CN1265143A - 通过内源基因活化制备促红细胞生成素 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在内源人EPO基因活化的基础上,能以足够的量和纯度产生EPO的人类细胞,从而经济地制备作为药物制品的人EPO。本发明还涉及用于制备这种人类产EPO细胞及用于在人类细胞中活化内源EPO的DNA构建体的方法,涉及在人类细胞中大规模生产EPO的方法。

Description

通过内源基因活化制备促红细胞生成素
本发明涉及在内源人促红细胞生成素(以下简称EPO)基因活化的基础上，能以足够的量和纯度产生EPO的人类细胞，从而经济地制备作为药物制品的人EPO。本发明还涉及用于制备这种人类产EPO细胞及用于在人类细胞中化内源EPO的DNA构建体的方法，涉及在人类细胞中大规模生产EPO的方法。
EPO是一种刺激血红细胞产生的人类糖蛋白。健康人血浆中EPO仅以非常低的浓度存在，因此不可能以此方法大量制备。EP-B-0 148 605和EP-B-0 205 564描述了在CHO细胞中制备重组人EPO。描述于EP-B-0 148 605中的EPO具有比尿EPO较高的分子量，且无O-糖基化。同时，述于EP-B-0 205 564中的来自CHO细胞的EPO可以纯的形式大量获得，但是其源于非人类细胞。此外，CHO细胞产生EPO的能力往往有限。
另外，已知从再生障碍性贫血患者的尿中获得人EPO(Miyake等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem)，252(1977)，5558-5564)。其中描述了一个7步骤方法，包括离子交换层析、乙醇沉淀、凝胶过滤和吸附层析。其以21％的产率获得了比活性为约70,000U/mg蛋白质的EPO制品。这种及其它获取尿EPO方法的缺点在于不能以足够数量及可重复的质量获得起始物料。而且，从尿中纯化较为困难，即使是纯化物仍含有尿杂质。
GB-A-2085 887描述了一种用于制备能以小量产生EPO的人类淋巴母细胞的方法。然而用这些细胞经济地生产药物是不可能的。
WO91/06667描述了一种用于重组制备EPO的方法。该方法第一步，在原代人胚胎肾细胞中通过同源重组将病毒启动子与内源EPO基因有效连接，并从这些细胞中分离DNA。第二步，将如上述分离的DNA转化入非人类CHO细胞，分析在这些细胞中EPO的表达。未提及可能在人类细胞中生产EPO。
WO93/09222描述了在人类细胞中生产EPO，其中在人成纤维细胞中可见相对较高的高达960,620mU/106细胞/24小时的EPO产量，其中所述成纤维细胞已被含有完整EPO基因的载体转染。这些细胞含有不在正确EPO基因座的外源EPO基因，故可预见存在细胞系稳定性方面的问题。在WO93/09222中未见关于组成型生产EPO的信息。此外，也未见关于是否可以足够用于药物用途的量生产EPO的任何信息。
此外，WO93/09222中描述了在人HT1080细胞中内源EPO基因的活化。其中，24小时内EPO的产量仅为2,500mU/106个细胞(相当于约16ng/106个细胞/24小时)。如此低的产量完全不适于经济地制备药物制品。
WO94/12650和WO95/31560描述了通过病毒启动子活化带有内源EPO基因的人类细胞，在内源EPO基因扩增后可产生高达约100,000mU/106个细胞/24小时(相当于0.6微克/106个细胞/24小时)。这样的产量仍旧不足以经济地生产药物。
本发明所要解决的问题在于至少部分消除现有技术中存在的上述缺陷，提供技术上较好的方法用于在人类细胞中制备EPO。特别是，本发明可获得足够量以及足够纯度的产物从而可能经济地生产用于药物用途的EPO。
通过在人类细胞中活化内源EPO基因以及任选地通过随后活化的人EPO基因的扩增解决了上述问题。以这种方式，通过筛选适当的起始细胞、DNA构建体和筛选方法，可以出人意料地提供能以足够数量、质量以及纯度生产EPO的人类细胞，从而经济地生产药物制品。特别是在活化内源EPO基因扩增后，可获得具有确定的更高产量的细胞来制备重组EPO，所述细胞的产量高于以前所用的CHO生产细胞。
本发明的一方面是一种人类细胞，它含有与在人类细胞中有活性的异源表达控制序列有效连接的内源EPO基因的一个拷贝，且无需在先的基因扩增就能够产生至少200ngEPO/106细胞/24小时。优选的，根据本发明的人类细胞能够产生200-3000ngEPO/106细胞/24小时，最优选的，能够产生1000-3000ngEPO/106细胞/24小时。
本发明的另一方面是一种人类细胞，它通过基因扩增获自前述细胞，其含有各自与在人类细胞中有活性的异源表达控制序列有效连接的内源EPO基因的数个拷贝，且能够产生至少1000ngEPO/106细胞/24小时，特别优选通过基因扩增获得的这样的人类细胞，其能产生1,000-25,000ngEPO/106细胞/24小时，最优选的产生5,000-25,000ngEPO/106细胞/24小时。
人类细胞可为任何细胞，只要它可在体外培养。特别优选的是可在无血清培养基中培养，尤其是悬浮培养的人类细胞。以这种方式，可在培养体积为如1,000升的大发酵罐中生产EPO。
特别优选的是为无限增殖化细胞的人类细胞，如HT1080细胞(Rasheed等人，癌症33(1974)，1027-1033)、Hela S3细胞(Puck等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)103(1956)，273-286)、Namalwa细胞(Nadkami等人，癌症23(1969)，64-79)或由上述细胞衍生的细胞。
根据本发明的一种细胞的例子是克隆“Aladin”，其已于1997年7月15日根据布达佩斯条约的规定保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ)，Mascheroder Weg 1 b，38124 Braunschweig，保藏号DSM ACC 2320。
在根据本发明的细胞中，内源EPO与在人类细胞中有活性的异源表达控制序列连接。该表达控制序列包含启动子以及优选地其它增强表达的序列，如增强子。启动子可以是诱导型或组成型启动子。优选的启动子是强病毒启动子，如SV40或CMV启动子。特别优选CMV启动子/增强子。
此外，为了优化EPO在人类细胞中的表达，对于与异源启动子有效连接的EPO基因优选地带有信号肽编码序列，该信号肽编码序列不同于天然信号肽编码序列，优选编码具有经修饰的氨基酸序列的信号肽。特别优选的是这样的信号肽编码序列，其编码选自Met-X1-X2-X3的前4个氨基酸区域中经修饰的信号肽序列，其中X1是Gly或Ser，X2是Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Pro，X3是Pro、Arg、Cys或His，只要X1-X2-X3不是序列Gly-Val-His，且特别是选自
(a)Met-Gly-Ala-His
(b)Met-Ser-Ala-His
(c)Met-Gly-Val-Pro或
(d)Met-Ser-Val-His。
最优选的是信号肽前4个氨基酸的序列为Met-Ser-Ala-His。
另一方面，本发明涉及用于制备如前述人类产EPO细胞的方法，包括步骤：
(a)提供至少含有内源EPO基因的一个拷贝的人类起始细胞，
(b)用含有如下部分的DNA构建体转染细胞，包括：
  (i)与人类EPO基因座区域同源的两个侧翼DNA序列，以允许同源重组，
  (ii)一种正选择标记基因，以及
