CN1596310A - 产生重组多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于产生表达目的重组多肽的经转化真核宿主细胞的方法,该方法包括将下列物质导入真核宿主细胞:(a)第一多核苷酸载体,其包含(i)编码目的重组多肽的第一核苷酸序列;以及(ii)编码选择性标记的第二核苷酸序列,其中当宿主细胞与选择性试剂接触时该第二核苷酸序列被扩增;以及(b)第二多核苷酸载体,其核苷酸序列与第一多核苷酸载体基本相同,不同之处在于第二核苷酸序列替换为编码不同选择性标记的第三核苷酸序列;第一多核苷酸载体和第二多核苷酸载体被稳定整合入宿主细胞基因组中。
Description
发明领域
本发明涉及用于产生表达重组多肽的宿主细胞的方法,所述重组多肽如人促红细胞生成素,以及涉及用于产生该多肽的方法。特别是,本发明涉及包含多种选择性标记的双载体表达系统和应用该系统的方法。
发明背景
红细胞生成的调控主要由一种糖蛋白激素即促红细胞生成素(Epo)完成,该激素于1977年发现。当时,Epo的分离和纯化由于起始材料的相对缺乏而受到限制,所述起始材料为再生障碍性贫血患者的尿液。仅可获得亚微克数量的纯化激素用于研究。
在19世纪70年代末,应用亲和柱子中以琼脂糖固定的凝集素首次进行了纯化尝试。麦芽和植物凝集素结合促红细胞生成素,且尿的粗制备物中的Epo可浓缩达100倍。
19世纪80年代初期,已经测定并克隆了人促红细胞生成素的DNA序列。促红细胞生成素为一单链糖蛋白,分子量约30到34kDa。该蛋白含有四个半胱氨酸残基,并分别在Cys7、Cys161以及Cys29、Cys33间形成两个链内二硫键。已显示Cys7和Cys161间形成的二硫键对生物活性至关重要。促红细胞生成素为高度糖基化蛋白,其分子量中约35到40%由碳水化合物组成。尿液制备物间碳水化合物的量存在差异,因此该不均一性并不反映肾脏分泌后的即时状态,而是反映由尿液制备的Epo分子;该差异受所使用的制备方法影响。尚未鉴定促红细胞生成素的循环血浆形式的寡糖结构,这是由于并未分离出上述这些形式的促红细胞生成素。促红细胞生成素具有三个提供N-糖基化位点的天冬酰胺(Asn38、Asn24和Asn83),以及具有一个用于O-连接糖基化的丝氨酸(Ser129)。
重组人促红细胞生成素(rhEpo)已在多种哺乳动物系统中进行表达,所述哺乳动物系统包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞和HeLa细胞。在这些不同细胞类型中表达的rhEpo的糖基化方式均存在差异。(综述见Takeuchi和Kobata,1991,糖生物学(Glycobiology)1(4):337-346)。rhEpo的商业生产需要具有高度体内活性的该蛋白质的高水平表达。用于提高表达水平的一项技术是将含有人Epo基因且还含有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的载体转染入dhfr缺陷的CHO细胞中(Lee等,1999,生物技术杂志(J.Biotech)69:85-93)。培养基中加入氨甲蝶呤(MTX)导致dhfr基因以及相连的Epo基因的扩增。
发明概述
本发明提供了产生表达如人促红细胞生成素的重组多肽的宿主细胞系的改进方法,已发现,向宿主细胞导入均含有可在宿主细胞中指导如rhEpo的重组多肽表达的表达盒的两个载体,其中一个载体含有对选择性试剂(如dhfr)作出响应而进行扩增的基因且另一载体包含选择性标记(如新霉素抗性基因),两载体的其它方面基本相同,上述操作允许根据重组多肽的表达来产生并筛选出具有所需特征的宿主细胞。
相应地,本发明的第一方面提供了用于产生可表达目的重组多肽的经转化真核宿主细胞的方法,该方法包括将下列物质导入真核宿主细胞:(a)第一多核苷酸载体,其包含(i)编码目的重组多肽的第一核苷酸序列;以及(ii)编码选择性标记的第二核苷酸序列,其中当宿主细胞与选择性试剂接触时所述第二核苷酸序列被扩增,以及(b)第二多核苷酸载体,其核苷酸序列与第一多核苷酸载体基本相同,不同之处在于将第二核苷酸序列替换为编码不同选择性标记的第三核苷酸序列;
第一多核苷酸载体和第二多核苷酸载体整合到宿主细胞基因组中。
有利地且优选地,第一和第二多核苷酸载体同时导入宿主细胞。作为备选,第一和第二多核苷酸载体依次导入宿主细胞。
宿主细胞优选地为哺乳动物细胞,更优选地为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
选择性试剂可为这样的任意化合物或组合物,即当宿主细胞与该选择性试剂接触时能够引起第二核苷酸序列的扩增。第二核苷酸序列优选地编码二氢叶酸还原酶多肽且选择性试剂为氨甲蝶呤。目的重组多肽优选地为人促红细胞生成素。
通常,第三核苷酸序列编码对抗生素的抗性,所述抗生素如G-418或新霉素(即第三核苷酸序列编码新霉素磷酸转移酶)。本领域内的技术人员将会明晓,也可应用新霉素组中的不同抗生素。
在一特定实施方案中,本发明提供了用于产生表达人促红细胞生成素的经转化真核宿主细胞的方法,该方法包含将下列物质导入CHO宿主细胞:(a)第一多核苷酸载体,其包含(i)编码人促红细胞生成素的第一核苷酸序列,以及(ii)编码二氢叶酸还原酶的第二核苷酸序列;以及(b)第二多核苷酸载体,该载体的核苷酸序列与第一多核苷酸载体基本相同,不同之处在于将编码二氢叶酸还原酶的核苷酸序列替换为编码氨基糖苷磷酸转移酶的第三核苷酸序列,所述氨基糖苷磷酸转移酶赋予对G-418、新霉素或新霉素组的不同抗生素的抗性;
第一多核苷酸载体和第二多核苷酸载体整合到宿主细胞的基因组中。
优选地,对于根据本发明如此处公开的所有方法,第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列与强启动子可操作地连接,所述启动子通常为病毒启动子如SV40早期启动子。优选地,三种核苷酸序列中的每一个均单独可操作连接到一强启动子,优选地为SV40早期启动子。但是,应用各自的多顺反子表达单元也是可能的。
同样优选地,对于根据本发明如此处公开的所有方法,第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列还与其它调控元件可操作地连接,所述调控元件如转录终止调控序列。在其优选实施方案中,该调控元件为编码SV40大T多聚腺苷酸化信号的序列。优选地,该SV40大T多聚腺苷酸化信号序列包括已知的天然存在的间插序列。
在本发明的第二个方面,本发明提供了可由本发明第一个方面的方法产生的真核宿主细胞。由宿主细胞表达的目的重组多肽优选地为促红细胞生成素,通常为hEpo。宿主细胞优选地为哺乳动物细胞,更优选地为CHO细胞。
本发明的第三个方面提供了经转化的真核宿主细胞,该细胞包含将下列物质整合到一条或多条其染色体中;(a)第一多核苷酸载体,其包含(i)编码目的重组多肽的第一核苷酸序列,以及(ii)编码选择性标记的第二核苷酸序列,其中当宿主细胞与选择性试剂接触时该第二核苷酸序列被扩增,以及(b)第二多核苷酸载体,其核苷酸序列与第一多核苷酸载体基本相同,不同之处在于将第二核苷酸序列替换为编码不同选择性标记的第三核苷酸序列。
由宿主细胞表达的目的重组多肽优选地为促红细胞生成素,通常为hEpo。宿主细胞优选地为哺乳动物细胞,更优选地为CHO细胞。
在一优选实施方案中,第二核苷酸序列编码二氢叶酸还原酶多肽。目的重组多肽优选地为促红细胞生成素,通常为hEpo。
在一特定实施方案中,本发明提供的哺乳动物宿主细胞在其一条或多条染色体中整合特别是稳定整合了以下序列,(a)一多核苷酸序列,其编码二氢叶酸还原酶多肽和促红细胞生成素,以及(b)一多核苷酸序列,该序列与(a)的多核苷酸序列不同,其编码促红细胞生成素以及编码赋予抗生素抗性的多肽。
宿主细胞优选地为CHO细胞。抗生素优选地为G-418、新霉素或新霉素组中不同(但类似)的抗生素。
在第四个方面,本发明提供了用于产生目的重组多肽的方法,该方法包含将根据本发明第二或第三个方面的宿主细胞在允许第一核苷酸序列表达的条件下进行培养。通常,也在导致第一核苷酸序列扩增的选择性试剂存在条件下培养宿主细胞。优选地,第二核苷酸序列编码二氢叶酸还原酶多肽且选择性试剂为氨甲蝶呤。
在一优选实施方案中,目的重组多肽为人Epo。
优选地,重组多肽分泌到培养基中。通常,方法进一步包括从培养基中回收表达的目的重组多肽。备选地或另外地,也可从经转化的宿主细胞中回收重组多肽。
此外,此处描述了包含糖基化的重组人促红细胞生成素的组合物,所述人促红细胞生成素由本发明第四个方面的方法产生。
在第五个方面,本发明提供了组合物,其包含:(a)第一多核苷酸载体,该载体包含(i)编码目的重组多肽的第一核苷酸序列,以及(ii)编码选择性标记的第二核苷酸序列,其中当宿主细胞与该选择性试剂接触时所述选择性试剂能够引起该第二核苷酸序列的扩增,以及(b)第二多核苷酸载体,其核苷酸序列与第一多核苷酸载体的核苷酸序列基本相同,不同之处在于将第二核苷酸序列替换为编码不同选择性标记的第三核苷酸序列。
目的重组多肽优选地为人促红细胞生成素。第二核苷酸序列优选地编码二氢叶酸还原酶。第三核苷酸序列优选地编码新霉素磷酸转移酶。
本发明也提供了该组合物在产生真核宿主细胞的方法中的应用,其中所述宿主细胞表达目的重组多肽。
在本发明的上下文中,如此处描述的优选或特定实施方案能够相互组合,由此导致其进一步优选的实施方案。
发明详述
除非另外定义,此处应用的所有技术和科学术语与领域内(如在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)普通技术人员所通常理解的含义相同。分子、遗传和生物化学方法(通常参见Sambrook等,分子克隆:实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.以及Ausubel等,分子生物学简要方法(Short Protocols in MolecularBiology)(1999)第四版,John Wiley & Sons,Inc.-以及标题为分子生物学当前方法(Current Protocols in Molecular Biology)的全部版本,前述在此引用作为参考)以及化学方法应用标准技术进行。
定义
如此处提及的真核宿主细胞可为真核细胞来源的任何细胞,无论其为原代细胞还是已建立的永生细胞,前述细胞可经过调整以适于表达异源多肽。因此,在其最广泛的实施方案中,该术语包括培养的原代细胞,器官培养中的组织和器官、组织移植物、完整的生物体和已建立的细胞系。在一优选实施方案中,术语指源自已建立细胞系的培养细胞,如CHO、BHK、COS和HeLa细胞。
如此处所指的表达为来自核酸编码序列的多肽产物的产生,通常通过序列的转录/翻译产生。表达的多肽可从宿主细胞分泌或可在其中积聚;优选地,根据本发明的表达包括多肽从细胞中的分泌。表达水平可存在差异,但优选地为高水平表达;细胞产生的总蛋白质中约1%,优选地约10%、25%或50%或甚至更多可为目的表达多肽。
″重组多肽″可为通过重组核酸技术产生的任何所需多肽。如此处所应用,术语″多肽″和″肽″是指这样的多聚体,其单体为氨基酸并通过肽键或二硫键连接在一起。多肽是指全长的天然存在的氨基酸链或″其片段″或″肽″,如目的多肽的选择区域,或其部分或全部为非天然的氨基酸多聚体或其片段或肽。因此″其片段″是指全长多肽中一部分的氨基酸序列,长度在约8个到约500个氨基酸之间,优选地在约8到约300之间,更优选地在约8到约200个氨基酸之间,且甚至更优选地长度在约10到约50或100个氨基酸之间。多肽为Epo时,其片段长度优选地在约8到约150个氨基酸之间,优选地在约15、20或30到约50、100或130个氨基酸之间。″肽″是指短氨基酸序列,其长度为10-40个氨基酸,优选地为10-35个氨基酸。此外,也可包括非天然氨基酸如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。通常遇到的非基因编码的氨基酸也可用于本发明中。用于本发明的所有氨基酸可为D-或L-光学异构体。L-异构体为优选。此外,其它肽模拟物也可应用于如本发明多肽的接头序列中(参见Spatola,1983,氨基酸、肽和蛋白质的化学和生物化学(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins),Weinstein编辑,Marcel Dekker,New York,267页)。
