해되는 경우, 코어 Man₁GlcNAc₂ 는 올리고-만노오스 N-글리칸의 가수분해의 결과로서 나타난다. 상부 패널은 덱스트란 참조 래더 (덱스트란) 이다. 범례 중 기호는 코어 Man₁GlcNAc₂ N-글리칸의 단당류를 고려하지 않는다.
도 5. 엔도T 처리된 hIL-22 ^WT 의 SDS-PAGE 분석. 엔도T 처리된 암모늄 술페이트 분획으로부터의 샘플을 SDS-PAGE 로 분석하였다. 패널 a. 4℃ 에서 수행된 투여량-연구 (㎍ 엔도T/mg 총 단백질로 나타남) 의 쿠마시 염색 겔. 화살표는 재조합 엔도T 에 해당하는 밴드를 나타낸다. 비(非)글리코실화 IL-22^WT 는 "0" 으로 나타나고, 3 개 이하의 N-글리칸을 갖는 글리코형태는 1 내지 3 으로 나타난다. 올리고-만노오스 백그라운드로 인한 스미어링 (smearing) 은 별표로 표시된다. 패널 b. 이전 패널에서와 동일한 샘플에 대한 hIL-22 에 대한 웨스턴 블롯. 패널 c. 과노출은 두드러진 스미어링에 의해 입증되는 임의의 잔류 백그라운드를 명확히 시각화한다. 분자 마커 (MM) 가 나타나고, 분자량은 kDa 로 제시된다.
도 6. 엔도T 처리된 hIL-22 ^N21 의 S DS-PAGE 분석. Gal₂Gn₂M₃-IL22^N21 의 엔도T 처리된 암모늄 술페이트 분획으로부터의 샘플을 SDS-PAGE 로 분석하였다. 패널 a. 4℃ 에서 수행된 투여량-연구 실험 (㎍/mg 총 단백질로 나타남) 의 쿠마시 염색 겔. 화살표는 재조합 엔도T 를 나타낸다. 비글리코실화 IL-22 는 "0" 으로 나타나고, 단일 N-글리코형태는 "1" 로 나타난다. 잠재적 분해를 △ 로 나타낸다. 패널 b. 이전 패널에서와 동일한 샘플에 대한 hIL-22 에 대한 웨스턴 블롯. 분자량 마커 (MM) 는 kDa 로 제시된다.
도 7. 엔도T 처리된 hIL-22 ^WT 의 정제. Gal₂Gn₂M₃-hIL-22^WT 로부터의 암모늄 술페이트 분획에 0.5 ㎍ 엔도T/(mg 총 단백질) 를 첨가하고, 4℃ 에서 밤새 유지시킨 후 SephadexG25 컬럼을 통해 탈염시켰다 (상부 왼쪽). 탈염 샘플을 Q-Sepharose 상에 로딩하고, 통과액을 수집하고, 컬럼에 벌크 오염물 및 재조합 엔도T 를 남겼다 (상부 오른쪽). 이후, IL-22 글리코형태를 S15 Source 에서 용리 중 분리하였다 (하부 왼쪽). 순수 IL-22 글리코형태를 풀링하고 Superdex75 컬럼에서 폴리싱하였다 (하부 오른쪽). IL-22 를 함유하는 분획을 회색으로 나타낸다. 검정색 실선: 280 nm 에서의 흡광도 (mAU), 회색 선: 전도도 (mS/cm), 회색 점선: 컬럼을 용리시키기 위해 적용되었던 NaCl 구배 (0-100% 완충액 B, 축에 표시되지 않음).
도 8. 엔도T 처리된 hIL-22 의 정제. Gal₂Gn₂M₃hIL-22^N21 암모늄 술페이트 분획에 1 ㎍ 엔도T/(mg 총 단백질) 를 첨가한 다음, SephadexG25 컬럼을 통해 탈염시켰다 (상부 왼쪽). 탈염 샘플을 Q-Sepharose 상에 로딩하고, 통과액을 수집하였다. 재조합 엔도T 포함 벌크 오염물을 1 M NaCl 로 용리될 때까지 컬럼에 유지시켰다 (상부 오른쪽). 이후, IL-22 글리코형태를 S15 Source 에서 용리 중 분리하였다 (하부 왼쪽). 순수 IL-22 글리코형태를 풀링하고, Superdex75 컬럼에서 폴리싱하였다 (하부 오른쪽). IL-22 를 함유하는 분획을 회색으로 나타낸다. 검정색 실선: 280 nm 에서의 흡광도 (mAU), 회색 선: 전도도 (mS/cm), 회색 점선: 컬럼을 용리시키기 위해 적용되었던 구배 (0-100% 완충액 B, 축에 표시되지 않음).
도 9. 엔도T 처리된 hIL-22 의 정제 중 글리코형태 분리. 패널 a. Gal₂GlcNAc₂hIL-22^WT 의 S15 Source 용리 프로파일의 세부사항이 나타나 있다. 뚜렷한 피크는 1-3 으로 넘버링되고, 이는 각각 1-3 개의 N-글리칸을 갖는 글리코형태를 나타낸다. 비글리코실화 분획을 "0" 으로 나타낸다. 수집된 분획을 도면에 제시한다. 검정색 실선: 280 nm 에서의 흡광도 (mAU), 회색 선: 전도도 (mS/cm), 회색 점선: 컬럼을 용리시키기 위해 적용되었던 NaCl-구배 (축에 표시되지 않음). 패널 b. S15 Source 용리 분획의 SDS-PAGE 분석, 1-3 개의 N-글리칸을 갖거나 N-글리칸을 갖지 않는 글리코형태를 이에 따라 넘버링한다. 분해 생성물에 관한 피크를 △ 로 나타낸다. 패널 c. S-Source 컬럼의 용리를 기반으로, 샘플을 풀링하고 Superdex75 컬럼에서 폴리싱하여, 상이한 글리코실화도를 갖는 3 개의 매우 순수한 분획 (N-글리코실화, 혼합 분획 및 매우 비글리코실화된 분획) 을 산출하였다. 패널 d. N-글리코실화 분획으로부터의 샘플을 환원 (+DTT) 및 비환원 (-DTT) 조건 하에서 비교하였다. 패널 e. 단지 올리고-만노오스 또는 혼성 N-글리칸만을 절단하고, 복합 N-글리칸은 절단하지 않는 엔도H (*) 에 의해, 및 올리고-만노오스 및 복합 N-글리칸 모두를 제거할 수 있는 PNGaseF(<) 에 의해 구별적으로 N-글리코실화 풀을 분해하였다. 상이한 수의 N-글리칸을 갖는 글리코형태를 이전과 같이 넘버링한다 (0, 1-3 및 분해에 대해 △). 분자량 마커 (MM), 질량을 kDa 로 제시한다.
도 10. 엔도T 처리된 hIL-22 ^N21 의 정제 중 글리코형태 분리. 패널 a. Gal₂Gn₂M_3-hIL-22^N21 의 S15 Source 용리 프로파일의 세부사항이 나타나 있다. 비글리코실화 IL-22^N21 을 "0" 으로 나타낸다. 단일 글리코형태는 "1" 로 표기한다. 가정된 분해 생성물을 "△" 로 나타낸다. 수집된 분획을 도면에 제시한다. 청색선: 280 nm 에서의 흡광도 (mAU), 갈색선: 전도도 (mS/cm), 녹색선: 컬럼을 용리시키기 위해 적용되었던 구배 (축에 표시되지 않음). 패널 b. S15 Source 용리 분획의 SDS-PAGE 분석, 1 개의 N-글리칸을 갖거나 N-글리칸을 갖지 않는 글리코형태를 이에 따라 넘버링한다. 분해 생성물을 "△" 및 "△2" 로 나타낸다. 패널 c. S-Source 컬럼의 용리를 기반으로, 샘플을 풀링하고, Superdex75 컬럼에서 폴리싱하여, 상이한 글리코실화도를 갖는 3 개의 매우 순수한 분획 (N-글리코실화, 혼합 분획 및 매우 비글리코실화된 분획) 을 산출하였다. 패널 d. 매우 N-글리코실화된 분획으로부터의 샘플을 환원 (+DTT) 및 비환원 (-DTT) 조건 하에서 비교하였다. 패널 e. 올리고-만노오스 및 복합 N-글리칸 모두를 제거하는 PNGaseF(<) 에 의해 구별적으로 N-글리코실화 풀을 분해하고, 단지 올리고-만노오스 또는 혼성 N-글리칸만을 분해하고, 복합 N-글리칸은 분해하지 않는 엔도H (*) 와 비교하였다. 상이한 수의 N-글리칸을 갖는 글리코형태를 이전과 같이 넘버링한다 (0, 1 및 분해에 대해 △). 분자량 마커 (MM), 질량을 kDa 로 제시한다.
도 11. 엔도T 처리된 hIL-22 ^WT 에 대한 대조 분해. 패널 a. 미처리된 hIL-22 함유 암모늄 술페이트 (레인 2 & 3) 또는 엔도T 처리된 정제 hIL-22 (레인 4 & 5) 로부터의 APTS-라벨링된 N-글리칸을 잭 빈 α-만노시다아제로 분해하여, 임의의 올리고-만노오스 백그라운드의 존재를 밝혔다 (레인 3 및 5). 대조 샘플의 N-글리칸이 α-만노시다아제로 분해되는 경우, 코어 Man₁GlcNAc₂ 는 올리고-만노오스 N-글리칸의 가수분해의 결과로서 나타난다. 패널 b. 엔도T-처리 후, 정제 hIL-22 로부터의 APTS-라벨링된 N-글리칸에 대한 엑소글리코시다아제 대조 분해. 미분해 샘플은 프로파일에서 우세한 피크를 보이고, 이는 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 및 마이너 GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 이성질체에 더불어 잔류 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 를 나타낸다 (레인 2). β-1,4-갈락토시다아제로의 분해는 비-환원 말단에서 갈락토오스 잔기를 제거하고, 단지 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-글리칸 만을 남긴다 (레인 3). β-N-아세틸헥소사미니다아제로의 추가의 분해는 말단 GlcNAc 모이어티를 제거하고, 단지 트리만노실 Man₃GlcNAc₂-코어만을 남긴다 (레인 4). 잭 빈 α-만노시다아제로의 추가의 분해는 N-글리칸을 코어로 트리밍 (trim) 한다. 대조 샘플은 엔도T 및 α-만노시다아제 둘 모두로도 분해되지 않고, 미처리된 암모늄 술페이트 분획의 N-글리칸 프로파일을 반영한다. 상부 패널은 덱스트란 참조 래더 (덱스트란) 이다. 하부 패널은 RNaseB 로부터의 참조 Man_5-9GlcNAc₂ N-글리칸 (M5-9) 을 나타낸다. * 은 미확인 N-글리칸을 나타낸다. 해석할 수 없는 또 다른 신호는 "?" 로 표시한다. 범례 중 기호는 코어 Man₁GlcNAc₂ N-글리칸의 단당류를 고려하지 않는다.
도 12. 엔도T 처리된 hIL-22 ^N21 에 대한 대조 분해 . 패널 a. 미처리된 hIL-22 함유 암모늄 술페이트 분획 (레인 2 & 3) 또는 엔도T 처리된 정제 hIL-22 (레인 4 & 5) 로부터의 APTS-라벨링된 N-글리칸을 잭 빈 α-만노시다아제로 분해하여, 임의의 올리고-만노오스 백그라운드의 존재를 밝혔다 (레인 3 및 5). 패널 b. 엔도T 처리 정제 hIL-22 로부터의 APTS-라벨링된 N-글리칸에 대한 엑소글리코시다아제 대조 분해. 미분해 샘플은 프로파일에서 우세한 피크를 보이고, 이는 아마 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 및 마이너 GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 이성질체에 더불어 잔류 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 를 보여준다 (레인 2). β-1,4-갈락토시다아제로의 분해는 비-환원 말단에서 갈락토오스 잔기를 제거하고, 단지 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-글리칸만을 남긴다 (레인 3). β-N-아세틸헥소사미니다아제로의 추가의 분해는 말단 GlcNAc 모이어티를 제거하고, 단지 트리만노실 Man₃GlcNAc₂-코어만을 남긴다 (레인 4). 잭 빈 α-만노시다아제로의 추가의 분해는 N-글리칸을 코어로 트리밍한다. 대조 샘플은 엔도T 및 α-만노시다아제 둘 모두로도 분해되지 않고, 미처리된 암모늄 술페이트 분획의 N-글리칸 프로파일을 반영한다. 대조 샘플의 N-글리칸이 α-만노시다아제로 분해되는 경우, 코어 Man₁GlcNAc₂ 는 올리고-만노오스 N-글리칸의 가수분해의 결과로서 나타난다. 상부 패널은 덱스트란 참조 래더 (덱스트란) 이다. 범례 중 기호는 코어 Man₁GlcNAc₂ N-글리칸의 단당류를 고려하지 않는다.
도 13. Colo-205 세포에서의 IL-22-의존성 IL-10 분비. E. 콜라이 (E. coli) 로부터 정제된 상업적 표준물 또는 정제된 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂-hIL22^N21 의 10배 희석물로 결장 암종 Colo-205 세포주를 밤새 자극하였다. 다음 날, IL-10 분비를 ELISA 로 측정하였다. 투여량 반응 곡선을 피팅하고, EC₅₀ 을 측정하였다.
도 14. 엔도T 가 N-글리칸 네오글리코형태를 절단함. 레인 2 는 플레이트 방법을 사용하여 제조된 정제 Man₅GlcNAc₂ 의 N-글리칸을 나타내고, 이는 예상된 Man₅GlcNAc₂ 뿐 아니라 Man_8-9GlcNAc₂ N-글리칸을 보여준다. 후자를 N-글리칸 엔지니어링 방법의 결과로서 신규한 구조로서 확인하였다. 동일한 샘플이 재조합 엔도T 로 사전-처리되는 경우, 샘플이 플레이트-방법에 따라 제조되는 경우, 더 이상 임의의 신호를 얻지 못한다 (레인 3). 그러나, 엔도T 분해 샘플이 바로 라벨링되는 경우, 엔도T-방출 N-글리칸은 분석될 수 있다 (레인 4). 엔도T 분해 N-글리칸은 PNGaseF 분해 N-글리칸과 유사한 프로파일을 갖지만, 환원 GlcNAc-잔기가 없다. 레인 5 는 바로 라벨링된 후 엔도T 의 N-글리칸 프로파일을 보인다. 레인 1 은 덱스트란 참조 표준물을 나타내고, 레인 6 은 RNaseB 로부터의 Man_5-9GlcNAc₂ 참조 N-글리칸 (M5-9) 을 나타낸다. hIL-22 에 대한 단당류 잔기의 치환은 완전히 특징규명되지 못했다. 따라서, 모든 단당류 구성성분은 유사하게 도시된다.
도 15. GlcNAc ₃ Man ₃ GlcNAc ₂ ProDerp1 의 모세관 전기영동 프로파일. 패널 1 은 덱스트란 표준물을 나타낸다. 패널 2 는 정제 GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂ ProDerp1 의 프로파일을 나타낸다. 패널 3 은 RNaseB 표준물을 나타낸다.
도 16. 엔도T 로 처리된 GlcNAc ₃ Man ₃ GlcNAc ₂ ProDerp1 의 모세관 전기영동 프로파일. 패널 1 은 덱스트란 표준물을 나타낸다. 패널 2 는 고-만노오스 백그라운드를 제거하기 위한 엔도T 로 처리된 GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂ ProDerp1 의 프로파일을 나타낸다. 피크의 확인은 하기 엑소글리코시다아제 분해를 수행함으로써 확인된다: β-N-아세틸헥소사미니다아제 (패널 3), α-1,2-만노시다아제 (패널 4), α-1,2/3/6-만노시다아제 (패널 5), β-N-아세틸헥소사미니다아제 및 α-1,2/3/6-만노시다아제의 조합 (패널 6). 패널 7 은 RNaseB 표준물을 나타낸다.
도 17. GalNAc ₃ GlcNAc ₃ Man ₃ GlcNAc ₂ ProDerp1 의 모세관 전기영동 프로파일. 패널 1 은 덱스트란 표준물을 나타낸다. 패널 2 는 GalNAc₃GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂ ProDerp1 의 프로파일을 나타낸다. 패널 3 은 RNaseB 표준물을 나타낸다.
도 18. 엔도T 로 처리된 GalNAc ₃ GlcNAc ₃ Man ₃ GlcNAc ₂ ProDerp1 의 모세관 전기영동 프로파일. 패널 1 은 덱스트란 표준물을 나타낸다. 패널 2 는 고-만노오스 백그라운드를 제거하기 위한 엔도T 로 처리된 GalNAc₃GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂ ProDerp1 의 모세관 전기영동 프로파일을 나타낸다. 피크의 확인은 하기 엑소글리코시다아제 분해를 수행함으로써 확인된다: α-1,2-만노시다아제 (패널 3), β-N-아세틸헥소사미니다아제 (패널 4), β-N-아세틸글루코사미니다아제 (패널 5), α-1,2/3/6-만노시다아제 (패널 6), β-N-아세틸헥소사미니다아제 및 α-1,2/3/6-만노시다아제의 조합 (패널 7). GalNAc 및 GlcNAc 사이의 차이를 검출하기 위해, 말단 GalNAc 및 GlcNAc 잔기 모두를 제거할 수 있는 β-N-아세틸헥소사미니다아제 분해 (반면, β-N-아세틸글루코사미니다아제는 단지 말단 GlcNAc 잔기만을 제거할 수 있음) 를 수행한다. 패널 8 은 RNaseB 표준물을 나타낸다.
도 19. N-글리칸 정량화. IL-22 당단백질의 생성 후 수행된 엔도글루코사미니다아제 클린 업 단계의 효과 및 N-글리칸 정량화. 데이터는 클린-업 절차 후 복합 N-글리칸 구조의 극적 증가를 보여준다.
도 20. 재조합 생성 IL-22 의 갈락토실화 글리코형태의 정량화. 특정 복합 N-글리칸 정량화를 엔도글루코사미니다아제 클린-업 단계 후 계산하였다.