  (iii)一种在人类细胞中有活性的异源表达控制序列，
(c)在可选择正选择标记基因存在的条件下培养转染的细胞，
(d)分析依步骤(c)选择的细胞，且
(e)鉴定产EPO细胞。
用于制备人类产EPO细胞的DNA构建体包含与人类EPO基因座区域同源的两个侧翼DNA序列，以允许同源重组。通过例如WO90/11354和WO91/09955中描述的方法选择合适的侧翼序列。优选地侧翼序列的长度各自至少为150bp。特别优选地，同源DNA序列选自EPO基因的5’非翻译序列、外显子1和内含子1。特别优选地，使用外显子1区域中经修饰的DNA序列，其编码在前几个氨基酸中经修饰的信号肽。如上述，特别优选外显子1中的修饰。
选择性标记基因可是任何适于真核细胞的选择性标记基因，其一经表达则产生可筛选的表型，如抗生素抗性、营养缺陷型等。一种特别优选的正选择标记基因是新霉素磷酸转移酶基因。
任选地，细胞中也可存在负选择标记基因，如HSV-胸苷激酶基因，籍此在选择剂存在下表达所述基因的细胞被破坏。
如果希望在人类细胞中内源性活化的EPO基因扩增，则DNA构建体应含有一种扩增基因。适当的扩增基因的例子有二氢叶酸还原酶、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。特别优选的扩增基因为二氢叶酸还原酶基因，尤其是二氢叶酸还原酶精氨酸突变体，与野生型基因相比其对选择剂(氨甲蝶呤)的敏感性低(Simonsen等人，美国国家科学院院报，80(1983)；2495)。
如果用于激活EPO基因的DNA构建体中存在一种扩增基因，本发明的方法还可包括下列步骤：
(f)编码EPO的DNA序列的扩增，及
(g)获得产EPO细胞，其含有与异源表达控制序列有效连接的编码成熟EPO的内源DNA序列，且拷贝数量多于起始细胞。
用于活化存在于人类起始细胞中的内源EPO基因的合适的DNA构建体为列于实施例中的质粒：p189、p187、p190和p192，或由其衍生的质粒。特别优选的是质粒p189，其已于1997年7月16日按照布达佩斯条约的规定保藏于DSMZ，保藏号为DSM 11661，或由其衍生的质粒。优选地，DNA构建体为环状质粒分子，其用于以线性化形式转染人类细胞。
本发明的另一方面是用于活化人类细胞中的内源EPO基因的DNA构建体，其包含：
(i)选择与选自EPO基因的5’非翻译序列、外显子1和内含子1的人类EPO基因座区域同源的两个侧翼DNA序列，以允许同源重组；在外显子1区域中存在编码氨基酸Met-X1-X2-X3的经修饰的序列，其中X1是Gly或Ser，X2是Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Pro，X3是Pro、Arg、Cys或His，只要X1-X2-X3不是序列Gly-Val-His，且特别是选自如下氨基酸：
(a)Met-Gly-Ala-His
(b)Met-Ser-Ala-His
(c)Met-Gly-Val-Pro或
(d)Met-Ser-Val-His，
  (ii)一种正选择标记基因，
  (iii)一种在人类细胞中有活性的异源表达控制序列，以及
  (iv)任选的一种扩增基因。
本发明的另一方面是用于在人类细胞中活化内源EPO基因的DNA构建体，包含：
  (i)与选自EPO基因的5’非翻译序列、外显子1和内含子1的人类EPO基因座区域同源的两个侧翼DNA序列，以允许同源重组，
  (ii)一种正选择标记基因，
  (iii)一种在人类细胞中有活性的异源表达控制序列，其中异源表达控制序列与EPO基因的翻译起始处之间的距离不超过1100bp，以及
  (iv)任选的一种扩增基因。
出人意料地发现，在EPO信号肽序列经修饰的情况下和/或在异源表达控制序列与EPO基因翻译起点的距离缩短的情况下实现了最佳表达。优选的，异源表达控制序列的启动子与EPO基因翻译起点的距离不超过1100bp，特别优选的不超过150bp，最优选不超过100bp。根据本发明，特别优选的所用DNA构建体的例子为质粒p189(DSM 11661)，或由其衍生的质粒。
本发明的另一方面是用于制备人类EPO的方法，其中在可产生EPO的条件下将根据本发明的人类细胞培养在适当的培养基中，并从培养基中收获EPO。优选地使用无血清培养基。优选地细胞被悬浮培养。培养特别优选在发酵罐中进行，特别是体积为10升-50,000升的大发酵罐中进行。
从人类细胞系培养物中收获人EPO优选地包含下列步骤：
(a)将细胞上清液通过亲和层析介质并收获含有EPO的级分，
(b)任选地将含有EPO的级分通过疏水相互作用层析介质并收获含有EPO的级分，
(c)将含有EPO的级分通过羟基磷灰石并收获含有EPO的级分，且
(d)浓缩和/或经过反相(RP)HPLC介质。
纯化过程中的步骤(a)包括将细胞上清液(有时可经过预处理)通过亲和层析介质。优选地亲和层析介质是那些偶联蓝色染料的介质。特别优选的例子是蓝色琼脂糖(blue sepharose)。
从亲和层析介质洗脱后，任选地将含有EPO的洗脱液通过疏水相互作用层析介质。如果使用了血清含量≥2％(v/v)的培养基则经过这个步骤是有利的。如果使用了低血清含量，如1％(v/v)的培养基或无血清培养基，可省略此步骤。优选地疏水相互作用层析介质为丁基琼脂糖(butyl-sepharose)。
来自步骤(a)或步骤(b)(如果采用的话)的洗脱液经过本发明方法的步骤(c)上样于羟基磷灰石，将含有EPO的级分经浓缩处理和/或经过反相HPLC纯化步骤。优选地通过排阻层析，如膜过滤进行浓缩，已证明使用的介质为如排阻体积为10kD的膜是有利的。
通过根据本发明的方法，获得了体内比活性(正常红细胞的小鼠)至少为100,100U/mg蛋白质的分离的人EPO，其不含有尿杂质，且其糖基化不同于来自CHO细胞的重组EPO。优选地，本发明的EPO的比活性至少为175,100IU/mg，特别优选的，比活性至少为200,000-400,000或450,000IU/mg蛋白质。由本发明的方法获得的人EPO可含有α-2，3和/或α-2，6连接的唾液酸残基。在对来自含有内源活化EPO基因的细胞的EPO的研究中，基于目前的初步结果发现存在α-2，3和/或α-2，6连接的唾液酸残基。此外，基于目前的初步结果发现，本发明的人EPO带有以N-乙酰神经氨酸的量为基准含量少于0.2％的N-乙二醇(glycol)神经氨酸。
本发明的人EPO的纯度优选为纯度至少为总蛋白量的90％，特别优选为至少95％，最优选为98％的量。可通过反相HPLC，如用Poros R/2H柱进行总蛋白量的测定。
另外，通过本发明，获得的人EPO种类在其氨基酸序列上有所不同。因此，通过质谱分析(MALDI-MS)发现，分离自Hela S3细胞的人EPO其主要是长度为165个氨基酸的多肽，该多肽经精氨酸残基的C-末端加工形成，有时含有高达15％的166个氨基酸的EPO。还有，可获得包括长度为166个氨基酸，即：非加工EPO的多肽的人EPO。业已从Namalwa细胞中分离了人EPO，其含有长度为165和166个氨基酸的多肽的混合物。
这样的人EPO可作为活性物质用于药物制剂，其中可含有其它活性物质以及药学常用的佐剂、载体和添加剂。
本发明的又一方面涉及一种经分离的DNA，其编码带有在信号肽的前4个氨基酸区域中经修饰的序列的人EPO，该序列选自：
Met-X1-X2-X3，
其中X1是Gly或Ser，X2是Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Pro，X3是Pro、Arg、Cys或His，只要X1-X2-X3不是序列Gly-Val-His，特别是选自：