适宜的重组多肽包括用于制药目的的蛋白质、凝血因子如Epo,如因子VIII和因子IX,凝结剂如水蛭素,激素包括胰岛素、人和动物生长激素、卵泡刺激素、促黄体激素,其它治疗性蛋白质如抗体,以及其它免疫球蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子、肿瘤坏死因子、白细胞介素、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、肥大细胞生长因子、肿瘤抑制基因p53、视网膜母细胞瘤、干扰素、黑素瘤相关抗原或B7以及任何的需要表达特别是需要大量表达的其它蛋白质。
″多核苷酸载体″为可用于将核酸编码序列递送到细胞基因组中以使序列在其中进行整合的核酸载体。整合到宿主细胞基因组导致宿主细胞的稳定转化(与通常与游离载体维持相关的瞬时转化相反)且可称为″稳定整合″。以下将更为详细描述的多核苷酸载体可为质粒、感染因子(病毒、病毒样颗粒、病毒核酸)、粘粒、噬菌粒、转座子、经包装的DNA或适于递送到细胞的任何其它形式的核酸。通常,应用质粒是由于其易于使用、为本领域内所熟知以及没有为感染因子如病毒所需的调节限制。″整合″或″稳定整合″是指至少部分的载体核酸序列整合到宿主细胞基因组中或其维持在人工染色体中;优选地至少第一和第二/第三核苷酸序列整合到宿主细胞基因组中。有利地,载体的全部序列整合到宿主细胞基因组中。
″转化″此处指将遗传物质导入细胞以使遗传物质在细胞内表达,前述细胞称作″经转化″细胞。为避免疑问,″转化″并不指由癌基因或致癌病毒等使细胞获得永生性。
″扩增″是指对筛选压力作出响应而导致的编码序列拷贝数的增加。因此,已知用MTX筛选时,作为响应,异源dhfr基因在其整合到宿主细胞处进行扩增且拷贝数增加。与dhfr基因连接的序列(即物理上与其靠近的序列)与dhfr基因一同得以扩增。这导致目的序列拷贝数的增加,且导致由其编码的基因产物表达的提高。
除非减轻选择性试剂作用的特定基因产物存在于细胞内,″选择性试剂″通常为将细胞置于压力或其它竞争性不利条件下的因子。因此,氨甲蝶呤具有细胞毒性,但其毒性可由dhfr基因的基因产物二氢叶酸还原酶(DHFR)中和。常见的可扩增系统包括二氢叶酸还原酶(DHFR)-氨甲蝶呤(MTX)、细菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(其介导对霉酚酸的抵抗),并在正常功能基因存在下进行扩增(如在methionine sulfoximine[MSX]存在条件下扩增谷氨酰胺合成酶)。这些系统的可扩增性在于对相应试剂施用产生的筛选压力导致核酸自身可进行扩增。
通常认为非可扩增系统包括如这样的抗生素抗性基因,即其编码的基因产物赋予对抗生素如氨苄青霉素或G-418/新霉素的抗性。
根据本发明的载体除选择性标记外具有类似的序列。第一选择性标记为可扩增基因;第二标记不必为可扩增基因。如此处所应用,″基本相同″意指除选择性标记序列外的载体序列完全或几乎相同。实际上,两载体通常基于相同的起始载体,其中选择性标记基因被替换了。因此,除任何可能发生的自发改变之外,其余的序列可完全相同。优选地,除包括其各自控制区的标记基因外,序列的同一性可大于85%;优选地同一性为90%;且优选地同一性至少为95%、98%、99%或甚至完全相同。
A.多核苷酸载体
用于产生宿主细胞的本发明方法包括导入两个基本相同的载体,前述两载体之间差异的本质在于一个载体包含的编码基因序列整合到宿主细胞染色体内时会对筛选作出响应而进行扩增,另一载体包含编码如抗生素抗性基因的另一选择性标记的核苷酸序列。
优选地,第二选择性标记并非具有如此的可扩增性。
载体通常为DNA分子,尽管可为线性但载体一般为环型质粒。载体可方便地包含原核细胞的复制起点以使其可在细菌细胞如大肠杆菌中进行繁殖。
第一载体包含第一核苷酸序列,该序列的本质为能够指导目的重组多肽(POI)如Epo在真核宿主细胞(通常为哺乳动物细胞)中进行表达的表达盒。相应地,该第一表达盒包含POI的实际编码序列,该序列与能够提供宿主细胞表达编码序列的调控序列可操作地连接。术语″可操作地连接″意指描述的组分间的关联使各组分能够以特定的方式行使功能。″可操作地连接″到编码序列的调控序列以这样的方式进行连接,即在与调控序列相容的条件下编码序列获得表达。
与编码POI的序列可操作连接的调控序列包括启动子/增强子和其它表达调控信号(包括转录终止子)。可选择与设计的表达载体所应用的宿主细胞相容的这些调控序列。术语″启动子″为领域内公知,且从最小启动子到包括上游元件和增强子的启动子其包含的核酸区域的大小和复制性均有所不同。
启动子通常选自在哺乳动物细胞中具有功能的启动子。启动子通常源自病毒或真核基因的启动子序列。例如,启动子可源自将发生表达的细胞的基因组。可优选地应用病毒启动子,这是由于此类启动子通常指导高水平的转录。示例包括SV40早期启动子及其活性片段、莫洛尼鼠白血病病毒长末端重复(MMLV LTR)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子或人巨细胞病毒(CMV)IE启动子。
由于载体可容易地在大肠杆菌中进行复制,因此可优选地包括大肠杆菌遗传标记和大肠杆菌的复制子起点。这些可从大肠杆菌质粒中获得,所述质粒如pBR322、Bluescript载体或pUC质粒,例如pUC18或pUC19,所述质粒包含大肠杆菌复制起点和赋予抗生素抗性如氨苄青霉素抗性的大肠杆菌遗传标记。
启动子为可诱导型也是有利的,这样POI的表达水平可在细胞的生命期内进行调控。可诱导意指可调控应用启动子所获得的表达水平。
可对调控序列进行修饰,例如通过加入其它转录调控元件如增强子序列进行修饰,以使调控序列指导的转录水平更为有效地对转录调节剂作出反应。也可应用包含来自以上描述的两种或多种不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
在优选的实施方案中,POI为促红细胞生成素,特别是人Epo。人Epo的序列在GenBank中给出,登录号为No.M 11319.1。但是,也需要修饰人Epo的序列以导入一个或多个用于连接碳水化合物的额外位点,如在美国专利号5,856,298中所描述的[Asn60]Epo、[Asn125,Ser127]Epo、[Thr125]Epo和[Pro124,Thr125]Epo。
第一载体也包含本质上为表达盒的第二核苷酸序列,当其整合入宿主细胞基因组时如果宿主细胞与引起核苷酸序列扩增的选择性试剂接触,所述表达盒可进行扩增。真核细胞,特别是哺乳动物细胞,能够对筛选压力作出响应而扩增特定的基因,这导致该基因拷贝数的增加且依次提高了基因的表达水平,所述筛选压力通常为酶抑制剂。额外的基因拷贝可维持在染色体内,或以染色体外遗传物质形式存在,所述染色体外遗传物质如微小染色体(综述参见:基因VI,Lewin,1997,Oxford University Press,Oxford U.K.,975-978页)。一个充分表征的实例是对氨甲蝶呤(MTX)作出响应而进行扩增的二氢叶酸还原酶基因。其它实例包括CAD基因(编码的蛋白质参与UMP合成的头三个步骤),所述基因对转氨甲酰酶的抑制剂作出响应而进行扩增,以及对methionine sulphoximine作出响应而进行扩增的谷氨酰胺合成酶(参见WO87/04462)。
该第二表达盒与第一表达盒的情形一样,包含能够被扩增的基因的实际编码序列,所述编码序列与可提供宿主细胞表达该编码序列的调控序列可操作地连接。适宜的调控序列如上描述。第一和第二核苷酸序列中的调控序列可相同或不同。
第二载体与第一载体基本相同,不同处在于对筛选压力作出响应而进行扩增的编码基因(例如,dhfr)的编码序列替换为选择性标记,所述选择性标记通常为编码提供抗生素抗性的多肽的核苷酸序列,如编码新霉素磷酸转移酶的核苷酸序列。其它抗生素抗性基因包括编码嘌呤霉素或潮霉素抗性的基因。
本发明的关键特征是,两个载体的本质区别之处仅在于其具有第二还是第三核苷酸序列。并不希望被理论所束缚,认为两载体间的充分同一性促进了编码目的重组多肽的第一核苷酸序列的扩增。编码选择性标记的第三核苷酸序列用作培养基中初选的标记,而对筛选压力作出响应继而进行扩增的第二核苷酸序列可导致整合序列的扩增,所述整合序列包括编码目的重组多肽的第一核苷酸序列。
但是,由于可允许存在轻度的差异,第二/第三核苷酸序列外的载体区域并非必须100%一致。例如,两载体除第二/第三核苷酸序列之外的序列同一性通常至少为95%、98%或99%。
然而,应用除第二/第三核苷酸序列之外的序列完全相同的载体更为便利,这是因为实际上正是应用相同的载体作为克隆第一和第二载体的基础。例如,可应用缺乏第二和第三核苷酸序列但含有适宜克隆位点的载体来产生克隆载体,其中选择的第二或第三核苷酸序列可插入到前述的载体中。
B.表达目的重组蛋白质的宿主细胞的产生
可应用任何适宜的技术将第一和第二多核苷酸载体导入适宜的宿主细胞。例如,一些已知的转染技术可提高哺乳动物细胞对核酸的摄入,所述转染技术如电穿孔或那些包括应用转染试剂的技术。这些试剂的示例包括阳离子试剂(例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖)以及脂质体(lipofectant)(例如lipofectamTM和transfectamTM)。通常,载体与转染试剂混合以产生组合物。可能需要较第一载体过量的第二载体。例如,第一和第二载体可以从1∶5到1∶100(第一∶第二)的比例进行混合,更特别地比例为从1∶10到1∶50。
优选的宿主细胞为哺乳动物细胞,如啮齿动物或人细胞,包括CHO、BHK、COS和HeLa细胞。细胞特别优选地为CHO细胞。在一优选实施方案中,宿主细胞最初缺乏存在于第二核苷酸序列中的基因(例如,dhfr)。缺乏dhfr的CHO细胞由以下描述:Urlaub和Chasin,1980,PNAS 77:4216-4220,并可从ATCC获得,目录号为ATCC CRL-9096。这些细胞已根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),Rockville,Md.20852,USA,2001年8月29日保藏,保藏号为ATCC PTA-3672。可用于本发明的DNA构建体和方法中的永生人细胞系的示例进一步包括但不限于HT1080细胞(ATCC CCL 121)、HeLa细胞和HeLa细胞的衍生细胞(ATCC CCL 2,2.1和2.2)、MCF-7乳腺癌细胞(ATCC BTH 22)、K-562白血病细胞(ATCC CCL 243)、KB癌细胞(ATCC CCL 17)、2780AD卵巢癌细胞(Van der Blick,A.M.等,癌症研究(Cancer Res),48:5927-5932(1988)、Raii细胞(ATCC CCL 86)、WiDr结肠腺癌细胞(ATCC CCL 218)、SW620结肠腺癌细胞(ATCC CCL 227)、Jurkat细胞(ATCC TIB 152)、Namalwa细胞(ATCC CRL 1432)、HL-60细胞(ATCC CCL 240)、Daudi细胞(ATCCCCL 213)、RPML 8226细胞(ATCC CCL 155)、U-937细胞(ATCC CRL1593)、Bowes黑素瘤细胞(ATCC CRL 9607)、WI-38VA13亚系2R4细胞(ATCC CLL 75.1)和MOLT-4细胞(ATCC CRL 1582),以及通过将人细胞与其它物种的细胞融合产生的异种杂交瘤细胞。其次,也可应用人成纤维细胞株如WI-38(ATCC CCL 75)和MRC-5(ATCC CCL 171)。
可在微量滴定板中方便地进行转染,但也可应用其它培养容器。转染后,通常将细胞培养在筛选培养基中(即用于筛选表达选择性标记细胞的培养基)进行汇片,且然后培养在含导致第二核酸序列扩增的选择性试剂的扩增培养基中,所述选择性试剂如MTX。通常,在为MTX的情况下,该试剂以约48nM(4.8×10-8M)的浓度存在。