본원에 사용된 바, 하기 각각의 용어는 본 섹션에서 연관된 의미를 갖는다. 관사가 본원에서 사용되고, 이는 하나 또는 하나 초과 (즉, 하나 이상의) 의 문헌의 문법적 대상물을 의미한다. 예로서, "요소" 는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 지칭한다. 본원에 사용된 바, 양, 시간 등과 같은 측정가능한 값을 언급하는 경우 "약" 은 특정 값의 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게는 ±5%, 보다 더욱 바람직하게는 ±1%, 보다 더욱더 바람직하게는 ±0.1% 의 변화를 포함하는 것으로 의미되고, 이와 같은 변화는 개시된 방법을 수행하기에 적절하다. 유기체, 조직, 세포 또는 이의 성분의 문맥에서 사용되는 경우, 용어 "비정상" 은 "정상" (예상된) 해당 특징을 나타내는 유기체, 조직, 세포 또는 이의 성분으로부터 하나 이상의 관찰가능하거나 검출가능한 특징 (예를 들어, 연령, 치료, 상태 (time of day) 등) 이 상이한 유기체, 조직, 세포 또는 이의 성분을 지칭한다. 하나의 세포 또는 조직 유형에 대해 정상이거나 예상되는 특징은, 상이한 세포 또는 조직 유형에 대해서는 비정상일 수 있다. 기재된 도면은 단지 도식적이고, 비제한적이다. 도면에서, 일부 요소의 크기는 과장될 수 있고, 예시적 목적을 위해 일정 규모로 도시되지 않을 수 있다. 용어 "포함하는" 이 본 설명 및 청구범위에서 사용되는 경우, 이는 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않는다. 추가로, 본 설명 및 청구범위의 용어 제 1, 제 2, 제 3 등은 유사한 요소 간의 구별을 위해 사용되고, 반드시 순차적 또는 연대적 순서를 설명하는 것은 아니다. 이와 같이 사용된 용어는 적절한 상황 하에서 상호교환적이고, 본원에 기재된 본 발명의 구현예는 본원에 기재 또는 예시된 다른 서열에서 작동할 수 있는 것을 이해해야 한다. 본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 용어는 본 발명의 당업자가 인식하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 당업계의 정의 및 용어에 관하여, 실무자는 특히 문헌 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2012); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 100), John Wiley & Sons, New York (2012) 을 참조한다. 본원에서 제공된 정의는 당업자가 이해하는 것보다 더 적은 범위를 갖는 것으로 해석되어서는 안된다.

본원에 사용된 바, 용어 "뉴클레오티드 서열" 은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체성 형태, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체를 지칭한다. 뉴클레오티드 서열은 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 임의의 알려지거나 알려지지 않은 기능을 수행할 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 비제한적 예는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 전이 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 컨트롤 영역, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침, 및 프라이머를 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 선형 또는 원형일 수 있다.

본원에 사용된 바, 용어 "폴리펩티드" 는 코딩 및 코딩되지 않은 아미노산, 화학적 또는 생화학적으로 개질 또는 유도체화된 아미노산을 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산의 중합체성 형태, 및 개질된 펩티드 백본을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드 서열은 단일-레터 (또는 1 레터) 아미노산 코드 또는 3 레터 아미노산 코드 (본원에서 하기 도시된 바와 같음) 로 도시될 수 있다:

본원에 사용된 바, 용어 "발현 벡터" 는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 예컨대 람다 파지, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이랄, AAV 또는 바큐로바이랄 (baculoviral) 벡터, 또는 인공 염색체 벡터, 예컨대 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC), 또는 P1 인공 염색체 (PAC) 를 비롯하여 당업자에게 알려진 임의의 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 특히 숙주 유기체 (예를 들어, 고등 진핵생물, 하등 진핵생물, 원핵생물) 에서 작동가능하도록 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 목적하는 코딩 서열 및 적절한 프로모터 서열을 함유한다.

전형적으로, 벡터는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 발현가능한 프로모터 또는 조절 뉴클레오티드 서열은 mRNA 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 DNA 영역과 작용가능하도록 연결되거나, 이와 연관되어, 조절 뉴클레오티드 서열이 연관된 뉴클레오티드 서열의 전사 또는 발현을 조절할 수 있도록 한다. 전형적으로, 벡터의 프로모터 또는 조절 뉴클레오티드 서열은 자연에서 발견되는 연관된 뉴클레오티드 서열에 작용가능하도록 연결되지 않기 때문에, 이는 이에 작동가능하게 연결된 DNA 영역의 코딩 서열에 대해 이종이다. 본원에 사용된 바, 용어 "작용가능하도록 (operatively)" 또는 "작동가능하도록 (operably)" "연결된" 은 프로모터 서열이 논의되는 유전자의 전사를 개시할 수 있도록 하는, 논의되는 발현가능한 프로모터 서열과 DNA 영역 또는 유전자 사이의 기능적인 연결을 지칭하고, 진핵 세포에서의 전사의 적절한 종결을 보장하기 위한 논의되는 유전자와 전사 종결 서열 사이의 기능적인 연결을 지칭한다. "유도성 프로모터 (inducible promoter)" 는 비제한적으로 온도, pH, 특정한 영양분, 특정 세포 신호 등과 같은 외부 자극에 대한 반응으로 스위치 '온' 또는 '오프' 될 수 있는 (이로 인해, 유전자 전사를 조절) 프로모터를 지칭한다. 이는 프로모터가 지속적으로 스위치 '온' 되어 있는 것을 의미하는, 즉 유전자 전사가 구조적으로 활성인 "구조성 프로모터 (constitutive promoter)" 와 구별하기 위해 사용된다.

본원에 사용된 바, "글리칸" 은 일반적으로 글리코시드 연결된 단당류, 올리고당류 및 다당류를 지칭한다. 따라서, 당단백질, 당지질 또는 프로테오글리칸과 같은 글리코콘쥬게이트의 탄수화물 부분이 본원에서 "글리칸" 으로 지칭된다. 글리칸은 단당류 잔기의 동종- 또는 이종중합체일 수 있고, 선형 또는 분지형일 수 있다. N-연결 글리칸은 또한 본원에 추가로 예시된 GalNAc, 갈락토오스, 뉴라민산, N-아세틸글루코사민, 푸코오스, 만노오스, 및 기타 단당류로 구성될 수 있다.

진핵생물에서, O-연결 글리칸은 골지체 중 펩티드 사슬의 세린 또는 트레오닌 잔기에서 한 번에 하나의 당이 조립된다. N-연결 글리칸과는 달리, 알려진 공통 서열은 없지만, 세린 또는 트레오닌에 대해 -1 또는 +3 에서의 프롤린 잔기의 위치가 O-연결 글리코실화에 바람직하다.

"글리코-엔지니어링 세포" 는 야생형 백그라운드에 비해 변경된 N-글리칸 구조 및/또는 O-글리칸 구조를 갖는 단백질을 발현하도록 유전적으로 개질된 세포를 지칭한다. 전형적으로, 당단백질에서의 자연 발생 개질은 글리코실화 경로에 수반되는 효소의 유전자 엔지니어링에 의해 변경되어 왔다. 일반적으로, N-연결 글리코실화의 당 사슬은 3 가지 유형으로 나눠질 수 있다: 고-만노오스 (전형적으로 효모), 복합 (전형적으로 포유류) 및 혼성형 글리코실화. 이외에도, 예를 들어 포유류 세포의 뮤신형 O-글리코실화와 상이한 효모 올리고만노실글리칸의 다양한 O-글리칸 패턴이 존재한다. 상이한 유형의 N- 및 O-글리코실화가 모두 당업자에게 잘 알려져 있고, 문헌에 정의되어 있다. 목적되는 N- 및/또는 O-글리코실화 패턴을 갖는 당단백질을 생성하는 진핵 세포의 엔지니어링을 위한 전략의 최적화 및 확인에 대한 상당한 노력이 진행되어 왔고 업계에 알려져 있다 (예를 들어, De Pourcq, K. et al., Appl Microbiol Biotechnol. 87(5), 2010). 이와 같은 글리코-엔지니어링 발현 시스템 중 하나의 비제한적 예는 특허 문헌 WO2010015722 에 기재되어 있고, 이는 엔도글루코사미니다아제 및 표적 단백질 모두를 발현하는 (고등 또는 하등) 진핵 세포에 관한 것이고, 여기서 재조합 분비된 표적 단백질은 균일한 N-글리코실화 패턴 (특히, 하나의 단일 GlcNAc 잔기 (하등 진핵생물에서)) 또는 이의 개질물, 예컨대 갈락토오스로 개질된 GlcNAc (LacNAc) 또는 시알릴-LacNAc (포유류 세포에서) 을 특징으로 한다. 또한 포함되는 것은 글리코실화 패턴이 인간-유사형이거나 인간화되는 단백질 또는 당단백질 (즉, 복합형 당단백질) 을 발현하도록 유전적으로 개질된 세포이다. 이는 불활성화된 내인성 글리코실화 효소를 갖고/갖거나 복합 글리코실화에 필요한 하나 이상의 효소를 인코딩하는 하나 이상의 다른 외인성 핵산 서열을 포함하는, 세포, 특히 하등 진핵 세포를 제공함으로써 달성될 수 있다. 불활성화될 수 있는 내인성 글리코실화 효소는 알파-1,6-만노실트랜스페라아제 Och1p, Alg3p, 알파-1,3-만노실트랜스페라아제 (Mnn1p 계열의), 베타-1,2-만노실트랜스페라아제를 포함한다. 복합 글리코실화에 필요한 효소는, 비제한적으로 하기를 포함한다: N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 I, N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 II, 만노시다아제 II, 갈락토실트랜스페라아제, 푸코실트랜스페라아제 및 시알릴트랜스페라아제, 및 공여자 당 뉴클레오티드 합성 또는 수송에 수반되는 효소. 또한, 본원에 고안된 다른 글리코-엔지니어링 세포, 특히 효모 세포는 고만노오스 구조 (고만노오스-형 글리칸) 의 생성에 수반된 하나 이상의 효소가 발현되지 않는 것을 특징으로 한다. 고만노오스 구조의 생성에 수반된 효소는 전형적으로 만노실트랜스페라아제이다. 특히, 알파-1,6-만노실트랜스페라아제 Och1p, Alg3p, 알파-1,3-만노실트랜스페라아제 (Mnn1p 계열의), 베타-1,2-만노실트랜스페라아제는 발현되지 않을 수 있다. 따라서, 세포는 부가적으로 또는 대안적으로, 특정 N-글리칸 구조의 고 수율 생성을 허용하는, 하나 이상의 효소 또는 효소 활성을 발현하기 위해 엔지니어링될 수 있다. 이와 같은 효소는, 예를 들어 효소와 일반적으로 관련되지 않은 신호 펩티드를 이용하여, 효소가 최적의 활성을 가질 숙주 세포하 소기관을 표적으로 할 수 있다. 본원에 기재된 효소 및 이의 활성은 당업계에 잘 알려져 있다는 것이 명백해야 한다.

본 출원에서 사용된 바, '당단백질' 은 이의 정상적인 생리학적 맥락 및/또는 이의 기능적인 형태에서, 이의 폴리펩티드 측쇄에 공유 결합된 올리고당 사슬 (글리칸) 을 함유하는 단백질을 지칭한다. 또한, 당단백질은 인공적으로 도입된 글리코실화 부위를 갖는 임의의 단백질이다. 전형적으로 당단백질, 전형적으로 재조합 당단백질, 예를 들어 이종 재조합 당단백질 (이는 일반적으로 진균 또는 효모 유기체에서 발생하지 않음) 은 글리코실화-엔지니어링 진균 또는 효모 유기체에서 만들어진 경우, 여러 글리코형태로서 생성된다. 상이한 글리코형태 (심지어 (재조합) 당단백질 상의 하나의 특정 기능적 N-글리코실화 부위로부터 유래됨) 가 발생할 수 있는데, 이는 N-글리코실화의 방법의 본질 때문이다. 본질적으로, 복합 N-글리코실화 글리칸 (특히, 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체에서의) 의 형성은 100% 효율적이지 않기 때문에 상이한 글리코형태가 당단백질에 존재하는 특정 N-글리칸 위치에서 발생한다. 따라서, 당단백질 (예를 들어, 2 개의 N-글리칸 수용체 부위를 갖는 당단백질) 에서, 하나의 N-글리칸은 복합 N-글리칸이고, 다른 하나의 N-글리칸은 혼성 글리칸 또는 고-만노오스형 글리칸일 수 있다. 특히, 본원에 사용된 바와 같은 당단백질은, 이의 생리학적 활성 형태에서 N-글리코실화를 나타내는 단백질이다. 따라서, 당단백질은 통상적으로 적어도 하나의 아스파라긴 잔기에 당 사슬을 함유한다. 당단백질의 비제한적 목록이 본 명세서에 제공된다. 용어 '당단백질' 은 아미노산 사슬의 길이를 지칭하고자 의도되지 않고, '당펩티드' 는 '당단백질' 의 정의 내에 포함된다.

본 출원에서 사용된 바, 용어 '(당)단백질' 및 '효소' (예를 들어, 엔도글루코사미니다아제, 글리코실트랜스페라아제, 만노시다아제, 만노실트랜스페라아제) 는 또한 자연 발생 단백질의 기능적으로 활성인 단편 및 변이체를 포함하기 위해 의도된다. 확실히, 다수의 (예를 들어, 치료적) 단백질에 있어서, 단백질의 일부는 (예를 들어, 치료적, 효소적) 효과를 달성하기에 충분할 수 있다. 이는 변이체 (즉, 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었으나, 기능성을 보유하거나, 심지어 개선된 기능성을 나타내는 단백질), 특히 효소적 활성을 위해 최적화된 효소의 변이체에도 동일하게 적용된다.

본 출원의 맥락상, 당단백질은 단백질 그 자체를 지칭하고; 당단백질은 이의 글리코실화 또는 비-글리코실화 형태일 수 있다. '글리코실화' 단백질은 하나 이상의 올리고당 사슬을 갖는 (당)단백질이다. N-글리코실화 단백질, 특히 N-글리코실화 재조합 당단백질은 N-글리칸 상에 하나 이상의 올리고당 사슬을 갖는 당단백질이다.

본 발명에서 사용된 바, '글리코형태' 는 글리코실화 당단백질의 변이체이고, 여기서 변이체는 상기 당단백질에 존재하는 N-글리칸 조성 내에 있다.

본원에 사용된 바, '당 사슬', '올리고당 사슬' 또는 '탄수화물 사슬' 은 청구범위에서 N-글리칸 (N- 은 N-글리코실화를 의미함) 으로 지칭된다. 당 사슬은 분지형이거나, 그렇지 않을 수 있고, 하나 이상의 유형의 올리고당류를 포함할 수 있다. 일반적으로, N-연결 글리코실화의 당 사슬은 3 가지 유형으로 분류될 수 있다: 고-만노오스, 복합 및 혼성형의 글리코실화. 이러한 용어는 당업자에 잘 알려져 있고, 문헌에 정의되어 있다. 간략하게, 고-만노오스형의 글리코실화는 통상적으로 (가능한 많은) 만노오스 및/또는 만노실포스페이트 잔기 (그러나, 통상적으로 다른 단당류는 부재함) 를 갖는 2 개의 N-아세틸글루코사민을 포함하는 올리고당 사슬을 지칭한다.