(a)Met-Gly-Ala-His
(b)Met-Ser-Ala-His
(c)Met-Gly-Val-Pro或
(d)Met-Ser-Val-His。
该DNA可以是例如基因组DNA或cDNA。
下面进一步结合下列实施例和附图以及序列表描述本发明。
图1.来自5’非翻译序列、外显子1和内含子1区域的EPO基因同源区的扩增示意图。
图2.含有来自5’非翻译序列、外显子1和内含子1区域的EPO基因同源区的质粒的示意图。
图3.基因活化序列的示意图，其含有劳氏肉瘤病毒启动子(RSV)、新霉素磷酸转移酶基因(NEO)、SV40(SVIpA)早期聚腺苷酸化区、早期SV40启动子(SVI)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、额外的早期SV40聚腺苷酸化区，以及巨细胞病毒立即早期启动子和增强子(MCMV)。
图4a.EPO基因靶向载体p176的制备。
图4b.EPO基因靶向载体p179和p187的制备。
图4c.EPO基因靶向载体p189的制备。
图4d.EPO基因靶向载体p190的制备。
图4e.EPO基因靶向载体p192的制备。
图5.带有信号肽序列突变的EPOcDNA的制备的示意图。
图6a.细胞DNA与来自图3所示基因盒的CMV区域的探针杂交；泳道1-4分别是用限制性酶AgeI和AscI切割的人类细胞DNA；泳道1：用1000nM MTX扩增的产EPO的Hela S3细胞；泳道2：用500nM MTX扩增的产EPO的Hela S3细胞；泳道3：未扩增的产EPO的Hela S3细胞；泳道4：不含有活化EPO基因的产EPO的Hela S3细胞；泳道5：地高辛标记的长度标记；泳道1-3中杂交片段的大小约为5,200bp，以及
图6b.来自EPO编码区域的探针与来自人类细胞的DNA杂交；泳道1：地高辛标记的长度标记；泳道2-4：用限制性酶BamHI、HindIII和SalI切割的来自人类细胞的DNA；泳道2：用500nM MTX扩增的产EPO的Hela S3细胞(由非活化内源基因产生的条带长度：3200bp；通过基因靶定活化的EPO基因的拷贝的长度：2600bp)；泳道3：来自未扩增的产EPO的Hela S3细胞的DNA；泳道4：来自Hela S3对照细胞的DNA。
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2用于制备PCR产物1的引物之核苷酸序列(图1)。
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4用于制备PCR产物2的引物序列(图1)。
SEQ ID NO.5引物EPOEX1之序列。
SEQ ID NO.6引物EX2之序列。
SEQ ID NO.7引物EX3之序列(Met-Gly-Ala-His)。
SEQ ID NO.8由引物EX3编码的经修饰的信号肽起点序列。
SEQ ID NO.9引物EX4之序列(Met-Ser-Ala-His)。
SEQ ID NO.10由引物EX4编码的经修饰的信号肽起点序列。
SEQ ID NO.11引物EX5之序列(Met-Gly-Val-Pro)。
SEQ ID NO.12由引物EX5编码的经修饰的信号肽起点序列。
SEQ ID NO.13引物EX6之序列(Met-Ser-Val-His)。
SEQ ID NO.14由引物EX6编码的经修饰的信号肽起点序列。
SEQ ID NO.15引物EX基因组1之序列。
SEQ ID NO.16引物EX13之序列。
SEQ ID NO.17引物EPO EX17之序列。
实施例
通过将基因活化序列同源整合实现用于工业规模生产蛋白质的EPO基因的活化，其中基因活化序列中含有用于筛选(G-418抗性)的新霉素磷酸转移酶(NEO)基因，鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于通过MTX基因扩增)和用于基因活化的巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子和增强子。实施例1 EPO同源区域的克隆
通过使用胎盘基因组DNA(Boehringer Mannheim)扩增EPO基因的同源区域。从来自EPO基因5’非翻译序列、外显子1和内含子1区域6.3kB同源区制备了两个PCR产物(参见图1)。用于制备PCR产物1的引物具有如下序列：5’-CGC GGC GGA TCC CAG GGA GCT GGG TTG ACC GG-3’(SEQ ID No.1)和5’-GGC CGC GAA TTC TCC GCG CCT GGC CGG GGT CCC TCAGC-3’(SEQ ID No.2)。
用于制备PCR产物2的引物具有如下序列：5’-CGC GGC GGA TCC TCT CCT CCC TCC CAA GCT GCA ATC-3’(SEQ ID No.3)和5’-GGC CGC GAA TTC TAG AAC AGA TAG CCA GGC TGA GAG-3’(SEQ ID No.4)。
通过限制性酶切从PCR产物切得期望的片段(PCR产物1：HindIII；PCR产物2：HindIII和EcoRV)，并克隆入已用HindIII和EcoRV切割的载体pCRII(Invitrogen)。以此方式获得的重组载体称为5epopcr1000(参见图2)。实施例2 EPO基因靶向载体的构建
2.1将一种基因活化序列插入含有EPO同源区的质粒5epopcr1000的AgeI位点，其中基因活化序列含有NEO基因、DHFR基因和CMV启动子/增强子(参见图3)，得到质粒p176(参见图4a)。为了将CMV启动子尽可能地靠近EPO基因的翻译起始位点，将限制性酶切位点AscI和AgeI之间的963bp长的片段切除(部分酶切)，由此获得了质粒p179(图4b)。
2.2为了实现最佳表达，用合成序列Met-Gly-Ala-His替换编码EPO先导序列起始处的外显子1的核苷酸，Met-Gly-Val-His(也参见实施例6)。此序列通过以如质粒pEPO148的基因组EPO-DNA序列作为模板，采用引物EX4(SEQ ID No.9)和EX17(SEQ ID No.17)(表1)经扩增获得，质粒pEPO148中含有在SV40启动子控制下的人EPO基因序列3.5kB BstEII/EcoRI片段(包括外显子1-5)(Jacobs等人，自然313(1985)，806和Lee-Huang等人，基因128(1993)，227)。由此获得质粒p187(图4b)。
2.3通过插入来自Psvtk-1(PvuII/NarI片段)的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSK-TV)从质粒p187制备质粒p189(图4c)。HSV-TK基因受SV40启动子的控制，在内含子1之3’端方向与CMV启动子相对，可用于同源重组的负选择。
2.4对于质粒p190的构建，将pHEAVY的SfiI/BglII片段亚克隆入用SfiI和BglII酶切的pGenak-1中，其中质粒pHEAVY含有述于Simonsen等人，美国国家科学院院报80(1983)，2495中的DHFR精氨酸突变体的cDNA，质粒pGenak-1含有RSV启动子控制下的NEO基因和晚期SV40聚腺苷酸化位点为终止子，早期SV40启动子控制下的鼠DHFR基因和早期SV40聚腺苷酸化位点为终止子(Kaufmann等人，分子细胞生物学2(1982)，1304；Okayama等人，分子细胞生物学3(1983)，280；和Schimke，生物化学杂志263(1988)，5989)以及CMV启动子(Boshart等人，细胞41(1995)521)。然后将含有编码DHFR精氨酸突变体的cDNA之HpaI片段连接入用HpaI酶切的质粒p189，由此获得质粒p190(图4d)。
