KR20040063937A

KR20040063937A - 재조합 폴리펩티드의 생산 방법

Info

Publication number: KR20040063937A
Application number: KR10-2004-7008030A
Authority: KR
Inventors: 도르퍼 쿠르트 쇠르겐; 외르크 빈디쉬; 레나테 쿠네르트; 플로리안 운테르루가우어
Original assignee: 산도즈 게엠베하
Priority date: 2001-11-28
Filing date: 2002-11-26
Publication date: 2004-07-14
Also published as: CA2468832A1; HRP20040477A2; WO2003046187A1; PL370550A1; AU2002358047A1; RU2004119814A; US20050084969A1; HUP0500059A2; EP1453966B1; NO20042173L; NZ533133A; MXPA04005191A; CN1596310A; BR0214489A; IL161909A0; EP1453966A1; ZA200403802B; JP2005510242A; SI1453966T1; JP4723185B2

Abstract

본 발명은 진핵 숙주 세포에 (a) (i) 목적 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 선별가능 마커를 코딩하며, 숙주 세포가 선별제와 접촉할 때 증폭되는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터; 및 (b) 제2 뉴클레오티드 서열이 다른 선별가능 마커를 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열로 치환된 것을 제외하고는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터와 본질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 폴리뉴클레오티드 벡터를 도입하는 것을 포함하며, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 벡터와 제2 폴리뉴클레오티드 벡터가 숙주 세포의 게놈 내에 안정하게 통합되는 것인, 목적 재조합 폴리펩티드를 발현하는 형질전환 진핵 숙주 세포의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 폴리펩티드의 생산 방법 {Method for Producing a Recombinant Polypeptide}

적혈구의 생성은 주로 하나의 당단백질 호르몬인 에리트로포이에틴 (Epo)에 의해 조절되며, Epo는 1977년에 발견되었다. 그 당시, Epo의 단리 및 정제는 출발 물질인 재생 불량성 빈혈 환자의 소변이 비교적 소량이기 때문에 어려웠다. ㎍ 이하의 정제된 호르몬 양만이 연구를 위해 입수가능하였다.

제1 정제 방법은 친화도 컬럼에서 아가로스에 고정된 렉틴을 이용하여 1970년대 후반에 수행되었다. 맥아 및 식물 적혈구 응집소 결합 에리트로포이에틴, 및 조 뇨 제제는 Epo에 대해 100배까지 풍부화될 수 있다.

1980년대 초반까지, 인간 에리트로포이에틴의 DNA-서열이 서열분석 및 클로닝되었다. 에리트로포이에틴은 분자량이 대략 30 내지 34 kDa인 단일쇄 당단백질이다. 에리트로포이에틴은 각각 Cys 7과 Cys 161 및 Cys 29와 Cys 33 사이에 2개의 쇄내 이황결합을 형성하는 4개의 시스테이닐 잔기를 함유하고 있다. Cys 7과 Cys 161 사이의 이황결합은 생물학적 활성에 중요한 것으로 나타났다. 에리트로포이에틴은 고도로 글리코실화되어 있다. 즉, 분자 질량의 약 35 내지 40％가 탄수화물로 구성되어 있다. 탄수화물의 양은 뇨 제제 사이에서 달라질 수 있고, 따라서 이러한 불균질성은 신장에 의한 분비 직후의 상태를 반영하는 것이 아니라 뇨로부터 제제화된 후의 Epo 분자를 반영한다. 즉, 이는 사용된 제제화 방법에 의해 영향받는다. 에리트로포이에틴의 순환중인 혈장 형태(들)의 올리고당 구조는, 이들 형태가 단리되지 않았기 때문에 결정되지 않았다. 에리트로포이에틴은 N-글리코실화 부위를 제공하는 4개의 아스파라긴 (Asn 38, Asn 24 및 Asn 83) 및 O-결합 글리코실화를 위한 1개의 세린 (Ser 129)을 가지고 있다.

재조합 인간 에리트로포이에틴 (rhEpo)은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포 및 HeLa 세포를 비롯한 다수의 포유동물 시스템에서 발현되었다. 이들 상이한 세포형에서 발현된 rhEpo의 글리코실화 패턴은 다르다 (문헌 [Takeuchi and Kobata, 1991, Glycobiology 1(4): 337-346]에서 고찰됨). rhEpo의 상업적 생산은, 생체내에서 활성이 높은 단백질의 다량 발현을 필요로 한다. 발현량을 증가시키기 위한 한가지 기술은 인간 Epo 유전자 뿐만 아니라 디히드로폴레이트 환원효소 (dhfr) 유전자를 함유하는 벡터를 dhfr 결핍 CHO 세포에 형질감염시키는 것이다 (Lee et al., 1999, J. Biotech 69: 85-93). 메토트렉세이트 (MTX)를 배양 배지에 첨가하면 dhfr 유전자가 증폭되고, 따라서 이와 연결된 Epo 유전자도 증폭된다.

<발명의 개요>

본 발명은 인간 에리트로포이에틴과 같은 재조합 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포주를 제조하는 개선된 방법을 제공한다. 숙주 세포에서 rhEpo와 같은 재조합 폴리펩티드의 발현을 유도하는 발현 카세트를 함유하는 2개의 벡터 (한 벡터는 dhfr과 같은 선별제에 반응하여 증폭되는 유전자를 함유하고, 다른 벡터는 네오마이신 내성 유전자와 같은 선별가능 마커를 함유하며, 이들 벡터는 다른 부분에 있어 본질적으로 동일함)를 숙주 세포에 도입하면, 재조합 폴리펩티드의 발현에 대해 바람직한 성질을 나타내는 숙주 세포의 생성 및 선별이 가능해진다는 것이 밝혀졌다.

따라서 제1 측면에서, 본 발명은 진핵 숙주 세포에

(a) (i) 목적 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 선별가능 마커를 코딩하며, 숙주 세포가 선별제와 접촉할 때 증폭되는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터; 및

(b) 제2 뉴클레오티드 서열이 다른 선별가능 마커를 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열로 치환된 것을 제외하고는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터와 본질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 폴리뉴클레오티드 벡터

를 도입하는 것을 포함하며, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 벡터와 제2 폴리뉴클레오티드 벡터가 숙주 세포의 게놈 내에 통합되는 것인, 목적 재조합 폴리펩티드를 발현하는 형질전환 진핵 숙주 세포의 제조 방법을 제공한다.

유리하고 바람직하게, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 벡터는 숙주 세포 내에동시에 도입된다. 별법으로, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 벡터는 숙주 세포 내에 연속적으로 도입된다.

바람직하게는 숙주 세포가 포유동물 세포이고, 보다 바람직하게는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.

선별제는, 숙주 세포가 그러한 선별제와 접촉할 때 제2 뉴클레오티드 서열의 증폭을 유발할 수 있는 임의의 화합물 또는 조성물일 수 있다. 바람직하게는, 제2 뉴클레오티드 서열이 디히드로폴레이트 환원효소 폴리펩티드를 코딩하며, 선별제가 메토트렉세이트이다. 바람직하게는, 목적 폴리펩티드가 인간 에리트로포이에틴이다.

통상적으로, 제3 뉴클레오티드 서열은 G-418 또는 네오마이신과 같은 항생물질에 대한 내성을 코딩한다 (즉, 제3 뉴클레오티드 서열은 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 코딩한다). 당업자에게 분명한 바와 같이, 네오마이신 군의 다른 항생물질을 사용할 수도 있다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명은 CHO 숙주 세포에

(a) (i) 인간 에리트로포이에틴을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 디히드로폴레이트 환원효소를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터; 및

(b) 디히드로폴레이트 환원효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이, G-418, 네오마이신, 또는 네오마이신 군의 다른 항생물질에 대한 내성을 부여하는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열로 치환된 것을 제외하고는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터와 본질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 폴리뉴클레오티드 벡터

를 도입하는 것을 포함하며, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 벡터와 제2 폴리뉴클레오티드 벡터가 숙주 세포의 게놈 내에 통합되는 것인, 인간 에리트로포이에틴을 발현하는 형질전환 진핵 숙주 세포의 제조 방법을 제공한다.

바람직하게는, 본원에 개시된 본 발명의 모든 방법에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제2 뉴클레오티드 서열 및 제3 뉴클레오티드 서열은 강력한 프로모터 (통상적으로, SV40 초기 프로모터와 같은 바이러스 프로모터)에 작동가능하게 연결되어 있다. 바람직하게는, 상기 3가지 뉴클레오티드 서열 각각이 독립적으로 그러한 강력한 프로모터 (바람직하게는 SV40 초기 프로모터)에 작동가능하게 연결되어 있다. 그러나, 각각의 폴리시스트론성 (polycistronic) 발현 단위를 이용하는 것도 가능하다.

마찬가지로 바람직하게는, 본원에 개시된 본 발명의 모든 방법에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제2 뉴클레오티드 서열 및 제3 뉴클레오티드 서열은 전사 종결 조절 서열과 같은 추가의 조절 성분에 작동가능하게 연결되어 있다. 바람직한 그의 실시양태에서, 그러한 조절 성분은 SV40 거대 (large) T 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 서열이다. 바람직하게는, 그러한 SV40 거대 T 폴리아데닐화 신호 서열이 공지의 자연 발생 개재 서열을 포함한다.

본 발명의 제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 방법에 의해 제조가능한 진핵 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는, 숙주 세포에 의해 발현된목적 재조합 폴리펩티드가 에리트로포이에틴 (통상적으로, hEpo)이다. 바람직하게는 숙주 세포가 포유동물 세포이고, 보다 바람직하게는 CHO 세포이다.

제3 측면에서, 본 발명은

를 하나 이상의 염색체 내에 통합시켜 포함하는 형질전환 진핵 숙주 세포를 제공한다.

바람직하게는, 숙주 세포에 의해 발현된 목적 재조합 폴리펩티드가 에리트로포이에틴 (통상적으로, hEpo)이다. 바람직하게는 숙주 세포가 포유동물 세포이고, 보다 바람직하게는 CHO 세포이다.

바람직한 실시양태에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 디히드로폴레이트 환원효소 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직하게는, 목적 재조합 폴리펩티드가 에리트로포이에틴 (통상적으로, hEpo)이다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명은

(a) 디히드로폴레이트 환원효소 폴리펩티드 및 에리트로포이에틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및

(b) 상기 (a)의 폴리뉴클레오티드 서열과 다르며 에리트로포이에틴 및 항생물질에 대한 내성 부여 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열

을 하나 이상의 염색체 내에 통합시켜 (특히, 안정하게 통합시켜) 포함하는 포유동물 숙주 세포를 제공한다.

바람직하게는, 숙주 세포가 CHO 세포이다. 바람직하게는, 항생물질이 G-418, 네오마이신, 또는 네오마이신 군의 다른 (그러나 유사한) 항생물질이다.

제4 측면에서 본 발명은, 본 발명의 제2 또는 제3 측면에 따른 숙주 세포를 제2 뉴클레오티드 서열이 발현되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 목적 재조합 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다. 통상적으로, 숙주 세포는 또한 제1 뉴클레오티드 서열의 증폭을 유발하는 선별제의 존재 하에 배양된다. 바람직하게는, 제2 뉴클레오티드 서열이 디히드로폴레이트 환원효소 폴리펩티드를 코딩하고, 선별제가 메토트렉세이트이다.

바람직한 실시양태에서, 목적 재조합 폴리펩티드는 인간 Epo이다.

바람직하게는, 제조합 폴리펩티드가 배양 배지 내로 분비된다. 통상적으로, 상기 방법은 발현된 목적 재조합 폴리펩티드를 배양 배지로부터 회수하는 것을 더 포함한다. 그러나 별법으로 또는 부가적으로, 재조합 폴리펩티드는 형질전환 숙주 세포로부터 회수될 수도 있다.