복합 글리코실화는 통상적으로 가장 흔하게는 내부 코어 구조 Man₃GlcNAc₂ 에 연결되어 있는, 통상적으로 1, 2 개 이상 (예를 들어, 6 개 이하) 의 최외 분지를 갖는 구조를 지칭한다. 예를 들어, 복합 N-글리칸은 하나 이상의 분지, 또는 둘 이상의 교대 GlcNAc 및 임의로 또한 다양한 올리고당류로 종결될 수 있지만 전형적으로 만노오스 잔기로는 종결되지 않을 것인 갈락토오스 (Gal) 잔기를 가질 수 있다. 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체에서 제조된 복합 N-글리칸의 여러 예가 첨부된 실시예 섹션에 나타나 있다. 명료함을 위해, 당단백질의 N-글리코실화 부위에 존재하는 단일 GlcNAc 는 복합 N-글리칸으로 간주되지 않는다.

혼성형 글리코실화는 중간체 형태, 즉 말단 만노오스 및 말단 비-만노오스 잔기에 더불어 2 개의 N-아세틸글루코사민 잔기를 갖는 글리코실화 단백질을 포함한다. 복합 글리코실화와 대조적으로, 혼성형 글리코실화 구조의 하나 이상의 분지는 만노오스 잔기에서 끝난다. 혼성 N-글리칸은 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체에 존재하는 이종 글리코실트랜스페라아제 효소의 비효율적인 글리코실화로부터 유래할 수 있다.

본 출원에서 사용된 바, '복합 N-글리코실화-엔지니어링 진균 유기체' 는 야생형 진균 유기체에서 발현되지 않는 복합 N-글리코실화에 필요한 효소를 인코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 발현하고/하거나, 일반적으로 야생형 진균에서 발현되는 고-만노오스형 구조의 생성에 수반된 하나 이상의 효소를 발현하지 않는, 진균 세포이다. 특히, 복합 N-글리코실화-엔지니어링 진균 유기체는 복합 N-글리코실화-엔지니어링 효모이다. 복합 N-글리코실화-엔지니어링 효모에 대해 엔지니어링될 수 있는 효모의 비제한적인 예는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)), 한세눌라 (Hansenula) 종 (예를 들어, 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha)), 아룩술라 (Arxula) 종 (예를 들어, 아룩술라 아데닌이보란스 (Arxula adeninivorans)), 야로위아 종 (예를 들어, 야로위아 리포라이티카 (Yarrowia lipolytica)), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종 (예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스 (Komagataella lactis)) 또는 코마가타엘라 파피 (Komagataella phaffii) (Kurtzman, C.P. (2009) J Ind Microbiol Biotechnol. 36(11)) (이는 이전에 명명되었고, 예전 명칭 피키아 파스토리스로 더 잘 알려져 있고, 본원에서 또한 추가로 사용됨) 를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 하등 진핵 세포는 피키아 세포이고, 보다 더욱 특정 구현예에서, 피키아 파스토리스 세포이다. 또한, 다른 '복합 N-글리코실화- 엔지니어링 진균 유기체' 는 마이셀리오프토라 써모필라　(Myceliopthora thermophila) (또한 Dyadic 사의 C1 으로도 알려짐), 아스페르길루스 (Aspergillus) 종 (예를 들어, 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 자포니쿠스 (Aspergillus japonicus)), 푸사리움 (Fusarium) 종 (예를 들어, 푸사리움 베네나툼 (Fusarium venenatum)), 하이포크레아 (Hypocrea) 및 트리코데르마 (Trichoderma) 종 (예를 들어, 트리코데르마 레세이 (T ichoderma reesei)) 를 포함한다.

특정 구현예에 있어서, 복합 N-글리코실화에 필요한 효소는 만노실트랜스페라아제 이외에 만노시다아제 또는 글리코실트랜스페라아제이다. 추가의 특정 구현예에 있어서, 복합 글리코실화에 필요한 하나 이상의 효소는 N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 I, N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 II, 만노시다아제 II, 갈락토실트랜스페라아제, 및 시알릴트랜스페라아제로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

특정 구현예에 있어서, 복합 N-글리코실화 효모 세포 (또는 약칭 글리코실화-엔지니어링 효모 세포 또는 글리코-엔지니어링 효모 세포) 는 고만노오스 구조 (고만노오스-형 글리칸) 의 생성에 수반된 하나 이상의 효소가 발현되지 않는 것 (또는 야생형 세포에서와 같이 세포에서 기능적으로 활성이 아닌 것) 을 특징으로 할 수 있다. 추가의 특정 구현예에 있어서, 하나 이상의 만노실트랜스페라아제는 글리코-엔지니어링 효모 세포에서 발현되지 않는다. 통상적으로, 글리코-엔지니어링 효모 세포에서 발현되지 않는 만노실트랜스페라아제는 효모 세포의 야생형 카운터파트 (counterpart) 에서 발현된다. 또한 추가의 특정 구현예에 있어서, 만노실트랜스페라아제는 α-1,2-만노실트랜스페라아제, α-1,3-만노실트랜스페라아제, α-1,6-만노실트랜스페라아제, 또는 β-1,4-만노실트랜스페라아제이다. 이러한 단백질은 흔히 효모에서 특이적 명칭 (예를 들어, Alg, Och, Mnn) 을 갖고, 이의 활성은 당업계에 잘 알려져 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 하나 이상의 만노실포스페이트 트랜스페라아제는 복합 N-글리코실화-엔지니어링 효모 세포에서 기능적으로 활성이 아니다.

본원에 사용된 바, '엔도글루코사미니다아제' 는 당단백질 또는 당지질의 올리고당류 및 이의 아글리콘 (aglycon) 의 비말단 베타-연결 N-아세틸글루코사민 잔기의 아노머성 탄소 간의 결합을 가수분해함으로써, 당단백질 또는 당지질 또는 당 중합체로부터 단당류 또는 올리고당류를 방출시키는 효소를 지칭한다. 엔도글루코사미니다아제는 글리코시다아제의 하위세트이며, 다른 효소적 활성 (예를 들어, 글리코실트랜스페라아제 활성과 같은) 을 가질 수 있거나, 갖지 않을 수 있다. 생화학 및 분자 생물학 국제 연합 (International Union of Biochemistry and Molecular biology, IUBMB) 명명법에서 EC 3.2.1.96 으로서 지정된 특정 부류의 엔도글루코사미니다아제는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 또는 만노실-당단백질 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제에 의해 형성된다. 이러한 특정 부류의 효소는 -[Man(GlcNAc)₂]Asn- 구조를 함유하는 고-만노오스 당펩티드 및 당단백질의 N,N'-디아세틸키토비오실 단위의 내부가수분해 (endohydrolysis) 를 촉매화할 수 있다. 하나의 N-아세틸-D-글루코사민 (GlcNAc) 잔기는 단백질에 부착된 채로 있고; 나머지 올리고당류는 손상되지 않은 채 방출된다. 따라서, 결과물은 당단백질에 존재하는 단일 GlcNAc-개질된 N-글리코실화 부위이다. 개질된 GlcNAc 잔기를 갖는 당단백질은 GlcNAc 잔기의 위치 4 에 제 2 의 당 잔기가 존재하지 않음에 따라 (즉, 통상적인 당 사슬이 존재하지 않음), 단일 GlcNAc-개질된 단백질로 여전히 지칭될 것이다. 엔도글루코사미니다아제의 비제한적 목록이 본 출원에서 추가로 제공된다.

특히, N-글리코실화-엔지니어링 진균 또는 효모 세포와 관련하여, 본원에 사용된 바, '복합 글리코실화에 필요한 효소' 는 고등 진핵생물에서 발견되는 것, 특히, 포유류에서 발견되는 것, 특히 인간에서 발견되는 것과 같이, 복합 글리칸의 합성에 관여할 수 있는 숙주 진균 또는 효모 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 임의의 효소를 지칭한다. 보다 특히, 상기 효소는 당 사슬로부터 만노오스 잔기를 제거하는 효소 (즉, 만노시다아제) 또는 글리코실트랜스페라아제, 특히, 만노실트랜스페라아제 이외의 글리코실트랜스페라아제 (즉, 고-만노오스 글리칸에서 발견되지 않는 단당류를 전달하는 글리코실트랜스페라아제) 및/또는 포스포만노실트랜스페라아제이다.

본 출원에 사용된 바, '글리코실트랜스페라아제' 는 생화학 반응에서 글리코실 기의 전달, 특히 아스파라긴-연결 당 잔기로의 글리코실 전달을 촉매화함으로써, N-연결 당단백질을 제공하는 임의의 그룹의 효소이다. 글리코실트랜스페라아제는 IUBMB 명명법에서 EC 2.4 하에 등재되고, 특정 부류의 글리코실트랜스페라아제는 헥소실트랜스페라아제 (EC 2.4.1) 이다. 당단백질로 펩티드를 가공하는 이러한 광범위한 후번역 효소는 비제한적으로 N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스페라아제, 시알릴트랜스페라아제, 푸코실트랜스페라아제, 갈락토실트랜스페라아제, 및 만노실트랜스페라아제와 같은 효소이다.

외인성 만노실트랜스페라아제는 본 출원에 기재된 N-글리코실화-엔지니어링 효모 세포의 특정 구현예에서 배제된다는 것에 유의한다. 본 출원에 사용된 바와 같은 '만노실트랜스페라아제' 는 골지체에서 수용체 분자, 통상적으로 또 다른 탄수화물로의 만노실 기의 전달을 촉매화하는 효소를 지칭한다. 만노실트랜스페라아제는 통상적으로 진균 및 효모의 내인성 효소이며, 고-만노오스형 글리칸의 합성에 관여한다.

효소가 글리코실트랜스페라아제 활성 다음에 이의 엔도글루코사미니다아제 활성을 가질 수 있다는 점이 주목된다. 이러한 두 활성을 발휘하기 위해 하나의 효소를 사용하는 것이 가능하다 할지라도, 통상적으로 사용된 효소는 단지 하나의 기능을 충족할 것이다. 따라서, 하나의 기능만을 수행하는 것을 보장하기 위해 개질되거나 돌연변이 형성되거나, 특이적 기능을 더욱 효율적으로 수행하는 것을 보장하기 위해 개질되거나 돌연변이 형성된 효소의 사용이 고안된다. 상기 개질 효소는 당업계에 알려져 있다.

본 발명은 재조합 당단백질에 존재하는 동종 형태의 N-글리칸, 특히 복합 N-글리칸을 포함하는 조성물, 특히 약학 조성물을 제공하는 것을 목적한다. 상기 재조합 당단백질은 복합 N-글리코실화-엔지니어링 진균 유기체에서 생성된다.

한 구현예에서, 본 발명은 복수의 재조합 당단백질을 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조의 혼합물을 포함하고, 상기 조합된 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸은 상기 조성물에서 총 N-글리칸의 90% 초과 수준에서 존재한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조의 혼합물을 포함하고, 상기 N-글리칸은 상기 조성물에서 총 N-글리칸의 90% 초과 수준에서 존재한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 복수의 재조합 당단백질을 포함하는 정제 조성물을 제공하고, 여기서 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조의 혼합물을 포함하고, 상기 조합된 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸은 상기 조성물에서 총 N-글리칸의 90% 초과 수준에서 존재한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 포함하는 정제 조성물을 제공하고, 여기서 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조의 혼합물을 포함하고, 상기 복합 N-글리칸은 상기 조성물에서 총 N-글리칸의 90% 초과 수준에서 존재한다.

이는, 특정 양상에 따라서, 당단백질을 인코딩하는 외인성 핵산 서열과 복합 N-글리코실화-엔지니어링 진균 유기체를 제공하고, 적합한 양의 엔도글루코사미니다아제와 분비된 당단백질을 시험관 내에서 접촉시킴으로써 (예를 들어, 발효 배지로의 첨가 또는 정제된 당단백질로의 첨가 또는 당단백질의 정제 중 첨가에 의해), 달성된다. 통상적으로, 상기 엔도글루코사미니다아제는 적합한 숙주 세포에서 재조합적으로 생성되고, 업스케일링 및 정제되고, 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체의 성장 배지에 존재하는 분비된 당단백질에 첨가된다. 중요하게, 상기 엔도글루코사미니다아제는 또한 관심사인 당단백질을 발현하는 동일한 세포에 의해 생성되지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 엔도글루코사미니다아제는 재조합 당단백질의 정제 중 재조합 당단백질에 적용된다. 또한 또 다른 특정 구현예에서, 상기 엔도글루코사미니다아제는 재조합 당단백질의 정제 후 재조합 당단백질에 적용된다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조의 혼합물을 포함하고, 상기 조합된 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸은 상기 조성물에서 총 N-글리칸의 90% 초과 수준에서 존재하고, 상기 조성물은 상기 당단백질이 발현되는 조건 하에서, 상기 당단백질을 인코딩하는 외인성 유전자 구조체를 포함하는 재조합 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체를 배양하는 것과 엔도글루코사미니다아제의 첨가에 의해 상기 재조합 당단백질을 접촉시키는 것을 포함하는 복합 N-글리코실화-엔지니어링 진균 유기체에서 상기 당단백질의 생성에 의해 수득된다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조의 혼합물을 포함하고, 상기 복합 N-글리칸은 상기 조성물에서 총 N-글리칸의 90% 초과 수준에서 존재하고, 상기 조성물은 상기 당단백질이 발현되는 조건 하에서, 상기 당단백질을 인코딩하는 외인성 유전자 구조체를 포함하는 재조합 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체를 배양하는 것과 엔도글루코사미니다아제의 첨가에 의해 상기 재조합 당단백질을 접촉시키는 것을 포함하는 복합 N-글리코실화-엔지니어링 진균 유기체에서 상기 당단백질의 생성에 의해 수득된다.

당단백질의 성질은 본 발명에 중요하지 않지만, 당단백질은 통상적으로 동종 N-글리코실화가 중요한 의약품 및/또는 산업에 적절한 단백질일 것이다. 비제한적인 예는 다수의 호르몬, 성장 인자, 사이토카인 및 이의 상응하는 수용체, 예를 들어 여포-자극 호르몬 (FSH), 황체형성호르몬 (LH), 갑상선-자극 호르몬 (TSH), 표피 성장 인자 (EGF), 인간 표피 성장 인자 수용체-2 (HER-2), 섬유아세포 성장 인자-알파 (FGF-α), 섬유아세포 성장 인자-베타 (FGF-β), 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-α), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-β), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), 인슐린-유사 성장 인자-2 (IGF-2), 신경 성장 인자 (NGF), 신경 성장 인자-베타 (NGF-β); 전술된 것의 수용체, 성장 호르몬 (예를 들어, 인간 성장 호르몬, 소의 성장 호르몬); 인슐린 (예를 들어, 인슐린 A 사슬 및 인슐린 B 사슬), 프로인슐린; 적혈구생성소 (EPO); 콜로니 자극 인자 (예를 들어, 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 대식세포 콜로니-자극 인자 (M-CSF)); 인터루킨 (예를 들어, IL-1 내지 IL-33); 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 이의 수용체 (VEGF-R); 인터페론 (예를 들어, IFN-α, β, 또는 γ); 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF-α 및 TNF-β) 및 이의 수용체, TNFR-1 및 TNFR-2; 트롬보포이에틴 (TPO); 트롬빈; 뇌의 나트륨배설 펩티드 (BNP); 응혈 인자 (예를 들어, 인자 VIII, 인자 IX, 폰 빌레브란트 인자 등); 항응혈 인자; 조직 플라스미노겐 활성인자 (TPA), 예를 들어, 우로키나아제 또는 인간 소변 또는 조직 유형 TPA; 칼시토닌; CD 단백질 (예를 들어, CD3, CD4, CD8, CD28, CD19 등); CTLA 단백질 (예를 들어, CTLA4); T-세포 및 B-세포 수용체 단백질; 항체, 골 모르포겐 단백질 (BMP, 예를 들어, BMP-1, BMP-2, BMP-3 등); 신경성장촉진인자, 예를 들어, 골 유래 신경성장촉진인자 (BDNF); 뉴로트로핀, 예를 들어, NT 3-6; 레닌; 류머티즘 인자; RANTES; 알부민; 릴락신 (relaxin); 대식세포 억제 단백질 (예를 들어, MIP-1, MIP-2); 바이러스 단백질 또는 항원; 표면 막 단백질; 이온 채널 단백질; 효소; 알칼리 포스파타아제; 렉틴; 조절 단백질; 항체; 면역조절 단백질, (예를 들어, HLA, MHC, B7 계열); 귀소 수용체 (homing receptor); 수송 단백질; 과산화물 디스뮤타아제 (SOD); G-단백질 커플링 수용체 단백질 (GPCR); 신경조절 단백질; 알츠하이머병 관련 단백질 및 펩티드 (예를 들어, A-베타), 및 상기의 융합 또는 키메라 단백질을 포함하여, 당업계에 알려진 다른 것을 포함한다.