2.5为获得不含有HSV-TK基因的转染载体，将含有基因活化序列的质粒p189之AscI/NheI片段连接入质粒p187的含有外显子1的AscI/NheI片段。所得质粒命名为p192(图4e)。实施例3细胞转染
选择多种细胞系用于生产EPO，并用靶向载体转染。3.1 Namalwa细胞
细胞培养在T150组织培养瓶中，通过电穿孔转染(1×107个细胞/800微升电穿孔缓冲液(20mM Hepes，138mM KCl，0.7mM Na2HPO4，6mM一水合D-葡萄糖，pH7.0，10微克线性化DNA，960μF，260V BioRad基因脉冲仪))。电穿孔后细胞培养在含有RPMI 1640、10％(v/v)胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠的96孔培养板中。两日后将细胞在含有1mg/mlG-418的培养基中培养10-20天。在固相ELISA中检测上清液中EPO的产生(见实施例4)。在24孔培养板及T-25组织培养瓶中扩增产EPO的克隆。冰冻等份样品，通过FACS将细胞亚克隆(Ventage，Becton Dickinson)。重复检测亚克隆中EPO的产生。3.2 HT 1080细胞
培养条件如Namalwa细胞所述，除了HT1080细胞在DMEM、10％(v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠中培养。为了通过电穿孔转染细胞，通过胰蛋白酶消化将细胞从培养容器壁上释放出来。电穿孔后，将1×107个细胞培养在含有DMEM、10％(v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠的96-孔培养板中。3.3 Hela S3细胞
培养条件如Namalwa细胞所述，除了Hela S3细胞在RPMI 1640、10％(v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、1％(V/V)MEM非必需氨基酸(Sigma)和1mM丙酮酸钠中培养。为了通过电穿孔转染细胞，通过胰蛋白酶消化将细胞从培养容器壁上释放出来。电穿孔的条件为960μF/250V。电穿孔后，将细胞培养在含有RPMI 1640、10％(v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、1％(V/V)MEM和1mM丙酮酸钠的T75培养瓶中。电穿孔24小时后，将细胞经胰蛋白酶消化，在含有600μg/ml的G-418的培养基之96孔板中培养10-15天。实施例4产EPO克隆的筛选
在EPO的ELISA中检测转染细胞的培养上清液。所有步骤均在室温下进行。预先用链亲和素包被的96孔板用生物素化的抗EPO抗体(Boehringer Manmheim)包被。为了包被，孔板首先用50mM磷酸钠pH7.2和0.05％(v/v)的吐温20洗涤。然后向每孔中加入0.01ml包被缓冲液(4μg/ml生物素化抗体，10mM磷酸钠，pH7.2，3mg/ml牛血清白蛋白，20mg/ml蔗糖以及9mg/ml氯化钠)，室温下温育3小时。然后用50mM磷酸钠，pH7.2洗涤培养板，干燥并密闭。
在检测前，用0.3ml磷酸缓冲盐液(PBS)和0.05％吐温20(Sigma)洗涤培养板，每孔含0.2ml PBS和1％(w/v)Crotein(BoehringerMannheim)温育平板过夜，以封闭非特异性结合。
去除封闭溶液后，加入0.1ml培养上清液，将培养板温育过夜。每个孔用0.3ml PBS和0.05％吐温20各洗涤一次，重复二次。加入100μl过氧化物酶(POD)偶联的单克隆抗体(Boehringer Mannheim，150mU/ml)反应2小时。每个孔再次用0.3ml PBS和0.05％吐温20各洗涤一次，重复二次。采用ABTS为底物405nm于Perkin Elmer光度计中405nm下进行过氧化物酶反应。使用以来自CHO细胞的重组EPO(Boehringer Mannheim，100-1000pg/孔)制备的标准曲线计算EPO浓度。实施例5 EPO基因的扩增
为增加EPO的表达，将产EPO的克隆在增加浓度(100pM-1000nM)的氨甲蝶呤(MTX)存在下培养。用ELISA检测每个氨甲蝶呤浓度下克隆产生的EPO(见实施例4)。通过有限稀释亚克隆高产克隆。实施例6信号肽序列的突变
为了优化EPO分子的先导序列，替换由外显子1编码的前几个氨基酸。使用具有不同序列的引物(SEQ ID No.4-17；3’引物含有用于筛选经修饰的序列的CeIII位点)采用质粒pEPO227以通过PCR获得作为模板的AscI/XbaI片段，其中质粒pEPO227含有在SV40启动子控制下的人EPO基因序列的HindIII/EcoRI片段(包括外显子1-5)(Jacobs等人，自然313(1985)，806；Lee-Huang等人，基因128(1993)，227)。将所得片段克隆入质粒pEPO148(实施例2.2)，获得质粒pEPO182、质粒pEPO183、质粒pEPO184和质粒pEPO185(图5)。EPO基因的表达由SV40启动子驱动。用构建体瞬时转染COS细胞(DEAE葡聚糖方法)，转染后48小时检测细胞是否产生EPO。
以此方法获得的突变的先导序列(Met-Ser-Ala-His)有最佳EPO表达，用于构建基因靶向载体(参见实施例2.2)。实施例7产EPO细胞系的表征
筛选3种不同的细胞系(Namalwa，Hela S3和HT 1080)的EPO基因活化。通过用质粒p179、p187、p189、p190或p192转染获得产EPO的克隆(参见实施例2和3)。
检测了约160,000个NEO抗性克隆是否产生EPO，其中有12-15个克隆可以较高产量将EPO分泌至细胞上清液。
其中令人惊讶地发现，共有7个克隆无需由MTX扩增即可以以足够用于大规模工业生产的量产生EPO。这些克隆的EPO产量为200ng/ml至高于1000ng/ml/106个细胞/24小时。这些细胞中的一个例子为克隆“Aladin″，其获自Namalwa细胞，已保藏于DSMZ(DSM ACC 2320)。在用500nM的MTX进行基因扩增后，上述产EPO克隆的EPO产量增加至高于3000ng/ml/106个细胞/24小时。额外将MTX浓度增至1000nM，可导致EPO产量高达高于7000ng/ml/106个细胞/24小时。
所得的克隆在无血清培养基中也产生EPO。实施例8产EPO克隆基因组的表征8.1方法
从约108个细胞中分离人基因组DNA并定量(Sambrook等人，1989)。分别用限制性酶，如AgeI和AscI、或BamHI、HindIII和SalI切割基因组DNA后，通过琼脂糖凝胶电泳依大小分离DNA片段，最终转移至尼龙膜并固定。
固定化DNA与地高辛标记的EPO探针或基因活化序列特异性DNA探针(DIG DNA标记试剂盒，Boehringer Mannheim)杂交，严格条件下洗涤。通过利用放射敏感胶片以化学发光方法检测特异性杂交信号。8.2结果
用500nM的MTX处理细胞后导致EPO基因座处杂交信号增加5至10倍。MTX经额外增加为1000nM后，所得杂交信号增加了高于10倍(图6a)。