또한, 본원에는 본 발명 제4 측면의 방법에 의해 제조된 글리코실화 재조합 인간 에리트로포이에틴을 포함하는 조성물이 기재되어 있다.

제5 측면에서, 본 발명은

(a) (i) 목적 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 선별가능 마커를 코딩하며, 숙주 세포가 뉴클레오티드 서열의 증폭을 유발할 수 있는 선별제와 접촉할 때 증폭되는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터; 및

를 포함하는 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 목적 재조합 폴리펩티드가 인간 에리트로포이에틴이다. 바람직하게는, 제2 뉴클레오티드 서열이 디히드로폴레이트 환원효소를 코딩한다. 바람직하게는, 제3 뉴클레오티드 서열이 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 코딩한다.

또한, 본 발명은 목적 재조합 폴리펩티드를 발현하는 진핵 숙주 세포를 제조하는 방법에 있어서의 상기 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명에 있어서, 본원에 기재된 바람직하거나 구체적인 실시양태를 서로 조합함으로써, 그의 바람직한 추가 실시양태를 형성할 수 있다.

본 발명은 인간 에리트로포에이틴 (erythropoietin)과 같은 재조합 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포의 제조 방법, 및 그러한 폴리펩티드의 생산 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 다양한 선별 마커를 포함하는 2-벡터 발현 시스템, 및 그러한 시스템의 이용 방법에 관한 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업계 (예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 혼성화 기술 및 생화학 분야) 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하는 동일한 의미를 갖는다. 분자적, 유전학적 및 생화학적 방법 (일반적으로 문헌 [Sambrooket al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2^nded. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 및 [Ausubelet al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4^thEd, John Wiley ＆ Sons, Inc.]와 표제 "Current Protocols in Molecular Biology"의 완전판을 참조할 수 있으며, 이들 문헌은 본원에 참고로 포함된 것으로 간주함), 및 화학적 방법에 사용되는 표준 기술을 이용하였다.

정의

본원에서 언급한 진핵 숙주 세포는 진핵 세포 기원 (1차 배양 세포든 확립 세포든 무관함)의 무한증식 세포 중 임의의 세포일 수 있으며, 이는 이종 폴리펩티드의 발현을 위해 개조될 수 있다. 따라서, 상기 용어는 가장 넓은 의미로서 1차 배양 세포, 기관 배양된 조직 및 기관, 조직 이식체, 전체 생물체, 및 확립된 세포주를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 용어는 확립된 세포주로부터 유래한 배양액 중의 세포, 예를 들어 CHO, BHK, COS 및 HeLa 세포를 나타낸다.

본원에서 언급한 발현은, 통상적으로 서열의 전사/번역에 의한 핵산 코딩 서열로부터의 폴리펩티드 산물 제조이다. 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포로부터 분비될 수도, 또는 숙주 세포 내에 축적될 수도 있으며, 바람직하게는 본 발명에 따른 발현은 세포로부터의 폴리펩티드 분비를 포함한다. 발현량은 달라질 수 있으나, 발현량이 높은 것이 유리하며, 세포에 의해 제조된 전체 단백질의 약 1％, 바람직하게는 10％, 25％ 또는 50％, 또는 심지어 이보다 높은 비율이 목적 폴리펩티드의 발현물일 수 있다.

"재조합 폴리펩티드"는 재조합 핵산 기술에 의한 생산이 요망되는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 단량체가 아미노산이며 펩티드 결합이나 이황결합에 의해 서로 결합되어 있는 중합체를 나타낸다. 폴리펩티드는 전장의 자연 발생 아미노산 쇄, 또는 목적하는 폴리펩티드 중의 선택된 영역과 같은 "그의 단편" 또는 "펩티드"를 나타내거나; 또는 아미노산 중합체, 또는 일부분이나 전부가 자연 발생의 것이 아닌 그의 단편 또는 펩티드를 나타낸다. 따라서, "그의 단편"은 전장 폴리펩티드의 일부인 아미노산 서열을 나타내며, 그 아미노산 길이는 약 8개 내지 약 500개, 바람직하게는 약 8개 내지 약 300개, 보다 바람직하게는 약 8개 내지 약 200개, 보다 더 바람직하게는 약 10개 내지 약 50개 또는 100개이다. 폴리펩티드가 Epo인 경우, 그의 단편은 유리하게는 아미노산 길이가 약 8개 내지 약 150개, 바람직하게는 약 15개, 20개 또는 30개 내지 약 50개, 100개 또는 130개이다. "펩티드"는 아미노산 길이가 10개 내지 40개, 바람직하게는 10개 내지 35개인 짧은 아미노산 서열을 나타낸다. 부가적으로, β-알라닌, 페닐 글리신 및 호모아르기닌과 같은 비천연 아미노산도 포함될 수 있다. 유전자에 의해 코딩되는 것이 아닌 통상적인 아미노산도 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명에 사용되는 모든 아미노산은 D- 또는 L-광학 이성질체 중 어느 하나일 수 있다. L-이성질체가 바람직하다. 또한, 다른 펩티드 모방체 (peptidomimetic)도, 예를 들어 본 발명 폴리펩티드의 링커 서열로 유용하다 (문헌 [Spatola, 1983,inChemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein, ed., Marcel Dekker, New York, p. 267] 참조).

적합한 재조합 폴리펩티드로는 Epo와 같은 제약 목적의 단백질; 인자 VIII 및 인자 IX와 같은 응고 인자; 히루딘과 같은 응고제; 인슐린, 인간 및 동물 성장 호르몬, 여포 자극 호르몬, 황체 호르몬을 비롯한 호르몬; 항체 및 기타 면역글로불린, 알파-글로빈, 베타-글로빈, 감마-글로빈, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자, 인터루킨, 대식세포 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, 비만 세포 성장 인자, 종양 억제 인자 p53, 망막모세포종, 인터페론, 흑색종 관련 항원 또는 B7과 같은 기타 치료 단백질; 및 발현이 특히 다량으로 요망되는 임의의 기타 단백질들이 있다.

"폴리뉴클레오티드 벡터"는 핵산 코딩 서열을 세포의 게놈에 전달하여 이것이 게놈 내에 통합되도록 하기 위해 사용될 수 있는 핵산 벡터이다. 숙주 세포 게놈 내로의 통합은 숙주 세포의 안정한 형질전환 (통상적으로 에피좀 벡터의 유지와 관련된 일시적 형질전환과 대비됨)을 초래하며, "안정한 통합"이라 언급될 수도 있다. 하기 보다 상세히 기재될 폴리뉴클레오티드 벡터는 플라스미드, 감염제 (바이러스, 바이러스-유사 입자, 바이러스 핵산), 코스미드, 파지미드, 트랜스포손, 패키징된 DNA, 또는 세포로의 전달에 적합한 임의 형태의 핵산일 수 있다. 통상적으로, 플라스미드는 사용상의 용이성, 당업계에서의 친숙함, 및 바이러스와 같은 감염제에 요구되는 조절 강제성으로부터의 자유로움으로 인하여 사용된다. "통합" 또는 "안정한 통합"은 벡터의 핵산 서열 중 적어도 일부를 숙주 세포의 게놈 내에 통합시키거나, 이를 인공 염색체 중에 유지시키는 것을 나타내며, 적어도 제1 및 제2/제3 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포의 게놈 내에 통합되는 것이 바람직하다.유리하게는, 벡터의 전체 서열이 숙주 세포의 게놈 내에 통합된다.

본원에서 "형질전환"은 유전자 물질을 세포에 도입시켜 세포 내에서 상기 유전자 물질이 발현되도록 하는 것을 나타내며, 이를 "형질전환된" 것이라고 칭한다. 의구심을 없애기 위해, "형질전환"은 종양유전자 또는 종양유전자성 바이러스 등에 의해 세포가 무한증식화 되는 것을 나타내지는 않는다.

"증폭"은 선별 압력에 반응하여 코딩 서열의 카피수가 증가하는 것을 나타낸다. 따라서, 당업계에는 MTX를 사용한 선별에 반응하여 이종 dhfr 유전자가 증폭되어, 이들이 통합된 숙주 세포 게놈의 좌위에서 카피수가 증가함이 공지되어 있다. dhfr 유전자에 연결된 서열들 (즉, 물리적으로 인접한 서열들)도 dhfr 유전자와 함께 증폭된다. 이는 목적 서열의 카피수 증가를 초래하며, 이에 의해 코딩된 유전자 산물의 발현이 증가한다.

"선별제"는 통상적으로, 선별제의 효과를 완화시켜주는 특정 유전자 산물이 세포 내에 존재하지 않으면 세포가 스트레스를 받거나 기타 경쟁적으로 불리한 상황에 놓이게 하는 물질이다. 따라서, 메토트렉세이트는 세포에 대해 독성이지만, dhfr 유전자의 유전자 산물인 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR)에 의해 중화된다. 통상적으로 증폭가능한 시스템으로는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR)-메토트렉세이트 (MTX), 박테리아 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 효소 (미코페놀산에 대한 내성을 매개함), 및 정상적으로 기능하는 유전자의 존재 하에서의 증폭 (예를 들어, 메티오닌 술폭시민[MSX] 존재 하의 증폭성 글루타민 신테타제)가 있다. 그러한 시스템은 동족 물질에 의해 가해지는 선별 압력에 반응하여 핵산 그자체가 증폭된다는 점에서 그 자체로 증폭가능하다.

그 자체로 증폭가능한 것으로 간주되지 않는 시스템으로는, 예를 들어 앰피실린 또는 G-418/네오마이신과 같은 항생물질에 대한 내성을 부여하는 유전자 산물을 코딩하는 항생 물질 내성 유전자가 있다.

본 발명에 따른 벡터는 선별가능 마커와 떨어져 있는 유사한 서열을 가지고 있다. 제1 선별가능 마커는 증폭가능한 유전자이고, 제2 마커는 증폭가능한 것일 필요는 없다. 본원에 사용된 "본질적으로 동일한"은 선별가능 마커 서열을 제외하고는 벡터의 서열이 동일하거나 거의 동일한 것을 의미한다. 사실상, 2개의 벡터는 통상적으로 동일한 출발 벡터에 기초하며, 이중에서 선별가능 마커 유전자가 치환된 것이다. 따라서, 나머지 서열은 유발 가능한 임의의 자발적 변이를 제외하고는 동일할 것이다. 유리하게는, 각각의 조절 영역을 비롯한 마커 유전자를 제외한 서열은 85％가 넘게 동일하고, 유리하게는 90％가 넘게 동일하며, 바람직하게는 95％, 98％, 99％ 이상 동일하거나, 또는 심지어 완전히 동일하다.

A. 폴리뉴클레오티드 벡터

숙주 세포를 제조하기 위한 본 발명의 방법은, 한 벡터는 숙주 세포의 염색체에 통합시 선별에 반응하여 증폭되는 유전자를 코딩하는 서열을 포함하고, 다른 벡터는 항생물질 내성 유전자와 같은 다른 선별가능 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다는 점에서 본질적으로 다른 2개의 실질적으로 동일한 벡터를 도입하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 제2 선별가능 마커가 그 자체로 증폭가능한 것이 아니다.

통상적으로 환형 플라스미드인 벡터 (이는 선형일 수도 있음)는 일반적으로 DNA 분자이다. 용이하게는 벡터가 원핵 세포의 복제 기점을 포함하여 이. 콜라이 (E. coli)와 같은 박테리아 세포에서의 증식이 가능할 수 있다.