然后筛选克隆,所述克隆通常培养在相同或类似浓度的选择性试剂中并通过如ELISA和/或免疫荧光筛选重组蛋白质的产生。然后根据筛选结果选择产量最高的克隆。
理想的情况是,对筛选的克隆进行进一步的试验以确定其生长特性、染色体稳定性、重组蛋白质产率以及重组蛋白质的活性。
可通过如观察细胞形态和/或进行DNA含量分析测定染色体的稳定性,所述DNA含量分析如Coulter计数器对细胞核DNA分析。通常,具有较大细胞核的克隆的染色体大于二倍体染色体组。这些克隆的稳定性可能较低且通常被弃用。优选的克隆其细胞核DNA含量与转染和筛选前的亲本宿主细胞胞核DNA含量基本相同。
可通过对细胞和/或培养上清进行SDS-PAGE/Western印迹来测试重组蛋白质的产率,其中所述培养上清中存在分泌蛋白质(如用于Ep0的例子)。可应用一系列的MTX(或其它的适宜试剂)进行测试。值得注意的是不仅要考虑蛋白质的量也要考虑蛋白质的结构(特别是当产生多种同种型如不同糖基化的同种型时,如为Epo的例子)。
本发明的方法优选地进一步包括一个或多个亚克隆步骤,其中筛选的克隆置于其浓度逐渐增加的引起第二核苷酸序列扩增的选择性试剂中。当为dhfr和MTX的情况下,通常初始克隆步骤应用浓度为10-8M的MTX,且其浓度逐渐提高到10-6M。
这样,在进一步的亚克隆步骤中,测试在系列浓度的选择性试剂(如MTX)存在条件下培养的细胞克隆,并确定重组蛋白质的滴度。然后进行亚克隆,进行该步骤的优选浓度为或高于这样的浓度,即该浓度与较低浓度相比蛋白质产量并未显著增加。在为Epo和CHO细胞的情况下,该浓度为约380nM(3.8×10-7M)。在一优选实施方案中,细胞培养在浓度渐进提高的接近最高所需浓度的试剂中。
然后可进一步对亚克隆进行试验以确定其特性,如以上所描述。任选地,可进行进一步的亚克隆步骤,通常用浓度提高的选择性试剂(如MTX)进行亚克隆。在实施例中,在1.54μM(1.54×10-6M)的MTX存在条件下进行亚克隆步骤。在其它例子中,MTX浓度可提高到10μM(1×10-5M)或甚至更高。
优选地,本发明筛选的表达Epo的宿主细胞为:当应用浓度为7.7×10-7M或1.54×106M的MTX时其表达Epo的速率大于10μg/106个细胞/天,更优选地大于20、25或30μg/106个细胞/天。同样优选地,本发明的宿主细胞其细胞核DNA含量与转染前的亲本宿主细胞基本相同(如CHO dhfr-细胞)。
使本发明的宿主细胞适应无血清的培养基可能也是需要的,所述适应通常在最终的亚克隆步骤后进行。将种子细胞培养至汇片并将培养基置换成无血清培养基或几次传代后逐渐将血清浓度降至零可获得上述的适应。优选地,也将细胞适应为悬浮培养生长。
应用标准技术可将筛选的宿主细胞系冻存于液氮中。
C.蛋白质的产生
本发明的宿主细胞可用于表达目的重组蛋白质如rhEpo。应用转染的重组细胞表达多肽的方法为本领域内公知。可选择培养条件以实现从第一核苷酸序列表达目的多肽。根据本发明,优选地应用悬浮培养方法或滚动瓶培养方法。用于表达目的多肽的宿主细胞的培养可在存在或不存在选择性试剂(即MTX或适宜的等效物)的条件下进行。优选地,宿主细胞培养在无血清培养基中。
根据需要可从适宜的培养上清或培养细胞块中回收重组蛋白质(在Epo表达的例子中为从培养上清回收)。然后,通常对重组蛋白质进行一个或多个的纯化步骤(参见如Broudy等,1988,生物化学和生物物理学通讯(Archives of Biochemistry and Biophysics)265:329-336;Ghanem等,1994,Preparative Biochemistry,24(2):127-142),所述纯化步骤如亲和层析和/或离子交换层析。
优选地,在包含由本发明宿主细胞表达并纯化的重组多肽的组合物中,重组多肽基本为纯化形式,例如纯度至少为90%、95%或99%。
可体内和/或体外测定纯化蛋白质的生物活性。一适宜的体外试验如下描述:Hammering等,1996,药物生物医学年度杂志(J Pharm Biomed Anal)14(11):1455-69,其中涉及类红细胞系细胞增殖刺激试验。一适宜的体内试验如下描述:Ghanem等,1994,同上,其中涉及测定59Fe掺入到患红细胞增多症小鼠的红细胞中。
在一优选实施方案中,本发明使用的细胞通过以下方法培养:(a)提供宿主细胞,其包含编码目的重组多肽的核苷酸序列和指导目的重组多肽在宿主细胞中表达的核苷酸序列;(b)提供无血清培养基,其包含(i)水、植物来源的蛋白胨、摩尔渗透压浓度调节剂、缓冲液、能源、氨基酸、脂源或前体物、铁源、非铁金属离子、一种或多种维生素和辅因子;以及(ii)不包含任何的全长多肽;以及(c)在允许目的重组多肽表达的条件下在培养基中培养宿主细胞。
目的重组多肽优选地为促红细胞生成素。宿主细胞可为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。该技术在此说明书的实施例部分中进行描述。
可通过以下方法从细胞培养物中纯化促红细胞生成素:(a)通过离心从细胞培养物中移除宿主细胞、细胞组分和碎片以获得清澈的培养物上清,所述离心应用圆盘层叠分离器(disc stack separator)并随后进行深度过滤步骤;(b)将上清的传导率调整到5mS/cm或更小,并将pH调整到约7.0和8.0之间;(c)将来自步骤(b)的上清加到含阴离子交换层析介质的柱子,洗柱子,从柱子中洗脱rhEpo并收集含rhEpo的峰级分(s);(d)将来自步骤(c)的合并峰级分进行反向层析,所述层析应用的树脂可在低介质压力(<10巴)下应用并可抵抗高浓度的NaOH,应用线性梯度的有机溶剂洗脱rhEpo;(e)将步骤(d)中洗脱的一个或多个含rhEpo的级分加到含阴离子交换层析介质的柱子,洗涤柱子,并应用线性盐梯度洗脱rhEpo;(f)筛选步骤(e)中洗脱的含rhEpo的一个或多个级分,所述筛选基于rhEpo唾液酸化的程度;以及(g)应用凝胶过滤介质将步骤(f)中洗脱的含rhEpo的一个或多个级分进行一次或多次的大小排阻层析步骤,以移除潜在的二聚体和更大的聚合体;以及收集含rhEpo的洗液。
优选地,步骤(c)中应用的阴离子交换介质为基于陶瓷的离子交换介质Q-HyperD FTM,所述介质可从BioSepra获得。步骤(d)中应用的聚苯乙烯树脂优选地为Source 30RPCTM(Pharmacia),而步骤(e)中应用的阴离子交换介质优选地为Pharmacia Q Sepharose High PerformanceTM。步骤(g)中应用的凝胶过滤介质优选地为Pharmacia Superdex75 prep gradeTM。
此类方法在本说明书的实施例部分中描述。
以以下的实施例为参考对本发明进行进一步的描述,所述实施例仅作为示例的目的并非构成本发明的限制。特别是,实施例涉及本发明的优选
实施方案。
实施例
材料
宿主细胞系
二氢叶酸还原酶缺失的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(ATCC CRL-9096)。这些细胞已根据布达佩斯条约保藏在美国类型培养物保藏中心(ATCC),Rockville,Md.20852,USA,于2001年8月29日保藏,保藏号为ATCCPTA-3672。
细胞培养基
培养用培养基:补充以L-谷氨酰胺(4mM)、10%FCS、HT(次黄嘌呤,胸腺嘧啶核苷)的DMEM,1x
筛选培养基:补充以L-谷氨酰胺(4mM)、经透析的FCS(10%)和G418(0.5mg/ml)的DMEM
扩增培养基:补充以L-谷氨酰胺(4mM)、经透析的FCS(10%)、G418(0.5mg/ml)和4.8×10-8M-1.54×10-6M MTX(氨甲蝶呤)的DMEM
冻存用培养基:补充以L-谷氨酰胺(4mM)、FCS(10%)和DMSO(10%)的DMEM
用于重组细胞系的无血清适应培养基:1∶1DMEM/Ham′s F12,补充有L-谷氨酰胺(6mM)、大豆蛋白胨/UF(0.25%)、杂交瘤细胞添加物(1x)、Pluronic-F68(0.1%)、G418(0.5mg/ml)、MTX(1.54×10-6M)
无血清生产培养基:1∶1 DMEM/Ham′s F12,补充以大豆蛋白胨/UF(0.25%)、杂交瘤细胞添加物(1x)、Lutrol(0.1%)、MTX(1.54×10-6M)、葡萄糖(1g/l)、NaHCO3(2.5g/l)
用于重组细胞系的无血清冻存培养基:PBS、PVP-10(20%)、DMSO(5%)、杂交瘤细胞添加物(100x)、乙醇胺-2.5×10-3M、柠檬酸铁-2.5×10-2M、L-抗坏血酸-2.0×10-3M、亚硒酸钠-5.0×10-6M
质粒构建体
pEpo/neo
该质粒编码Epo的编码区以及编码新霉素抗性基因,前述两编码序列作为两个不同的表达盒置于SV40早期启动子/终止子序列的调控之下。构建细节在实施例1中提供。
pEpo/dhfr
该质粒编码Epo和dhfr的编码区,前述两编码序列作为两个不同的表达盒置于SV40早期启动子/终止子序列的调控之下。构建细节在实施例2中提供。
细胞培养方法
CHO-dhfr的培养
二氢叶酸还原酶缺失的CHO细胞(Urlaub等,1980,PNAS 77(7):4216-4220)(称作CHO dhfr)培养在DMEM培养用培养基中,每周以1∶10的比率传代两次。
CHO细胞的转染
进行脂质体(lipofectin)转染前一日将细胞以1-5×104个细胞/cm2接种到25cm2的T-形瓶或96孔板。将相应的质粒以适宜的比例混合,根据生产商的使用说明加入lipofectin试剂(GIBCO/BRL)(0.5-1μl/cm2)。用转染混合物在无血清DMEM中覆盖细胞4到16小时,然后将含DNA的培养基替换为培养用培养基。在含血清培养基中培养24到48小时后,将培养基换成筛选培养基。首先将转染细胞培养在筛选培养基中培养至汇片,然后培养在扩增培养基(4.8×10-8M MTX)中,之后通过ELISA筛选细胞培养上清的Epo产生。确定产量最高的细胞,将MTX浓度提高两倍并选择最佳细胞用于进一步的培养。
分析方法
在不同介质中检测Epo的ELISA法
抗体
多克隆血清:兔抗Epo,生物素标记的(R & D系统;目录号AB-286-NA)
单克隆抗体:小鼠抗Epo(Genezyme;目录号AE7A5)
ELISA缓冲液
包被缓冲液:8.4g/lNaHCO3,4.2g/lNa2CO3,pH9.6-9.8
洗涤缓冲液:0.2g/l KCl,1.15g/l Na2HPO4x2H2O,0.2g/l KH2PO4,8g/lNaCl,0.1%吐温20
稀释缓冲液:2%PVP(Sigma目录号PVP-4OT),溶于洗涤缓冲液中
样本缓冲液:溶于稀释缓冲液中的0.5%α单-硫代-甘油
染色缓冲液:7.3g/l柠檬酸x2H2O,11.86g/l Na2HPO4x2H2O,pH4.8-5.0
染色溶液:100μl OPD溶液/10ml染色缓冲液,5μl H2O2/10ml染色缓冲液
OPD储存溶液:PP:L0017
方法
应用ELISA方法检测ng/ml浓度范围的Epo,特别是具有的检出限为约10ng/ml范围,开始用500ng/ml并进行8次两倍稀释。针对Epo头26个氨基酸的单克隆抗体用作结合Epo的包被层。下一步中Epo由捕获抗体特异结合。通过生物素标记的识别Epo的免抗血清进行检测。链亲和素-过氧化物酶偶联到平板后用OPD染色以进行显色。
免疫荧光
表达Epo的CHO细胞以5×104个细胞/200μl接种到6孔板中的盖玻片上并孵育24-72小时。用PBS洗涤吸附细胞两次并于-20℃用甲醇固定5分钟,然后空气干燥且随后再次浸泡在PBS中。用含20%FCS的PBS孵育15分钟以饱和非特异蛋白质,然后用抗-Epo孵育1小时。与FITC连接的抗小鼠IgG反应进行显色。通过共聚焦显微镜检测荧光,检测用的激发波长为488nm且发射波长大于515nm。
核大小测定
材料
Coulter Counter;Model ZM(Coulter Electronics Inc.)