在与EPO特异性探针杂交的情况中，也可检测出通过同源重组未受影响的染色体7的拷贝。由图6b可见，这些类似杂交的DNA片段有明显不同的易于区分的大小，不会由于使用MTX改变其信号强度。实施例9从人细胞系(Hela S3；Namalwa和HT 1080)培养上清液中纯化EPO
为了从人细胞系培养上清液中纯化EPO，主要使用了在层析步骤的数量和原理上不同的两种方法，且依照培养基的组分以及EPO的浓度选择使用何种方法。方法1：
第1步：蓝色琼脂糖柱
第2步：丁基琼脂糖柱
第3步：羟基磷灰石柱
第4步：再浓缩万法2：
第1步：蓝色琼脂糖柱
第2步：羟基磷灰石柱
第3步：再浓缩(或者第3步：RP-HPLC)
带有2％(v/v)胎牛血清(FCS)的Hela S3细胞培养上清液的纯化的例子采用方法1：1.蓝色葡聚糖柱
5ml Hi-Trap-Blue柱(Pharmacia蓝色葡聚糖预装柱)用至少5倍柱体积(SV)的缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl2；100mMNaCl)平衡。然后用循环法以0.5ml/分钟的流速将70ml Hela细胞上清液(含有约245μg EPO和70-100mg总蛋白)上样过夜。
用至少5倍SV的缓冲液B(20mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl2；250mM NaCl)和至少5倍SV的缓冲液C(20mM Tris-HCl，pH7.0；0.2mM CaCl2；100mM NaCl)以0.5ml/分钟的流速洗涤柱。充分洗涤后于OD280处检测蛋白质含量。
用缓冲液D(100mM Tris-HCl，pH7.0；0.2mM CaCl2；2M NaCl)以0.5ml/分钟的流速洗脱EPO。以1-2ml级分收集洗脱液。
通过将等份样品上样于POROS R2/H柱(Boehringer Mannheim)采用反相(RP)-HPLC测定级分、洗涤液、穿透液中的EPO含量。另外，进行免疫点杂交用于定性鉴定含有EPO的级分。
合并含有EPO的级分(8-12ml)并上样于丁基琼脂糖柱。
经过蓝色琼脂糖柱后的产量约为175μgEPO(相当于约70％)。通常经过蓝色琼脂糖柱处理后的产率为50-75％。2.丁基琼脂糖柱(疏水相互作用层析)
自制2-3ml丁基琼脂糖柱(材料：Toyopearl Butyl S650)用至少5倍SV的缓冲液D(100mM Tris-HCl，pH7.0；0.2mM CaCl2；2M NaCl)平衡，然后以0.5ml/分钟的流速上样来自步骤1的含有EPO的合并蓝色琼脂糖级分(约150μgEPO)。
用至少5倍SV的缓冲液E(20mM Tris-HCl，pH7.0；2M NaCl和10％异丙醇)以0.5ml/分钟的流速洗涤柱。充分洗涤后于OD280处检测蛋白质含量。
用缓冲液F(20mM Tris-HCl，pH7.0；2M NaCl和20％异丙醇)以0.5ml/分钟的流速洗脱EPO。以1-2ml级分收集洗脱液。
通过将等份样品上样于POROS R2/H柱采用RP-HPLC测定级分、洗涤液、穿透液中的EPO含量。另外，进行免疫点杂交用于定性鉴定含有EPO的级分。
合并含有EPO的级分(10-15ml)并上样于羟基磷灰石柱。
经过丁基琼脂糖柱后的产量约为130μgEPO(相当于约85％)。通常，经过丁基琼脂糖后的产率为来自蓝色琼脂糖柱合并级分中总量的60-85％。3.羟基磷灰石柱
5ml羟基磷灰石柱(BioRAD的Econo-Pac CHT II预装柱)用至少5倍SV的缓冲液F(20mM Tris-HCl，pH7.0；2M NaCl和20％异丙醇)平衡。然后以0.5ml/分钟的流速上样来自步骤2的含有EPO的合并丁基琼脂糖级分(约125μgEPO)。
用至少5倍SV的缓冲液G(20mM Tris-HCl，pH7.0；2M NaCl)以0.5ml/分钟的流速洗涤柱。充分洗涤后于OD280处检测蛋白质含量。
用缓冲液H(10mM磷酸钠，pH7.0；80mM NaCl)以0.5ml/分钟的流速洗脱EPO。以1-2ml级分收集洗脱液。
通过将等份样品上样于POROS R2/H柱采用反相RP-HPLC测定级分、洗涤液、穿透液中的EPO含量。
合并含有EPO的级分(3-6ml)。羟基磷灰石柱的产量约为80μgEPO(相当于约60％)。通常，经过羟基磷灰石柱处理后的产量相当于丁基琼脂糖柱合并级分的50-75％。4.再浓缩
在排阻体积为10kD离心单元(如Filtron的Microsep)中将来自羟基磷灰石柱步骤的合并EPO级分的浓度提高到0.1-0.5mg/ml，加入0.01％吐温20，等分后贮存于-20℃。产率表
  EPO(μg)    产率(％)
起始     245      100
蓝色琼脂糖柱     175       70
丁基琼脂糖柱     130       53
羟基磷灰石柱      80       33
再浓缩      60       25
经分离的EPO的纯度约＞90％，一般地甚至＞95％。
为增加EPO产量，也使用方法2，其中省略了丁基琼脂糖柱步骤。此方法特别用于细胞培养上清液中不含有FCS或含有1％(v/v)FCS的情况，所得纯度大致相当的(90-95％)分离的EPO。在用于羟基磷灰石柱的平衡缓冲液(缓冲液F)中含有5mM CaCl2改善了此方法中的结合，以及在羟基磷灰石柱步骤中洗脱行为的可重复性。因此，方法2基本上采用与方法1相同的步骤进行，使用下列缓冲液：1.蓝色葡聚糖柱：
平衡缓冲液(缓冲液A) 20mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl2；100mM NaCl
洗涤缓冲液1(缓冲液B) 20mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl2；250mM NaCl
洗涤缓冲液2(缓冲液C) 20mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl2；250mM NaCl
洗脱缓冲液(缓冲液D) 100mM Tris-HCl，pH7.0；5mM CaCl2；2M NaCl
2.羟基磷灰石柱：
平衡缓冲液(缓冲液F) 50mM Tris-HCl pH7.0；5mM CaCl2；1MNaCl
洗涤缓冲液(缓冲液G) 10mM Tris-HCl pH7.0；5mM CaCl2；80mM NaCl
洗脱缓冲液(缓冲液H) 10mM磷酸钠pH7.0；0.5mM CaCl2；80mM NaCl
产率表
   EPO(μg)    产率(％)
起始      600      100
蓝色琼脂糖柱      450       75
羟基磷灰石柱      335       55
再浓缩      310       52
向方法1中的缓冲液B-G中加入5mM CaCl2也可改善结合，并使羟基磷灰石柱的洗脱行为更稳定。实施例10来自人细胞系(对正常血红细胞小鼠的生物测定)的EPO之体内比活性的测定
基于在施用EPO后血液中网织红细胞的增加，在小鼠体内测定EPO对红细胞前体细胞的增殖及分化的剂量依赖性活性。
为此目的，向8只小鼠肠道外施用不同剂量的待分析的EPO样品以及EPO标准品(配成WHO标准EPO)。将小鼠置于恒定条件下，EPO处理后4日从小鼠取血，用吖啶橙染色网织红细胞。通过分析红色荧光直方图，在流式细胞仪中由微量荧光测定法测定每30,000个红细胞中的网织红细胞数量。