제1 벡터는 본질적으로 진핵 숙주 세포 (통상적으로, 포유동물 세포)에서 Epo와 같은 목적 재조합 폴리펩티드 (POI)의 발현을 유도할 수 있는 발현 카세트인 제1 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 제1 발현 카세트는 숙주 세포에 의해 코딩 서열을 발현시킬 수 있는 조절 서열과 작동가능하게 연결된 POI의 실제 코딩 서열을 포함한다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 기재된 성분들이 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 놓여 있는 것이다. 코딩 서열과 "작동가능하게 연결된" 조절 서열은, 코딩 서열의 발현이 조절 서열에 의해 이루어지는 조건 하에서 달성되는 방식으로 라이게이션 (ligation)된 것이다.

POI를 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결된 조절 서열로는 프로모터/인핸서 및 기타 발현 조절 신호 (전사 터미네이터 포함)가 있다. 이들 조절 서열은 발현 벡터를 사용하도록 디자인된 숙주 세포와 상용성을 갖도록 선택될 수 있다. 용어 "프로모터"는 당업계에 공지되어 있고, 그 크기 및 복잡성이 최소 프로모터로부터 상류 성분과 인핸서를 포함하는 프로모터까지의 범위인 핵산 영역을 포함한다.

프로모터는 통상적으로 포유동물 세포에서 기능을 나타내는 프로모터로부터 선택된다. 프로모터는 통상적으로 바이러스성 또는 진핵세포성 유전자의 프로모터 서열로부터 유래한다. 예를 들어, 프로모터는 발현이 발생하는 세포의 게놈으로부터 유래한 프로모터일 수 있다. 바이러스 프로모터는 일반적으로 높은 수준의 전사를 유도하기 때문에 유리하게 사용될 수 있다. 그 예로는 SV40 초기 프로모터 및 그의 활성 단편, 몰로니 뮤린 (Molony murine) 백혈병 바이러스 장쇄 말단 반복서열 (MMLV LTR) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터, 또는 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) IE 프로모터가 있다.

벡터의 복제는 이. 콜라이 (E. coli)에서 용이하게 수행되기 때문에, 이. 콜라이 (E. coli) 유전자 마커 및 이. 콜라이 (E. coli) 복제 기점이 포함되는 것이 유리하다. 이들은 pBR322, Bluescriptⓒ 벡터 또는 pUC 플라스미드 (예를 들어, pUC18 또는 pUC19, 이들은 이. 콜라이 (E. coli) 복제 기점과 앰피실린과 같은 항생물질에 대한 내성을 부여하는 이. 콜라이 (E. coli) 유전자 마커를 둘 다 함유함)와 같은 이. 콜라이 (E. coli) 플라스미드로부터 얻을 수 있다.

또한, 프로모터는 POI의 발현량이 세포의 수명 동안 조절될 수 있는 유도가능 프로모터인 것이 유리할 수 있다. 유도가능이란 프로모터를 사용하여 얻은 발현량이 조절될 수 있음을 의미한다.

조절 서열은, 예를 들어 인핸서 서열과 같은 추가의 전사 조절 성분을 부가하여 조절 서열에 의해 유도되는 전사 수준을 전사 조절자에 대해 보다 반응성이도록 함으로써 변형될 수 있다. 또한, 2개 이상의 상이한 상기 프로모터로부터의 서열 성분을 포함하는 키메라 프로모터도 사용될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, POI는 에리트로포이에틴, 특히 인간 Epo이다. 인간 Epo의 서열은 진뱅크 (GenBank) 허가번호 M 11319.1호로 등록되어 있다. 그러나, 인간 Epo 서열에 1개 이상의 탄수화물 부착 부위를 추가로 도입하여 변형시킨 것 (예를 들어, 미국 특허 제5,856,298호에 기재된 [Asn60]Epo, [Asn125, Ser127]Epo, [Thr125]Epo 및 [Pro124, Thr125]Epo)이 바람직할 수 있다.

제1 벡터는 또한, 본질적으로 숙주 세포의 게놈 내에 통합시 숙주 세포가 뉴클레오티드 서열의 증폭을 유발하는 선별제와 접촉할 때 증폭되는 발현 카세트인 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 진핵 세포, 특히 포유동물 세포는 선별 압력 (통상적으로 효소 억제제)에 반응하여 특정 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 그 유전자를 증폭시킬 수 있으며, 그 결과 유전자의 발현량이 증가한다. 부가의 유전자 카피는 염색체 내에 유지될 수도, 또는 미세 염색체 (minute chromosome)와 같은 염색체외 유전자 물질의 형태일 수도 있다 (고찰을 위해서는 문헌 [Genes VI, Lewin, 1997, Oxford University Press, Oxford U.K., pp975-978] 참조). 특성이 잘 규명된 예로는 메토트렉세이트 (MTX)에 반응하여 증폭되는 디히드로폴레이트 환원효소 유전자가 있다. 다른 예로는 트랜스-카르바밀라제의 억제제에 반응하여 증폭되는 CAD 유전자 (UMP 합성의 처음 세 단계에 관여하는 단백질을 코딩함), 및 메티오닌 술폭시민에 반응하여 증폭되는 글루타민 신텐타제 (WO87/04462 참조)가 있다.

이 제2 발현 카세트는, 제1 발현 카세트의 경우에서와 같이 숙주 세포에 의해 코딩 서열의 발현을 제공할 수 있는 조절 서열과 작동가능하게 연결된 증폭가능한 유전자의 실제 코딩 서열을 포함한다. 적합한 조절 서열은 상기 설명하였다. 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열의 조절 서열은 동일할 수도, 또는 상이할 수도 있다.

제2 벡터는, 선별 압력 (예를 들어, dhfr)에 반응하여 증폭되는 유전자를 코딩하는 코딩 서열이 선별가능 마커 (통상적으로는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 같이 항생물질 내성을 제공하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 치환된 것을 제외하고는 제1 벡터와 본질적으로 동일하다. 다른 항생물질 내성 유전자로는 퓨로마이신 또는 하이그로마이신 내성을 코딩하는 유전자들이 있다.

본 발명의 중요한 특징은, 2개의 벡터가 제2 또는 제3 뉴클레오티드 서열에 있어서만 본질적으로 다르다는 것이다. 특정 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 2개의 벡터들 사이의 실질적인 동일성은 목적 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열의 증폭을 용이하게 한다고 생각된다. 선별가능 마커를 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열은 배양액의 1차 선별을 위한 마커로서 작용하는 반면, 선별 압력에 반응하여 증폭되는 제2 뉴클레오티드 서열은 목적 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 비롯한 통합 서열의 증폭을 유발한다.

그러나, 미미한 정도의 차이는 허용될 수 있기 때문에 제2/제3 뉴클레오티드 서열 이외의 영역이 반드시 100％ 동일해야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 제2/제3 뉴클레오티드 서열을 제외한 두 벡터의 서열은 통상적으로 95％, 98％ 또는 99％ 이상 동일할 것이다.

그럼에도 불구하고, 제2/제3 뉴클레오티드 서열 이외의 서열이 동일한 벡터를 사용하는 것이 편리한데, 이는 실제로 동일한 벡터가 제1 및 제2 벡터를 클로닝하는 기초로서 사용되기 때문이다. 예를 들어, 제2 및 제3 뉴클레오티드 서열이결여되었지만 적합한 클로닝 부위를 함유하는 벡터를 사용하여, 선택된 제2 또는 제3 뉴클레오티드 서열을 삽입할 수 있는 클로닝 벡터를 생성할 수 있다.

B. 목적 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포의 제조

제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 벡터는 임의의 적합한 기술을 이용하여 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 세포에 의한 핵산의 유입 정도는, 예를 들어 전기천공법이나 형질감염제 사용을 포함하는 방법과 같은 몇몇 공지된 형질감염 기술에 의해 증대된다. 형질감염제의 예로는 양이온성 제제 (예를 들어, 인산칼슘 및 DEAE-덱스트란) 및 지질감염제 (lipofectant) [예를 들어, 리포펙탐 (liofectam, 상표명) 및 트랜스펙탐 (transfectam, 상표명)]가 있다. 통상적으로, 벡터를 형질감염제와 혼합하여 조성물을 제조한다. 제1 벡터에 비해 제2 벡터를 과량으로 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 벡터는 1:5 내지 1:100 (제1 벡터:제2 벡터), 보다 구체적으로는 1:10 내지 1:50의 비율로 혼합될 수 있다.

바람직한 숙수 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 설치류 또는 인간 세포이며, 그 예로는 CHO, BHK, COS 및 HeLa 세포가 있다. 특히 바람직한 세포는 CHO 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 최초에 제2 뉴클레오티드 서열에 존재하는 유전자 (예를 들어, dhfr)가 결핍되어 있다. dhfr이 결핍된 CHO 세포는 문헌 [Urlaub and Chasin, 1980, PNAS 77: 4216-4220]에 기재되어 있고, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)로부터 수탁번호 ATCC CRL-9096으로 입수할 수 있다. 이는 부다페스트 조약 하에 2001년 8월 29일에 미국 20852 메릴랜드주 록빌에 소재하는아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 수탁번호 ATCC PTA-3672로 기탁되었다. 본 발명의 DNA 작제물 및 방법에 사용될 수 있는 무한증식 인간 세포주의 예로는, HT1080 세포 (ATCC CCL 121), HeLa 세포 및 HeLa 세포의 유도체 (ATCC CCL 2, 2.1 및 2.2), MCF-7 유방암 세포 (ATCC BTH 22), K-562 백혈병 세포 (ATCC CCL 243), KB 암종 세포 (ATCC CCL 17), 2780AD 난소 암종 세포 [Van der Blick, A.M. et al., Cancer Res, 48:5927-5932 (1988)], Raji 세포 (ATCC CCL 86), WiDr 결장 선암종 세포 (ATCC CCL 218), SW620 결장 선암종 세포 (ATCC CCL 227), Jurkat 세포 (ATCC TIB 152), Namalwa 세포 (ATCC CRL 1432), HL-60 세포 (ATCC CCL 240), Daudi 세포 (ATCC CCL 213), RPMI 8226 세포 (ATCC CCL 155), U-937 세포 (ATCC CRL 1593), 보우스 흑색종 (Bowes Melanoma) 세포 (ATCC CRL 9607), WI-38VA13 아세포주 2R4 세포 (ATCC CLL 75.1) 및 MOLT-4 세포 (ATCC CRL 1582) 뿐만 아니라 인간 세포와 다른 종의 세포를 융합시켜 제조한 헤테로하이브리도마가 있으나 이들로 한정되는 것은 아니다. 2차 인간 섬유아세포주, 예를 들어 WI-38 (ATCC CCL 75) 및 MRC-5 (ATCC CCL 171)도 사용할 수 있다.

형질감염은 마이크로타이터 플레이트에서 편리하게 수행될 수 있지만, 다른 배양 용기를 사용할 수도 있다. 형질감염 후, 세포는 통상 선별 배지 (즉, 선별가능 마커를 발현하는 세포를 선별하는 배지)에서 세포가 플레이트에 가득 차도록 (confluence) 배양한 후, 제2 뉴클레오티드 서열의 증폭을 유발하는 선별제 (예를 들어, MTX)를 함유하는 증폭 배지에서 배양한다. 통상적으로 MTX의 경우, 이 물질은 약 48 nM (4.8×10^-8M)의 농도로 존재한다.

이어서, 통상적으로 동일하거나 유사한 농도의 선별제에서 배양된 클론을 선별하고, 예를 들어 ELISA 및(또는) 면역형광법에 의해 재조합 단백질의 생산 여부를 스크리닝한다.

이상적으로는, 선별된 클론에 대해 이후에 증식 특성, 염색체 안정성, 재조합 단백질 생산성 및 재조합 단백질 활성을 측정하기 위해 추가 시험한다.