Coulter ChannelyzerModel 256
孵育溶液:柠檬酸(0.1M),Triton X 100(2%)
Electrolyte Isoton II(目录号844 8011;Coulter Euro DiagnosticGmbH)
Coulter Counter可确定悬浮于导电溶液中的粒子的大小和数量。用真空器通过两侧带有电极的毛细管真空吸附液体。阻力的变化诱导产生可由Coulter Channelizer计数的电压脉冲。核大小与细胞的DNA含量相关,因此可由其将二倍体和多倍体染色体区别开来。
方法
将约1×106个CHO-细胞用PBS洗涤一次,重悬在2ml的孵育溶液中并放置4-5小时。以下步骤特异用于Coulter Counter。
SDS聚丙烯酰胺电泳和Western印迹
材料
SDS凝胶:Novex Tris-甘氨酸4-20%
样本缓冲液:Tris甘氨酸SDS 2x(Novex LC 2676)
跑胶缓冲液:Tris甘氨酸SDS(Novex LC 2675)
印迹缓冲液:Na2B4O7×10H2O,50mM,SDS,0.1%,甲醇,20%
印迹基材:PVDF Immobilon P 0.45μM Millipore;K8JM8238H
洗涤缓冲液:参见ELISA洗涤缓冲液
稀释缓冲液:1%的奶粉溶于洗涤缓冲液中
检测缓冲液:NaCl,0.1M Tris-HCl 0.1M pH9.5
方法
在含1%α-MTG的1x样本缓冲液中将含Epo的样本调整为30ng/20μl并加样到SDS凝胶上。跑胶结束时,将蛋白质转印PVDF immobilon膜2小时,然后用检测Epo头26个氨基酸的单克隆抗体对Epo进行特异染色。用与碱性磷酸酶连接的抗小鼠IgG和NBT/BCIP染色进行显色。
等电子聚焦
材料
系统:Multiphor II,Amersham Biosciences
IPG凝胶:pH2.5-7
再膨胀缓冲液:9g尿素,0.5g CHAPS,0.04g DTE,0.5ml resolyte(pH3.5-10),10μl溴酚蓝(0.1%),用水调整到25ml
样本缓冲液:IPG样本缓冲液pH3-10,25μl溶于625μl的水中
印迹缓冲液:2.93g甘氨酸,5.81g Tris,20ml甲醇,0.375g SDS,用水调整到1000ml
印迹基材:PVDF Immobilon P 0.45μM Millipore;K8JM8238H
洗涤缓冲液:参见ELISA洗涤缓冲液
稀释缓冲液:1%的奶粉溶于洗涤缓冲液
检测缓冲液:NaCl,0.1M,Tris-HCl 0.1M pH9.5
方法
含Epo的样本调整到500-1000ng/50μl,脱盐,在样本缓冲液中1∶1稀释并加到再膨胀的IPG凝胶上。跑胶条件首先为300V1分钟,然后线性提高到3500V并最终于3500V进行1小时。在整个调焦过程中,设定的界限为10mA和10W。之后通过过夜扩散或通过电转印将蛋白质转印到PVDF Immobilon膜上,然后用检测Epo头26个氨基酸的单克隆抗体对Epo进行特异染色。用AP连接的抗小鼠IgG和NBT/BCIP染色进行显色。
DNA含量测定
通过FACS分析将重组细胞系和CHO-dhfr-宿主细胞系的DNA含量进行比较。
材料
洗涤缓冲液:0.1M Tris-HCl,pH7.4,2mM MgCl2,0.1% Triton X100
染色缓冲液:溶于洗涤缓冲液中的0.3μg/ml DAPI(Hoechst)
方法
用PBS洗涤5×105个细胞并用冰冷的70%乙醇进行固定。之后用洗涤缓冲液洗涤细胞两次,然后在染色缓冲液中室温孵育30分钟。用FACSVantage(Becton and Dickinson)以359nm激发和450nm发射条件测定DNA含量。
体外特异性试验
人红白血病细胞系TF-1(德国微生物和细胞培养物保藏中心(GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures))的生长依赖于IL3或hGM-CSF。这些细胞因子对增殖显示出协同效应,而Epo可将生活力维持一段时间。细胞按常规培养在含GM-CSF和Epo的培养用培养基中。
试验补充
培养用培养基:RPML 1640,补充以4mM Gln、10% FCS、20μg/ml转铁蛋白、10μMβ巯基乙醇、12ng/ml rhGM-CSF、3U/ml rhEpo
试验用培养基:RPML 1640,补充以4mM Gln、100μg/ml转铁蛋白、2mg/ml BSA
方法
在96孔板中用MTT存活力试验进行功能性测试(Hammerling等,1996,药物生物医学年度杂志(J Pharm Biomed Anal)14(11):1455-69)。将样本1∶2稀释8次。试验用培养基中Epo的初始浓度为100ng/ml。将50μl的每一样本稀释液、标准稀释液或空白转移到96孔试验平板上。用冷PBS洗涤TF-1细胞三次并在试验用培养基中将其调整为每毫升2×105个细胞。96孔试验平板中每一孔覆盖以50μl的细胞悬液并将这些细胞在CO2孵箱中放置72小时。之后加入10μl的MTT溶液(6mg/ml,溶于PBS)并于37℃孵育4小时。用100μl的SDS/HCl(10%SDS,溶于0.1M HCl)于暗处溶解染料4小时并在550/690nm处光度测定Epo依赖的存活力。
实施例1-质粒Epo/neo的构建
1.p2-neo的构建
1.1从含SV40早期启动子的pSV2neo中制备载体片段
载体构建的基础为包含在pSV2neo中的pBR322载体骨架。较小的EcoRI-PvuII限制性片段包含该pBR322骨架,且邻近的来自SV40的PvuII-HindIII片段携带SV40早期启动子的相应片段。
用限制性酶EcoRI和HindIII切割质粒pSV2neo(ATCC 37149)。产生的两片段的大小为3092bp和2637bp。2637bp的片段由包括pBR322骨架的EcoRI-PvuII限制性片段和邻近的含有SV40早期启动子的PvuII-HindIII片段组成。通过凝胶电泳制备并纯化2637bp的片段。
1.2新霉素抗性基因的制备
neo基因取自pSV2neo的转位子Tn5。其被扩增为仅含有基因编码区的片段。作为克隆策略的一部分,在两末端导入限制性内切酶识别位点。HindIII位点设于上游扩增引物,EcoRI和SpeI位点位于下游引物。扩增的区域与pSV2neo序列(Genbank登录号U02434)中2846到1938位核苷酸对应。寡核苷酸按如下设计:
Oligo2004-01:长度:38mer
5′-ggg gga agc ttg ttg gga agc cctgca aag taa act gg-3′ SEQ.ID.No.1
5′HindIII:
aagctt-g(=pSV2neo中的2846位)ttgggaagccctg............ SEQ.ID.No.2
Oligo2004-02:长度:42mer
5′-ggg gaa ttc
act
agt gag tcc cgc tca gaa gaa ctcgtcaag-3′ SEQ.ID.No.35′
/SpeI:
actagt-g(=pSV2neo中的1938位)agtcccgctcagaa...... SEQ.ID.No.4
应用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)通过PCR制备引物2004-01和2004-02的扩增产物。PCR法的参数为:在提供的缓冲液中加入20ng的pSV2neo、10pmol的每一引物、10mmol的dNTPs、2.5U的Pwo聚合酶,总体积为50μl;温度参数:95℃5分钟,35循环的(95℃30秒,65℃20秒,72℃90秒),72℃3分钟,于4℃冷却待用。
用DNA分离柱子(Mini,Wizard Promega GmbH)纯化产生的935bp的DNA片段,用EcoRI和HindIII消化,并通过琼脂糖凝胶纯化并应用Spin柱子(Supelco)洗脱。
1.3p1-neo的构建
应用Ligation Express(Clontech)将扩增的EcoRI-HindIII neo基因片段与来自pSV2-neo的EcoRI-HindIII载体片段连接并转化到大肠杆菌宿主(E.coli SURE(Stratagene))中。在补充有50mg/l氨苄青霉素的LB培养基中对转化子进行筛选。
从克隆中分离质粒DNA并应用Ec0RI和Nc0I限制性分析对其进行鉴定(3个片段分别为2527bp、780bp和251bp)。测定显示预期片段的质粒DNA构建体的相关部分的序列以进行进一步的鉴定。经证实含有SV40早期启动子和新霉素抗性基因的质粒DNA被命名为p1-neo。
1.4SV40终止区SV40LTpolyA/IVS的制备
设计PCR引物以扩增pSV2neo中SV40终止区的片段(751到1598位核苷酸)。上游引物也含有SpeI限制性位点。除了已包括在pSV2-neo中751位的BamHI位点,在下游引物中导入一EcoRI位点,该ECoRI位点由来自BamHI位点的6个核苷酸间插区隔开。两引物的序列如下:
Oligo2004-05:长度:40mer
5′-ggg g
ac
tag
ttt gtg aag gaa cct tac ttc tgt ggt gtg a-3′ SEQ.ID.No.5
5′SpeI:
actag-t(=pSV2neo中的1598位)ttgtgaagga............. SEQ.ID.No.6
Oligo2004-06:长度:46mer
5′-ggg g
ga
att
cgg agg g
gg
atc
cag aca tga taa gat aca ttg atg a-3′SEQ.ID.No.7
应用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)通过PCR制备上述引物2004-05+2004-06的扩增产物。应用DNA分离柱子纯化产生的873bp的DNA片段,用EcoRI和SpeI消化并用凝胶进行纯化。
1.5p2-neo的制备
用EcoRI+SpeI消化p1-neo质粒DNA。纯化产生的线性片段,与含SV40LTpolyA/IVS的扩增片段连接并转化大肠杆菌宿主。在补充有50mg/l氨苄青霉素的LB培养基中对转化子进行筛选。
从克隆中分离质粒DNA并应用以下酶限制性分析进行鉴定:EcoRI(1个4411bp的片段)和NcoI(2个大小为3631bp和780bp的片段)和SphI(3个大小为3499bp、840bp和72bp的片段)。测定显示预期片段的质粒DNA构建体的相关部分的序列以进行进一步的鉴定。经证实含有SV40LTpolyA/IVS的质粒DNA被命名为p2-neo。
2.质粒p3的构建
2.1SV40早期启动子片段的制备
应用质粒pSV2neo作为SV40早期启动子片段的来源。该片段大小与用于构建p2质粒的片段基本相同。但是,该片段末端经过修饰以导入BamHI和NotI识别位点。用于扩增该启动子的寡核苷酸引物按如下设计:
Oligo2004-07:长度:38mer
5′-ggg g
gg
atc
ctg tgg aat gtg tgt cag tta ggg tgt gg-3′ SEQ.ID.No.9
5′BamHI:
ggatcc-t(=pSV2neo中的3435位)gtggaat............. SEQ.ID.No.10
Oligo2004-08:长度:46mer
5′-ggg g
gc
ggc
cgc agc ttt ttg caa aag cct agg cct cca aaa aag c-3′ SEQ.ID.No.11
5′NotI:
gcggccgc-a(=pSV2neo中的3093位)gctttttgcaaaag.... SEQ.ID.No.12
应用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)通过PCR制备上述引物2004-07+2004-08的扩增产物。应用DNA分离柱子纯化产生的365bp的DNA片段,用BamHI和NotI消化并用凝胶进行纯化。
2.2pBluescript载体部分的制备
分别用BamHI和NotI依次消化pBluescript II SK+DNA。应用碱性磷酸酶对DNA进行去磷酸化。连接前通过琼脂糖凝胶电泳从小片段中纯化出BamHI/NotI片段。
2.3质粒p3的制备和确认
将扩增的含SV40早期启动子的BamHI-NotI片段与制备的pBluescript II SK+载体连接,所述连接应用T4 DNA连接酶(PromegaGmbH)。从补充以100mg/l氨苄青霉素的LB培养基上生长的克隆中分离并纯化来自大肠杆菌SURE(Stratagene)转化子的质粒DNA。
应用EcoRI和NcoI通过限制性分析鉴定产生的DNA(大小为3039bp和253bp的2个片段)。
显示预期片段的两质粒DNA通过测序进行进一步的鉴定。SV40早期启动子两条链均经过测序以使每一位置均得以验证。该质粒命名为p3。
3.人Epo cDNA的分离
3.1用TRIZol试剂分离总RNA
用于从人肾组织(从Lainzer Krankenhaus医院获得)中分离Epo RNA的TRIzol试剂为苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液。在细胞裂解期间于细胞破坏的同时,异硫氰酸胍与RNA形成水溶性复合体。加入氯仿,随后离心,将溶液分离成含RNA的水相和有机相。分离水相后,用异丙醇沉淀RNA,乙醇洗涤,空气干燥并重悬于不含RNA酶的水中。
将人肾组织片段切成小块,通过100μm的细胞滤网,离心(179xg/10分钟)并用PBS将产生的沉淀块洗涤三次。然后将沉淀块重悬在PBS中,分装在无菌管中,-196℃冷冻并储存在-80℃待用。
加入1ml的TRIzol试剂裂解冷冻组织,匀浆化并于15-30℃孵育5分钟以保证完全裂解。加入200μl氯仿、振摇管并于15-30℃孵育2-3分钟后,将管于12000xg离心10分钟。离心后,将上层液相小心转移到新管,与500μl的异丙醇混合并于15-30℃孵育10分钟。离心沉淀的RNA(12000xg,10分钟),用乙醇洗涤沉淀,再次离心,空气干燥并溶解在无RNA酶的DEPC水中。用光度计于260nm处测定总RNA含量。