利用由Linder所述的方法(A.Lingder，实验设计与评价，第3版，Birkenhauser Verlag Basel)，即用平行直线成对测定含量的方法，从不同剂量下样品中网织红细胞计数值和标准EPO处理的网织红细胞计数值计算生物活性。结果
细胞系的EPO     比活性(U/ng)
Hela S3(样品1)        100,000
Hela S3(样品2)        110,000
                             序列表
(1)一般信息：
  (i)申请人：
    (A)姓名：Boehringer Mannheim GmbH
    (B)街道：Sandhofer Str.112-132
    (C)城市：Mannheim
    (D)国家：德国
    (E)邮政编码：68305
  (ii)发明名称：通过内源基因活化制备促红细胞生成素
  (iii)序列数目：17
  (iv)计算机可读形式：
    (A)介质类型：磁盘
    (B)计算机：IBM兼容机
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release #1.0，Version#1.30(EPA)
(2)SEQ.ID.NO.1的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：32个碱基对
    (B)类型：核苷酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (xi)SEQ.ID.NO.1的序列描述：
CGCGGCGGAT CCCAGGGAGC TGGGTTGACC GG                        32
(2)SEQ.ID.NO.2的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：38个碱基对
    (B)类型：核苷酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (xi)SEQ.ID.NO.2的序列描述：
GGCCGCGAAT TCTCCGCGCC TGGCCGGGGT CCCTCAGC                  38
(2)SEQ.ID.NO.3的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：36个碱基对
    (B)类型：核苷酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (xi)SEQ.ID.NO.3的序列描述：
CGCGGCGGAT CCTCTCCTCC CTCCCAAGCT GCAATC                    36
(2)SEQ.ID.NO.4的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：36个碱基对
    (B)类型：核苷酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (xi)SEQ.ID.NO.4的序列描述：
CGCCGCGAAT TCTAGAACAG ATAGCCAGGC TGAGAG                    36
(2)SEQ.ID.NO.5的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：24个碱基对
    (B)类型：核苷酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (xi)SEQ.ID.NO.5的序列描述：
TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCT                                 24
(2)SEQ.ID.NO.6的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：61个碱基对
    (B)类型：核苷酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (xi)SEQ.ID.NO.6的序列描述：
ATGCTCGAGC GGCCGCCAGT GTGATGGATA TCTGCAGAGC TCAGCTTGGC CGCGAATTCT     60
A                                                                     61
(2)SEQ.ID.NO.7的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：78个碱基对
    (B)类型：核苷酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ix)特征：
    (A)名称/关键词：CDS
    (B)位置：49..60
  (xi)SEQ.ID.NO.7的序列描述：
TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCTGAGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG GGG GCC    57
                                                     Met Gly Ala
                                                       1
CAC GGTGAGTACT CGCGGGCT                                             78
His
(2)SEQ.ID.NO.8的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：4个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ.ID.NO.8的序列描述：
          Met Gly Ala His
            1
(2)SEQ.ID.NO.9的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：78个碱基对
    (B)类型：核苷酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ix)特征：
    (A)名称/关键词：CDS
    (B)位置：49..60
  (xi)SEQ.ID.NO.9的序列描述：
TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCTGAGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG AGC GCC    57
                                                     Met Ser Ala
                                                       5
CAC GGTGAGTACT CGCGGGCT                                             78
His