엔도글루코사미니다아제의 성질은 당단백질의 목적하는 당집합 (glycopopulation) 에 의존할 것이다. 예를 들어, 엔도글루코사미니다아제는 이의 기질 특이성에 대해 선택될 수 있다. 일부 엔도글루코사미니다아제, 예를 들어 엔도 H 및 엔도 T 는 고-만노오스형 당 사슬 및 혼성형 당을 가수분해하지만, 복합 탄수화물 구조는 손상되지 않은 채로 남긴다. 상기 효소는 예를 들어 복합 N-글리칸으로 이루어지는 N-글리칸을 수득하고, 생성된 당단백질로부터의 목적하지 않은 고-만노오스 및/또는 혼성 형 당을 제거하고, 또한 예상치 못하게 본 발명의 실시예에서 관찰한 바와 같은, 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체에서 발현되는 재조합 당단백질의 N-글리칸 네오글리코형태를 제거하는 경우, 이상적이다. 특정 구현예에 있어서, 엔도글루코사미니다아제는 고-만노오스형 당 사슬, 혼성형 글리칸, N-글리칸 네오글리코형태를 가수분해하지만, 복합형 글리칸은 가수분해하지 않는다.

엔도글루코사미니다아제는 또한 (당 사슬에만 관련된 것이 아니라) 당단백질에 관해 기질 특이성을 가질 수 있고, 일부 엔도글루코사미니다아제는 예를 들어 다른 엔도글루코사미니다아제보다, (특히, 조밀하게 폴딩된) 단백질로부터 당 사슬을 더욱 성공적으로 가수분해하고 (예를 들어, 엔도 T), 다른 것은 (또한) 당펩티드 또는 조밀하지 않게 폴딩된 단백질로부터 당 사슬을 특히 성공적으로 가수분해할 수 있다 (예를 들어, 엔도 H, 엔도 T). 중요하게, 이것이 통상적으로 엔도글루코사미니다아제의 특이성보다 기질의 접근성 또는 이용가능성에 관련되기 때문에, 이는 특정 단백질에 대해 특정한 효소를 사용하는 것을 배제하지는 않지만, 일부 엔도글루코사미니다아제는 모든 N-연결 당 구조의 가수분해를 완료하기 위해 더 많은 시간을 요구할 수 있다. 복합 글리코-엔지니어링 진균 세포 (예컨대, 피키아 파스토리스) 에서 생성된 N-글리코실화 단백질에 존재하는 엔도 T 또는 엔도 H 에 의한 고-만노오스 N-글리칸 또는 혼성 N-글리칸의 가수분해는 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸을 유도한다. 엔도글루코사미니다아제의 특히 바람직한 부류는 만노실-당단백질 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (IUBMB 명명법에서 EC 3.2.1.96 로 지정됨) 에 의해 형성된다. 이러한 효소는 단백질 상에 하나의 GlcNAc 잔기를 남기면서, 당 사슬 (본원에 나타난 N-글리칸의 혼성 N-글리칸, 고만노오스 N-글리칸 및 네오글리코형태) 을 제거할 수 있다. 이들의 예는, 비제한적으로, 엔도 A, 엔도 BH, 엔도 CE, 엔도 D, 엔도 F1, 엔도 H, 엔도 M, 엔도 T (또한 WO2006/050584 참조), 및 ENGase 을 포함한다. 다른 예가 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 www.cazy.org, 특히 글리코시드 가수분해효소 계열 85 및 18 하에서 확인할 수 있다. 특히, 히포크레아 제코리나 (Hypocrea jecorina) (이전에 트리코데마 레세이 (Trichoderma reesei) 로 알려짐) 로부터의 엔도 T 효소의 사용이 고안되고, 이는 WO2006/050584 에 기재되어 있다 (예를 들어, 상기 문헌의 SEQ ID 9-12 참조).

'네오글리코형태' 는 이종 발현, 유전자 결실 또는 다른 과정을 통한 N-글리코실화 경로에 개입한 결과로서, 심지어 매우 엔지니어링된 균주에서도 형성될 수 있는 예상치 못한 N-글리칸일 수 있다. 녹-아웃을 개시하기 위해, 이에 기인하는 글리코실트랜스페라아제가 확인되어야 할 수 있다.

본 발명에서, 네오글리코형태가 엔도글루코사미니다아제에 의해 제거될 수 있고, 이의 제거가 보다 동종 글리코실화 프로파일을 제공하거나 효모-특이적 백그라운드의 존재를 감소시키면서 보다 높은 순도를 제공하는 당단백질을 유도한다는 것이 나타난다.

네오글리코형태는 예를 들어 4당류 개질물을 갖는 Man₅GlcNAc₂ N-글리칸을 포함할 수 있다. Man₅GlcNAc₂ N-글리칸의 4당류 (Glcα1-2Manβ1-2Manβ1-3Glucα-) 치환물은 만노실 코어의 가장 안쪽의 α-1,3 암에 부착될 수 있는 가능성이 높다. 네오글리코형태는 재등장하는 다수의 중간체를 포함할 수 있고, 재등장하는 중간체는 Man₅GlcNAc₂ 를 포함할 수 있다. Man₅GlcNAc₂ N-글리칸은 β-만노오스 및/또는 글루코오스를 함유하는 선형 헥소실-당류로 치환될 수 있다. 네오글리코형태는 Hex_6-9GlcNAc₂ N-글리칸 및 심지어 Hex_6-11GlcNAc₂ N-글리칸을 포함할 수 있다. 또한, 특정한 네오글리코형태는 하나 이상의 포스포만노오스 잔기를 함유할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조의 혼합물로 이루어진다.

복합 N-글리칸의 혼합물 내에서 하나의 우세한 글리코형태를 수득하는 것이 유리할 수 있다. 상기 우세한 글리코형태는 전형적으로 복합 N-글리코실화-엔지니어링 진균 유기체의 당단백질의 생성으로부터 유도된다.

특정 구현예에서, 조성물은 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 포함하고, 여기서 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸의 혼합물로 이루어지고, 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조는 실질적으로 고-만노오스-형 N-글리칸 구조, 혼성 글리칸 구조 및 N-글리칸 네오글리코형태를 갖지 않는다. 표현 "고-만노오스-형 N-글리칸 구조, 혼성 글리칸 구조 및 N-글리칸 네오글리코형태를 갖지 않는" 은 재조합 당단백질에 존재하는 N-글리칸이 본질적으로 복합형 N-글리칸이라는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 조성물은 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 포함하고, 여기서 상기 당단백질은 복합 N-글리코실화-엔지니어링 진균 유기체에서 생성되고, 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸의 혼합물로 이루어지고, 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조는 실질적으로 고-만노오스-형 N-글리칸 구조, 혼성 글리칸 구조 및 N-글리칸 네오글리코형태를 갖지 않는다.

또한 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조의 혼합물을 포함하고, 상기 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸의 총합은 상기 당단백질에 존재하는 총 N-글리칸의 90% 초과의 수준에서 존재한다. 표현 "상기 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸의 총합" 은 "조합된 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸" 과 동등하고, 본 발명의 과정 (또는 방법) 이 모든 비-복합 N-글리칸 (즉, 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체 유래의 혼성 N-글리칸 및 고만노오스 N-글리칸) 의 완전한 제거를 배제할 수 없다는 사실을 나타낸다. 임의의 경우에서, 재조합 당단백질에 존재하는 N-글리칸의 총량에 대한 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸의 총합은 90% 초과, 93% 초과, 다수의 경우 심지어 98% 초과의 수준에서 존재한다.

또한 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 당단백질은 복합 N-글리코실화-엔지니어링 진균 유기체에서 생성되고, 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조의 혼합물을 포함하고, 상기 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸의 총합은 상기 당단백질에 존재하는 총 N-글리칸의 90% 초과, 93% 초과 또는 심지어 98% 초과의 수준에서 존재한다.

또한 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 여기서 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조의 혼합물을 포함하고, 상기 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸은 상기 혼합물에서 90% 초과, 93% 초과 또는 심지어 98% 초과의 수준에서 존재한다.

또한 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 여기서 상기 당단백질은 복합 N-글리코실화-엔지니어링 진균 유기체에서 생성되고, 여기서 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조의 혼합물을 포함하고, 상기 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸은 상기 혼합물에서 90% 초과, 93% 초과 또는 심지어 98% 초과의 수준에서 존재한다.

복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체에서 생성된 재조합 당단백질이 2 개 이상의 기능적 N-글리코실화 수용체 부위를 갖는 또 다른 특정 구현예에서, 이러한 재조합 당단백질이 배지로부터 정제되고, 적합한 양의 엔도글루코사미니다아제와 외인적으로 접촉하는 경우, 또한 복수의 글리코형태가 생성된다. 이러한 경우에, 또한 이러한 재조합 당단백질의 글리코형태는 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 으로 이루어지는 N-글리칸으로 이루어지는 동일한 재조합 당단백질에서 나타날 것이다. 따라서, 2 개의 기능적 N-글리코실화 부위가 당단백질에 존재하는 경우, 이론적으로 다수의 상이하게 혼합된 글리코형태 (예를 들어, 단일 GlcNAc N-글리칸 및 복합 N-글리칸의 혼합물) 가 나타날 것이다. 상기 재조합 당단백질에 존재하는 총 N-글리칸에 대한 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸의 총합은 90% 초과일 것이라고 이해된다.

따라서, 또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 둘 이상의 N-글리코실화 부위를 갖는 재조합 당단백질의 글리코형태를 제공하고, 여기서 상기 당단백질에 존재하는 하나 이상의 N-글리코실화 부위는 단일 GlcNAc 로 이루어지고, 상기 동일한 당단백질의 하나 이상의 N-글리코실화 부위는 복합 N-글리칸으로 이루어진다.

또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 둘 이상의 N-글리코실화 부위를 갖는 재조합 당단백질의 글리코형태를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 여기서 상기 당단백질에 존재하는 하나 이상의 N-글리코실화 부위는 단일 GlcNAc 로 이루어지고, 상기 동일한 당단백질의 하나 이상의 N-글리코실화 부위는 복합 N-글리칸으로 이루어진다.

또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조의 혼합물을 포함하고, 상기 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸은 상기 혼합물에서 90% 초과의 수준에서 존재하고, 상기 조성물은 상기 당단백질이 발현되는 조건 하에서, 상기 당단백질을 인코딩하는 유전자 구조체를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체를 배양하는 것과 상기 재조합 당단백질을 생성한 후 엔도글루코사미니다아제와 접촉시키는 것을 포함하는 복합 N-글리코실화-엔지니어링 진균 유기체에서 상기 당단백질의 생성에 의해 수득된다.

또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 여기서 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸은 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조의 혼합물을 포함하고, 상기 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸은 상기 혼합물에서 90% 초과의 수준에서 존재하고, 상기 조성물은 상기 당단백질이 발현되는 조건 하에서, 상기 당단백질을 인코딩하는 유전자 구조체를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체를 배양하는 것, 상기 재조합 당단백질을 생성한 후 엔도글루코사미니다아제와 접촉 및 정제시키는 것과 적절한 약학적 부형제 (또는 담체) 로 재조합 단백질의 수득된 복수의 글리코형태를 제형화하는 것을 포함하는 복합 N-글리코실화-엔지니어링 진균 유기체에서 상기 당단백질의 생성에 의해 수득된다.

본 발명에 따라 생성된 특정 당단백질의 조성물 또는 글리코형태를 함유하는 약학 조성물은, 이를 필요로 하는 환자에 투여함으로써 목적하는 약학적 효과를 달성하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 환자는 특정 병태 또는 질환의 치료를 필요로 하는 인간을 비롯한 포유류이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 약학적으로 허용가능한 담체 및 약학적으로 유효한 양의 특정 당단백질의 조성물 또는 글리코형태, 또는 이의 염을 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 바람직하게는 활성 성분의 유효한 활성과 일치하는 농도에서 비교적 비독성이고 환자에게 무해한 담체이고, 이에 따라 담체로 인한 임의의 부작용이 활성 성분의 유리한 효과를 손상시키지 않는다. 약학적으로 유효한 양의 특정 당단백질의 조성물 또는 글리코형태는 바람직하게는 치료되는 특정 병태에 대해 영향을 미치거나 결과를 생성하는 양이다. 본 발명의 특정 당단백질의 조성물 또는 글리코형태는 즉각적, 서방형 및 지효성 방출 (slow and timed release) 제제, 경구, 비경구, 국소, 비강, 안과, 척추강내, 뇌심실내, 설하, 직장, 질 등을 비롯한 임의의 효과적인 종래의 투약 형태를 사용하여, 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체에 의해 투여될 수 있다.

본원에 따른 바, 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 세포는 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 생성할 수 있다. 단 하나의 기능적인 N-글리코실화 부위가 재조합 당단백질에서 나타나는 경우, 하나의 우세한 글리코형태는 복합 N-글리칸을 가질 것인 반면, 또 다른 글리코형태는 단일 GlcNAc 를 가질 것이다. 특정 양상에서, 글리칸의 이러한 두 집단을 분리하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 특정한 경우, 단지 복합 N-글리칸만을 갖는 재조합 당단백질을 이용하여 작업하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 경우, 단지 단일 GlcNAc 만을 갖는 글리코형태는 복합 N-글리칸을 갖는 글리코형태로부터 쉽게 분리될 수 있다.

대안의 특정 구현예에 있어서, 상기 재조합 당단백질은 상기 당단백질의 동일한 N-글리코실화 부위에 단일 GlcNAc 및 복수의 복합 N-글리칸 모두를 나타내는 하나 이상의 N-글리코실화 부위를 갖는다.

특정 구현예에 있어서, 재조합 당단백질은 둘 이상의 N-글리코실화 부위를 갖고, 여기서 하나 이상의 상기 당단백질에 존재하는 N-글리코실화 부위는 단일 GlcNAc 로 이루어지고, 하나 이상의 상기 동일한 당단백질 상의 N-글리코실화 부위는 복수의 복합 N-글리칸으로 이루어진다.

특정 구현예에 있어서, 상기 재조합 당단백질의 상기 글리코형태는 셋 이상의 글리코실화 부위를 갖고, 여기서 상기 당단백질 상의 하나 이상의 N-글리코실화 부위는 단일 GlcNAc 로 이루어지고, 적어도 또 다른 N-글리코실화 부위는 복수의 복합 N-글리칸으로 이루어진다.

특정 구현예에 있어서, 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체에서의 생성 후 분비된 당단백질에 외인적으로 첨가된 엔도글루코사미니다아제 효소는 만노실-당단백질 엔도-베타-N-아세틸글루코사미니다아제이고, 즉, 이는 IUBMB 명명법의 E.C. 3.2.1.96 의 활성을 가지며, 이는 단백질에 하나의 GlcNAc 잔기를 남기면서 당 사슬을 제거할 수 있음을 의미한다. 대안의 구현예에 있어서, 엔도글루코사미니다아제는 상이한 유형의 글리코실화 구조에 대해 상이한 친화도를 갖는다. 후자의 전형적인 예는, 혼성형 당 및/또는 고-만노오스 당을 가수분해할 수 있지만, 복합형 글리칸을 절단할 수 없는 엔도글루코사미니다아제이다. 추가의 특정 구현예에 있어서, 엔도글루코사미니다아제는 상이한 유형의 글리코실화 구조에 대해 상이한 친화도를 갖는 만노실-당단백질 엔도-베타-N-아세틸글루코사미니다아제이다. 또한 추가의 특정 구현예에 있어서, 엔도-베타-N-아세틸글루코사미니다아제는 혼성형 당 및/또는 고-만노오스 당을 절단할 수 있지만, 복합형 글리칸은 절단할 수 없다. 보다 더욱 추가의 특정 구현예에 있어서, 엔도글루코사미니다아제는 엔도H 또는 엔도T 이다. 보다 더욱더 추가의 특정 구현예에 있어서, 엔도글루코사미니다아제는 엔도 T 이다.

특정 구현예에 있어서, 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 (예를 들어, 효모) 유기체의 엔지니어링에 요구되는 하나 이상의 효소는 하나 초과의 효소이다. 보다 특히, 하나 이상의 효소는 복합 글리코실화의 경로를 형성하기 위해 필요한 효소의 수이다. 보다 특히, 복합 글리코실화에 필요한 각각의 이들 효소는 이들이 순차적으로 올바른 순서로 작용하도록 (통상적으로, 하나의 효소가 다음 효소를 위한 기질로 당 사슬을 개질시킬 것임) 표적화된다. 특정 구현예에 있어서, 복합 글리코실화에 필요한 하나 이상의 효소는 하나 이상의 N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 (예를 들어, GnT I, GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI), 하나 이상의 만노시다아제 (특히, 만노시다아제 II), 하나 이상의 푸코실트랜스페라아제, 하나 이상의 갈락토실트랜스페라아제, 하나 이상의 시알릴트랜스페라아제, 또는 이들 효소의 임의의 조합이다.