염색체 안정성은, 예를 들어 세포 형태를 관찰하고(하거나) DNA 함량 분석 (예를 들어, 코울터 계수기 (Coulter Counter) 핵 DNA 분석)을 수행함으로써 측정할 수 있다. 일반적으로, 더 큰 핵을 갖고 있는 클론은 이배체 (diploid) 염색체 함량이 더 많다. 이들 클론은 보다 덜 안정할 것이며, 따라서 일반적으로 배제된다. 바람직한 클론은 형질감염 및 선별 전의 모 숙주 세포와 실질적으로 동일한 핵 DNA 함량을 갖는 클론이다.

재조합 단백질 생산성은 세포 및(또는) 배양 상청액 (단백질이 분비되는 경우, 예컨대 Epo의 경우)의 SDS-PAGE/웨스턴 블롯에 의해 시험할 수 있다. 시험은 소정 범위의 MTX (또는 다른 적합한 선별제)에 대해 수행할 수 있다. 단백질의 양 뿐만 아니라 단백질의 패턴 (특히 다수의 이소형, 예를 들어 차등적으로 글리코실화된 이소형이 생산되는 경우, 예컨대 Epo의 경우)에 대해서도 고려하는 것이 바람직할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 방법은 선별된 클론을 제2 뉴클레오티드 서열의 증폭을 유발하는 선별제의 증가되는 농도에 노출시키는 하나 이상의 서브클로닝 단계를 더 포함한다. dhfr 및 MTX의 경우, 통상적으로 최초 클로닝 단계에서는 10^-8M농도의 MTX를 사용하고, 10^-6M 농도까지 증가시킨다.

이와 같이 추가의 서브클로닝 단계에서는, 세포 클론을 소정 농도 범위의 선별제 (예를 들어, MTX) 존재 하에 시험 배양하여 재조합 단백질의 역가 (titre)를 결정한다. 이어서 서브클로닝은, 세포 클론이 보다 낮은 농도에 비해 단백질 생산량이 유의한 증가를 나타내지 않는 선별제 농도 또는 그 이상의 농도에서 수행하는 것이 바람직하다. Epo 및 CHO 세포의 경우, 이 농도는 약 380 nM (3.8×10^-7M)이다. 바람직한 실시양태에서는 점진적으로 높아지는 선별제 농도에서부터 가장 높은 바람직한 농도까지에서 세포를 배양한다.

이어서, 서브클론을 추가로 시험하여 상기 설명한 이들의 특성을 결정한다. 임의로는, 통상적으로 증가된 선별제 (예를 들어, MTX) 농도로 추가의 서브클로닝 단계를 수행할 수 있다. 실시예에서는, 1.54 μM (1.54×10^-6M)의 MTX 존재 하에 서브클로닝 단계를 수행하였다. 다른 경우, MTX 농도는 10 μM (1×10^-5M)만큼 높은 농도, 또는 이보다 더 높은 농도까지 증가될 수 있다.

바람직하게는, Epo를 발현하는 선별된 본 발명의 숙주 세포는 7.7×10^-7M 또는 1.54×10^-6M에서 10 ㎍/10⁶개 세포/일보다 높은 비율로, 보다 바람직하게는 20, 25 또는 30 ㎍/10⁶개 세포/일보다 높은 비율로 Epo를 발현한다. 또한, 본 발명의 숙주 세포는 형질감염 전의 모 숙주 세포 (예를 들어, dhfr 결핍 CHO 세포)와실질적으로 동일한 핵 DNA 함량을 갖는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 숙주 세포를 통상적으로 최종 서브클로닝 단계 이후에 혈청-무함유 배지에 적응시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 시딩된 세포를 플레이트에 가득 차도록 배양하고, 배양 배지를 혈청-무함유 배지로 대체하거나, 또는 수차례 계대 배양을 통해 혈청 농도를 점진적으로 감소시킴으로써 달성할 수 있다. 바람직하게는, 세포가 현탁 배양액으로서 배양되도록 적응시킨다.

선별된 숙주 세포주는 표준 기술을 이용하여 액체 질소에 동결보관될 수 있다.

C. 단백질 생산

본 발명의 숙주 세포는 rhEpo와 같은 목적 재조합 단백질의 발현에 사용될 수 있다. 형질감염된 숙주 세포를 사용하여 폴리펩티드를 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 배양 조건은 제1 뉴클레오티드 서열로부터 목적 폴리펩티드의 발현을 달성하도록 선택될 것이다. 본 발명에 있어서는 현탁 배양 방법 또는 롤러 병 배양 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 목적 폴리펩티드를 발현시킬 목적으로 숙주 세포를 배양하는 것은 선별제 (즉, MTX 또는 적당한 등가물)의 존재 또는 부재 하에 수행될 수 있다. 바람직하게는 숙주 세포가 혈청-무함유 배지에서 배양된다.

재조합 단백질은 배양 상청액으로부터 회수될 수도, 또는 경우에 따라 배양된 세포의 펠렛으로부터 회수될 수도 있다 (Epo 발현의 경우에는 배양 상청액으로부터 회수함). 이어서, 재조합 단백질은 통상적으로 친화도 크로마토그래피 및(또는) 이온 교환 크로마토그래피와 같은 하나 이상의 정제 단계를 거치게된다 (예를 들어, 문헌 [Broudyet al., 1988, Archives of Biochemistry and Biophysics 265: 329-336] 및 [Ghanemet al., 1994, Preparative Biochemistry 24(2): 127-142] 참조).

바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포에서 발현되어 이로부터 정제된 재조합 폴리펩티드 (특히, Epo)를 포함하는 조성물에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 실질적으로 순수하다 (예를 들어, 순도 90％, 95％ 또는 99％ 이상).

정제된 단백질의 생물학적 활성은 시험관내에서 및(또는) 생체내에서 측정할 수 있다. 적합한 시험관내 시험은 문헌 [Hammerlinget al., 1996, J Pharm Biomed Anal 14(11):1455-69]에 기재되어 있고, 이는 적혈구 세포주의 증식 자극에 대한 시험을 포함한다. 적합한 생체내 시험은 문헌 [Ghanemet al., 1994, 상기 문헌]에 기재되어 있으며, 이는 적혈구 증가증 마우스의 적혈구 내로⁵⁹Fe가 혼입되는 것을 측정하는 단계를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 목적 재조합 폴리펩티드를 코딩하며 숙주 세포에서 목적 재조합 폴리펩티드의 발현을 유도하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공하고; (b) (i) 물, 식물-유래 펩톤, 삼투농도 조절제, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산, 지질 공급원 또는 전구체, 철 공급원, 비철 금속 이온, 및 1종 이상의 비타민 및 보조인자를 포함하며, (ii) 임의의 전장 폴리펩티드를 함유하지 않는 혈청-무함유 배양 배지를 제공하고; (c) 목적 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 조건 하에 배양 배지 중에서 숙주 세포를 배양함으로써 배양된 숙주 세포를 사용한다.

바람직하게는 목적 재조합 폴리펩티드가 인간 에리트로포이에틴이다. 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포일 수 있다. 이러한 기술은 본 명세서의 실시예 단락에 기재되어 있다.

에리트로포이에틴은, (a) 디스크 퇴적 분리기를 이용한 원심 분리에 의해 세포 배양 배지로부터 숙주 세포, 세포 구성분 및 세포 찌꺼기를 제거한 후, 심층 여과 (depth filtration) 단계를 통해 맑은 배양 배지 상청액을 수득하고; (b) 상청액의 전도율을 5 mS/cm 이하로 조정하고, pH를 약 7.0 내지 8.0 사이로 조정하고; (c) 음이온 교환 크로마토그래피용 매질을 포함하는 컬럼에 단계 (b)의 상청액을 로딩하고, 컬럼을 세척하고, 컬럼으로부터 rhEpo를 용출시키고, rhEpo를 함유하는 피크 분획(들)을 수집하고; (d) 중간 압력 (10 bar 미만)에서 구동될 수 있고 고농도의 NaOH에 대해 내성이 있는 수지를 이용한 역상 크로마토그래피 단계에 단계 (c)로부터의 합해진 피크 분획을 적용하고, 유기 용매의 선형 구배를 이용하여 rhEpo를 용출시키고; (e) 단계 (d)에서 용출된 rhEpo 함유 분획 하나 이상을 음이온 교환 크로마토그래피용 매질을 포함하는 컬럼에 로딩하고, 컬럼을 세척하고, 선형 염 구배를 이용하여 rhEpo를 용출하고; (f) 단계 (e)에서 용출된 rhEpo 함유 분획 하나 이상을 rhEpo의 시알릴화 정도에 기초하여 선별하고; (g) 단계 (f)에서 용출된 rhEpo 함유 분획 하나 이상을 겔 여과 매질을 이용한 1종 이상의 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 잠재적 이량체 및 고분자량 응집물을 제거하고, rhEpo를 함유하는 용출액을 수집함으로써 배양 배지로부터 정제될 수 있다.

유리하게는, 단계 (c)에서 사용되는 음이온 교환 매질은 바이오세프라 (BioSepra)에서 입수할 수 있는 세라믹계 이온 교환 컬럼 Q-HyperD F (상표명)이다. 단계 (d)에서 사용되는 폴리스티렌 수지는 파마시아 (Pharmacia)의 소스 (Source) 30RPC (상표명)이 유리한 반면, 단계 (e)에서 사용되는 음이온 교환 매질은 파마시아 Q 세파로스 하이 퍼포먼스 (Pharmacia Q Sepharose High Performance, 상표명)가 유리하다. 단계 (g)에서 사용되는 겔 여과 매질은 파마시아 수퍼덱스 75 프렙 그레이드 (Pharmacia Superdex 75 prep grade, 상표명)이 바람직하다.

이러한 방법은 본 명세서의 실시예 단락에 기재되어 있다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 추가로 설명되는데, 이 실시예는 단지 예시를 위한 것이며 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 특히, 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 것이다.

재료

숙주 세포주

차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 디히드로폴레이트-환원효소 결핍 (ATCC CRL-9096). 이 세포주를 부다페스트 조약하에 수탁번호 ATCC PTA-3672로 아메리칸 타입 컬처 콜렉션 (ATCC) (미국 20852 메릴랜드주 록빌 소재)에 2001년 8월 29일자로 기탁하였다.

세포 배양 배지

배양 배지: 4 mM L-글루타민, 10％ FCS, 1 x HT (히포크산틴, 티미딘)를 보충한 DMEM,

선별 배지: 4 mM L-글루타민, 투석된 10％ FCS 및 0.5 mg/ml G418을 보충한 DMEM

증폭 배지: 4 mM L-글루타민, 투석된 10％ FCS, G418 0.5 mg/ml, 및 4.8 x 10^-8M - 1.54 x 10^-6M MTX (메토트렉세이트)를 보충한 DMEM

동결 배지: 4 mM L-글루타민, 10％ FCS 및 10％ DMSO를 보충한 DMEM.