1OD260nm=40μg RNA/ml
通过评测OD260nm和OD280nm(蛋白质的最大吸光度)的比值可估计出分离的RNA纯度。该比值应位于1.6和1.8之间。
3.2用Dynabeads Oligo(dT)25分离mRNA
Dynabeads Oligo(dT)25 mRNA DIRECT试剂盒采用将真核mRNA的多聚腺苷酸尾杂交至其表面共价连接有包含25个核苷酸长的脱氧胸苷酸的超磁、聚苯乙烯颗粒。可应用Dynal磁珠浓缩器(Dynal MPC)分离结合到磁珠上的mRNA。
洗涤缓冲液Tris-HCl 10mM,pH8.0;LiCl 0.15mM;EDTA 1mM
2x结合缓冲液Tris-HCl 20mM,pH7.5;LiCl 1mM;EDTA 2mM
对于10μg的总RNA,在Dynal MPC中分离100μl的Dynabeads oligo(dT)25并用2x洗涤缓冲液洗涤两次。同时用1x洗涤缓冲液将总RNA的体积调整为200μl并于65℃孵育4分钟进行变性。然后将RNA与珠子混合,室温孵育5分钟并在Dynal MPC中进行分离。用1x洗涤缓冲液洗涤珠子两次。用洗脱缓冲液(2×10μl)于65℃孵育4分钟将多聚腺苷酸化的RNA从Dynalbeads Oligo(dT)25上洗脱。在Dynal MPC中分离Dynabeads并立即将上清转移到新的无RNA酶的微离心管。洗脱液直接用于反转录。
3.3反转录
将用于Epo的特异引物于80℃孵育4分钟进行变性,并将mRNA在65℃孵育5分钟进行变性。冰上将以下成分加到1.5ml的无菌微离心管中:
试剂 终浓度
MRNA 10μl
MMLV(200U/μl) 0.25μl
Boehringer PCR缓冲液(10x) 2μl
dNTPs(10mM) 2μl
MgCl2(50mM) 1μl
Epo正向引物(100pmol/μl) 1μl
DTT(0.1M) 0.25μl
RNA酶抑制剂(40U/μl) 0.25μl
H2O 3.25μl
孵育:37℃ 60分钟
灭活:100℃ 5分钟
3.4聚合酶链反应
于4℃将以下成分加到无菌的1.5ml微离心管中。PCR条件如下所列。
试剂 Epo
模板 cDNA Epo 5μl
聚合酶 Vent 1U(0.5μl)
聚合酶缓冲液(10x) Vent缓冲液1x(10μl)
dNTPs(10mM) 200μM(2μl)
MgCl2(50mM) /
正向引物(10pM) 30pM(3μl)
反向引物(10pM) 30pM(3μl)
DMSO /
H2O 76.5μl
PCR循环
1变性 95℃ 2分钟
2变性 94℃ 45秒
3引物退火 58℃ 30秒
4延伸 72℃ 1分钟
5终末延伸 72℃ 10分钟
6循环 30个循环
用琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。
3.5琼脂糖胶电泳
6xBX缓冲液 溴酚蓝0.25%;二甲苯腈蓝0.25%,甘油30%
TAE缓冲液 Tris碱242g;冰醋酸57.1ml;EDTA(0.5M,pH8.0)
100ml;用水调整到1000ml
λ-标记物III 10μg噬菌体λ-野生型-Dann
(2.5μl HindIII+2.5μl EcoRI+20μl 缓冲液
R(Fermentas),用水调整到200μl;37℃消化1小时,
65℃灭活20分钟;补充以40μl的BX上样缓冲液)
在微波炉中溶解1g的琼脂糖和99g的1xTAE缓冲液,冷却到约60℃并加入3μl的溴化乙锭母液(10mg/ml)。在1xTAE缓冲液中以100-300V进行约30分钟的电泳,所述时间取决于待分离的DNA片段的长度。每一泳道含有10μl样本与2μl 6xBX缓冲液的混合物。DNA片段的鉴定基于与λ/HindIII消化的分子量标准进行比较。
3.6用于连接的PCR产物和载体的制备
3.6.1用于粘端克隆的载体DNA和插入片段的限制性消化
根据生产商的使用说明书将10μl的限制性酶和适宜的限制性酶缓冲液与1μg的载体和插入片段混合。将混合物置37℃(SmaI为30℃)孵育30到60分钟,时间根据应用的酶、载体和插入片段。然后将温度提高到65℃持续10分钟以灭活酶并通过琼脂糖凝胶电泳分析反应混合物。
3.6.2连接
pIRESneoSV40载体
pIRESneo载体(Clontech实验室)含有脑心肌炎病毒(ECMV)的内部核糖体进入位点(IRES),所述位点允许从一条信使RNA上进行两开放阅读码框的翻译。pIRESneo的表达盒含有人巨细胞病毒(CMV)的主要立即早期启动子/增强子和位于其后的多克隆位点(MCS)、含有ECMV IRES和位于其后的新霉素磷酸转移酶基因以及含有牛生长激素的多聚腺苷酸化信号。在此载体中CMV启动子被SV40早期启动子替换。
用T4 DNA连接酶连接载体和PCR产物。对于最佳连接,应用摩尔比约1∶10的约20ng载体和200ng插入片段(根据长度而定)并与以下试剂混合,用水调至10μl。15℃进行过夜孵育并室温孵育3小时。然后于65℃孵育10分钟热灭活连接酶。
试剂 最终量
载体(pIRESneoSV40) ~20ng
插入片段(Epo) ~200ng
T4 DNA连接酶 1U(1μl)
缓冲液(5x) 1×(2μl)
H2O 加到10μl
3.6.3细菌和培养基
JM109 (Promega,USA)
LB-培养基 酪蛋白来源的蛋白胨10g;酵母提取物5g;NaCl 10g,
用水调整到1000ml并用5M NaOH将pH调节为7.0
LB琼脂 在1000ml LB-培养基中加入15g琼脂
LB-氨苄青霉素 1000ml LB-培养基中加入100μl的氨苄青霉素
(100mg/ml)
SOC培养基 细菌用胰蛋白胨20g;酵母提取物5g;NaCl 10mM;KCl
3mM;MgCl2 10mM;葡萄糖20mM,MgSO4 10mM
3.6.4用CaCl2进行转化
感受态细菌(JM109)的制备
将大肠杆菌(JM109)接种到10ml的LB培养基中并于37℃过夜培养。取4ml的细菌培养物按1∶100稀释加到LB培养基中并培养至其OD260nm达到0.8。以4500转/分钟于4℃将细菌离心10分钟并将所用的每50ml细菌悬液的沉淀重悬在10ml的0.1M CaC12(4℃)中,离心细胞并将沉淀重悬在2ml的0.1M CaCl2中并按100μl总体积分装,液氮中冷冻并于-80℃保存。
转化
在预冷的17×100mm聚丙烯培养管中将5-10ng的质粒DNA加到JM109感受态细菌,轻轻混合并置冰上30分钟。然后在严格的42℃水浴中将细胞热休克45秒,此期间不可摇动管,并立即置冰上2分钟。然后向管中加入900μl SOC培养基并于37℃孵育30分钟,之后将100μl的细菌悬液涂布在LB-氨苄青霉素平板上。
3.6.5筛选及甘油培养物的建立
通过PCR技术从氨苄青霉素抗性的克隆中筛选插入的DNA片段。取部分的氨苄青霉素抗性克隆与PCR反应混合物以及对克隆的DNA片段特异的引物(参见以下)混合。阳性克隆在琼凝糖凝胶电泳中显示出PCR扩增的DNA条带。然后将这些克隆在LB-氨苄青霉素培养基中增殖用于进一步的分析和质粒纯化。为用于进一步的应用和储存,将1ml的细菌培养物与500μl甘油(87%)混合并保存在-80℃。
3.6.6WizardPlus SV Minipreps DNA纯化系统
细胞重悬溶液Tris-HCl 50mM,pH7.5;EDTA 10mM,RNase A 100μg/ml
细胞裂解溶液NaOH 0.2M,SDS1%
中和溶液盐酸胍4.09M,乙酸钾0.759M;冰醋酸2.12M,pH4.2
洗柱溶液乙酸钾60mM,Tris-HCl 10mM,pH7.5;60%乙醇
将单克隆接种到2-3ml LB-氨苄青霉素培养基并于37℃过夜培养。离心(12000xg,5分钟)溶液并将产生的沉淀块完全重悬在250μl的重悬溶液中且然后加入250μl的细胞裂解溶液,立即颠倒管4次进行混合并于室温孵育1-5分钟。之后加入10μl的碱性蛋白酶(室温孵育5分钟)并加入350μl的中和溶液。颠倒管4次进行立即混合并将细菌裂解液于室温12000xg离心10分钟。将清澈上清转移到Spin柱子并离心(12000xg,5分钟),并用洗涤溶液(750μl/250μl)洗柱子两次。用100μl无核酸酶的水洗脱DNA。
3.6.7质粒测序
以特异引物通过IBL(Gerasdorf,Austria)和GenXpress(Maria Worth,Austria)对插入序列进行序列测定。用于Epo和SV40早期启动子扩增和序列分析的寡核苷酸引物如下所列。
寡核苷酸引物 序列
SV40早期启动子
SV40早期ClaI正向 5′-aga tcg atc aag ctt ttt gca aaa gcc tag-3′SEQ.ID.No.13
SV40早期NruI反向 5′-agt cgc gag cgc agc acc atg gcc tg-3′SEQ.ID.No.14
SV40早期281反向 5′-gcc cag ttc cgc cca ttc-3′SEQ.ID.No.15
Epo
Epo BamHI正向 5′-tag gat cct cat ctg tcc cct gtc ctg c-3′SEQ.ID.No.16
Epo EcoRI反向 5′-tag aat tcc gcc atg ggg gtg cac gaa tgt cc-3′
SEQ.ID.No.17
Epo 221正向 5′-taa ctt tgg tgt ctg gga-3′SEQ.ID.No.18
Epo 204反向 5′-tcc cag aca cca aag tt-3′SEQ.ID.No.19
pIRESneo
pIRESneo 181反向 5′-tta ggg tta ggc gtt ttg cg-3′SEQ.ID.No.20
pIRESneo 1016正向 5′-act cac ccc aac agc cg-3′SEQ.ID.No.21
pIRESneo 2786正向 5′-ggcc aaa caa cag atg gct-3′SEQ.ID.No.22
pIRES-200反向 5′-tgg aaa gag tca aat ggc-3′SEQ.ID.No.23
4.质粒p5的构建
4.1 Epo基因片段的制备
用pSVGPIRNEO为模板DNA通过PCR扩增Epo(人促红细胞生成素)的结构基因。Epo的序列在GenBank中给出,登录号为M11319.1。分别将NotI和KspI的识别位点导入上游和下游引物。按如下设计引物:
Oligo2004-09:长度:45mer
5′-ggg g
gc
ggc
cgc atg ggg gtg cac gaa tgt cct gcc tgg ctg tgg-3′ SEQ.ID.No.24
5′NotI:
gcggccgc a(=PSVGPIRNEO中的665位)tgggggtg............... SEQ.ID.No.25
Oligo2004-10:长度:44mer
5′-ggg g
cc
gcg
gtc atc tgt ccc ctg tcc tgc agg cct ccc ctg tg-3′ SEQ.ID.No.26
5′KspI:
ccgcgg-t(=PSVGPIRNEO中的1246位)catctgtcccct............ SEQ.ID.No.27
应用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)通过PCR制备引物2004-09+2004-10的扩增产物,如上描述。应用DNA分离柱子纯化产生的604bp的DNA片段,用KspI和NotI消化,并进行凝胶纯化。产生的592bp的KspI/NotI片段用于以下描述的三片段连接。
4.2SV40LTpolyA/IVS终止区的制备
通过PCR从pSV2neo中克隆SV40LTpolyA/IVS的终止区,所用方法与以上描述的1.4部分中用于构建p2-neo的方法基本相同,不同处在于设计的引物具有的限制性核酸内切酶识别位点不同:上游引物引入KspI(=SacII)位点且下游引物引物引入SacI和EcoRI位点。
Oligo2004-11:长度:42mer
5′ggg g
cc
gcg
gtt tgt gaa gga acc tta ctt ctg tgg tgt gac-3′ SEQ.ID.No.28
5′KspI:
ccgcgg-t(=pSV2neo中的1598位)ttgtgaaggaa............. SEQ.ID.No.29
Oligo 2004-12:长度:46mer
5′-ggg g
ga
gct
cga
att
cga tcc aga cat gat aag ata cat tga g-3′ SEQ.ID.No.30
5′SacI/EcoRI:
gagctc
gaattc-g(=pSV2neo中的752位)atccagacatg.... SEQ.ID.No.31
应用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)通过PCR制备引物2004-11+2004-12的扩增产物,如上描述。应用DNA分离柱子纯化产生的873bp的DNA片段,用KspI和SacI消化。然后对产生的858bp的DNA片段进行凝胶纯化。
4.3p3载体部分的制备
分别应用NotI和SacI依次消化p3质粒DNA。用碱性磷酸酶处理DNA并对载体片段进行凝胶纯化。
4.4三片段连接和质粒p5的分离
将质粒p3的NotI/SacI载体部分、Epo基因的KspI/NotI部分和SV40L TpolyA/IVS终止区的KspI/SacI部分置于一个连接反应(LigationExpress,Clontech)中进行连接。在补充以100mg/l氨苄青霉素的LB培养基上筛选转化子。
通过菌落杂交筛含两个插入片段的阳性转化株,所述菌落杂交应用2004-09/2004-10和2004-11/2004-12两对引物的扩增片段作为标记探针。挑选用两个探针杂交获得阳性杂交信号的十个克隆进行“小”规模质粒制备(Qiagen)。