복합 글리코실화 경로가 엔지니어링된 글리코-엔지니어링 효모의 예는 당업계에 광범위하게 기재되어 있다 (예를 들어, Choi et al., 5022 2003; Hamilton et al.; Science 1244; Wildt et al., 119 2005; Hamilton et al., 387 2007; EP1211310; WO02/000879; US2006148039 참조). 또한, 복합형의 글리코실화 당단백질, 예를 들어 ER 및 골지 특이적 수송인자 (예를 들어, UDP-갈락토오스 및 다른 전구체의 공동수송 및 역수송 (sym- and antiport) 수송인자), 또는 활성화된 올리고당류 전구체의 합성에 관여하는 효소, 예를 들어 UDP-갈락토오스 및 CMP-N-아세틸뉴라민산의 최적의 생성을 보장하기 위해, 다수의 다른 유전자가 또한 본원에 기재된 글리코-엔지니어링 효모 세포에서 형질전환될 수 있다. 실제로, 복합 글리코실화에 필요한 하나 이상의 효소와의 접촉은 효율적이고 올바른 글리코실화를 보장하기 위해, 특이적 글리코실 공여체 (예를 들어, 당 뉴클레오티드 공여체) 의 존재 하에 발생할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 방법은 당단백질 및 엔도글루코사미니다아제 사이의 접촉이 최적의 환경 하에서 발생하는 것을 보장하도록 (즉, 예를 들어 특정 pH, 온도, 염 및 완충액 조건에 의존하는 당단백질에 대해 엔도글루코사미니다아제의 최적의 활성을 보장하기 위해) 추가 조정될 수 있다.

본원에 사용된 바, '접촉된' 또는 '접촉되는' 은 생성된 재조합 당단백질 및 엔도글루코사미니다아제 사이의 물리적인 근접성을 지칭한다. 본 발명에서 '접촉되는' 은 시험관 내에서 발생한다.

본원에 기재된 바와 같은 방법은 당단백질 및 엔도글루코사미니다아제 사이의 접촉이 최적의 환경 하에서 발생하는 것을 보장하도록 (즉, 당단백질에서 엔도글루코사미니다아제의 최적의 활성을 보장하거나, 엔도글루코사미니다아제와의 접촉 동안 및 후에 당단백질 그 자체의 바이오활성을 유지하는 것을 보장하기 위해) 추가 조정될 수 있다.

엔도글루코사미니다아제 및 당단백질 사이의 접촉은 외인적으로 발생할 수 있다. 엔도글루코사미니다아제 및 당단백질 사이의 접촉은 당단백질의 분비 후 세포 외에서 발생할 수 있다. 그러나, 사용되는 세포 및 엔도글루코사미니다아제에 따라, 세포를 위한 최적의 성장 및 생성 조건 (예를 들어, pH, 온도) 은 효소적 활성을 위한 최적의 조건과 상이할 수 있다. 따라서, 당단백질 및 엔도글루코사미니다아제 사이의 세포외 접촉이 수행되는 배지는 당단백질의 최적의 바이오활성을 위해 조정될 수 있다. 배지의 온도는 당단백질의 최적의 바이오활성을 유지하기 위해 조정될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 있어서, 당단백질 및 엔도글루코사미니다아제 사이의 접촉이 수행되는 배지의 온도는 4-37℃ 로 조정된다. 배지의 온도를 4℃ 로 조정하는 것이 유리할 수 있다. 다른 구현예에서, 온도를 37℃ 초과로 유지시키는 것이 유리할 수 있다.

또 다른 특정 구현예에 있어서, 엔도글루코사미니다아제 활성은 높은 염 농도의 배지에서 유지된다. 엔도글루코사미니다아제 및 당단백질 사이의 접촉이 수행되는 배지의 염 농도가 높더라도, 엔도글루코사미니다아제는 당단백질에서 이의 기능을 발휘할 수 있을 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명은 재조합 N-글리코실화 IL-22 또는 적어도 97% 아미노산 동일성을 갖는 이의 재조합 N-글리코실화 IL-22 를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 IL-22 는 상기 재조합 IL-22 에 존재하는 총 복합 N-글리칸의 65% 초과에서 존재하는 복합 N-글리칸 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 재조합 N-글리코실화 IL-22 또는 적어도 97% 아미노산 동일성을 갖는 이의 재조합 N-글리코실화 IL-22 를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 IL-22 는 상기 재조합 IL-22 에 존재하는 총 복합 N-글리칸의 85% 초과, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과 또는 100% 에서 존재하는 복합 N-글리칸 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 를 포함한다.

"하나 이상의 돌연변이 형성된 N-글리코실화 수용체 부위" 는 N-글리코실화 수용체 부위의 돌연변이를 지칭한다. 잠재적 N-글리코실화 수용체 부위가 공통 서열 Asn-Xaa-Ser/Thr 에 특이적인 것이 당업계에 잘 알려져 있다. 단백질의 폴딩이 N-글리코실화의 조절에 중요한 역할을 한다는 사실로 인해, 아스파라긴 잔기 (Asn) 가 글리코실화된다는 결론을 내리기에는 공통 트리펩티드의 존재가 불충분하다는 것이 주목되어야 한다. 또한, Asn 및 Ser/Thr 사이의 프롤린의 존재가 N-글리코실화를 저해할 것이라는 것이 밝혀졌다. 당단백질 IL-22 에서, 통상적으로 3 개의 상이한 N-글리코실화 수용체 부위 (포유류 종 기원에 따라) 가 존재한다.

또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 하나의 기능적 N-글리코실화 수용체 부위 또는 적어도 97% 아미노산 동일성을 갖는 이의 재조합 N-글리코실화 IL-22 를 갖는 재조합 N-글리코실화 IL-22 를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 IL-22 는 상기 재조합 IL-22 에 존재하는 총 복합 N-글리칸의 85% 초과에서 존재하는 복합 N-글리칸 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 를 포함한다.

또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 에 도시된 서열의 위치 N21 에 존재하는 하나의 기능적 N-글리코실화 수용체 부위를 갖는 재조합 N-글리코실화 인간 IL-22 또는 적어도 97% 아미노산 동일성을 갖는 이의 재조합 N-글리코실화 인간 IL-22 를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 인간 IL-22 는 상기 재조합 인간 IL-22 에 존재하는 총 복합 N-글리칸의 85% 초과, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과 또는 100% 에서 존재하는 복합 N-글리칸 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 를 포함한다.

SEQ ID NO: 1 은 하나의 기능적 글리코실화 부위 (밑줄 표시됨), 즉 글리코실화 수용체 부위 N21 (hIL-22 N21 돌연변이) 만을 갖는 인간 IL-22 의 아미노산 서열을 도시한다. 다른 두 글리코실화 수용체 부위 (SEQ ID NO: 1 에 표시됨) 는 비-기능적 N-글리코실화 수용체 부위로 돌연변이 형성된다.

SEQ ID NO: 1

hIL-22 N21

SEQ ID NO: 2 는 2 개의 기능적 글리코실화 부위 (밑줄 표시됨), 즉 글리코실화 수용체 부위 N21 및 N35 (hIL-22 N21-N35 돌연변이) 를 갖는 인간 IL-22 의 아미노산 서열을 도시한다. 다른 2 개의 글리코실화 수용체 부위 (SEQ ID NO: 2 에 표시됨) 은 비-기능적 N-글리코실화 수용체 부위로 돌연변이 형성된다.

SEQ ID NO: 2

hIL-22 N21-N35

SEQ ID NO: 3 은 3 개의 기능적 글리코실화 부위 (밑줄 표시됨) 를 갖는, 야생형 인간 IL-22 (hIL-22 WT) 아미노산 서열을 도시한다.

SEQ ID NO: 3

hIL-22 WT

또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 재조합 N-글리코실화 IL-22 또는 적어도 97% 아미노산 동일성을 갖는 이의 재조합 N-글리코실화 IL-22 를 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공하고, 여기서 상기 IL-22 는 본원에 상기 기재된 상기 재조합 IL-22 에 존재하는 총 복합 N-글리칸의 65% 초과에서 존재하는 복합 N-글리칸 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 를 포함하고, 상기 조성물은 하기를 포함하는 복합 N-글리코실화-엔지니어링 진균 유기체에서 제조된다: i) IL-22 이 발현되는 조건 하에서, IL-22 를 인코딩하는 유전자 구조체를 포함하는 재조합 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체를 배양하는 단계, 및 상기 IL-22 를 생성 후 엔도글루코사미니다아제 효소의 첨가에 의해 접촉시키는 단계.

또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 재조합 N-글리코실화 IL-22 또는 적어도 97% 아미노산 동일성을 갖는 이의 재조합 N-글리코실화 IL-22 를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 IL-22 는 상기 재조합 IL-22 에 존재하는 총 복합 N-글리칸의 65% 초과에서 존재하는 복합 N-글리칸 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 를 포함하고, 상기 조성물은 IL-22 이 발현되는 조건 하에서, 상기 IL-22 를 인코딩하는 유전자 구조체를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 복합 N-글리코실화 엔지니어링 진균 유기체를 배양하는 단계, 및 엔도글루코사미니다아제의 첨가에 의해, 상기 재조합 IL-22 를 접촉시키는 단계를 포함하는 복합 N-글리코실화-엔지니어링 진균 유기체에서의 상기 재조합 IL-22 의 생성에 의해 수득된다.

특정 구현예, 특정 구성뿐 아니라 재료 및/또는 분자가, 본원에서 본 발명에 따른 세포 및 방법에 대해 논의되었지만, 본 발명의 범위 및 개념에서 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항에서의 다양한 변화 또는 변형이 만들어질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 하기 실시예는 특정 구현예를 더 잘 설명하기 위해 제공되고, 본 출원을 제한하는 것으로 여겨져서는 안된다. 본 출원은 오직 청구범위에 의해 제한된다.

재료 및 방법

특히 실시예 1 을 위한 재료 및 방법: 복합 글리코형태를 풍부하게 하기 위한 엔도글루코사미니다아제 클린-업

균주 및 배지

피키아 파스토리스 GS115 (his4) 를 야생-형 발현 숙주로서 사용하였다 (De Schutter, K. et al., Nat. Biotechnol. 27, 561-566 (2009)). Gal₂Gn₂M₃-hIL-22^N21 및 -IL-22^WT 균주를 구성하기 위해, 각각 Man₅GlcNAc₂ 및 GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-글리칸으로 우세하게 당단백질을 개질시키는 M5- (Man5) 및 GnM₅-균주 (GnMan₅) 로부터 N-글리칸 엔지니어링을 개시하였다 (Vervecken, W. et al., Appl. Environ. Microbiol. 70, 2639-2646 (2004)). 가장 동종 혼성-형 GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-글리칸을 갖는 GnM₅-균주의 클론을, EcoRI-선형화 후 pGAPKanMnn2DmMan-II 로 형질전환하여, 복합-형 GlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-글리칸으로 개질된 당단백질을 발현하였다. pGAPKanMnn2DmMan-II 벡터는, S. 세레비지애 (S. cerevisiae) Mnn2p 초기-골지 국소화된 글리코실트랜스페라아제의 N-말단 도메인을 통해 골지에 대해 표적화되는 드로소필라 멜라노가스테르 (Drosophila melanogaster) 로부터 만노시다아제-II 를 인코딩한다. 래투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus) 로부터의 골지-국소화된 β-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제-II 를 인코딩하는 BglI-선형화 pGAPHygMnn2rGnT-II 의 형질전환에 의한 추가의 엔지니어링을 위해, GnM₃-균주로부터의 가장 동종 GlcNAc₃Man₃ N-글리칸을 갖는 클론을 사용하여, 2-안테나 (bi-antennary), 복합-형 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-글리칸을 갖는 당단백질을 발현하는 균주 (Gn₂M₃-균주) 를 얻었다. 이후, 가장 동종 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-글리칸을 갖는 Gn₂M₃-균주의 클론을 EcoRV-선형화 pGAPNorMnn2SpGal10GalT 로 형질전환하였다. 이러한 벡터는 Mnn2p-골지 국소화 도메인, 쉬연구카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) UDP-글루코오스/-갈락토오스 4-에피메라아제 및 인간 β-1,4 갈락토실트랜스페라아제-I (GalT-I) 의 삼중 융합물을 인코딩한다. 수득된 균주는 이의 당단백질을 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 로 개질시킨다. 벡터 및 구조체는 하기 문헌에 기재되어 있다 (Jacobs, P. P. et al., Nat. Protocols 4, 58-70 (2008)). 방법론은 Laukens, B. et al., Methods Mol. Biol. 1321, 103-22 (2015) 에 광범위하게 기재되었다.

-80℃ 에서 균주를 글리세롤 스톡으로서 유지시켰다. 실험 전, 블라스티시딘S-HCl (100 ㎍/mL), Zeocin ^® (100 ㎍/mL), G418 (500 ㎍/mL), 히그로마이신 (100 ㎍/mL) 및 나우어세오트리신 (Nourseothricin) (100 ㎍/mL) 을 보충한 YPD 상에 플레이팅함으로써, 글리세롤 스톡으로부터 신선한 배양을 개시하였다. 모든 배양물을 28℃ 에서 성장시키고 4℃ 에서 저장하여 추가의 실험을 대기하였다.

엔도T 의 재조합 생성

엔도T 의 재조합 생성을 위해, AOX1-프로모터의 제어 하에서 풀 사이즈 성숙 엔도T 를 발현하는 야생형 균주 (NRRL-Y11430) 를 구성하였다. 6 리터 수준 (24 × 250 ml/2 리터 플라스크) 의 배플 셰이크 플라스크 (baffled shake flask) 에서 대규모 생성을 수행하였다 (Schoonooghe, S., Leoen, J. & Haustraete, J., Pichia pastoris. Methods Mol. Biol. Clifton NJ 907, 325-340 (2012)). 유도 후반부에서, 4℃ 에서 30 min 동안 18,000 × g 에서 원심분리에 의해 배지를 수집하고, 20 mM Tris pH 7.5 로 정용여과 (diafilter) 하였다. 투명한 상청액을 20 mM Tris pH 7.5 로 평형화된 138 ml Q sepharose FF 컬럼 XK26 × 26 (GE Healthcare) 에 적용하였다. 동일한 완충액에서 5 개의 컬럼 부피에 대해 1 M NaCl 로의 구배로 컬럼을 용리하였다. 용리 분획을 SDS-PAGE 에서 분석하고, 엔도T 함유 분획을 함께 풀링하였다. 마지막으로, 제형에 대한 러닝 용액 (running solution) 으로서 PBS 를 이용하여 Superdex 75 겔여과 컬럼 XK26 × 52 에 단백질을 주입하여, 마이너한 오염물을 제거하였다. 수득된 분획을 SDS-PAGE 로 분석하고, 마이크로-BCA 검정 (Pierce) 을 사용하여 농도를 측정하고, LPS 함량 (Endosafe-PTS) 을 측정하였다 (< 1 EU/ml).

정제 후 최종 수율은 0.183 g/L (>95% 순도) 였다.

IL-22 글리코형태의 생성 및 정제

적절한 항생제가 보충된 10 mL YPD 에 hIL-22-발현 균주의 예비 배양물을 접종하고, 밤새 성장시켰다. 그 다음 날, 예비 배양물을 사용하여 2 L 배플 셰이크 플라스크에서 8 × 250 mL BMGY (pH 5.5) 를 파종하였다. 배양물을 성장시키고, 배지를 BMMY 로 보충하였다. 배양물을 48 시간 동안 유도한 후, 상청액을 수집하고, 암모늄 술페이트 침전시켰다. 간략하게, 응집물 단백질 및 잔류 세포를 제거하기 위해, 30% 까지 암모늄 술페이트 염을 첨가하여 상청액을 포화시켰다. 샘플을 16,800 g 에서 원심분리하고, 수득한 펠렛을 폐기하였다. 상청액을 연속 교반 하에서 80% 로 추가 포화시켰다. hIL-22 함유 침전물을 원심분리에 의해 수집하였다. 잔류 상청액을 폐기하고, 펠렛을 추가 정제될 때까지 -20℃ 에서 저장하였다.

정제를 위해, hIL-22 암모늄 술페이트 펠렛을 25 mM MES pH 5.5 에 용해시키고, 0.22 ㎛ 바틀탑 필터 (Millipore) 를 통해 여과시켜 가용화 후 불순물을 제거하였다. 여과물을 25 mM MES pH 5.5 에서 작동하는 Sephadex G25 XK26/80 컬럼 (GE Healthcare) 을 통해 탈염시키고, 동일한 완충액으로 사전 평형화하였다. 피키아 숙주 단백질의 벌크를 제거하고, 잠재적 엔도톡신 (LPS) 을 제거하기 위해, 탈염 분획을 풀링하고, 러닝 완충액으로서 25 mM MES pH 5.5 를 이용하여 평형화된 Q-Sepharose XK16/32 컬럼 (GE Healthcare) 상에 로딩하였다. hIL-22 함유 통과액을 수집하고, 컬럼을 대규모로 세척한 다음, 25 mM MES pH 5.5 중 1 M NaCl 로 용리하였다. 이후, Q-Sepharose 통과액을 동일한 러닝 완충액으로 평형화된 Source 15S 컬럼 상에 로딩하였다. 로딩 후, 컬럼을 러닝 완충액으로 대규모로 세척하고, 25 mM MES pH 5.5 중 0-1 M NaCl 의 단계식 선형 구배로 hIL-22 을 용리하였다. 우세하게 N-글리코실화된 hIL-22 를 함유하는 분획을 pH 8.0 으로 설정된 PBS 로 평형화된 Superdex75 컬럼 (GE Healthcare) 에서 폴리싱하였다. 폴리싱 후, hIL-22 함유 분획을 10 kDa 분자량 컷-오프 (MWCO, molecular weight cut-off) 를 갖는 Amicon 스핀 컬럼 (Millipore) 을 사용하여 농축시키고, Millex 저 단백질 결합 0.22 ㎛ 주사기 필터 (Millipore) 를 통해 멸균하고, 농도를 BCA (Pierce) 로 측정하였다. 샘플을 분취액으로 나누고, -80℃ 에서 저장하였다. Akta Explorer 또는 Akta Pure 정제 플랫폼 (GE Healthcare) 을 사용하여 정제 단계를 수행하였다. Unicorn 5.11 에서 크로마토그램을 분석하고, 이후 CorelDraw 11 에서 포맷화하였다.