재조합 세포주용 혈청-무함유 적응 배지: 6 mM L-글루타민, 0.25％ 소야(Soya)-펩톤/UF, 1 x 하이브리도마 서플러먼트 (Supplement), 0.1％ Pluronic-F68, 0.5 mg/ml G418, 1.54 x 10^-6M MTX가 보충된 DMEM/함스 (Ham's) F12 (1:1);

혈청-무함유 생산 배지: 0.25％ 소야-펩톤/UF, 1 x 하이브리도마 서플러먼트, 0.1％ 루트롤 (Lutrol), 1.54 x 10^-6M MTX, 1 g/ℓ 글루코스, 2.5 g/ℓ NaHCO₃가 보충된 DMEM/함스 F12 (1:1);

재조합 세포주용 혈청-무함유 동결 배지: PBS, 20％ PVP-10, 5％ DMSO, 100 x 하이브리도마 서플러먼트, 2.5 x 10^-3M 에탄올아민, 2.5 x 10^-2M 시트르산 제2철, 2.0 x 10^-3M L-아스코르브산, 5.0 x 10^-6M 아셀렌산나트륨

플라스미드 작제물

pEpo/neo

이 플라스미드는 Epo 및 네오마이신 내성 유전자의 코딩 영역을 SV40 초기프로모터/터미네이터 서열의 조절 하에 각각 2개의 상이한 발현 카세트로 코딩한다. 작제 세부사항을 실시예 1에서 제공한다.

pEpo/dhfr

이 플라스미드는 Epo 및 dhfr의 코딩 영역을 SV40 초기 프로모터/터미네이터 서열의 조절 하에 각각 2개의 상이한 발현 카세트로 코딩한다. 작제 세부사항을 실시예 2에서 제공한다.

세포 배양 방법

CHO-dhfr ^- 의 배양

디히드로폴레이트 환원효소 결핍 CHO 세포 (Urlaub et al., 1980, PNAS 77(7):4216-4220) (CHO dhfr로서 칭함)를 1주일에 2회 분할률 1:10으로 DMEM 배양 배지에서 배양하였다.

CHO 세포의 형질감염

리포펙틴 (lipofectin) 형질감염을 수행하기 1일 전에 1 ㎠ 당 1 내지 5 x 10⁴세포를 25 ㎠ T-플라스크 병 또는 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 상응하는 플라스미드를 적절한 비율로 혼합하고, 제조자 프로토콜에 따라 리포펙틴 시약 (GIBCO/BRL) (0.5 내지 1 ㎕/㎠)에 첨가하였다. 이어서, 4 내지 16시간 동안 혈청-무함유 DMEM에서 형질감염 칵테일로 세포를 오버레이한 후에, DNA-함유 배지를 배양 배지로 교환하였다. 24 내지 48시간 동안 혈청-함유 배지에서 배양한 후에 세포를 선별 배지로 교체하였다. 형질감염된 세포 집합체를 먼저 선별 배지에서 플레이트가 가득 차도록 배양하고, 이어서 증폭 배지 (4.8 x 10^-8M MTX)에서 배양한 후에 Epo 생산에 대해 ELISA로 세포 배양 상청액을 스크리닝하였다. 생산성이 가장 높은 것을 결정하고, MTX 농도를 2배 증가시켜 가장 우수한 생산자를 추가의 배양에 사용하였다.

분석 방법

ELISA에 의한 상이한 매트릭스에서의 Epo 검출

항체

폴리클로날 혈청: 바이오티닐화된 토끼 항 Epo (R＆D 시스템; 카탈로그 # AB-286-NA)

모노클로날 항체: 마우스 항 Epo (진자임 (Genezyme); 카탈로그 코드 AE7A5)

ELISA 완충액

코팅 완충액: NaHCO₃8.4 g/ℓ, Na₂CO₃4.2 g/ℓ, pH 9.6 내지 9.8

세척 완충액: KCl 0.2 g/ℓ, Na₂HPO₄x 2H₂O 1.15 g/ℓ, KH₂PO₄0.2 g/ℓ, NaCl 8 g/ℓ, 0.1％ 트윈 (Tween) 20

희석 완충액: 세척 완충액 중의 2％ PVP (시그마 (Sigma) 카탈로그 번호 PVP-4OT)

샘플 완충액: 희석 완충액 중의 0.5％ 알파 모노-티오-글리세롤

염색 완충액: 시트르산 x 2H₂O 7.3 g/ℓ, Na₂HPO₄x 2H₂O 11.86 g/ℓ, pH 4.8 내지 5.0

염색 용액: OPD 용액 100 ㎕/염색 완충액 10 ml, H₂O₂5 ㎕/염색 완충액 10 ml

OPD 원액: PP: L0017

방법

ELISA 방법을 사용하여 Epo를 농도 범위 ng/ml로 검출하며, 특히 검출 한계가 약 10 ng/ml의 범위이고, 500 ng/ml 및 8개의 2배 희석물로 시작하였다. Epo의 제1의 26개 아미노산에 대한 하나의 모노클로날 항체는 코팅 층으로서 기능하며, Epo와 결합하였다. 다음 단계에서 Epo는 캐처 (catcher) 항체에 의해 특이적으로 결합되었다. 토끼 항혈청을 인식하는 바이오티닐화된 Epo를 통해 검출하였다. 스트렙타비딘-퍼옥시다제를 플레이트에 커플링한 후에 OPD로 염색하여 시각화를 수행하였다.

면역형광

Epo 발현 CHO-세포를 6-웰 플레이트 중의 커버 슬립 상에 5 x 10⁴세포/200 ㎕로 접종하고, 24 내지 72시간 동안 인큐베이션하였다. 점착성 세포를 PBS로 2회 세척하고, 5분 동안 -20 ℃의 메탄올로 고정하고, 이어서 통풍 건조시킨 후에, 다시 PBS에 침지시켰다. 비특이적 단백질을 PBS 중의 20％ FCS를 사용하여 15분 동안 인큐베이션하여 포화시키고, 이어서 항-Epo를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응을 컨쥬게이트된 항-마우스 IgG FITC로 시각화시켰다. 형광을 공초점 현미경으로 488 nm의 여기 파장 및 515 nm보다 더 높은 방출 파장에서 검출하였다.

핵 크기 측정

재료

코울터 계수기 (Coulter Counter (등록상표)) 모델 ZM (코울터 일렉트로닉스 인크. (Coulter Electronics Inc.))

코울터 채널라이저 (Coulter Channelyzer (등록상표)) 모델 256

인큐베이션 용액: 0.1M 시트르산, 2％ 트리톤 X 100, 일렉트롤라이트 아이소톤 (Electrolyte Isoton) II (Kat-No.844 8011; 코울터 유로 다이어그노스틱 게엠베하 (Coulter Euro Diagnostic GmbH))

코울터 계수기로 전기 전도성 유체에 현탁된 입자의 크기 및 수를 정량하였다. 양쪽에 전극을 갖는 모세관을 통해 진공으로 유체를 흡수하였다. 저항의 변화는 코울터 채널라이저로 계수될 수 있는 전압 임펄스를 유도하였다. 핵 크기는 세포의 DNA 함량과 상호관련되어 염색체의 이배체 내지 다배체 세트 간의 구별이 가능하다.

방법

약 1 x 10⁶CHO-세포를 PBS로 1회 세척하고, 인큐베이션 용액 2 ml에 재현탁하고, 4 내지 5시간 동안 방치하였다. 하기 단계는 코울터 계수기에 특이적이다.

SDS 폴리아크릴아미드-전기영동 및 웨스턴 블롯팅

재료

SDS 겔: 4 내지 20％ 노벡스 (Novex) Tris-글리신

샘플 완충액: 2 x Tris 글리신 SDS (노벡스 LC 2676)

러닝 완충액: Tris 글리신 SDS (노벡스 LC 2675)

블롯팅 완충액: 50 mM Na₂B₄O₇x 10H₂O, 0.1％ SDS, 20％ 메탄올

블롯팅 매트릭스: PVDF 임모빌론 (Immobilon) P 0.45 μM 밀리포어; K8JM8238H

세척 완충액: ELISA 세척 완충액 참조

희석 완충액: 세척 완충액 중의 1％ 밀크 파우더

검출 완충액: 0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-HCl pH 9.5

방법

Epo 함유 샘플을 1％ α-MTG를 갖는 1 x 샘플 완충액 중에서 30 ng/20 ㎕로 조정하고, SDS 겔에 가하였다. 러닝 말미에, 단백질을 PVDF 임모빌론 막에 2시간 동안 블롯팅하고, 이어서 Epo의 제1의 26개 아미노산을 검출하는 모노클로날 항체로 Epo를 특이적으로 염색하였다. 알칼리성 포스파타제에 컨쥬게이트된 항 마우스 IgG 및 NBT/BCIP 염색으로 시각화하였다.

등전점 집속

재료

시스템: 멀티포르 (Multiphor) II, 아머샴 바이오사이언스

IPG 겔: pH 2.5 내지 7

재팽윤 완충액: 우레아 9 g, CHAPS 0.5 g, DTE 0.04 g, 리솔라이트 (resolyte) (pH 3.5 내지 10) 0.5 ml, 브롬페놀-블루 (0.1％) 10 ㎕, H₂O로 25 ml로조정함

샘플 완충액: H₂O 625 ㎕ 중의 IPG 샘플 완충액 pH 3 내지 10 25 ㎕

블롯팅 완충액: 글리신 2.93 g, Tris 5.81 g, 메탄올 20 ml, SDS 0.375 g, H₂O로 1000 ml로 조정함

블롯팅 매트릭스: PVDF 임모빌론 P 0.45 ㎛ 밀리포어; K8JM8238H

세척 완충액: ELISA 세척 완충액 참조

희석 완충액: 세척 완충액 중의 1％ 밀크 파우더

검출 완충액: 0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-HCl pH 9.5

방법

Epo 함유 샘플을 500 내지 1000 ng/50 ㎕로 조정하고, 탈염하고, 샘플 완충액에 1:1로 희석하고, 재팽윤된 IPG 겔에 가하였다. 러닝 조건은 먼저 300 V에서 1분, 이어서 선형으로 3500 V로 상승시키고, 마지막으로 3500 V에서 1시간으로 하였다. 전체 집속 공정 동안 10 mA 및 10 W의 제한을 설정하였다. 이후에, 단백질을 하룻밤 확산시키거나 전자블롯에 의해 PVDF 임모빌론 막에 블롯팅하고, 이어서 Epo의 제1의 26개 아미노산을 검출하는 모노클로날 항체로 Epo를 특이적으로 염색하였다. 컨쥬게이트된 항 마우스 IgG AP 및 NBT/BCIP 염색으로 시각화하였다.

DNA 함량의 측정

재조합 세포주의 DNA 함량을 FACS 분석으로 CHO-dhfr^-숙주 세포주와 비교하였다.

재료

세척-완충액: 0.1 M Tris-HCl, pH 7.4, 2 mM MgCl₂, 0.1％ 트리톤 X100

염색 완충액: 세척 완충액 중의 DAPI (획스트 (Hoechst)) 0.3 ㎍/ml

방법

5 x 10⁵세포를 PBS로 세척하고, 빙냉 70％ 에탄올로 고정하였다. 이후에, 세포를 세척 완충액으로 2회 세척하고, 이어서 염색 완충액에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. DNA 함량을 FACS 밴티이지 (Vantage) (벡톤 (Becton) 및 딕킨손 (Dickinson))로 여기 359 nm 및 방출 450 nm에서 측정하였다.

시험관내 특이성 시험

인간 적백혈병 세포주 TF-1 (미생물 및 세포 배양의 게르만 콜렉션)은 IL3 또는 hGM-CSF에 대해 성장-의존적이다. 이들 사이토카인은 증식에 대해 상승효과를 나타내는 반면, Epo는 일부 시간 동안 생존성을 유지할 수 있다. 세포를 GM-CSF 및 Epo 함유 배양 배지에서 일상적으로 배양하였다.