应用以下的酶进行限制性分析,BamHI(4723bp的1个片段)、EcoRI(2913、1810bp的2个片段)以及PvuII(2513、1204、903、103bp的4个片段)。筛选出两个显示正确限制性片段的克隆并通过序列测定进行确证。对克隆到pBluescriptII SK+中的完整盒进行测序并与预定的核苷酸序列进行比较。每一单核苷酸均得以正确确认。该质粒命名为p5。
5.pEpo/neo的构建
5.1pEpo/neo 12-1的构建
BamHI和EcoRI消化p5质粒DNA并对产生的代表SV40启动子-Epo基因-SV40终止子盒的1792bp片段进行凝胶纯化。同样用BamHI和EcoRI消化质粒p2-neo并凝胶纯化线性化载体。此外,应用碱性磷酸酶对DNA进行去磷酸化并用Amicon Micropure酶去除剂进行纯化。
将4411bp的p2-neo载体和来自p5的1792bp盒子这两个片段连接(Ligation Express,Clontech)并转化到大肠杆菌SURE。从生长在补充以70mg/l氨苄青霉素的LB培养基上的多个转化株中分离质粒DNA并应用限制性内切酶PvuII、EcoRI和NcoI消化以对其进行分析。
筛选显示有预期片段(EcoRI:6191bp,NcoI:4085、1326和780bp,PvuII:3273、2130、685和103bp)的克隆并命名为pEpo/neo-12。
为进一步进行纯化,将DNA转化到大肠杆菌SURE中(参见以下)并从单克隆(pEpo/neo-12-1)接种的培养基中应用″Midi-prep″方法(Qiagen)制备质粒DNA。应用以下的酶进行限制性内切酶分析:BamHI、HindIII、EcoRI、NcoI、NotI、PstI、SpeI、SphI、PvuII、NarI。可发现预期的片段和大小,证实克隆为正确的pEpo/neo克隆。
5.2 pEpo/neo的最终构建
pEpo/neo-12-1中Epo基因的上游区在起始的ATG的负3位处进行改变。导入一额外的核苷酸A导致在起始ATG的-3位产生嘌呤碱基G。该位置的嘌呤可提高基因的表达水平。为达到该目的,应用修改的上游引物2004-09-a扩增Epo基因:
Oligo2004-09-a:长度:46mer
5′gggggcggccgcaatgggggtgcacgaatgtcctgcctggctgtgg-3′ SEQ.ID.No.32
应用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)通过PCR制备引物2004-09-a+2004-10的扩增产物,如以上所描述。应用DNA分离柱子纯化产生的605bp的DNA片段并用KspI和NotI进行消化。然后对产生的593bp的DNA片段进行凝胶纯化。
分别用KspI和NotI消化pEpo/neo-12-1质粒DNA,以移除Epo基因。然后凝胶纯化5599bp的片段。将制备的两条DNA连接(Ligation Express,Clontech)。从生长在补充以70mg/l氨苄青霉素的LB培养基上的克隆中分离并纯化质粒DNA。在第一轮筛选中应用NcoI对DNA进行限制性分析。
筛选阳性克隆并应用″Midi prep″方法(Qiagen)分离DNA。应用BamHI、HindIII、EcoRI、NcoI、NotI、PstI、SpeI、SphI、PvuII、NarI进行进一步的限制性内切酶分析。可发现预期的片段和大小,证实克隆为正确的pEpo/neo。插入到pBR322载体部分的完整盒子(SV40早期启动子-neo基因-SV40LTpolyA/IVS-SV40早期启动子-Epo基因-SV40LTpolyA/IVS)中的每一单核苷酸也通过测序进行确证。实施例2-质粒Epo/dhfr的构建
1.p2-dhfr-CDS的构建
1.1dhfr基因的制备
用于载体构建的dhfr基因取自存在于质粒pLTRdhfr26(ATCC 37295)中的小鼠cDNA。小鼠dhfr cDNA(MUSDHFR)的核苷酸序列可从Genbank中获得,登录号为L26316。
应用设计的引物从pLTRdhfr26扩增dhfr,产生的片段所包含的编码区为从56位的起始ATG到619位的终止密码子TAA。对于以上描述的新霉素抗性基因的扩增,分别在上游和下游扩增引物中引入HindIII和SpeI位点。反向引物中除SpeI位点外也导入了EcoRI位点。寡核苷酸的序列如下:
Oligo2004-13:长度:39mer
5′-ggg g
aa
gct
tat ggt tcg acc att gaa ctg cat cgt cgc-3′ SEQ.ID.No.33
5′HindIII:
aagctt-A(=MUSDHFR中的56位)TGgttcgaccattg............. SEQ.ID.No.34
Oligo2004-14:长度:42mer
5′ggg
gaa ttc
act
agt tag tct ttc ttc tcg tag act tca aac-3′ SEQ.ID.No.35
SEQ.ID.No.36
应用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)通过PCR制备引物2004-13+2004-14的扩增产物,如上描述。应用DNA分离柱子纯化产生的588bp的DNA片段,用HindIII和EcoRI消化并进行凝胶纯化。
1.2p1-dhfr-CDS的制备
应用Ligation Express(Clontech)将扩增的EcoRI-HindIII dhfr基因片段与来自pSV2-neo的EcoRI-HindIII载体片段连接,并转化到大肠杆菌宿主中。通过在补充以50mg/l氨苄青霉素的LB培养基上培养筛选转化株。从补充以50mg/l氨苄青霉素的LB培养基上生长的克隆中分离并纯化转化株的质粒DNA。
从克隆中分离质粒DNA并通过EcoRI加ScaI的限制性内切酶分析进行鉴定(大小为2225bp、514bp和473bp的3个片段)。
对显示预期片段的质粒DNA构建体的相应部分进行序列测定以进一步进行鉴定。证实含有SV40早期启动子和二氢叶酸还原酶基因的质粒DNA被命名为p1-dhfr-CDS。序列分析显示,与已发表的MUSDHFR中dhfr基因序列相比存在一个差异,具体地为MUSDHFR序列中451位T到C的改变。随后的测序表明该改变也存在于原始质粒中。但由于CTT和CTC均编码亮氨酸,因此产生的变化并不导致核苷酸序列所编码的氨基酸序列的改变。
1.3p2-dhfr-CDS的制备
用EcoRI+SpeI消化p1-dhfr-CDS质粒DNA。纯化产生的线性片段并与扩增的含SV40LTpolyA/IVS(以上描述)的片段连接。转化和筛选后,通过应用AccI的限制性内切酶分析对产生的质粒进行分析(2994、855和216bp的3个片段)。筛选出几个质粒并用以下的酶进行进一步的分析,HincII(分别为3466bp和599bp的2个片段)、AflIII(分别为2872bp和1193bp的两个片段)以及BglI(分别为2371bp和1694bp的2个片段)。
对显示所有正确大小片段的质粒DNA通过序列测定进行进一步的鉴定。经确认的质粒被命名为p2-dhfr-CDS。
2.Epo/dhfr的构建
2.1pEpo/dhfr21的制备
用BamHI和EcoRI消化p5质粒并将产生的代表SV40启动子-Epo基因-SV40终止子盒子的1792bp片段进行凝胶纯化。
同样用BamHI和EcoRI消化质粒p2-dhfr-CDS并凝胶纯化线性化的载体,并应用Supelco spin柱子对线性化载体进行纯化和洗脱。此外,用碱性磷酸酶对DNA去磷酸化并应用Amicon Micropure酶移除剂进行纯化。
将4053bp的p2-dhfr-CDS载体和来自p5的1792bp盒子的两个片段连接(Ligation Express,Clontech)并转化大肠杆菌SURE。用Epo基因(PCR产物)为探针对生长在补充以70mg/l氨苄青霉素的LB培养基上的转化株克隆进行杂交。从多个阳性克隆中分离质粒DNA并用限制性内切酶NcoI消化对其进行分析。
筛选显示预期片段(NcoI:4085bp和1760bp)的克隆并将其命名为pEpo/dhfr-21。为进行进一步的纯化,将DNA再转化大肠杆菌SURE(参见以上)并应用″Midi-prep″方法(Qiagen)从单克隆(pEpo/dhfr-21-1)接种的培养物中制备质粒DNA。
应用以下的酶进行限制性内切酶分析:BamHI、HindIII、EcoRI、NcoI、NotI、PstI、SpeI、SphI、PvuII、NarI。可发现所有的预期片段和大小,证实克隆为正确的pEpo/dhfr-21。
2.2pEpo/dhfr的最终构建
与用于pEpo/neo的方法相同,Epo/dhfr-21中Epo基因的上游区在相当于起始ATG的负3位进行改动。导入一额外的A以在距起始ATG负3位处产生嘌呤碱基G。如实施例1的4.2中所描述的方法扩增Epo基因。
用KspI和NotI消化pEpo/dhfr-21质粒DNA以移除Epo基因。然后凝胶纯化5259bp的片段。
将制备的两DNA连接到一起(Ligation Express,Clontech)。从在补充以70mg/l氨苄青霉素的LB培养基中生长的克隆中分离并纯化质粒DNA。在第一轮筛选中应用NcoI限制性内切酶对DNA进行分析。
筛选阳性克隆以应用″Midi prep″方法(Qiagen)分离DNA。应用BamHI、HindIII、EcoRI、NcoI、NotI、PstI、SpeI、SphI、PvuII、NarI进行进一步的限制性内切酶分析。可发现预期的片段和大小,证实克隆为正确的pEpo/dhfr。
也通过测序对插入到pBR322载体部分的完整盒子(SV40早期启动子-dhfr基因-SV40LTpolyA/IVS-SV40早期启动子-Epo基因-SV40LTpolyA/IVS)中的每个单核苷酸进行确证。
实施例3-由pEpo/neo和pEpo/dhfr中产生重组CHO-细胞
进行lipofectin转染前一天,将细胞以1-5×104个细胞/cm2接种到25cm2的T-型瓶或96孔平板。以50∶1=Epo/neo:Epo/dhfr比例将两质粒混合并根据生产商的说明书将其吸附到lipofectin试剂(GIBCO/BRL)。
简言之,使用0.25μg DNA/cm2和1.5μllipofectin-试剂/cm2并将此DNA/脂质混合物调整为200μl/cm2细胞层。然后在无血清DMEM中用转染混合物覆盖细胞4个小时,之后用培养用培养基替换含DNA的培养基。在含血清的培养基中培养24小时后,将血清换成筛选培养基。首先将转染的细胞池培养在筛选培养基中进行汇片,然后在扩增培养基(4.8×10-8MMTX)中培养,之后通过ELISA筛选产生Epo的细胞培养上清。确定产量最高的细胞,将MTX浓度提高两倍并应用产量最高的细胞进一步培养。筛选37株重组细胞并比较其生长特性、Epo生产率、蛋白质形式(通过western印迹分析)、Epo功能和染色体稳定性。
在T25-培养瓶中进行转染,每个T25-瓶中含有2.5μg pEpo/neo、0.05μg pEpo/dhfr和15μl lipofectin(09/T25/1和09/T25/2),以及每个T25-瓶中含有2μg pEpo/neo、0.4μg pEpo/dhfr和15μl lipofectin(09/T25/3和09/T25/4)。
另5个平板每平板用10μg pEpo/neo、0.2μg pEpo/dhfr和60μl lipofectin转染(09/96/1-09/96/5),5个平板每平板用8μg pEpo/neo、1.6μg pEpo/dhfr和60μl lipofectin转染(09/96/6-09/96/10)。平板11和12每平板用6.25μgpEpo/neo、0.08μg pEpo/dhfr和37.5μl lipofectin转染。
简言之,使用0.25μg DNA/cm2和1.5μl lipofectin-试剂/cm2且将该DNA/脂质混合物调整到200μl/cm2细胞层。
由于先前的实验显示一个培养单位中的克隆数最多为三到五个,因此系列转染主要在微滴定平板中进行。这意味着单克隆转染体的分离较之从T型瓶中几百个克隆中的分离更为容易。表1描述了每96平板中的克隆数以及存在或不存在扩增压力时的ELISA滴度。转染的细胞池首先培养在筛选培养基中进行汇片且然后在扩增培养基(4.8×10-8M MTX)中培养,之后通过ELISA筛选生产Epo的细胞培养上清。筛选约1000个培养细胞,将50个培养细胞用浓度提高的MTX测试特异Epo产率。确定最高产量的细胞,将MTX浓度提高两倍并将产量最高的细胞用于进一步的培养。
筛选和第一扩增步骤在96孔板进行,筛选所有克隆后,培养在4.8×10-8M MTX中,筛选出7个克隆,命名为09/96/1F5、09/96/3D5、09/96/3H5、09/96/5D4、09/96/5H1、09/96/6C5和09/96/7E6,并比较其生长特性、Epo产率、western印迹中的蛋白质形式、Epo功能性试验和染色体稳定性。
所有克隆的细胞加倍的时间似乎相同,且其可按1∶2到1∶5每周两次进行传代。将MTX浓度从9.6×10-8M提高到1.9×10-7M也可提高产率,而进一步将MTX浓度提高一倍并不影响ELISA值。因此以3.8×10-7M MTX的进行亚克隆。用1.9×10-7M MTX分析免疫荧光,该浓度下的单培养物差异并不显著。
用光学显微镜和Coulter Counter核DNA分析比较细胞形态。克隆09/96/7E9、09/96/6C5、09/96/5H1、09/96/5D4和09/96/3D5显示的细胞核大小分布与宿主细胞系CHO-DHFR-相同。相反,细胞系09/96/1 F5和09/96/3H5具有较大的细胞核。从以往的试验得知,该结果源自染色体数量的提高。因此决定应用克隆09/96/3D5用于进一步的稳定性试验。
在TF-1细胞上进行的Epo功能性试验时,所有7个培养物上清得出的斜率与重组的药用产物相同。
通过SDS PAGE和western印迹对每一MTX浓度的重组蛋白质进行试验,且在任何的重组培养上清中仅存在微小的变化。这些克隆产生Epo。
总结和讨论