단백질 분석 기술

15% Tris-글리신 SDS-PAGE 겔에서 단백질을 분석하였다. 로딩 전, 샘플에 Laemli 로딩 염료 (달리 명백히 언급되지 않는 한, 30 mM DTT 를 갖는 0.8% 브로모페놀 블루, 10% SDS, 40% 글리세롤 함유 200 mM Tris-HCl, pH 6.8) 를 보충하고, 10 분 동안 98℃ 에서 열 변성시켰다. 분자량 래더로서, Precision Plus Protein All Blue Standard (Bio-Rad) 를 포함하였다. 시각화를 위해, 겔을 쿠마시 염색하거나, 반-건조 웨스턴 블롯 (1 mA/㎠) 에 의해 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이동시켰다. PBST-3% 우유 중 1:1000 희석된 항-hIL-22 마우스 단일클론 항체 (Abcam, ab134035) 를 사용하여 인간 IL-22 를 시각화하였다. Lightning ECL 향상된 화학발광 기질 (Enhanced Chemiluminescence Substrate) (Perkin Elmer) 과 PBST-3% 우유 중 1:5000 희석된 항-마우스 HRP-커플링된 IgG (GE Healthcare) 를 사용하여 블롯을 밝혔다.

엔도H 또는 PNGaseF (New England Biolabs) 를 사용하는 단백질 탈글리코실화를 하기 제연구의 지시에 따라 수행하였다. 간략하게, 1x 당단백질 변성 완충액 (0.5% SDS, 40 mM DTT) 에서 5-10 ㎍ 정제 단백질을 열 변성시켰다 (5 분, 98℃). 샘플을 냉각시킨 후, PNGaseF 분해를 위한 샘플에 1% NP-40 및 1× 완충액 G7 을 보충하였고, 1000 NEB Units PNGaseF (15.4 IUB mU/㎕ 의 등량물, 내부 제조됨) 를 첨가하였다. 엔도H 분해를 위한 샘플에 1× 완충액 G5 및 500 유닛의 엔도H (NEB) 를 보충하였다. 모든 분해물을 2-4 시간 동안 37℃ 에서 유지시킨 후, SDS-PAGE 상에 로딩하였다.

모세관 전기영동에 의한 글리코실화 분석

모세관 전기영동에 의한 N-글리칸 분석을 위해, 50 ㎕ 의 암모늄 술페이트 분획 또는 10 ㎍ 의 정제 hIL-22 를 하기 기재된 플레이트 방법에 따라 제조하였다: Laroy, W., Contreras, R. & Callewaert, N., Nat. Protoc. 1, 397-405 (2006).

용액내 (in-solution) 엔도T-분해를 위한 샘플을 25 mM MES pH 5.5 에서 희석시킨 후, 100 ng 의 재조합 정제 엔도T 를 첨가하였다. 샘플을 밤새 인큐베이팅하고 건조시켰다. 상기 기재된 바와 같이 라벨링을 수행하였다. 상기 기재된 바와 같이 ABI 3130 모세관 DNA 시퀀서 (sequencer) 에 대해 APTS-유도체화된 N-글리칸을 분석하였다 (Laroy, W., Contreras, R. & Callewaert, N., Nat. Protoc. 1, 397-405 (2006)). 소 RNase B 의 N-글리칸 (Man_5-9GlcNAc₂, M5-9) 및 α-1,6-연결 글루코오스 잔기 (글루코오스 단위, Glucose Unit (G.U)) 로 이루어지는 덱스트란 래더를 모두 참조물로서 포함하였다. Genemapper 소프트웨어 (Applied Biosystems) 를 이용하여 데이터를 분석하였다.

엑소글리코시다아제 시퀀싱을 위해, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae) β-1,4-갈락토시다아제 또는 β-N-아세틸헥소사미니다아제 (Prozyme, 분해물 당 4 mU), 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei) α-1,2-만노시다아제 (본 실험실에서 제조됨, 분해물 당 0.33 ㎍) 및 잭 빈 α-1,2/-3/-6-만노시다아제 (Sigma, 분해물 당 20 mU) 를 이용하여, 라벨링된 글리칸의 엑소글리코시다아제 처리를 수행하였다. 모든 반응을 20 mM 소듐 아세테이트 (pH 5.0) 에서 37℃ 에서 밤새 수행하였다.

N-글리코형태 클린-업을 위한 엔도T 투여량-연구

엔도T 처리의 영향을 측정하기 위해, 단일 암모늄 술페이트 펠렛 (250 mL 배양물의 등량물) 을 25 mM MES pH 5.5 25 mL 에 다시 용해시키고, 0.22 ㎛ SteriTop/SteriCup 바틀탑 필터 (Millipore) 를 통해 여과시켰다. 여과물의 총 단백질 농도를 BCA (Pierce) 로 측정하였다. 각 에펜도르프 튜브가 1 mg 의 총 단백질을 함유하도록, 멸균 에펜도르프 튜브를 통해 단백질을 2 개의 시리즈로 나눴다. 25mM MES pH 5.5 에서 재조합 엔도T 를 희석시킴으로써, 재조합 엔도T 의 희석 시리즈를 제조하였고, IL-22 함유 암모늄 술페이트 분획에 첨가하였다. 각 시리즈 (10 ㎍ 엔도T/mg 총 단백질에서 0.001 ㎍/mg) 를 2회 제조하고, 샘플을 밤새 (~14 시간) 4℃ 또는 37℃ 에서 인큐베이팅하였다. 그 다음 날, 샘플을 침전에 대해 평가하였다. 엔도T 처리의 영향을 평가하기 위해, 1 μL 의 두 시리즈의 각각의 샘플을 웨스턴 블롯에 의한 전이를 위해 SDS-PAGE 상에 로딩하였다. 쿠마시 분석을 위해, 5 ㎕ 의 각각의 반응물을 SDS-PAGE 상에 로딩하였다.

N-글리코실화 분석을 위해, 50 ㎕ 의 각각의 샘플을 상기 기재된 바와 같이 모세관 전기영동 (DSA-FACE) 을 위해 제조하였다. N-글리칸 프로파일의 올리고-만노오스 백그라운드를 조정된 잭 빈 α-만노시다아제 분해를 사용하여 밝혔다. 따라서, 1 μL 의 APTS-라벨링된 N-글리칸 샘플을 잭 빈 α-1,2/-3/-6-만노시다아제 (Sigma, 분해물 당 10 mU) 로 분해하였다. 20 mM 소듐 아세테이트 (pH 5.0) 에서 37℃ 에서 2 시간 동안 분해를 수행한 후, 모세관 전기영동으로 분석하였다. 보다 긴 인큐베이션은 복합-형 N-글리칸의 분해를 야기하는데, 이는 상업적 잭 빈 제제 중 낮은 수준의 오염 β-N-아세틸헥소사미니다아제 및 갈락토시다아제에 기인한다.

엔도T-처리된 IL-22 글리코형태의 정제

hIL-22 를 정제하기 위해, 암모늄 술페이트 펠렛을 100 mL 의 최종 부피로 25 mM MES pH 5.5 에서 용해시키고, 0.22 ㎛ 바틀탑 필터를 통해 여과하였다. 여과물의 총 단백질 농도를 BCA 로 측정하였다. 그 다음, 여과물에 재조합 엔도T (0.5-1.0 ㎍/mg 총 단백질) 를 첨가하였다. 셰이커-플랫폼에서 약하게 진탕하면서, 반응물을 4℃ 에서 (밤새) 유지시켰다. 그 다음 날, 침전에 대해 반응을 평가하였다. 0.22 ㎛ SteriTop/SteriCup 바틀탑 필터를 통해 침전물을 제거하고, 여과물을 상기 기재된 바와 같이 정제하였다.

IL-22 바이오활성에 대한 시험관 내 Colo-205 검정

American Type Culture Collection (ATCC) 로부터 인간 Colo-205 결장 암종 세포를 주문하고, 데이터시트에 제공된 가이드라인에 따라 배양하였다. 간략하게, 세포주를 37℃, 5% CO₂ 에서 10% 소 태아 혈청 (FBS) 을 보충한 RPMI1640 (Gibco) 에서 반-부착 세포 (semi-adherent cell) 로서 배양하였다. 계대배양 (passaging) 을 위해, 현탁액 중 성장하는 세포를 수집하고, 부착 세포를 하기 표준 조직 배양 절차에 따라 트립신화하였다. Colo-205 검정을 위해, 세포를 3.0 × 10⁵ 세포/mL (100 ㎕/웰) 로 96-웰 U-바닥 플레이트에 파종하였다. 24 시간 동안 세포를 적응시킨 후, hIL-22 의 희석 시리즈로 세포를 자극하였다. 모든 자극을 밤새 진행하였다. 대조로서, 시판 재조합 hIL-22 (무담체) 의 희석 시리즈 (E. 콜라이 생성 (Biolegend)) 를 사용하였다. 그 다음 날, 400 g, 4℃ 에서 10 분 플레이트를 원심분리하고, 상청액을 수집하였다. 상청액을 hIL-10 DuoSet ELISA (R&D systems) 를 사용하여 IL-10 에 대해 검정하였다. 데이터를 GraphPad Prism 6 에서 분석하였다. EC₅₀ 을 측정하기 위해 사용된 투여량-반응 곡선을 기반으로 특이적 활성을 측정하였다.

특히 실시예 2 를 위한 재료 및 방법: 엔도T 를 사용하는 ProDerp1 글리코형태의 클린-업

상이한 ProDerp1 글리코형태를 수득하기 위해, pPIC9ProDerp1 피키아 파스토리스 발현 벡터를 Man₅GlcNAc₂ N-글리칸으로 우세하게 당단백질을 개질시키는 M5- (Man5) OCH1 돌연변이 형성된 피키아-균주로 형질변환하였다 (Jacobs, P. P. et al., Nat. Protocols 4, 58-70 (2008), Vervecken, W. et al., Appl. Environ. Microbiol. 70, 2639-2646 (2004)).

이후, 하기 효소를 이의 해당 OCH1 돌연변이 형성된 피키아-균주 벡터를 사용하여 상기 균주로 연속 형질변환하였다: N-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제 I, 만노시다아제 II, N-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제 II 및 N-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제 IV. 각각의 형질변환 단계 사이에, 모세관 전기영동을 사용하여 ProDerp1 의 N-글리칸 프로파일을 분석하고, ProDerp1 의 발현을 분석하였다. 마지막으로, GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂ ProDerp1 발현 균주를 수득하였다.

대규모 발현 실험 후, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 음이온 교환 및 겔 여과 (최종 완충액: 50 mM Tris-HCl pH 7.4) 의 조합을 사용하여 GlcNAc3Man3GlcNAc2 ProDerp1 을 정제하였다. 다음 단계에서, 시험관 내 GalNAc 전이를 하기 조건을 사용하여 수행하였다: 150 μM 말단 GlcNAc, 10 mM UDP-GalNAc, 50 mM Tris-HCl pH 7.4 + 10 mM MnCl₂, 0.5 ㎍ 인간 베타-1,4-갈락토실트랜스페라아제 Y285L (특이적 활성 > 2,000 pmol/min/㎍, R&D Systems) (Ramakrishnan, B. & Qasba, P. K., J. Biol. Chem. 277, 20833-20839 (2002)), 37℃ 에서 밤새 인큐베이션). GlcNAc3Man3GlcNAc2 및 GalNAc3GlcNAc3Man3GlcNAc2 ProDerp1 샘플에 존재하는 고-만노오스 백그라운드를 제거하기 위해, 두 샘플을 엔도T (10 ㎍ 의 당단백질에 대해 200 ng 의 엔도T, 37℃ 에서 밤새 인큐베이션) 로 처리하였다.

실시예

실시예 1: hIL-22 ^WT 및 hIL-22 ^N21 의 복합 글리코형태에 대한 엔도글루코사미니다아제 클린-업

도입 및 전략

피키아 파스토리스를 엔지니어링하여 복합형 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-글리칸으로 개질된 hIL-22^WT (3 개의 기능적 N-글리코실화 부위를 가짐) 를 발현시켰다. IL-22^N21 N-글리코실화 부위 돌연변이 (하나의 기능적 글리코실화 부위를 가짐) 를 발현하는 Gal₂Gn₂M₃-균주를 또한 엔지니어링하였다 (이는 모두 재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같음).

N-글리칸의 구조적으로 이종 백그라운드를 제거하기 위해, 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei) 로부터의 재조합 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (엔도T) 를 적용하였다.

결과

1.1 백그라운드 N-글리칸을 클린 업하기 위한 엔도T 투여량 연구

정제 방법에 엔도T 를 통합하기 위해, 암모늄 술페이트 펠렛의 가용화 직후 엔도글루코사미니다아제를 첨가하여 정제 전 재조합 효소가 첨가될 수 있는지를 연구하였다. 높은 염 농도가 효소 활성에 대해 최적이 아닐 수 있으므로, 먼저 4℃ 에서 투여량-연구 실험을 수행하여 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂-hIL-22^WT 샘플의 모든 N-글리칸 백그라운드를 해결하기 위해 얼마나 많은 엔도T 가 요구될 수 있는지를 평가하였다 (도 1).

이후, N-글리칸을 모세관 전기영동으로 분석하고, 보다 고온에서 인큐베이팅된 샘플과 유사한 N-글리칸 프로파일에 대한 엔도T 의 효과를 관찰하였다 (데이터는 나타나지 않음). 보다 상세하게, 인큐베이션이 4℃ 에서 수행되는 경우, 보다 많은 엔도T 가 동일한 효과를 달성하기 위해 필요하다. 예를 들어, Man₅GlcNAc₂ 에 상응하는 피크는 0.01 ㎍ 엔도T/mg 에서만 감소하기 시작하고, 0.1 ㎍ 엔도T/mg 이하가 잔류 Man₅GlcNAc₂ 를 완전히 제거하기 위해 필요하다. 유사하게, 고만노오스 N-글리칸 (M9-10) 은 0.01 ㎍ 엔도T/mg 이하까지 지속된다. 하전된 N-글리칸 함유 포스포-만노오스를 제거하기 위해, 0.5 ㎍ 엔도T/mg 이하가 필요하다. 그러나, 1 ㎍ 엔도T/mg 이 첨가되는 경우, N-글리칸 프로파일은 어떠한 N-글리칸 함유 올리고-만노오스, 혼성 또는 포스포-만노오스도 갖지 않았다. 잔류하는 N-글리칸은 보다 고온에서 인큐베이팅된 샘플에서와 동일하며, 다른 조건에 대해 N-글리칸 유형을 비교하는 경우 피크 강도 사이의 차이는 없다.

IL-22^N21 발현 균주의 모세관 전기영동 (도 2) 은, 엔도T 로 처리되지 않은 암모늄 술페이트 분획의 N-글리칸 프로파일이 이미 비교적 동종으로 나타난다는 것을 밝혔다 (도 2 의 대조군 참조). 샘플을 엔도T 로 밤새 인큐베이팅한 경우, Man₅GlcNAc₂ 에 상응하는 피크의 강도가 1 ng 엔도T/mg 총 단백질에서 이미 감소하기 시작하고, 임의의 잔류 Man₅GlcNAc₂ 가 0.05 ㎍ 엔도T/mg 에서 N-글리칸 프로파일로부터 완전히 사라지지 않는다는 것을 볼 수 있었다. 분해 후, 고-만노오스 및 포스포-만노실 N-글리칸에 상응하는 임의의 마이너 백그라운드 피크는 0.01 ㎍/mg 엔도T 부터 사라졌다. 상기 농도에서, Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-글리칸에 상응하는 거의 단일 우세 피크가 수득되었다. 또한, 언더갈락토실화 (undergalactosylated) GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 이성질체로 이루어지는 마이너 분획 및 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 는 거의 볼 수 없었다.