시험 보충물

배양 배지: 4mM Gln, 10％ FCS, 트랜스페린 20 ㎍/ml, 10 μM 베타-메르캅토-에탄올, rhGM-CSF 12ng/ml, rh Epo 3U/ml를 보충한 RPMI 1640

시험 배지: 4mM Gln, 트랜스페린 100 ㎍/ml, BSA 2mg/ml를 보충한 RPMI 1640

방법

기능 시험을 MTT 생존성 시험으로서 96-웰 플레이트에서 수행하였다(Hammerling et al., 1996, J Pharm Biomed Anal 14(11):1455-69). 샘플을 1:2배로 8회 희석하고, 시험 배지에서 1 ml 당 Epo 100 ng으로 시작하였다. 샘플 희석물, 표준 희석물 또는 블랭크 (blank) 각각 50 ㎕를 96-웰 시험 플레이트에 옮겼다. TF-1 세포를 냉각 PBS로 3회 세척하고, 시험 배지에서 1 ml 당 2 x 10⁵세포로 적응시켰다. 96-웰 시험 플레이트 각각의 웰을 세포 현탁액 50 ㎕로 오버레이하고, 이들 세포를 72시간 동안 CO₂인큐베이터 내에 방치하였다. 이후에 MTT 용액 (PBS 중에 6 mg/ml) 10 ㎕를 첨가하고, 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 염료를 SDS/HCl (0.1 M HCl 중의 10％ SDS) 100 ㎕로 또다른 4시간 동안 암실에서 용해시키고, Epo 의존 생존성을 550/690 nm에서 광도계로 측정하였다.

실시예 1 - 플라스미드 Epo/neo의 작제

1. p2-neo의 작제

1.1 SV40 초기 프로모터를 함유한 pSV2neo로부터의 벡터 단편의 제조

벡터 작제의 기초는 pSV2neo를 함유한 pBR322 플라스미드 골격이었다. 더 작은 EcoRI - PvuII 제한효소절단 단편은 이 pBR322 골격을 포함하고, SV40로부터의 인접한 PvuII - HindIII 단편은 SV40 초기 프로모터의 관련 단편을 가졌다.

플라스미드 pSV2neo (ATCC 37149)를 제한 효소 EcoRI 및 HindIII로 절단하였다. 2개의 생성된 단편의 크기는 3092 bp 및 2637 bp이었다. 2637 bp 단편은 pBR322 골격을 포함하는 EcoRI - PvuII 제한효소절단 단편 및 SV40 초기 프로모터단편을 포함하는 인접한 PvuII - HindIII 단편으로 이루어졌다. 2637 bp를 제조하여 겔 전기영동을 퉁해 정제하였다.

1.2 네오마이신 내성 유전자의 제조

neo 유전자를 pSV2neo의 트랜스포손 Tn5으로부터 취하였다. 유전자의 코딩 영역을 단독으로 함유하는 단편으로서 증폭하였다. 클로닝 방법의 일부로서, 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 양 끝에 도입시켰다. HindIII 부위를 상류 증폭 프라이머에 부설하고, EcoRI 및 a SpeI 부위를 하류 프라이머에 부설하였다. 증폭된 영역은 pSV2neo (진뱅크 U02434호)의 서열 중 뉴클레오티드 2846 내지 1938에 상응하였다. 올리고뉴클레오티드를 하기와 같이 디자인하였다:

프라이머 2004-01 및 2004-02의 증폭 생성물을 Pwo 중합효소 (로슈 다이어그노스틱스 (Roche Diagnostics))를 사용하며 PCR하여 제조하였다. 공정의 파라미터는 하기와 같았다: 총용적이 50 ㎕인 공급된 완충액 중에 pSV2neo 20 ng, 10 pmol 프라이머 각각, 10 mmol dNTP, 2.5 U Pwo 중합효소; 온도 프로파일: 5분 95 ℃, 35회 (30초 95 ℃, 20초 65 ℃, 90초 72 ℃), 3분 72 ℃, 추가 사용때까지 4 ℃로 냉각시킴.

935 bp의 생성된 DNA 단편을 DNA 단리 칼럼 (Mini, Wizard Promega GmbH)으로 정제하고, EcoRI 및 HindIII로 절단하고, 아가로스 겔을 통해 정제하고, 스핀 (Spin) 칼럼 (Supelco)을 사용하여 용리하였다.

1.3 p1-neo의 작제

증폭된 EcoRI-HindIII neo 유전자 단편을 pSV2-neo로부터의 EcoRI-HindIII 벡터 단편에 라이게이션 익스프레스 (Ligation Express) (Clontech)를 사용하여 라이게이션하고, 이. 콜라이 (E. coli) 숙주 (이. 콜라이 SURE (Stratagene)) 내로 형질전환시켰다. 형질전환체를 앰피실린 50 mg/ℓ이 보충된 LB 배지 상에서 성장시켜 선별하였다.

플라스미드 DNA를 클론으로부터 단리하고, EcoRI 및 NcoI (각각 2527 bp, 780 bp 및 251 bp의 3개 단편)를 사용하는 제한효소절단 분석으로 확인하였다. 예상된 단편을 나타내는 플라스미드 DNA를 작제물의 관련 부분을 서열분석함으로써 추가로 확인하였다. 확인된 SV40 초기 프로모터 및 네오마이신 내성 유전자를 함유한 플라스미드 DNA를 p1-neo로서 지정하였다.

1.4 SV40 종결 영역 SV40LTpolyA/IVS의 제조

pSV2neo에 존재하는 SV40 종결 영역의 단편 (뉴클레오티드 751 내지 1598)을 증폭하기 위해 PCR 프라이머를 디자인하였다. 상류 프라이머는 또한 SpeI에 대한 제한효소절단 부위를 함유하였다. pSV2-neo의 위치 751에 이미 포함된 BamHI 부위 외에 EcoRI 부위를 BamHI로부터의 6개 뉴클레오티드 간격 (spacing) 영역에 의해분리되는 하류 프라이머 내로 도입시켰다. 프라이머 2개의 서열은 하기와 같았다:

프라이머 2004-05 + 2004-06의 증폭 생성물을 상술한 바와 같이 Pwo 중합효소 (로슈 다이어그노스틱스)를 사용하여 PCR함으로써 제조하였다. 873 bp의 생성된 DNA 단편을 DNA 단리 칼럼으로 정제하고, EcoRI 및 SpeI로 절단하고, 겔-정제하였다.

1.5 p2-neo의 제조

p1-neo 플라스미드 DNA를 EcoRI + SpeI를 사용하며 절단하였다. 생성된 선형화된 단편을 정제하고, SV40LTpolyA/IVS를 함유한 증폭된 단편과 라이게이션하고, 이. 콜라이 숙주 내로 형질전환하였다. 형질전환체를 앰피실린 50 mg/ℓ을 보충한 LB 배지 상에 성장시켜 선별하였다.

플라스미드 DNA를 클론으로부터 단리하고, EcoRI (4411 bp의 1개 단편) 및 NcoI (크기 3631 bp 및 780 bp의 2개 단편) 및 SphI (크기 3499 bp, 840 bp 및 72 bp의 3개 단편)으로 제한효소절단 분석하여 확인하였다. 예상된 단편을 나타내는 플라스미드 DNA를 작제물의 관련 부위를 서열분석하여 추가로 확인하였다. 확인한 SV40LTpolyA/IVS를 함유한 플라스미드 DNA를 p2-neo로서 지정하였다.

2. 플라스미드 p3의 작제

2.1 SV40 초기 프로모터 단편의 제조

플라스미드 pSV2neo를 SV40 초기 프로모터 단편에 대한 공급원으로서 사용하였다. 단편 크기는 p2 플라스미드의 작제에 사용된 것과 거의 동일하였다. 그러나, 단편의 말단을 개질하여 BamHI 및 NotI에 대한 인식 부위를 도입하였다. 프로모터를 증폭하기 위해 사용하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 하기와 같이 디자인하였다:

프라이머 2004-07 + 2004-08의 증폭 생성물을 상술한 바와 같이 Pwo 중합효소 (로슈 다이어그노스틱스)를 사용하여 PCR함으로써 제조하였다. 365 bp의 생성된 DNA 단편을 DNA 단리 칼럼으로 정제하고, BamHI 및 NotI로 절단하고, 겔-정제하였다.

2.2 pBluescript 벡터 부분의 제조

pBluescript II SK+ DNA를 순차적으로 BamHI 및 NotI 각각으로 제한효소절단하였다. DNA를 알칼리성 포스파타제로 탈인산화시켰다. BamHI/NotI 단편을 라이게이션 전에 아가로스 겔 전기영동을 통해 작은 단편으로부터 정제하였다.

2.3 플라스미드 p3의 제조 및 확인

SV40 초기 프로모터를 함유한 증폭된 BamHI-NotI 단편을 T4 DNA 라이게이즈 (리가아제) (Promega GmbH)를 사용하여 제조된 pBluescript II SK+ 벡터 내로 라이게이션하였다. 이. 콜라이 SURE (Stratagene) 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA를 단리하고, 앰피실린 100 mg/ℓ을 보충한 LB 배지 상의 콜로니로부터 정제하였다.

생성된 DNA를 EcoRI 및 NcoI (크기 3039 bp 및 253 bp의 2개 단편)로 제한효소절단 분석하여 확인하였다.

예상된 단편을 나타내는 2개의 플라스미드 DNA를 서열분석으로 추가로 확인하였다. SV40 초기 프로모터의 가닥 모두를 서열분석하여 각각의 위치를 확인할 수 있었다. 플라스미드를 p3로서 지정하였다.

3. 인간 Epo cDNA의 단리

3.1 TRIZol (등록상표) 시약을 사용하는 총 RNA의 단리

인간 신장 조직 (라인저 크란켄하우스 (Lainzer Krankenhaus) 병원로부터 얻음)으로부터 Epo RNA를 단리하기 위해 사용되는 TRIzol (등록상표) 시약은 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트의 단일-상 용액이다. 세포 융해 동안 구아니딘 이소티오시아네이트는 RNA와 수용성 복합체를 형성하는 동시에 세포를 파열시켰다. 클로로포름을 첨가한 후에 원심분리하고, 용액을 RNA 함유 수상 및 유기상 내로 분리하였다. 수상을 분리한 후에 RNA를 이소프로필 알콜로 침전시키고, 에탄올로 세척하고, 통풍 건조시키고, RNAse 무함유 물에 재현탁하였다.

인간 신장 조직 단편을 작은 조각으로 절단하고, 100 ㎛ 세포 여과기를 통해 강압하고, 원심분리하고 (179 x g/10분), 생성된 펠렛을 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 펠렛을 PBS 중에 재현탁하고, 멸균 튜브에 분취하고, -196 ℃로 동결시키고, -80 ℃에서 추가로 사용할 때까지 저장하였다.

TRIzol (등록상표) 시약 1 ml를 첨가하여 동결 조직을 융해시키고, 균질화하고, 15 내지 30 ℃에서 5분 동안 인큐베이션하여 완전한 분리를 확실하게 하였다. 클로로포름 200 ㎕를 첨가한 후에 튜브를 진탕하고, 2 내지 3분 동안 15 내지 30 ℃에서 인큐베이션하고, 튜브를 12000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에 상위 수상을 조심스럽게 새로운 튜브로 옮기고, 이소프로필 알콜 500 ㎕와 혼합하고, 15 내지 30 ℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 침전 RNA를 원심분리하고 (12000 x g, 10분), 펠렛을 에탄올로 세척하고, 다시 원심분리하고, 통풍 건조시키고, RNAse 무함유 DEPC 물 중에 용해시켰다. 총 RNA 함량을 260 nm에서 광도계로 측정하였다.

1 OD_260nm= RNA 40 ㎍/ml

OD_260nm및 OD_280nm의 비율 (단백질의 최대 흡광도)을 평가하여 RNA 단리의 순도를 평가할 수 있다. 범위가 1.6 내지 1.8이어야 한다.