(2)SEQ.ID.NO.10的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：4个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
  (xi)SEQ.ID.NO.10的序列描述：
              Met Ser Ala His
                1
(2)SEQ.ID.NO.11的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：78个碱基对
    (B)类型：核苷酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ix)特征：
    (A)名称/关键词：CDS
    (B)位置：49..60
    (xi)SEQ.ID.NO.11的序列描述：
TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCTGAGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG GGG GTG    57
                                                     Met Gly Val
                                                       5
CCC GGTGAGTACT CGCGGGCT                                             78
Pro
(2)SEQ.ID.NO.12的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：4个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
  (xi)SEQ.ID.NO.12的序列描述：
               Met Gly Val Pro
                 1
(2)SEQ.ID.NO.13的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：78个碱基对
    (B)类型：核苷酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
   (A)名称/关键词：CDS
   (B)位置：49..60
(xi)SEQ.ID.NO.13的序列描述：
TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCTGAGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG GGG GTG    57
                                                     Met Ser Val
                                                       5
CAC GGTGAGTACT CGCGGGCT                                             78
His
(2)SEQ.ID.NO.14的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：4个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
  (xi)SEQ.ID.NO.14的序列描述：
              Met Ser Val His
                1
(2)SEQ.ID.NO.15的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：78个碱基对
    (B)类型：核苷酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (xi)SEQ.ID.NO.15的序列描述：
GGACATTCTA GAACAGATAT CCAGGCTGAG CGTCAGGCGG GGAGGGAGAA GGGTGGCTG    59
(2)SEQ.ID.NO.16的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：48个碱基对
    (B)类型：核苷酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (xi)SEQ.ID.NO.16的序列描述：
GTGATGGATA TCTCTAGAAC AGATAGCCAG GCTGAGAGTC AGGCGGGG       48
(2)SEQ.ID.NO.17的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：39个碱基对
    (B)类型：核苷酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (xi)SEQ.ID.NO.17的序列描述：
ATGGATATCA TCGATTCTAG AACAGATAGC CAGGCTGAG                 39

Claims (58)

1.人类细胞，其特征在于它含有与在人类细胞中有活性的异源启动子有效连接的内源EPO基因的一个拷贝，且能够产生至少200ngEPO/106细胞/24小时。
2.人类细胞，其特征在于它能够产生200-3000ngEPO/106细胞/24小时。
3.人类细胞，其可从权利要求1或2的细胞通过基因扩增获得，其特征在于它含有各自与在人类细胞中有活性的异源启动子有效连接的数个内源EPO基因的拷贝，且能够产生至少1000ngEPO/106细胞/24小时。
4.权利要求3的人类细胞，其特征在于它能够产生1000-25，000ngEPO/106细胞/24小时。
5.权利要求1-4中任一项的人类细胞，其特征在于它是无限增殖化细胞。
6.权利要求1-5中任一项的人类细胞，其特征在于它可在无血清培养基中培养。
7.权利要求1-6中任一项的人类细胞，其特征在于它选自HT1080细胞、Hela S3细胞、Namalwa细胞或衍生自上述细胞的细胞。
8.权利要求1-7中任一项的人类细胞，其特征在于活化的内源EPO基因在病毒启动子，特别是CMV启动子的控制下。
9.权利要求1-8中任一项的人类细胞，其特征在于EPO基因具有不同于天然信号肽编码序列的信号肽编码序列。
10.权利要求9的人类细胞，其特征在于与异源表达控制序列有效连接的内源EPO基因具有如下信号肽编码序列，其编码前4个氨基酸区域中经修饰的信号肽序列，前4个氨基酸选自Met-X1-X2-X3，其中X1是Gly或Ser，X2是Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Pro，X3是Pro、Arg、Cys或His，只要X1-X2-X3不是序列Gly-Val-His。
11.权利要求10的人类细胞，其特征在于前4个氨基酸选自
(a)Met-Gly-Ala-His
(b)Met-Ser-Ala-His
(c)Met-Gly-Val-Pro或
(d)Met-Ser-Val-His。
12.权利要求11的人类细胞，其特征在于信号肽前4个氨基酸的序列为Met-Ser-Ala-His。
13.一种用于制备权利要求1-12项中任一项的人类产EPO细胞的方法，包括步骤：