결론적으로, N-글리칸 이질성은 이용가능한 N-글리코실화 부위의 개수와 상관관계가 있다고 관찰되었고, 이에 따라, 또한 IL-22 N-글리칸 프로파일의 클린 업에 필요한 엔도T 의 양에 대한 차이점이 있을 수 있는지 여부가 결정되었다. 상기 결과로부터, IL-22^WT 의 경우 0.1 ㎍ 엔도T/mg 총 단백질에 비해 현재의 IL-22^N21 샘플의 경우 단지 0.05 ㎍ 엔도T/mg 만이 요구된 것과 같이, N-글리칸 이질성 (예를 들어, IL-22^N21 대 IL-22^WT) 의 감소는 클린 업 수행에 요구되는 재조합 엔도T 의 양의 감소와 양립가능하다는 결론을 내릴 수 있었다.

1.2 잭 빈 만노시다아제 분해는 백그라운드를 밝히고 확인시킴

백그라운드의 일부가 정교한 고-만노오스 N-글리칸으로 이루어지기 때문에, 상기 N-글리칸에 상응하는 신호는 매우 분산될 수 있고, 이에 따라 모세관 전기영동과 같은 방법을 사용하여 구별하기 어렵다. 이를 방지하기 위해, 4℃ 에서 엔도T 로 이전에 인큐베이팅된 샘플에 대한 잭 빈 α-1,2/-3/-6-만노시다아제 분해를 포함시켰다 (도 3 및 도 4).

Gal₂Gn₂M₃IL-22^WT 샘플을 연구하기 위해, 대조 샘플 (엔도T 또는 잭 빈 만노시다아제로 미처리됨) 을 잭 빈 만노시다아제으로 분해된 동일한 샘플과 비교하였다 (도 3). Man₅GlcNAc₂ N-글리칸의 Man₁GlcNAc₂ 코어로의 즉각적인 가수분해가 나타났다. 그러나, 후자 피크의 피크 강도는 미분해 샘플의 Man₅GlcNAc₂ 피크의 강도를 초과하며, 이는 또한 다른 N-글리칸이 가수분해되었음을 나타낸다. 엔도T 처리된 샘플이 분해된 경우, Man₁GlcNAc₂ 코어 N-글리칸의 피크 강도의 지속적 감소가 관찰되었다. 후자 피크의 감소는 암모늄 술페이트 샘플을 사전 처리하기 위해 사용된 엔도T 의 양과 반비례 관계이다. 0.5 ㎍ 엔도T/mg 이 사용된 시점에서, 잭 빈 만노시다아제 분해 후 Man₁GlcNAc₂ 의 코어는 거의 더 이상 관찰될 수 없었다.

Gal₂Gn₂M₃ IL-22^N21 샘플의 N-글리칸 프로파일에 관해, 엔도T 또는 잭 빈 α-만노시다아제로 미처리된 대조 샘플은 이미 비교적 동종 N-글리칸 프로파일을 갖는다 (도 4). 일부 다른 마이너 고-만노오스 및 포스포릴화 유형 이외에 단지 일부 Man₅GlcNAc₂ 가 존재하였다. 이러한 대조 샘플 (엔도T 로 미처리됨) 이 α-만노시다아제로 분해되는 경우, Man₁GlcNAc₂ 코어에 상응하는 뚜렷한 피크가 나타났다. 후자 피크의 강도는, 대조 샘플에서 관찰된 Man₅GlcNAc₂ 의 양보다 상당히 크고, 이는 비교적 클린한 N-글리칸 프로파일에도 불구하고, 검출될 수 없는 몇몇의 백그라운드가 여전히 존재함을 나타낸다. 그러나, Man₁GlcNAc₂ 피크는 엔도T 의 농도가 0.2 ㎍/mg 엔도T 까지 증가함에 따라 즉시 감소한다. 결론적으로, 0.5 ㎍/mg 이후부터, 코어 N-글리칸은 더 이상 나타나지 않고, 단지 우세한 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 피크, 소량의 GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 언더갈락토실화 이성질체 및 미량의 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 만이 잔류하고, 이는 모두 복합 N-글리칸인 것을 입증할 수 있었다.

1.3 SDS-PAGE 분석에 의한 IL-22 ^WT 및 IL-22 ^N21 의 엔도T 분해 후 IL22 안정성 모니터링.

IL-22 안정성에 대한 엔도T-분해 (밤새) 의 영향을 SDS-PAGE 에서 샘플을 분석함으로써 연구하였다 (도 5, 패널 a 및 도 6, 패널 a).

비글리코실화 IL-22^WT 및 1- 또는 -2 개의 N-글리칸을 갖는 글리코형태에 상응하는 밴드를 명확하게 구별할 수 있었다 (도 5, 패널 a). 완전 N-글리코실화 글리코형태 (3 개의 N-글리칸) 는 쿠마시 염색 겔 상에서 구별하기 어려웠다. 또한, 아마도 단백질가수분해 클리핑 (proteolytic clipping) 에 상응하는 밴드를 관찰하였다 (△). 이러한 밴드의 양은 샘플에 첨가되는 엔도T 의 농도가 상승함에 따라 증가한다. 유사한 패턴을 탈글리코실화/비-글리코실화 유형 (0) 에 대해 관찰하였다. 대조 샘플에서, 엔도T 의 농도가 증가함에 따라 점진적으로 사라지는, 15- 및 37 kDa 사이의 확산 스미어가 확인되었다. 0.5 ㎍ 엔도T/mg 총 단백질에서, 스미어링은 더 이상 관찰될 수 없었다.

IL-22 에 반응성인 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의한 분석은, 관찰된 확산 스미어가 사실 IL-22 이었고, 실제로 엔도T 의 농도가 증가함에 따라 사라진다는 것을 밝혔다 (도 5, 패널 b 및 -c). 이는 쿠마시 염색 겔 및 웨스턴 블롯 모두에서 확인될 수 있었고; 엔도T 의 증가는 비글리코실화 IL-22 의 증가 (온전한 클리핑 및 단백질가수분해 클리핑 둘 모두) 에 더불어 스미어링의 감소를 유도하고, 이는 스미어가 IL-22^WT 의 글리코형태를 함유한다는 것을 확인한다.

엔도T 처리된 IL-22^N21 샘플을 또한 SDS-PAGE 로 분석하였다 (도 6, 패널 a). 쿠마시 염색 겔에서, N-글리코실화 IL-22^N21 에 상응하는 밴드는 명백히 확인될 수 있었지만, 스미어링은 샘플에 존재하지 않았다. 샘플을 웨스턴 블롯으로 분석하였는데, 또한 여기서도 스미어링은 확인할 수 없었다 (도 6, 패널 b).

하이퍼글리코실화 백그라운드의 신호는 블롯의 백그라운드 신호를 초과하지 않았다 (나타나지 않음). 그러나, 비글리코실화 분획은 엔도T 의 투여량이 증가함에 따라 증가한다는 것을 확인할 수 있었고, 이는 존재하는 몇몇의 백그라운드의 제거가 검출될 수 없었음을 나타낸다.

1.4 엔도T-처리된 Gal ₂ GlcNac ₂ Man ₃ hIL-22 ^WT 의 정제.

엔도T 클린-업 절차가 정제 실험에 통합될 수 있는지를 연구하였고, 기존의 프로토콜이 또한 재조합 엔도T 를 다시 제거하는 것을 허용하는지를 시험하였다. 투여의 투여량-연구 실험에서, 심지어 4℃ 에서 인큐베이팅하는 경우에도, 약 0.5 ㎍/mg 엔도T (총 단백질 1 mg 당) 가 임의의 올리고-만노오스 백그라운드를 제거하기에 충분해야 한다는 것을 확립하였다. 이러한 발견은 2 L 배양물의 등량물에 대해 실행되었고, 가용화된 암모늄 술페이트 분획의 총 단백질 농도를 측정한 후, 이에 따라 엔도T 를 첨가하였다. 4℃ 에서 밤새 인큐베이션 후, 샘플을 표준 프로토콜에 따라 정제하였다 (도 7).

SephadexG25 를 통해 탈염시킨 후 (도 7, 상부 왼쪽), 벌크 오염물을 Q-Sepharose 컬럼을 통해 제거하였다. 엔도T 의 pI 는 처리에 따라 4.3-4.4 에서 가변적이고 (Expasy, Compute MW/pI); 이에 따라, 엔도T 는, 배지로부터의 벌크 오염물과 같이 pH 5.5 에서 Q-Sepharose 컬럼 상에 유지되어야 하는 반면 (나타나지 않음), IL-22^WT 는 통과액을 통과한다 (도 7, 상부 오른쪽). 이후, S15 Source 컬럼을 사용하여 혼합물의 상이한 N-글리코형태를 분리하였다. 임의의 잔류 엔도T 는 통과액에서 손실되어야 하는 반면, IL-22^WT 는 결합되어 유지된다. 또한 엔도T 가 산성 pI (~4.2) 를 갖기 때문에, 표준 크로마토그래피 단계를 사용하는 정제 중 임의의 잔류 엔도T 를 제거하는 것은 꽤 간단해야 한다. 나아가, 요구되는 엔도T 의 양은 다소 제한되고, 정제 방법에 영향을 미쳐서는 안된다. 심지어, 샘플, 예컨대 상당한 이질성을 갖는 hIL-22^WT 의 경우에도, 0.5-1.0 ㎍ 엔도T/mg 총 단백질을 첨가하고, 4℃ 에서 인큐베이팅함으로써, 매우 순수한 N-글리코형태를 수득하였다. 이는 다른 당단백질에 대해서 시험될 필요가 있지만, 1:1000 의 비가 추가의 최적화를 위한 개시 포인트로 제안된다.

S15 Source 로부터의 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂-IL-22^WT 의 용리 프로파일에서, 여러 피크가 구별될 수 있다 (도 7, 하부 왼쪽 및 도 9).

S15 Source 컬럼에서 hIL-22^WT 를 용리하는 경우, 어떠한 이질성도 신속하게 검출될 수 있다. 엔도T-처리된 Gal₂GlcNAc₂Man₃-hIL-22^WT 의 용리 프로파일에서, 다소 별개의 피크가 관찰되었다 (도 9, 패널 a). SDS-PAGE 에서 용리 분획을 분석한 경우, 글리코형태가 사실상 스미어링 없이 별개 밴드로서 움직인 것을 확인하였고, 이는 강한 N-글리칸 이질성을 나타낸다 (도 9, 패널 b). 나아가, 용리 프로파일의 피크는 SDS-PAGE 에서 관찰된 상이한 글리코형태의 용리 시간과 일치한다. 이후, 용리 분획을 이의 N-글리칸 함량을 기준으로 풀링하고, Superdex75 컬럼에서 폴리싱하였다 (도 7, 하부 오른쪽). IL-22 을 응집 또는 광범위한 분해의 징후 없이 단일 피크로서 용리하였고, 저장을 위해 적합한 완충액으로 전환시켰다. 최종 폴리싱 분획을 SDS-PAGE 에서 분석하였고, 이는 혼합- 및 대부분의 비글리코실화 분획 이외에 대부분의 N-글리코실화 분획이 분리될 수 있음을 나타내는 최종 풀의 개요를 제공하였다 (도 9, 패널 c). 보다 많은 분해가 환원 조건 하에서 관찰되었지만, 환원 및 비환원 조건 하에서 올리고머화의 징후는 발견할 수 없었다 (도 9, 패널 d). 임의의 잔류 백그라운드를 시험하기 위해, PNGaseF 및 엔도H 에 의한 구별적인 분해를 수행하였다 (도 9, 패널 e). N-글리코실화 분획을 PNGaseF 로 완전 탈글리코실화시켰다. 대조적으로, 사실상 엔도H 분해 후 어떠한 효과도 발견할 수 없었고, 이는 N-글리칸이 엔도H 에 매우 내성이고, 이에 따라 복합-형 N-글리칸이어야 한다는 것을 나타낸다.

엔도T 로 처리된 새롭게 정제된 IL-22 와, 미정제, 미처리된 상청액의 N-글리코실화 프로파일을 비교하였다 (도 11, 패널 a). 미처리된 샘플에서 (레인 2), 올리고-만노오스- 및 포스포-만노실 N-글리칸뿐 아니라 상이한 경로 중간체에 상응하는 다양한 피크를 볼 수 있었다. 잭 빈 α-만노시다아제는 대부분 이질성을 제거하고, 단일 Man₁GlcNAc₂-피크로 감소시킨다. 후자 피크는 심지어 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 피크를 초과한다 (레인 3).

대조적으로, 엔도T 처리된 샘플은 보다 동종이고 (레인 4), 이는 예상된 복합 N-글리칸 (Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂, GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 이성질체 및 잔류 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂) 에 상응하는 피크만을 나타낸다. 특히, α-만노시다아제 분해는 어떠한 백그라운드도 전혀 나타내지 않고 (레인 5), 이는 이러한 접근법의 효율을 입증한다.

또한, 순차적 엑소글리코시다아제 분해를 사용하여 스펙트럼의 우세한 피크의 아이덴티티를 확인하였다 (도 11, 패널 b). β-1,4-갈락토시다아제에 의한 정제, 엔도T-처리된 hIL-22^WT 로부터의 N-글리칸의 분해 (레인 2) 는 비환원 말단의 갈락토오스 잔기를 절단하고, 이로 인해 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 피크 및 언더갈락토실화 이성질체를 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 로 감소시킨다 (레인 3). β-N-아세틸헥소사미니다아제로의 분해는 잭 빈 α-만노시다아제 분해 후 Man₁GlcNAc₂ 코어 (레인 5) 로 완전히 감소되는 트리만노실 코어 (레인 4) 를 산출한다.

1.5 엔도T-처리된 Gal ₂ GlcNac ₂ Man ₃ IL-22 ^N21 의 정제.

엔도T 클린-업 절차를 정제 반응에 통합시켰다. 이제, 이를 시험하여 클린한 Gal₂GlcNac₂Man₃GlcNAc₂ IL-22^N21 를 단리하였다. 투여의 투여량-연구 실험에서, 심지어 4℃ 에서 인큐베이팅하는 경우에도, 0.5 ㎍ 엔도T /(mg 총 단백질) 가 임의의 올리고-만노오스 백그라운드를 제거하기에 충분해야 한다는 것을 확립하였다. 예비 분해를 위해, 2 L 배양물의 등량물을 사용하였고, 가용화된 암모늄 술페이트 분획의 총 단백질 농도를 측정한 후, 엔도T 를 1 ㎍/mg 총 단백질로 첨가하여, 완전 분해를 보장하였다. 4℃ 에서 밤새 인큐베이션 후, 샘플을 표준 프로토콜을 사용하여 정제하였다 (도 8 은 정제 방법의 개요를 제공함).

먼저, 샘플을 SephadexG25 컬럼을 통해 탈염시키고 (도 8 상부 왼쪽), 용리액을 Q-Sepharose 컬럼 상에 로딩하였다. IL-22 함유 통과액 및 세척 분획을 수집한 반면, 벌크 오염물 및 엔도T 를 단지 1M NaCl (나타나지 않음) 로 컬럼으로부터 용리하였다 (도 8 , 상부 오른쪽). IL-22 함유 분획을 이후 S15 Source 컬럼 상에 로딩하였다. 상이한 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂-IL-22^N21 의 N-글리코형태를 100 내지 300mM NaCl 에서 용리한 반면, 비글리코실화 IL-22^N21 은 단지 300mM NaCl 에서 용리하였다 (도 8, 하부 왼쪽 및 도 10, 패널 a). S15 Source 컬럼으로부터의 용리 중, 상이한 피크를 구별할 수 있었지만, 이는 완전 분해되지 않는다 (도 8, 하부 왼쪽 및 도 10, 패널 a). SDS-PAGE 에서의 용리 분획의 분석은 일련의 비글리코실화 IL-22^N21 및 이의 단일 글리코형태에 상응하는 뚜렷한 밴드를 나타냈다 (도 10, 패널 b). 용리 분획에서 스미어링은 관찰되지 않았고, 이는 매우 동종 N-글리코형태를 나타낸다. SDS-PAGE 겔로부터의 결과는 용리 프로파일의 피크의 표기와 일치한다. 용리 분획을 N-글리칸 함량을 기준으로 풀링하고, Superdex75 컬럼을 통해 폴리싱하였다 (도 8, 하부 오른쪽). IL-22 는 단일 피크로서 용리되고, 응집 또는 광범위한 분해를 나타내는 피크는 없다. 최종 폴리싱 분획을 또한 SDS-PAGE 에서 분석하였고, 이는 혼합- 및 대부분의 비글리코실화 분획 이외에 대부분의 N-글리코실화 분획의 분리를 보여준다 (도 10, 패널 c). 이후, N-글리코실화 분획을 환원 및 비환원 조건 하에서 비교하였다. 단백질이 환원 조건 하에서 분석된 경우, 분해 생성물의 존재를 제외하고 차이가 없었다 (도 10, 패널 d). 이후, PNGaseF 및 엔도H 에 의한 구별적인 분해를 사용하여 올리고-만노오스 백그라운드가 여전히 존재할 수 있는지를 시험하였다 (도 10, 패널 e). PNGaseF 로의 분해 후, N-글리코실화 분획을 완전 탈글리코실화하였지만, 어떠한 밴드도 엔도H 에 의한 분해에 감응성이 아니고, 이는 복합 N-글리칸 및 단지 약간의 혼성 또는 올리고-만노오스 N-글리칸의 존재를 나타낸다.