描述了从真核表达载体的构建到哺乳动物细胞转染和表达Epo的多克隆细胞池的分离从而对表达Epo的重组CHO细胞系的筛选。分析的基础主要应用ELISA、免疫荧光、western印迹和体外功能性测试。所有这些方法建立在这样的浓度范围内,即其能够筛选只有ng/ml量的低产量细胞池培养上清以及更为稳定的重组细胞。
产生了重组CHO-细胞池,其中基因拷贝数用直至达3.8×10-7M MTX得以逐步扩增。这些细胞可按1∶3到1∶4每周传代两次,且每次用ELISA检测出的Epo水平均提高。
实施例4-重组细胞系的进一步筛选
用重组细胞池09/96/3D5进行进一步的稳定性试验。MTX浓度逐步提高到0.38μM MTX。在此扩增水平,将重组3D5细胞亚克隆成每孔10到20个细胞。通过ELISA筛选具有单克隆的孔的培养上清。表2显示在0.38μM MTX存在下重组细胞池3D5的亚克隆条件和效率。测试300个单克隆的上清。用0.77μM MTX在24孔板中筛选传代4天后Epo滴度提高的克隆。
将这些克隆中的7个保存在液氮中并通过将MTX浓度提高到1.54μM筛选基因拷贝数的进一步扩增。
表3汇集了第二轮稳定性试验的铺板条件和效率。此时,克隆09/96/3D5/1H9和09/96/3D5/18E5用1.54μM MTX进行最后一次亚克隆。每孔的细胞数减至4个细胞。筛选260个单克隆,其中每一亚培养中多于20个克隆转移到T型瓶并筛选比生产率。通过标准值确定最终的生产克隆,所述标准值如比表达速率、生长情况和核大小分步。弃去显示四倍体的克隆,这是由于根据经验此类细胞在生物转化器中易于呈现复杂的生长模式。筛选后选择以下6个亚克隆(4个1H9和2个18E5亚克隆),将所述克隆冷冻在液氮中。
09/96/3D5/1H9/4C2 09/96/3D5/1H9/6C2 09/96/3D5/1H9/6D4
09/96/3D5/1H9/15B4 09/96/3D5/18E5/7A6 09/96/3D5/18E5/15C3
实施例5-对无血清培养用培养基的适应
选择来自实施例4的最终的6个重组细胞系,在末次亚克隆步骤后进行无血清培养条件的适应。
将亚克隆后7-12次传代的细胞以5×104个细胞/cm2接种到T25-瓶中并培养3-4天直至汇片。在此时间点将培养基完全替换为无血清适应培养基且之后每日更新80%的培养基。所有悬浮的细胞均放回培养物中。适应期过后,几乎所有细胞均悬浮生长,将克隆每周传代两次并以悬浮培养物培养。
将克隆在无血清适应培养基中培养11-13代后将其低温保存。每一细胞系以5×106个细胞/瓶共6个安瓿瓶以无血清冻存培养基保存于液氮中。冻化后,在无血清生产培养基中培养克隆。对冻化后第二和第三次传代的上清进行特性分析以筛选生产克隆。
分析试验包括:
比生长速率[μ]-(μ=In(X2/X1)/天)
比生产率[qp]-(Qp=产物生成×106/(细胞数x天))
Western印迹
等电聚焦
DNA含量和稳定性
克隆稳定性
所有的6个克隆均可在无血清生长培养基中生长并每周传代两次。也经行无血清冷冻保存且冻化后将培养用培养基转换为无血清生产培养基。该配方中富含葡萄糖和氨基酸。
5次传代后测定多种蛋白质和细胞参数,并选择出一个生产克隆(09/96/3D5/1H9/6C2;简写为6C2)以及一个后备克隆(09/96/3D5/1H9/4C2;简写为4C2)。
实施例6-重组细胞系的比较
几周后计算来自实施例4和5的6个细胞系的生长特性,所述计算通过测定培养物中的细胞数以及传代时的传代比进行。通过ELISA测定Epo生产率。通过这些数据计算出如上描述的比生产率和比生长速率。
表4总结了在标准培养条件下获得的数据,所述标准条件为培养3天后以1∶3的比例传代。
显示了传代后及额外的3天后的细胞数(通过Coulter Counter测定)。
还原条件下的SDS-PAGE
通过SDS-PAGE分离6个细胞系的上清并比较分子量差异。显示6份上清的SDS图形相同,均带有在此类高度糖基化蛋白质中常见的成片条带(数据未显示)。
用于比较的可商业获得的产物以更为清晰的条带迁移,可能是由于其源自在下游处理中分离出的更为清晰的条带。
IEF-Western印迹
IEF-western印迹分析将反应出糖蛋白潜在的微观不均一性。根据上样到凝胶上的蛋白质的量,可见到14条带。在western印迹上见到约在凝胶中部的一条特征性双带;在此双带之下的条带定义为1带且在此凝胶酸性部分中可见到9至10条带。比较用的商业产物在与异源产物中6到9带对应处显示4条主要条带。
重组细胞的DNA含量
DNA含量与细胞系染色体的数目成正比。重组细胞系的稳定性部分地受染色体数影响且DNA含量的鉴定通过与宿主细胞系(CHOdhfr-)的比较得以证实。
总结和讨论
在此描述了表达重组Epo的CHO细胞系的分离。两轮亚克隆后,以6个亚克隆细胞系的不同特性的比较为基础,确定了最终的生产克隆。分析主要基于ELISA、western印迹和IEF试验以及测量DNA的FACS分析。
与商售的纯化蛋白质相比,重组培养上清的western印迹图形显示有几条额外的低分子量条带。一个解释是这些额外条带代表同种型,用于比较的商售产物在下游处理时将所述同种型移除。另一种可能是该条带为由于SDS的不完全摄入而检测出的假条带。无论其Qp大小,所有细胞培养上清的等电位聚焦显示相同的同种型分布。
产量最佳且最易于操作的克隆为选作生产克隆的克隆6C2。选择4C2作为后备克隆。两克隆可在摇动瓶中增殖。
实施例7-在T型瓶中培养CHO细胞
在T型瓶中用无血清条件培养的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)产生重组人促红细胞生成素。培养物接种密度为2.67×105个细胞/mL。接种3天后,最终的细胞密度可达到9.35×105细胞/mL(=>μ=0.42天-1)。
实施例1到6描述了多种表达Epo的CHO克隆的制备。在实施例4和5获得的6个克隆中,选择克隆CHO 6C2是由于其出众的高细胞比生产率和其高的比生长速率。
实施例8-在生物反应器中培养CHO细胞
在150L的生物反应器中以Fed-Batch(T43C6C2)模式培养CHO细胞系6C2。应用的细胞培养基由补充以氨基酸的50∶50 DMEM/Hams F12组成并包含0.25%的植物肽、0.1% lutrol、1.54μm氨甲蝶呤(MTX)、4g/L葡萄糖、2.5g/L NaHCO3、乙醇胺、柠檬酸铁、抗坏血酸和亚硒酸钠。培养基不包含任何昂贵的功能蛋白(重组或天然来源)。存在来自动物来源的组分。细胞以约5×105细胞/mL接种到56L培养基中。pO2设为50%空气饱和,温度为37℃且pH为7.0并在发酵过程中保持恒定。
葡萄糖浓度保持在高于1g/L。4天后用新鲜培养基将反应液补充至150L。9天后加1875mL的营养浓缩液扩大批发酵,所述营养浓缩液包含氨基酸、糖和植物来源的蛋白胨。10天后另外加入1875mL的营养浓缩液。两天后(第12天)回收含促红细胞生成素的上清。
实施例9-在不含氨甲蝶呤的生物反应器中生产促红细胞生成素
在5-L的生物反应器中以Fed-Batch(Kamp 4 B5-1和2)模式培养CHO细胞系6C2。培养基如实施例9中所示。第一生物反应器(Kamp 4 B5-1)设定为1.54μm MTX,且第二生物反应器(Kamp 4 B5-2)不含MTX。
葡萄糖浓度保持在高于1g/L。以约5×105细胞/mL将细胞接种在1250-mL培养基中。pO2设定为50%空气饱和,温度为37℃且pH为7.0并在发酵过程中保持恒定。2天后用新鲜培养基将反应液补充到5L。第6、7、8、9和10天后加入50-122mL的营养浓缩液继续批发酵,所述营养浓缩液包含氨基酸、糖和植物来源的蛋白胨。在第11天回收含促红细胞生成素的上清。
发现不含氨甲蝶呤进行培养更为优越,这是由于其显示出更好的糖基化模式。
实施例10-在生物反应器中用强化培养基生产促红细胞生成素
在5L的生物反应器中以Fed-Batch(Kamp 11 B5-1和2)模式培养CHO细胞系6C2。生物反应器1的操作如在实施例10(Kamp 4 B5-2)中所示。生物反应器2中应用的细胞培养基由补充以强化氨基酸的50∶50DMEM/HamsF12组成并含有0.325%的植物肽、0.1% lutrol、6.4g/L葡萄糖、2.5g/L NaHCO3、乙醇胺、柠檬酸铁、抗坏血酸、亚硒酸钠和0.6g/L磷酸盐。将细胞以约5×105细胞/mL接种到1250mL培养基中。pO2设定为50%空气饱和,温度为37℃。开始时的pH设为7.1。发酵过程中逐渐降至6.9。
培养过程中生物反应器2中的葡萄糖浓度保持在3到4g/L之间。2.5天后用新鲜培养基将反应液补充至5L。第6、7、8、9和10天后加入含氨基酸、糖和植物来源蛋白胨的强化营养浓缩液继续批发酵。在第11天回收含Epo的上清。
用营养强化的培养基(氨基酸、葡萄糖、植物蛋白胨和磷酸盐)以及pH从7.1到6.9移动的条件进行培养,发现可使最终的Epo浓度以相当的糖基化模式提高两倍以上。
实施例11-在不含动物来源组份的生物反应器中生产促红细胞生成素
在5-L的生物反应器中以Fed-Batch(Kamp 17 B5-1和3)模式培养CHO细胞系6C2。除非另外指出,所有参数的设定如实施例10(Kamp 4B5-2)中所示。在生物反应器2中,应用的细胞培养基不含任何的动物来源的组份。例如,通常源自动物(如鲑鱼或人毛发)的氨基酸:酪氨酸或半胱氨酸已由合成氨基酸替换。
2.5天后用新鲜培养基将反应液补充至5L。第5、6、7、8和9天后,加入含氨基酸、糖和植物来源蛋白胨的营养浓缩液继续批发酵。在第9到10天回收含促红细胞生成素的上清。
发现不含任何动物来源组份的培养基可产生相当的最终Epo浓度。但培养物生长较慢并需要加入额外的营养浓缩液。
实施例12-在生物反应器中以强化培养基(维生素、痕量元素)生产促红细胞生成素
在10L的生物反应器中以Fed-Batch(Kamp 12 C)模式培养CHO细胞系6C2。除以下的不同,生物反应器按实施例11(Kamp 11 B5-2)操作:
应用的细胞培养基由补充有强化氨基酸的50∶50 DMEM/HamsF12组成并包含0.325%的植物肽、0.1%lutrol、6.4g/L葡萄糖、2.5g/L NaHCO3、乙醇胺、柠檬酸铁、维生素、痕量元素、亚硒酸钠和0.6g/L磷酸盐。浓缩液中的浓度加倍并富含维生素。
将细胞以约5×105细胞/mL接种到4500mL的培养基中。pO2设为50%空气饱和,温度为37℃。起始的pH设为7.1。在发酵过程中逐渐降至6.9。
在培养过程中生物反应器中的葡萄糖浓度保持在3到4g/L之间。3天后用新鲜培养基将反应液补充至10L。第6、7、8、9、10、11和12天后加入强化的营养浓缩液继续批发酵。在第13天回收含促红细胞生成素的上清。
实施例13-Epo的分离
细胞分离
通过不连续饲料分批发酵无血清条件下培养的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)生产重组人促红细胞生成素。发酵(在2个不同生物反应器中的4xca.1+2批模式延伸阶段)后将具有约200-300mg/L rhEpo的回收发酵物冷却到2-8℃,且不经过中间的存储阶段即进行澄清,所述澄清首先通过圆盘层叠分离器离心随后通过深度过滤(Seitz Bio10或CunoA90M08,产量约300L/m2过滤面积)以及0.2μ过滤(PP Polygard 0.1μm,Sartobran P,Sartorius或Duropore 0.22μ,Millipore)。为避免高度细胞裂解以及随后的HCPs(宿主细胞蛋白质)的高产物污染,重要的是首先在最佳的时间点(主培养的约12天,氧消耗停滞)回收,其次是应用专门为脆弱的真核细胞设计的细胞分离设备,例如具有水气密入口的CSC6(6000m2 ECA,15500xg,约200L/h,Westfalia)或具有平缓圆盘入口和箭猪样出口的BTPX 250(11000m2 ECA,13000xg,300L/h,Alfa Laval)。对包括切向流动过滤和离心的不同分离技术进行比较揭示出细胞裂解中剪切力(通过胞内标志酶LDH的释放测定)的差异。离心为最温和的分离方法(<3U LDH/mg rhEpo)并成为优选。
最为备选,仅将以上描述的通过圆盘层叠分离器(不含深度过滤步骤)的离心用于细胞分离步骤。在另一备选中,应用以上描述的深度过滤步骤(不含离心步骤)。
通过阴离子交换(AEX)层析进行捕获
澄清后用约3倍体积的水稀释原始上清以使最终导电率达到小于或等于5mS/cm并用Tris碱将pH调至7.5,之后加到AEX-捕获树脂。
应用的AEX-柱子的床高度约10-20cm,充填以具有较好流动特性的QCeramic HyperD F(Biosepra)。柱子用20mM Tris pH7.5和50mM NaCl平衡。然后将稀释的细胞上清加样到(每mL树脂10-15mg rhEpo)柱子,流速为4-8cm/分钟并用10-15倍柱体积(CV)的平衡缓冲液洗涤柱子。通过改换到具更高电导率的缓冲液逐步洗脱产物,所述缓冲液为20mM Tris pH7.5,含150mM NaCl。收集峰级分且产量为约50-60%。
在一备选中,通过超滤浓缩级分池以减小中间体体积并使随后的沉淀条件标准化。优选地应用5到10kDa的截止膜并将靶产物浓度调整为约20mg/ml。
硫酸铵沉淀
来自先前步骤的捕获池通常应用2.4M(NH4)2SO4进行进一步的纯化以沉淀污染的宿主细胞蛋白质。在此硫酸铵浓度下的沉淀中不存在任何产物,留下纯化的无宿主细胞蛋白质(HCP)的上清,在随后的RPC纯化前所述上清必须经过稀释以使RPC中(NH4)2SO4<240mM。
向1倍体积的捕获池中加1.5倍体积的硫酸铵母液(4M(NH4)2SO4,20mM Tris pH7.5)进行沉淀,于10-15℃孵育30分钟并通过深度过滤(SeitzBio10或Cuno A90M08)和0.2μ过滤(Sartobran P,Sartorius或Duropore0.22μ,Millipore)分离沉淀。在高洗脱体积=稀释的rhEpo洗脱池(<5mgrhEpo/ml)的情形下,可通过任选的UF-浓缩步骤(10kDa截止)提高HCP沉淀。
硫酸铵沉淀的效率高于疏水交互作用层析。
为降低来自前面沉淀步骤中的硫酸铵含量,含产物的上清必须经过如上提及的稀释。备选是超滤/渗滤步骤。优选地应用5到10kDa截止的膜并将靶硫酸铵浓度调整为小于240mM以及产物浓度调整为约30mg/ml。应用至渗滤步骤中的缓冲液为20mM Tris/HCl pH7.0。