3.2 디나비드 (Dynabead) 올리고 (dT)25를 사용하는 mRNA 단리

폴리스티렌 입자의 표면에 공유결합된 데옥시-티미딜레이트의 25개 뉴클레오티드 길이 쇄를 함유한 초자석 (supermagnetic) 폴리스티렌 입자에 진핵세포 mRNA의 폴리아데노신 꼬리 RNA를 혼성화시키는 것에 디나비드 올리고 (dT)25 mRNA DIRECT 키트를 사용하였다. 디날 (Dynal) 자석 입자 농축기 (디날 MPC (등록상표))로 자석 비드에 결합한 mRNA를 분리할 수 있었다.

세척 완충액: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.15 mM LiCl; 1mM EDTA

2 x 결합 완충액: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM LiCl; 2 mM EDTA

총 RNA 10 ㎍에 대해, 디나비드 올리고 (dT)₂₅100 ㎕를 디날 MPC (등록상표)에서 분리하고, 2 x 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 한편 총 RNA를 1 x 세척 완충액으로 200 ㎕의 용적으로 조정하고, 65 ℃에서 4분 동안 인큐베이션하여 변성시켰다. 이어서, RNA를 비드와 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고, 디날 MPC (등록상표)에서 분리하였다. 비드를 1 x 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 폴리아데닐화된 RNA를 디날비드 올리고 (dT)₂₅로부터 용리 완충액 (2 x 10 ㎕)과 4분 동안 65 ℃에서 인큐베이션하였다. 디나비드를 디날 MPC (등록상표)에서 분리하고, 상청액을 새로운 RNAse 무함유 미세원심분리 튜브로 즉시 옮겼다. 용출액은 역상 전사에 직접적으로 사용한다.

3.3 역 전사

Epo에 대한 특정 프라이머를 80 ℃에서 4분 인큐베이션으로 변성시키고, mRNA를 65 ℃에서 5분 인큐베이션으로 변성시켰다. 하기 구성성분을 얼음 상의 멸균 1.5 ml 미세원심분리 튜브에 첨가하였다:

시약	최종 농도
mRNA	10 ㎕
MMLV (200 U/ ㎕)	0.25 ㎕
뵈링거 (Boehringer) PCR 완충액 (10 x)	2 ㎕
dNTP (10 mM)	2 ㎕
MgCl₂(50 mM)	1 ㎕
Epo 정방향 (100 pmol/ ㎕)	1 ㎕
DTT (0.1 M)	0.25 ㎕
RNAse 억제제 (40 U/㎕)	0.25 ㎕
H₂O	3.25 ㎕

인큐베이션: 60분 37 ℃

불활성화: 5분 100 ℃

3.4 중합효소 연쇄 반응

하기 구성성분을 멸균 1.5 ml 미세원심분리 튜브에 4 ℃에서 첨가하였다. PCR 조건을 하기에 열거한다.

시약	Epo
주형	cDNA Epo 5 ㎕
중합효소	벤트 (Vent) 1U (0.5 ㎕)
중합효소 완충액 (10 x)	벤트 완충액 1 x (10 ㎕)
dNTP (10 mM)	200 μM (2 ㎕)
MgCl₂(50 mM)	/
프라이머 정방향 (10 pM)	30 pM (3 ㎕)
프라이머 역방향 (10 pM)	30 pM (3 ㎕)
DMSO	/
H₂O	76.5 ㎕

PCR 사이클
1 변성	95 ℃ 2분
2 변성	94 ℃ 45초
3 프라이머 어닐링	58 ℃ 30초
4 연장	72 ℃ 1분
5. 최후 연장	72 ℃ 10분
6. 사이클	30

PCR 증폭 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다.

3.5 아가로스 겔 전기영동

6 x BX 완충액: 0.25％ 브롬페놀 블루; 0.25％ 크실렌 시아놀, 30％ 글리세롤

TAE 완충액: Tris 염기 242g; 빙초산 57.1 ml; EDTA (0.5 M, pH 8.0) 100 ml; H₂O로 1000 ml로 조정함

람다-마커 III: 박테리오파지 람다-야생형-단 (Dann) 10 ㎍

(Hind III 2.5 ㎕ + Eco R I 2.5 ㎕ + 완충액 R (Fermentas) 20 ㎕, 200 ㎕까지 H₂O로 충전하고; 37 ℃에서 1시간 절단하고, 65 ℃에서 20분 불활성시키고; BX-적하 완충액 40 ㎕를 보충함)

아가로스 1 g 및 1 x TAE 완충액 99 g을 마이크로파 오븐에서 용융시키고, 약 60 ℃로 냉각시키고, 에티듐 브로마이드 원액 (10 mg/ml) 3 ㎕를 보충하였다. 겔을 1 x TAE 완충액 중에서 100 내지 300 V에서 약 30 분 동안 러닝시키며, DNA 단편의 길이에 따라 분리되었다. 각각의 레인이 6 x BX 완충액 2 ㎕와 혼합한 10 ㎕ 샘플을 함유하였다. DNA 단편의 확인은 람다/Hind III 절단 분자량 표준과의 비교를 기준으로 하였다.

3.6 라이게이션을 위한 PCR 생성물 및 벡터의 제조

3.6.1 스티키 (sticky) 말단 클로닝을 위한 벡터 DNA 및 삽입체의 제한효소절단

제한 효소 및 적절한 제한효소절단 완충액 10 u를 제조자 사용설명서에 따라 벡터 DNA 및 삽입체 1 ㎍과 혼합하였다. 사용되는 효소, 벡터 및 삽입체에 따라 혼합물을 37 ℃ (SmaI의 경우 30 ℃)에서 30 내지 60분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 효소를 65 ℃ 이하로 10분 동안 가열하여 불활성화시키고, 반응 혼합물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다.

3.6.2 라이게이션

pIRESneoSV40 벡터

pIRESneo 벡터 (Clontech laboratories)는 하나의 메신저 RNA로부터 2개의 오픈 리딩 프레임의 번역을 가능하게 하는 뇌심근염 (encephalomyocarditis) 바이러스 (ECMV)의 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)를 함유하였다. pIRESneo의 발현 카세트를 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 주요 극초기 프로모터/인핸서에 이어지는 다중 클로닝 부위 (MCS), ECMV IRES에 이어지는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 소과 성장 호르몬의 폴리아데닐화 신호를 함유하였다. 이 벡터에서 CMV 프로모터를 SV40 초기 프로모터로 대체하였다.

벡터 및 PCR 생성물을 T4 DNA 리가아제로 라이게이션하였다. 최적 라이게이션의 경우 벡터 약 20 ng 및 삽입체 200 ng (길이에 따름)을 몰비 약 1:10로 사용하고, 하기 시약을 총용적 H₂O 10 ㎕에서 혼합하였다. 인큐베이션을 밤새 15 ℃에서 수행하고, 3 시간 동안 실온에서 수행하였다. 이어서, 리가아제를 65 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하여 열-불활성화시켰다.

시약	최종 양
벡터 (pIRESneoSV40)	~ 20 ng
삽입체 (Epo)	~ 200 ng
T4 DNA 리가아제	1U (1 ㎕)
완충액 (5x)	1x (2 ㎕)
H₂O	10 ㎕까지 첨가함

3.6.3 박테리아 및 배양 배지

JM109: (Promega, USA)

LB-배지: 카세인으로부터의 펩톤 10 g; 효모 추출물 5 g; NaCl 10 g, H₂O로 1000 ml로 조정하고, 5M NaOH로 pH 7.0로 조정함

LB 한천: LB-배지 1000 ml 중의 한천 15 g

LB-Amp: LB-배지 1000 ml 중의 앰피실린 100 ㎕ (100 mg/ml)

SOC 배지: 박토 (bacto) 트립톤 20 g; 효모 추출물 5 g; 10 mM NaCl; 3 mM KCl; 10 mM MgCl₂; 20 mM 글루코스, 10 mM MgSO₄

3.6.4 CaCl ₂ 를 사용하는 형질전환

항체반응 박테리아 (JM109)의 제조

LB 배지 10 ml에 이. 콜라이 (JM109)를 접종하고, 밤새 37 ℃에서 성장시켰다. 박테리아 배앵액 4 ml를 LB 배지에 1:100로 희석하고, OD_{260 nm}가 0.8에 도달할 때까지 성장시켰다. 박테리아를 4500 rpm에서 10분 동안 4 ℃에서 원심분리하고, 세포 펠렛을 0.1 M CaCl₂(4 ℃) 10 ml/사용한 박테리아 현탁액 50 ml에 재현탁하였다. 세포를 원심분리하고, 펠렛을 0.1 M CaCl₂2 ml에 재현탁하고, 총 용적 100 ㎕로 분취하고, 액체 질소에서 동결시키고, -80 ℃에 저장하였다.

형질전환

미리 냉각시킨 17 x 100 mm 폴리프로필렌 배양 튜브에서 플라스미드 DNA 5 내지 10 ng을 JM109 항체반응 박테리아에 첨가하고, 완만하게 혼합하고, 30분 동안 얼음 상에 두었다. 이어서, 세포를 45초 동안 수조에서 정확하게 42 ℃에서 진탕 없이 열-충격을 주고, 즉시 2 분 동안 얼음 상에 두었다. 이어서, SOC 배지 900 ㎕를 튜브에 첨가하고, 30분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하고, 박테리아 현탁액 100 ㎕를 LB-Amp 플레이트 상에 플레이팅하였다.

3.6.5 글리세린 배양의 스크리닝 및 확립

앰피실린 내성 콜로니를 삽입된 DNA 단편에 대해 PCR 기술로 스크리닝하였다. 앰피실린 내성 콜로니의 부분들을 PCR 반응 혼합물 및 클로닝된 DNA 단편 (하기 참조)에 대한 특정 프라이머와 혼합하였다. 양성 콜로니는 PCR-증폭된 DNA 밴드를 아가로스 겔 전기영동에서 나타냈다. 이들 콜로니를 이어서 추가 분석 및 플라스미드 정제를 위해 LB-Amp 배지에 증식시켰다. 추가 사용 및 저장의 경우 목적하는 박테리아 배양액 1 ml를 글리세린 (87％) 500 ㎕와 혼합하고, -80 ℃에서 저장하였다.

3.6.6 위자르드 (등록상표) 플러스 SV 미니프렙 DNA 정제 시스템 (Wizard (등록상표) Plus SV Minipreps DNA Purification System)

세포 재현탁 용액: 50 mM Tris-HCl, pH7.5; 10 mM EDTA, RNase A 100 ㎍/ml

세포 융해 용액: 0.2 M NaOH, 1％ SDS

중화 용액: 4.09 M 구아니딘 히드로클로라이드, 0.759 M 아세트산칼륨; 2.12 M 빙초산, pH 4.2

칼럼 세척 용액: 60 mM 아세트산칼륨, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 60％ 에탄올

LB-Amp 배지 2 내지 3 ml에 단일 콜로니를 접종하고, 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 용액을 원심분리하고 (12000 x g, 5분), 생성된 펠렛을 재현탁 용액 250 ㎕에 완전히 재현탁하고, 이어서 세포 융해 용액 250 ㎕에 재현탁하고, 튜브를 4회 뒤집기하여 혼합하고, 실온에서 1 내지 5분 동안 인큐베이션하였다. 이후에, 알칼리성 프로테아제 용액 (5분 동안 실온에 인큐베이션함) 10 ㎕ 및 중화 용액 350 ㎕를 첨가하였다. 튜브를 4회 뒤집기하여 즉시 혼합하고, 박테리아 융해물을 12000 x g에서 10분 동안 실온에서 원심분리하였다. 맑은 융해물을 스핀 칼럼에 옮기고, 원심분리하고 (12000 x g, 5분), 칼럼을 세척 용액 (750 ㎕/250 ㎕)으로 2회 세척하였다. DNA를 뉴클레아제-무함유 물 100 ㎕로 용리하였다.