엔도T 클린-업이 정제 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂-hIL22^N21 의 N-글리칸 프로파일에 어떻게 영향을 주는지를 확립하기 위해, 미처리된 암모늄 술페이트 분획의 N-글리코실화 프로파일을 정제 hIL-22^N21 와 모세관 전기영동에 의해 비교하였다 (도 12, 패널 a). 본래의 샘플에서 (레인 2), Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂, GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 이성질체 및 잔류 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 에 상응하는 피크는 뚜렷하게 보인 반면, 상당 부분의 Man₅GlcNAc₂ 는 단지 미량의 올리고-만노오스- 및 포스포-만노실화 N-글리칸만이 존재하는 것으로 관찰되었다. 잭 빈 α-만노시다아제 분해가 미처리 샘플에서 수행되는 경우, Man₅GlcNAc₂ 는 Man₁GlcNAc₂-코어로 분해된다. 그러나, 후자 피크의 크기는 분해 전 관찰된 Man₅GlcNAc₂ 의 양을 초과하고, 이는 다른 올리고-만노오스 N-글리칸이 샘플에 존재하였음을 나타낸다 (레인 3). 대조적으로, 엔도T 로 처리된 샘플은 보다 동종이고 (레인 4), 이는 단지 예상된 복합 N-글리칸 (Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂, GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 이성질체 및 잔류 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂) 에 상응하는 피크만 보여준다. α-만노시다아제 분해를 사용하여 임의의 잔류 백그라운드를 밝히는 것은 불가능하였고, 이는 클린-업 단계의 효과를 설명한다 (레인 5). 이 결과로부터, 미량의 상업적 잭 빈 제제의 β-갈락토시다아제 활성이 또한 언더갈락토실화 피크의 증가에 의해 명백히 밝혀질 수 있다. 그러나, 이러한 실험에서, 이는 문제가 되지 않는데, 이는 복합형 N-글리칸의 분해가 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 에 비해 더 진행되지 않았기 때문이다. 추가의 분해는 또한 일부 트리-만노실-코어를 산출할 가능성이 높을 수 있고, 이는 샘플에서 부재이다.

이후, 엑소글리코시다아제 분해를 사용하여 글리코형태의 순도를 추가로 확인하고, 스펙트럼에서 우세한 피크의 아이덴티티를 확인하였다 (도 12, 패널 b). 미처리 대조군에서, 메인 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 피크 외부에서 여러 보다 작은 피크를 확인하였다. 그러나, β-1,4 갈락토시다아제 분해 후, 단지 단일 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 피크만 관찰되었고, 이때 임의의 잔류 오염물의 징후는 없었다. HexNAc'ase 로의 추가의 분해는 후자 피크를 Man₃GlcNAc₂-코어로 감소시켰다. 잭 빈 분해 후, 후자 피크를 이후 Man₁GlcNAc₂-코어로 감소시켰다. 주목할 것은 복합-형 중간체 외부에서, 엑소글리코시다아제 분해 중 오염 피크가 관찰되지 않았다는 점이다.

1.6 엔도T 처리된 글리코형태의 바이오-활성.

정제 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂-hIL-22^WT 및 -hIL-22^N21 의 바이오-활성을 측정하기 위해, 글리코형태를 인간 Colo-205 결장 암종 세포주에서 IL-10 을 유도하는 이의 능력에 대해 시험하였다. IL-22 의 상승하는 투여량으로 자극함으로써, 엔도T 처리된 IL-22 의 EC₅₀ 를 측정하고, E. 콜라이로부터 정제된 상업적 재조합 IL-22 표준물과 비교하였다 (도 13). 피키아-생성 hIL-22 는 적어도 E. 콜라이 생성 IL-22 만큼 활성인 것으로 확인되었다 (각각 hIL-22^WT 및 hIL-22^N21 의 경우, 0.094±0.15 ng/mL 및 0.082±0.13 ng/mL 대 E. 콜라이-생성된 IL-22 의 경우, 0.269±0.14 ng/mL (EC₅₀±SE)).

1.7 예상되지 않은 네오글리코형태에 대한 적용가능성

다양한 hIL-22-발현 균주의 N-글리칸 엔지니어링 중, 내인성 글리코실트랜스페라아제에 의해 발생한 인공 N-글리칸 중간체의 인식으로부터 유도될 수 있는 통상적이지 않은 글리코형태를 발견하였다. 이전에, 뮤린 IL-22 의 Man₅GlcNAc₂ N-글리칸이 α1,3-연결 글루코오스, 2 개의 연속 β1,2-연결 만노오스 잔기 및 캐핑 (capping) α-1,2-글루코오스를 함유하는 선형 4당류로 치환될 수 있는 것을 발견하였다 (데이터는 나타나지 않음). 유사한 관찰이 Man5-균주에서 발현된 인간 IL-22 에 대해 나타났다. 그러나, N-글리칸 치환은 하나의 헥소오스 잔기가 더 작았다. 엔도T 클린-업이 또한 확인된 네오글리코형태에 대해 작동할 수 있는지를 평가하기 위해, 정제된 Man₅GlcNAc₂hIL-22^WT 에서의 엔도T 에 의한 시험관 내 분해를 시험하였다 (도 14). 정제된 Man₅GlcNAc₂-hIL-22^WT 로부터의 N-글리칸이 플레이트 방법을 사용하여 PNGaseF 에 의해 방출되는 경우 (Laroy, W., Contreras, R. & Callewaert, N., Nat. Protoc. 1, 397-405 (2006)), α-만노시다아제 분해에 내성인 Man₅GlcNAc₂ N-글리칸 및 Hex_8-9GlcNAc₂ N-글리칸이 확인될 수 있다 (레인 2). 샘플이 플레이트 방법을 사용하는 N-글리칸의 제조 중 PNGaseF-방출 전 엔도T 에 의해 처리되는 경우, 신호는 더 이상 검출될 수 없었다 (레인 3). 그러나, 일부 피크는 전기영동도 (electropherogram) 에서 초기에 나타나는 것으로 나타났다. 이러한 피크는 샘플에 존재하는 오염 중합체이고 (이들 피크 사이의 동일한 간격 주목), N-글리칸이 아닌 것으로 확인되었다.

또한 동일한 것이 레인 5 에서 확인되고, 이에 따라 이는 분석에 사용된 정제된 엔도T 에 존재하는 오염 중합체일 수 있다. 엔도T 분해의 상청액을 바로 라벨링하는 것을 사용하여 분석하였고, 잔기가 ~1GU 만큼 프로파일의 왼쪽을 향해 이동한 것을 제외하고, PNGaseF 방출 샘플의 경우와 유사한 프로파일을 관찰하였다 (레인 4). 이는 엔도T 와 같은 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제에 의한 절단과 일치하였는데, 이는 키토바이오스 (chitobiose) 코어의 GlcNAc 잔기 사이에서 절단되기 때문이다. 글리칸 프로파일에서의 이동을 제외하고, 프로파일은 대부분 PNGaseF 방출 샘플과 동일하였고, 이는 엔도T 에 대해 알려진 기질인 Man₅GlcNAc₂ 이외에, 잠재적 면역원성 β-만노실 잔기를 함유하는 통상적이지 않은 N-글리칸이 또한 분해된다는 것을 보여준다. 또한, 재조합 엔도T 에서 N-글리칸은 플레이트 방법을 사용하여 검출되지 않았다 (레인 5).

실시예 2: IL-22 에서의 복합 N-글리칸의 상대적 존재량 측정

Jacobs et al. (Jacobs PP et al. (2009) Nat. Protoc. 4(1): 58-70) 에 기재된 바와 같이, ABI3130 DNA 시퀀서에서 N-글리칸 단리 및 분석을 수행하였다. ABI GeneMapper 소프트웨어 v3.7 (Applied Biosystems) 을 사용하여 피크를 할당하였다. 소프트웨어를 사용하여, 각 데이터포인트의 피크 강도 및 곡선 하 면적 (AUC) 을 계산하였다. N-글리칸 아이덴티티를 엑소글리코시다아제 분해를 사용하여 사전에 할당하였다. 이종 백그라운드 (이종 올리고-만노오스 N-글리칸 포함) 를 밝히기 위해, 각각의 샘플을 잭 빈 α-만노시다아제로 분해하였다. 잭 빈 α-만노시다아제 후, 코어 Man₁GlcNAc₂ 는 올리고-만노오스 N-글리칸의 가수분해의 결과로 나타나고, 이는 백그라운드의 보다 정확한 추정을 허용한다.

엔도글루코사미니다아제 클린-업 전 또는 후에 IL-22^N21 또는 IL-22^WT 글리코형태의 N-글리칸 프로파일 내의 각각의 글리코형태의 상대적 정량을 측정하였다. 상대적 존재량을 측정하기 위해, 엑소글리코시다아제 분해에 의해 확인된 피크의 AUC 를 모든 할당된 피크의 총 AUC 에 대해 계산하였다. 백그라운드를 코어 Man₁GlcNAc₂ 피크 (잭 빈 α-만노시다아제 분해에 의해 밝혀짐) 및 엑소글리코시다아제 분해에 의해 확인될 수 없는 피크의 총 AUC 로서 정의하였다.

특히, 엔도글루코사미니다아제 처리 이전의 Gal₂GlNAc₂Man₃GlcNAc₂ IL-22^WT 글리코형태의 경우, 62.15% 복합 N-글리칸 (백그라운드는 37.85%) - 도 11, 패널 3 에서 수득된 피크로부터 계산됨 - 이었다. 그러나, 엔도글루코사미니다아제 처리 후, 복합 N-글리칸 함량은 93.44% 에 달하고, 단지 6.56% 백그라운드만 남아 있다 - 도 11, 패널 5 에서 수득된 피크로부터 계산됨. 계산된 데이터는 도 19, 하부 패널에 나타나 있다.

특히, 엔도글루코사미니다아제 처리 이전의 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ IL-22^N21 글리코형태의 경우, 80.3% 복합 N-글리칸 (백그라운드는 19.7%) - 도 12, 패널 3 에서 수득된 피크로부터 계산됨 - 이었다. 그러나, 엔도글루코사미니다아제 처리 후, 복합 N-글리칸 함량은 98.3% 에 달하고, 단지 1.7% 백그라운드만 남아 있다 - 도 12, 패널 5 에서 수득된 피크로부터 계산됨. 계산된 데이터는 도 19, 상부 패널에 나타나 있다.

실시예 3. IL-22 에서의 갈락토실화 글리코형태의 상대적 존재량 측정

Jacobs et al. (Jacobs et al. (2009) Nat. Protoc. 4(1): 58-70) 에 기재된 바와 같이, ABI3130 DNA 시퀀서에서 N-글리칸 단리 및 분석을 수행하였다. ABI GeneMapper 소프트웨어 v3.7 (Applied Biosystems) 을 사용하여 피크를 할당하였다. 소프트웨어를 사용하여, 각 데이터포인트의 피크 강도 및 곡선 하 면적 (AUC) 을 계산하였다. N-글리칸 아이덴티티를 엑소글리코시다아제 분해를 사용하여 사전에 할당하였다. IL-22^WT 의 N-글리코실화 프로파일에 대한 피크 계산은도 11, 패널 4 기준이었다 (엔도글루코사미니다아제 클린-업 후 정제된 IL-22^WT). IL-22^N21 의 N-글리코실화 프로파일에 대한 피크 계산은 도 12, 패널 4 기준이었다 (엔도글루코사미니다아제 클린-업 후 정제된 IL-22^N21). 전자 및 후자 N-글리칸 프로파일 및 상응하는 피크 계산에서, 미정제 잭 빈 제제 중 보고된 미량의 β-갈락토시다아제 및 헥소사미니다아제 활성으로 인해 갈락토실화 N-글리칸의 상대적 존재량이 감소되기 때문에, 잭 빈 분해는 포함되지 않는다.

엔도글루코사미니다아제 클린-업 후 IL-22^N21 또는 IL-22^WT 글리코형태의 N-글리칸 프로파일 내의 각각의 글리코형태의 상대적 정량을 측정하였다. 상대적 존재량을 측정하기 위해, 엑소글리코시다아제 분해에 의해 확인된 피크의 AUC 를 총 AUC 에 대해 계산하였다. 피크 계산은 도 2, 패널 10 기준이었다 (1.0 ㎍/mg 로서 도시됨).

IL-22^N21 의 2-안테나 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 의 상대적 정량은 총 복합 N-글리칸 풀의 88.89% 에 달한 반면, 8.93% 는 단일 말단 갈락토오스를 갖거나 97% 이하의 모든 복합 N-글리칸은 적어도 하나의 단일 말단 갈락토오스를 갖는 2-안테나 복합 N-글리칸이다. 계산된 데이터는 도 20, 상부 패널에 나타나 있다.

IL-22^WT 의 2-안테나 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 의 상대적 정량은 총 복합 N-글리칸 풀의 66.19% 에 달한다. 또한, 22.06% 는 단일 말단 갈락토오스를 갖는다. 이와 함께, 88.25% 이하는 적어도 하나의 단일 말단 갈락토오스를 갖는 2-안테나 복합 N-글리칸이다. 계산된 데이터는 도 20, 하부 패널에 나타나 있다.

실시예 4: 엔도T 를 사용하는 ProDerp1 글리코형태 클린-업

도입 및 전략

본 목적은 말단 GalNAc 잔기를 함유하는 우성 집먼지 진드기 알레르겐 Derp1 의 효소적으로 불활성 프로폼 (proform) 인 ProDerp1 의 상이한 글리코형태를 생성하는 것이었다.

결과

도 15 는 정제된 GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂ ProDerp1 의 모세관 전기영동 프로파일을 나타낸다. 도 16 은 엔도T 로 처리되고, 상이한 피크를 표기하기 위해 엑소글리코시다아제 분해를 수행한 정제된 GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂ ProDerp1 의 모세관 전기영동 프로파일을 나타낸다. 도 17 은 GalNAc₃Gn₃Man₃GlcNAc₂ ProDerp1 의 모세관 전기영동 프로파일을 나타낸다. 도 18 은 엔도T 로 처리되고, 상이한 피크를 표기하기 위해 엑소글리코시다아제 분해를 수행한 GalNAc₃Gn₃Man₃GlcNAc₂ ProDerp1 의 모세관 전기영동 프로파일을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> VIB VZW UNIVERSITEIT GENT <120> Means and methods for generating complex glycans derived from fungal engineered hosts <130> NC/ENDex/549 <150> EP 16168156.4 <151> 2016-05-03 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Gln Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Gln 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu 85 90 95 Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val 100 105 110 Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 130 135 140 Cys Ile 145 <210> 2 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Gln 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu 85 90 95 Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val 100 105 110 Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 130 135 140 Cys Ile 145 <210> 3 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu 85 90 95 Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val 100 105 110 Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 130 135 140 Cys Ile 145

Claims (8)

1. 재조합 당단백질의 복수의 글리코형태를 포함하는 조성물로서, 상기 글리코형태에 존재하는 N-글리칸이 복합 N-글리칸 및 단일 GlcNAc 로 이루어지는 N-글리칸 구조의 혼합물을 포함하고, 상기 복합 N-글리칸이 상기 조성물에서 총 N-글리칸의 90% 초과 수준에서 존재하고, 상기 조성물이, 상기 당단백질이 발현되는 조건 하에서, 상기 당단백질을 인코딩하는 유전자 구조체를 포함하는 재조합 복합 N-글리코실화 엔지니어링 피키아 파스토리스를 배양하는 것과 상기 재조합 당단백질을 시험관 내에서 적합한 양의 엔도글루코사미니다아제와 접촉시키는 것을 포함하는 복합 N-글리코실화 엔지니어링 피키아 파스토리스에서 상기 당단백질의 생성에 의해 수득되는 조성물.
2. 당단백질이 발현되고, 배지로 분비되는 조건 하에서, 당단백질을 인코딩하는 유전자 구조체를 포함하는 복합 글리코실화 엔지니어링 피키아 파스토리스를 배양하는 것과 상기 당단백질을 생성한 후 적합한 양의 엔도글루코사미니다아제 효소와 시험관 내에서 접촉시키는 것을 포함하는, 제 1 항에 따른 조성물의 제조 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 접촉이 당단백질의 정제 중 발생하는 제조 방법.
4. 제 2 항에 있어서, 상기 접촉이 당단백질의 정제 후 발생하는 제조 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 조성물.
6. 제 1 항에 따른 조성물을 포함하는 약학 조성물.
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