反相层析
下一纯化步骤为反相层析,可用于多个方面:a)可根据其糖骨架(高度糖基化/唾液酸化形式在较低糖基化/唾液酸化形式之前洗脱)很好地分离不同的同种型,b)通过此高效层析移除残余的宿主细胞蛋白质,以及c)该层析对于移除病毒以及对于通过有机溶剂灭活病毒是一有力的步骤。Source30RPC(Amersham Biosciences)为聚合树脂,其能够a)在中等压力(<10巴)下运行,以及b)通过高浓度NaOH进行灭菌处理。优选的床高度在10至15cm之间,推荐的上样范围为8-12mg rhEpo/ml填充树脂。
在反相层析(RPC)步骤之前,需将含产物的上清中硫酸铵的终浓度调整为小于0.24M。该条件可通过进行以下步骤实现,a)通过随后的直接稀释步骤(在RPC上样时用1体积的rhEpo上清+4体积的20mM Tris/HClpH7.0+5体积的50%(v/v)的CAN在20mM Tris/HClpH7.0,或为了免用昂贵的有机溶剂优选地在上样步骤前再次对20mM Tris/HCl pH7.0进行渗滤/浓缩(10kDa截止的UF)。之前柱子已进行平衡并在上样后用溶于20mM Tris pH7.0中的25%(v/v)乙腈(ACN)洗涤。用从25%到50%ACN的线性梯度洗脱产物,以小级分(特别是约0.2CV,备选地,约0.3-0.5CV)收集在预先用4体积稀释缓冲液(50mM Tris pH 7.0)预填充的容器内,以立即降低可诱导聚合并影响随后AEX层析的溶剂浓度。收集约头半个洗脱峰的级分作为RPC池,用于进一步的处理。该池包含有利的高度糖基化的同种型。通过此级分方法,在细胞培养基中水平接近20%的126位Ser缺失O-多糖的脱-O-糖基化的rhEpo产物得以移除。
在一备选方法中,为通过暴露于有机溶剂而诱导病毒灭活,将级分再充填0.5倍体积的20mM Tris pH7.0,而不是如以上描述的4倍体积的同一缓冲液,并孵育20-40分钟或更长。此孵育步骤后,另加入与原始未稀释级分体积对应的3.5倍体积的20mM Tris pH7.0,并因此终止病毒灭活。
收集进行或未进行病毒灭活的级分用于进一步的纯化。通常在50-100%最高OD的升点处开始并于级分为大于约70-80%最高OD的降点处结束。更早洗脱的级分可能包含宿主细胞蛋白质,而较后洗脱的级分包含较少唾液酸化、较低活性的同种型。可另外进行CZE分析以支持对特定同种型的收集。
阴离子交换层析
然后将稀释的RPC池上样至高效AEX柱子,所述柱子可再次有助于筛选特定同种型并移除宿主蛋白质。此次根据等电点分离同种型,即根据与糖基化程度成比例的唾液酸的数目。应用高效树脂Q-SepharoseHP(Amersham Biosciences),所述树脂具有卓越的分离效率。床高度在15至20cm之间。确定所有条件如装载、梯度和床高度以保持相当低的产物浓度,否则由于溶剂诱导的产物聚合可在洗脱过程中导致明显的后峰。
在20mM Tris pH7.0预平衡的Q Sepharose HP上将RPC池装载2-4mg Epo/mL树脂。在平衡缓冲液的洗涤步骤后,产物以10CV、在平衡缓冲液中的从0到300mM NaCl线性盐梯度洗脱。以0.1CV或0.25Cv级分收集洗脱峰并通过CZE分析待分析池以发现含所需促红细胞生成素同种型的正确级分池。AEX池通常由洗脱峰的后半部分组成,该部分级分洗脱有高度糖基化和唾液酸化的同种型。
通过应用毛细管区带电泳(CZE)作为程序进行中的控制,甚至当由于不同的发酵条件或宿主细胞使得来源物中仅含有少数高度唾液酸化异构体时,它也可产生精确定义的促红细胞生成素同种型混合物。
CZE是能够分离带不同电荷同种型的高分辨方法。该方法对每个级分中的每一单个同种型给出定量结果。该信息使得能够收集特定级分并导致批发酵之间保持一致的同种型特征。一般通过仅收集较后洗脱级分可去除较早洗脱的低唾液酸化同种型。
大小排阻层析
在最后的层析步骤中,通过可移除潜在二聚体和多聚体的大小排阻对AEX池进行加工,并进行改变缓冲液用于最终的制剂。用于此步骤的制备级Superdex75(Pharmacia)甚至在高达15%柱体积的较高上样体积时也具有高分辨率。床高度优选地在60至80cm之间。
由于不可能以前一步骤中获得AEX池中高产度浓度的方式进行AEX层析,因此必须在凝胶过滤前浓缩该池。浓缩通过超滤步骤进行,所述超滤步骤应用10kDa UF-膜,并导致UF-保留物的浓度提高约10倍,即每mL中约10mg促红细胞生成素。
约3-7 CV%的UF-保留物直接上样至20mM磷酸钠pH7.0,75mMNaCl预平衡的Superdex75 pg柱子。约1-1.5 CV后产物开始从柱子洗脱并收集洗脱峰以产生SEC-池。
纳米过滤
为移除潜在的病毒载量,另外进行一个终末的病毒过滤步骤。应用设计为可移除如15nm小颗粒的特殊膜进行该过滤步骤,所述膜如Planova15N(Asahi)。备选的终末纳米过滤单元为PALL Ultipor VF Grade DV20或MilliporeViresolve NFP盒或囊。特别对于小的无包膜病毒如细小病毒来说,几乎没有其它的移除或灭活病毒的工具。
无菌的经过滤的SEC-池通过终末的具有适宜膜的滤器且滤液代表最终的散装药物物质。备选地,可在UF-浓缩和大小排阻层析之间插入纳米过滤。
以上说明中提及的所有出版物在此引用作为参考。本领域内的技术人员将会明晓,本发明所描述的方法和系统的多种改变和变更并不背离本发明的范围和精神。尽管本发明的描述与特定的优选实施方案相关联,但应当理解所要求权利的本发明不应过度限制于此类特定实施方案。实际上,分子生物学或相关领域内的技术人员所熟知的那些进行本发明描述模式的多种变更包括在以下权利要求的范围之内。
表1:重组CHO细胞:用Epo/neo和Epo/dhfr进行转染
T25转染
转染 | 每个T25中的克隆数 | Qp,9.6×10-8M MTX[μg/106个细胞/天] |
09/T25/1(50∶1) | 136 | 0.16 |
09/T25/2(50∶1) | 107 | 2.6 |
09/T25/3(5∶1) | 459 | 0.14 |
09/T25/4(5∶1) | 648 | 0.9 |
96孔转染
转染 | 每一平板的克隆数 | 经筛选的克隆 |
09/96/1(50∶1) | 47 | 1F5 |
09/96/2(50∶1) | 46 | |
09/96/3(50∶1) | 50 | 5D5,3H5 |
09/96/4(50∶1) | 52 | |
09/96/5(50∶1) | 49 | 5D4,5H4 |
09/96/6(5∶1) | 416 | 6C5 |
09/96/7(5∶1) | 556 | 7E9 |
09/96/8(5∶1) | 392 | |
09/96/9(5∶1) | 427 | |
09/96/10(5∶1) | 352 | |
09/96/11(75∶1) | 49 | |
09/96/12(75∶1) | 60 | 12A9 |
不同克隆的扩增
克隆 | Qp[μg/10个细胞/天] | ||
9.6×10-8M MTX | 1.9×10-7M MTX | 3.8×10-7M MTX | |
09/96/1F5 | 11 | 11.4 | 17.1 |
09/96/3D5 | 8.4 | 14.4 | 11.4 |
09/96/3H5 | 8.2 | 14.1 | 12.9 |
09/96/5D4 | 4.9 | 3.8 | 3.6 |
09/96/5H1 | 4.7 | 7.1 | 6.7 |
09/96/6C5 | 4.2 | 3.8 | 3.6 |
09/96/7E9 | 5.5 | 8.8 | 8.9 |
09/96/12A9 | 6 |
表2:细胞池3D5的亚克隆条件和铺板效率(用0.38μM MTX)
96孔板的编号 | 接种细胞的数目/孔 | %生长孔 | %单克隆 |
25(编号6-30) | 10 | 3% | 77% |
5(编号1-5) | 20 | 24% | 54% |
表3:亚克隆3D5/1H9和3D5/18E5的亚克隆条件和铺板效率(1.54M MTX)3D5/1H9
96孔板编号 接种细胞的数目/孔 %生长孔 %单克隆
8(编号9-16) 10 6.4% 85%
8(编号1-8) 30 19% 46%
3D5/18E5
96孔板编号 接种细胞的数目/孔 %生长孔 %单克隆
8(编号9-16) 4 15% 56%
8(编号1-8) 8 29% 44%
表4:重组CHO克隆的比生产率和比生长特性
4C2 6C2 6D4 15B4 7A6 15C3 | |
接种细胞数[×105个细胞/ml]最终细胞数[×105个细胞/ml]比生长速率μ[天-1] | 2.17 2.67 2.89 0.71 2.38 2.167.27 9.35 8.8 2.61 6.41 6.150.4 0.42 0.37 0.43 0.33 0.35 |
Claims (32)
1.用于产生表达目的重组多肽的经转化真核宿主细胞的方法,该方法包括将下列载体导入真核宿主细胞:
(a)第一多核苷酸载体,其包含(i)编码目的重组多肽的第一核苷酸序列,以及(ii)编码选择性标记的第二核苷酸序列,其中当宿主细胞与选择性试剂接触时所述第二核苷酸序列被扩增,以及
(b)第二多核苷酸载体,其具有的核苷酸序列与第一多核苷酸载体基本相同,不同之处在于将第二核苷酸序列替换为编码不同选择性标记的第三核苷酸序列;
第一多核苷酸载体和第二多核苷酸载体被整合入宿主细胞的基因组中。
2.权利要求1的方法,其中将第一和第二多核苷酸载体同时导入宿主细胞。
3.权利要求1的方法,其中第二核苷酸序列编码二氢叶酸还原酶多肽且选择性试剂为氨甲蝶呤。
4.权利要求1的方法,其中目的重组多肽为人促红细胞生成素。
5.权利要求1的方法,其中第三核苷酸序列编码对抗生素的抗性。
6.权利要求5的方法,其中抗生素为G-418、新霉素或新霉素组的不同抗生素。
7.权利要求1的方法,其中宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
8.用于产生表达人促红细胞生成素的经转化真核宿主细胞的方法,该方法包括将下列载体导入CHO宿主细胞:
(a)第一多核苷酸载体,其包含(i)编码人促红细胞生成素的第一核苷酸序列,以及(ii)编码二氢叶酸还原酶的第二核苷酸序列;以及
(b)第二多核苷酸载体,其具有的核苷酸序列与第一多核苷酸载体基本相同,不同之处在于将编码二氢叶酸还原酶的核苷酸序列替换为编码氨基糖苷磷酸转移酶的第三核苷酸序列,所述氨基糖苷磷酸转移酶赋予对G-418、新霉素或新霉素组的不同抗生素的抗性;
第一多核苷酸载体和第二多核苷酸载体被整合入宿主细胞的基因组中。
9.权利要求8的方法,其中第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列可操作地与SV40早期启动子连接。
10.权利要求8的方法,其中第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列可操作地与编码SV40大T多聚腺苷酸化信号的核苷酸序列连接。
11.产生目的重组多肽的方法,该方法包括在允许第一核苷酸序列表达的条件下培养由权利要求1的方法产生的经转化宿主细胞。
12.权利要求11的方法,其中在引起第二核苷酸序列扩增的选择性试剂存在下培养所述宿主细胞。
13.权利要求12的方法,其中第二核苷酸序列编码二氢叶酸还原酶多肽且选择性试剂为氨甲蝶呤。
14.权利要求11的方法,其中目的重组多肽为促红细胞生成素。
15.权利要求11的方法,其中表达的目的重组多肽分泌到培养基中。
16.权利要求15的方法,其进一步包括从培养基中回收表达的目的重组多肽。
17.权利要求16的方法,其中目的重组多肽为促红细胞生成素。
18.经转化的真核宿主细胞,其包含整合入其一条或多条染色体中的下列载体:
(a)第一多核苷酸载体,其包含(i)编码目的重组多肽的第一核苷酸序列;以及(ii)第二核苷酸序列,其中当该第二核苷酸序列整合入宿主细胞基因组,在宿主细胞与引起该核苷酸序列扩增的选择性试剂接触时,该第二核苷酸序列被扩增,以及
(b)第二多核苷酸载体,其具有的核苷酸序列与第一多核苷酸载体基本相同,不同之处在于将第二核苷酸序列替换为编码不同选择性标记的第三核苷酸序列。
19.权利要求18的宿主细胞,其中第二核苷酸序列编码二氢叶酸还原酶多肽。
20.权利要求18的宿主细胞,其中目的重组多肽为促红细胞生成素。
21.权利要求18的宿主细胞,其为CHO细胞。
22.经转化的哺乳动物宿主细胞,其包含稳定整合入其一条或多条染色体中的下列多核苷酸序列:(a)编码二氢叶酸还原酶多肽和促红细胞生成素的多核苷酸序列,以及(b)与(a)的多核苷酸序列不同且编码促红细胞生成素和编码赋予抗生素抗性的多肽的多核苷酸序列。
23.权利要求22的宿主细胞,其中抗生素为G-418、新霉素或新霉素组中的不同抗生素。
24.权利要求22的宿主细胞,其为CHO细胞。
25.用于产生重组人促红细胞生成素的方法,该方法包括在允许编码人促红细胞生成素的多核苷酸序列表达的条件下培养根据权利要求22的宿主细胞。
26.权利要求25的方法,其中在氨甲蝶呤存在下培养宿主细胞。
27.权利要求25的方法,其中表达的目的重组多肽分泌到培养基中。
28.权利要求27的方法,其进一步包括从培养基中回收表达的目的重组多肽。
29.组合物,其包含
(a)第一多核苷酸载体,其包含(i)编码目的重组多肽的第一核苷酸序列,以及(ii)第二核苷酸序列,其中当该第二核苷酸序列整合入宿主细胞基因组,在宿主细胞与引起该核苷酸序列扩增的选择性试剂接触时,该第二核苷酸序列被扩增,以及
(b)第二多核苷酸载体,其具有的核苷酸序列与第一多核苷酸载体基本相同,不同之处在于将第二核苷酸序列替换为编码不同选择性标记的第三核苷酸序列。
30.权利要求29的组合物,其中目的重组多肽为人促红细胞生成素。
31.权利要求29的组合物,其中第二核苷酸序列编码二氢叶酸还原酶。
32.权利要求29的组合物,其中第三核苷酸序列编码新霉素磷酸转移酶。
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