(a)提供至少含有内源EPO基因的一个拷贝的人类起始细胞，
(b)用含有如下部分的DNA构建体转染细胞，包括：
  (i)与人类EPO基因座区域同源的两个侧翼DNA序列，以允许同源重组，
  (ii)一种正选择标记基因，以及
  (iii)一种在人类细胞中有活性的异源表达控制序列，
(c)在可筛选正选择标记基因存在的条件下培养转染的细胞，
(d)分析依步骤(c)筛选的细胞，且
(e)鉴定产EPO细胞。
14.权利要求13的方法，其特征在于同源DNA序列选自EPO基因的5’非翻译序列、外显子1和内含子1。
15.权利要求14的方法，其特征在于使用一种外显子1区域中经修饰的序列。
16.权利要求14或15的方法，其特征在于使用新霉素磷酸转移酶基因作为选择性标记基因。
17.权利要求14至16中任一项的方法，其特征在于DNA构建体还含有一种扩增基因。
18.权利要求17的方法，其特征在于使用二氢叶酸还原酶基因作为扩增基因。
19.权利要求18的方法，其特征在于使用二氢叶酸还原酶精氨酸突变体基因作为扩增基因。
20.权利要求17至19中任一项的方法，其还含有下列步骤：
(f)EPO基因的扩增，及
(g)获得产EPO细胞，其含有各自与异源表达控制序列有效连接的数个内源EPO基因的拷贝。
21.权利要求13至20中任一项的方法，其特征在于使用CMV启动子/增强子作为表达控制序列。
22.权利要求13至21中任一项的方法，其特征在于使用线性化形式的质粒p189(DSM 11661)或由其衍生的质粒作为DNA构建体。
23.用于在人类细胞中活化内源EPO基因的DNA构建体，包含：
  (i)与选自EPO基因的5’非翻译序列、外显子1和内含子1的人类EPO基因座区域同源的两个侧翼DNA序列，以允许同源重组；在外显子1区域中存在的经修饰的序列，其编码氨基酸Met-X1-X2-X3，其中X1是Gly或Ser，X2是Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Pro，X3是Pro、Arg、Cys或His，只要X1-X2-X3不是序列Gly-Val-His，
  (ii)一种正选择标记基因，
  (iii)一种在人类细胞中有活性的异源表达控制序列，以及
  (iv)如需要，一种扩增基因。
24.权利要求23的DNA构建体，其特征在于氨基酸选自：
(a)Met-Gly-Ala-His
(b)Met-Ser-Ala-His
(c)Met-Gly-Val-Pro或
(d)Met-Ser-Val-His。
25.用于在人类细胞中活化内源EPO基因的DNA构建体，包含：
  (i)与选自EPO基因的5’非翻译序列、外显子1和内含子1的人类EPO基因座区域同源的两个侧翼DNA序列，以允许同源重组，
  (ii)一种正选择标记基因，
  (iii)一种在人类细胞中有活性的异源表达控制序列，其中异源表达控制序列与EPO基因的翻译起始处之间的距离不超过1100bp，以及
  (iv)如需要，一种扩增基因。
26.质粒p189或由其衍生的质粒。
27.用于制备人类EPO的方法，其特征在于在EPO产生的条件下将权利要求1-12中任一项的人类细胞培养在适当的培养基中，并从培养基中收获EPO。
28.权利要求27的方法，其特征在于使用无血清培养基。
29.权利要求27或28的方法，其特征在于细胞经悬浮培养。
30.权利要求27-29中任一项的方法，其特征在于培养在发酵罐中进行。
31.权利要求30的方法，其特征在于发酵罐的体积为10升-50,000升。
32.权利要求27-31中任一项的方法，其特征在于从培养基中收获EPO，包含下列步骤：
(a)将细胞上清液通过亲和层析介质并收获含有EPO的级分，
(b)如需要，将含有EPO的级分通过疏水相互作用层析介质并收获含有EPO的级分，
(c)将含有EPO的级分通过羟基磷灰石并收获含有EPO的级分，且
(d)浓缩和/或经过反相HPLC介质。
33.权利要求32的方法，其特征在于在步骤(a)中使用了蓝色琼脂糖介质。
34.权利要求32或33的方法，其特征在于在步骤(b)中使用了丁基琼脂糖介质。
35.权利要求32-34中任一项的方法，其特征在于通过排阻层析进行浓缩。
36.权利要求35的方法，其特征在于使用排阻体积为10kD的介质。
37.权利要求27-36中任一项的方法，其特征在于获得了纯度至少为90％的人EPO。
38.权利要求27-37中任一项的方法，其特征在于获得了体内比活性(正常红细胞小鼠)至少为100,000IU/mg的人EPO。
39.权利要求38的方法，其特征在于获得了体内比活性(正常红细胞小鼠)至少为175,000IU/mg-450,000IU/mg的人EPO。
40.权利要求27-39中任一项的方法，其特征在于获得的人EPO带有相对于N-乙酰神经氨酸的量含量少于0.2％的N-乙二醇神经氨酸。
41.权利要求27-40中任一项的方法，其特征在于获得的人EPO带有α-2，3连接的唾液酸残基。
42.权利要求27-41中任一项的方法，其特征在于获得的人EPO带有α-2，3及α-2，6连接的唾液酸残基。
43.权利要求27-42中任一项的方法，其特征在于获得的人EPO含有长度为165个氨基酸的多肽。
44.权利要求27-42中任一项的方法，其特征在于获得的人EPO含有长度为166个氨基酸的多肽。
45.权利要求27-42中任一项的方法，其特征在于获得的人EPO含有长度为165个氨基酸和长度为166个氨基酸的多肽的混合物。
46.经分离的人EPO，其是由权利要求27-45中任一项的方法获得的，体内比活性至少为100,000IU/mg蛋白质，其不含尿杂质。
47.权利要求46的经分离的人EPO，其特征在于其纯度至少为90％。
48.权利要求46或47的经分离的人EPO，其特征在于它含有相对于N-乙酰神经氨酸的量含量少于0.2％的N-乙二醇神经氨酸。
49.权利要求46-48中任一项的经分离的人EPO，其特征在于它带有α-2，3连接的唾液酸残基。
50.权利要求46-49中任一项的经分离的人EPO，其特征在于它带有α-2，3及α-2，6连接的唾液酸残基。
51.权利要求46-50中任一项的经分离的人EPO，其特征在于它含有长度为165个氨基酸残基的多肽。
52.权利要求46-50中任一项的经分离的人EPO，其特征在于它含有长度为166个氨基酸残基的多肽。
53.权利要求46-50中任一项的经分离的人EPO，其特征在于它含有长度为165个氨基酸和166个氨基酸的多肽的混合物。
54.药物制品，其特征在于它含有权利要求46-53中任一项的人EPO作为活性物质，如需要还含有其它活性物质以及药学常用载体、佐剂或添加物。
55.经分离的DNA，其编码带有在信号肽的前4个氨基酸区域中经修饰的序列的人EPO，修饰的序列选自：
Met-X1-X2-X3，
其中X1是Gly或Ser，X2是Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Pro，X3是Pro、Arg、Cys或His，只要X1-X2-X3不是序列Gly-Val-His。
56.权利要求55的经分离的DNA，其特征在于氨基酸序列选自：
(a)Met-Gly-Ala-His
(b)Met-Ser-Ala-His
(c)Met-Gly-Val-Pro或
(d)Met-Ser-Val-His。
57.权利要求55或56的DNA，其特征在于它是基因组DNA。
58.权利要求55或56的DNA，其特征在于它是cDNA。
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