3.6.7 플라스미드의 서열분석

삽입된 서열을 특정 프라이머를 사용하며 IBL (Gerasdorf, Austria) 및 GenXpress (Maria Woerth, Austria)로 서열분석하였다. Epo 및 SV40 초기 프로모터의 증폭 및 서열 분석에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 하기에 열거한다.

4. 플라스미드 p5의 작제

4.1 Epo 유전자 단편의 제조

Epo (인간 에리트로포에틴)에 대한 구조 유전자를 pSVGPIRNEO를 주형 DNA로서 사용하며 PCR하여 증폭하였다. Epo의 서열을 진뱅크 M 11319.1호로 얻었다. NotI 및 KspI에 대한 인식 부위를 상류 및 하류 프라이머 각각에 도입하였다. 프라이머를 하기와 같이 디자인하였다:

프라이머 2004-09 + 2004-10의 증폭 생성물을 상기와 같이 Pwo 중합효소 (로슈 다이어그노스틱스)를 사용하며 PCR하여 제조하였다. 604 bp의 생성된 DNA 단편을 DNA 단리 칼럼을 사용하여 정제하고, KspI 및 NotI로 절단하고, 겔-정제하였다. 생성된 592 bp KspI/NotI 단편을 하기에 기재된 삼중 라이게이션에 사용하였다.

4.2 종결 영역 SV40LTpolyA/IVS의 제조

프라이머를 상이한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 사용하여 디자인한 것을 제외하고는 p2-neo의 작제에 대해 상기 1.4 단락에 상술된 간단한 방식으로 PCR에 의해 pSV2neo로부터 SV40LTpolyA/IVS의 종결 영역을 재클로닝하였으며: KspI (=SacII)에 대한 부위를 상류 프라이머 내에 도입시키고, SacI 및 EcoRI에 대한 부위를 하류 프라이머 내에 도입시켰다.

프라이머 2004-11 + 2004-12의 증폭 생성물을 상술된 바와 같이 Pwo 중합효소 (로슈 다이어그노스틱스)를 사용하며 PCR로 제조하였다. 873 bp의 생성된 DNA 단편을 DNA 단리 칼럼을 사용하여 정제하고, KspI 및 SacI로 절단하였다. 858 bp의 생성된 DNA 단편을 이어서 겔-정제하였다.

4.3 p3 벡터 부분의 제조

p3 플라스미드 DNA를 순차적으로 NotI 및 SacI 각각 사용하며 절단하였다. DNA를 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 벡터 단편을 겔-정제하였다.

4.4 플라스미드 p5의 삼중 라이게이션 및 단리

플라스미드 p3의 NotI/SacI 벡터 부분, KspI/NotI Epo 유전자 및 KspI/SacI 종결 영역 SV40LTpolyA/IVS를 하나의 라이게이션 반응 (Ligation Express, Clontech)으로 라이게이션하였다. 형질전환체를 앰피실린 100 mg/ℓ을 보충한 LB 배지 상에서 선별하였다.

증폭된 단편 2004-09/2004-10 및 2004-11/2004-12 모두를 표지된 프로브로서 사용하며 콜로니 혼성화하여 삽입된 단편 모두를 함유한 양성 형질전환체를 스크리닝하였다. 프로브 모두와 양성 혼성화 신호를 갖는 10개의 콜로니를 "미디 (midi)" 규모 플라스미드 제조 (Qiagen)를 위해 선택하였다.

제한효소절단 분석을 효소 BamHI (1개 단편, 4723 bp), EcoRI (2개 단편, 2913, 1810 bp) 및 PvuII (4개 단편, 2513, 1204, 903, 103 bp)를 사용하여 수행하였다. 올바른 제한효소절단 단편을 나타내는 2개의 콜로니를 선별하고, 서열분석으로 확인하였다. pBluescript II SK+내로 클로닝된 모든 카세트를 서열분석하고, 예상된 뉴클레오티드 서열과 비교하였다. 모든 단일 뉴클레오티드를 성공적으로 확인할 수 있었다. 이 플라스미드를 p5로 지정하였다.

5. pEpo/neo의 작제

5.1 pEpo/neo 12-1의 작제

p5 플라스미드 DNA를 BamHI 및 EcoRI로 절단하고, SV40프로모터-Epo유전자-SV40터미네이터의 카세트를 나타내는 생성된 1792 bp 단편을 겔-정제하였다.

플라스미드 p2-neo를 BamHI 및 EcoRI로 또한 절단하고, 선형화된 벡터를 겔-정제하였다. 추가로, DNA를 알칼리성 포스파타제로 탈인산화시키고, 아미콘 마이크로퓨어 (Amicon Micropure) 효소 제거기로 정제하였다.

p5로부터의 4411 bp p2-neo 벡터 및 1792 bp 카세트 단편 모두를 라이게이션하고 (Ligation Express, Clontech), 이. 콜라이 SURE 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 앰피실린 70 mg/ℓ가 보충된 LB 배지 상에서 성장시킨 다양한 형질전환체로부터 단리하고, 제한 엔도뉴클레아제 PvuII, EcoRI 및 NcoI를 사용하여 절단함으로써 분석하였다.

예상된 단편 (EcoRI: 6191 bp, NcoI: 4085, 1326 및 780 bp, PvuII: 3273, 2130, 685 및 103 bp)을 나타내는 클론을 선별하고, pEpo/ neo12로서 절단하였다.

추가 정제를 위해, DNA를 이. 콜라이 SURE (상기 참조) 내로 재형질전환시키고, 단일 콜로니 (pEpo/neo-12-1)로 접종한 배양액으로부터 "미디-프렙" 방법 (Qiagen)을 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 제한효소절단 분석을 하기 효소를 사용하여 수행하였다: BamHI, HindIII, EcoRI, NcoI, NotI, PstI, SpeI, SphI, PvuII, NarI. 예상된 단편 및 크기를 볼 수 있었고, 올바른 pEpo/neo 클론으로서 클론을 확인하였다.

5.2 pEpo/neo의 최종 작제

pEpo/neo-12-1에서 Epo 유전자의 상류 영역을 출발 ATG로부터 -3 위치에서 변화시켰다. 부가의 뉴클레오티드 A를 도입하여 출발 ATG로부터 -3 위치에 퓨린 염기 G를 생성시켰다. 상기 위치의 퓨린 염기는 유전자의 발현 수준을 개선시킬 수 있다. 그러한 목적으로, 개조된 상류 프라이머 2004-09-a를 사용하여 Epo 유전자를 다시 증폭시켰다.

올리고 2004-09-a: 길이: 46머

5'- gggggcggccgcaatgggggtgcacgaatgtcctgcctggctgtgg -3' 서열 32

상기 설명한 바와 같이,Pwo중합효소 (Roche Diagnostics)를 사용한 PCR에 의해 프라이머 2004-09-a + 2004-10의 증폭 산물을 제조하였다. 생성된 605 bp의 DNA 단편은 DNA 단리 컬럼을 이용하여 단리하고,KspI 및NotI을 사용하여 분해하였다. 이어서, 생성된 593 bp의 단편을 겔-정제하였다.

pEpo/neo-12-1 플라스미드 DNA를 각각KspI 및NotI으로 분해하여 Epo 유전자를 제거하였다. 이어서, 5599 bp의 단편을 겔-정제하였다. 제조된 2개의 DNA를 서로 라이게이션시켰다 (라이게이션 익스프레스 (Ligation Express, Clontech)). 형질전환체로부터 유래한 플라스미드 DNA를, 70 mg/ℓ의 앰피실린이 보충된 LB 배지에서의 콜로니로부터 단리 및 정제하였다. 1차 스크리닝으로,NcoI을 사용하여DNA를 제한효소에 의해 분석하였다.

양성 클론을 선별하여, "미디 프렙 (Midi Prep)" 절차 (Qiagen)를 이용하여 DNA를 단리하였다.BamHI,HindIII,EcoRI,NcoI,NotI,PstI,SpeI,SphI,PvuII,NarI을 이용하여 확장된 제한효소 분석을 수행하였다. 예상된 단편 및 크기를 확인할 수 있었고, 이로부터 올바른 pEpo/neo 클론임이 증명되었다. pBR322 벡터 부분에 삽입된 전체 카세트 (SV40 초기_프로모터 -neo 유전자- SV40LT폴리A/IVS - SV40 초기_프로모터 -Epo 유전자- SV40LT폴리A/IVS)의 모든 단일 뉴클레오티드도 서열분석에 의해 확인하였다.

실시예 2 - 플라스미드 Epo/dhfr의 작제

1. p2-dhfr-CDS의 작제

1.1 dhfr 유전자의 제조

벡터 작제에 사용된 dhfr 유전자는 플라스미드 pLTRdhfr26 (ATCC 37295)에 존재하는 마우스 cDNA로부터 채취하였다. 마우스 dhfr cDNA (MUSDHFR)의 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 허가번호 L26316호로서 입수가능하다.

dhfr은 위치 56의 출발 ATG에서 위치 619의 정지 코돈 TAA까지의 코딩 영역을 함유하는 단편을 생성하도록 디자인된 프라이머를 사용하여 pLTRdhfr26으로부터 증폭하였다. 상기 설명한 네오마이신 내성 유전자의 증폭에 있어서는,HindIII 및SpeI 부위를 각각 증폭 프라이머의 상류 및 하류에 도입하였다. 또한,EcoRI 부위를 역방향 프라이머의SpeI 부위 옆에 도입하였다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 아래와 같다.

올리고2004-13:길이: 39머

5'- ggg gaa gct t at ggt tcg acc att gaa ctg cat cgt cgc -3' 서열 33

5'HindIII:aagctt-A(=MUSDHFR의 위치 56)TGgttcgaccattg...... 서열 34

올리고2004-14:길이: 42머

5'- ggggaa ttc act ag t tag tct ttc ttc tcg tag act tca aac - 3' 서열 35

5' Eco RI / Spe I:

gaattc actag-t(=MUSDHFR의 위치 619)tagtctttcttctcgtagacttcaaact..... 서열 36

프라이머 2004-13 + 2004-14의 증폭 산물은 상기 설명한 바와 같이Pwo중합효소 (Roche Diagnostics)를 사용한 PCR에 의해 제조하였다. 생성된 588 bp의 DNA 단편은 DNA 단리 컬럼을 이용하여 정제하고,HindIII 및EcoRI을 사용하여 분해하여, 겔-정제하였다.

1.2 p1-dhfr-CDS의 제조

증폭된EcoRI-HindIII dhfr 유전자 단편을 라이게이션 익스프레스 (Ligation Express; Clontech)를 이용하여 pSV2-neo로부터의EcoRI-HindIII 벡터 단편에 라이게이션시키고, 이를 이. 콜라이 (E. coli) 숙주에 형질전환시켰다. 앰피실린 50 mg/ℓ가 보충된 LB 배지에서 배양함으로써 형질전환체를 선별하였다. 앰피실린 50 mg/ℓ가 보충된 LB 배지 상의 콜로니로부터 형질전환체의 플라스미드 DNA를 단리하고 정제하였다.

콜로니로부터 플라스미드 DNA를 단리하여,EcoRI +ScaI (각각 2225 bp, 514 bp 및 473 bp의 3가지 단편)을 이용하여 제한효소 분석으로 확인하였다.

예상된 단편을 나타내는 플라스미드 DNA를 작제물의 관련 부분에 대한 서열분석에 의해 추가 확인하였다. 증명된 SV40 초기 프로모터 및 디히드로폴레이트 환원효소 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA를 p1-dhfr-CDS라 명명하였다. 서열을 분석한 결과, 공개된 MUSDHFR 서열로부터의 dhfr 유전자 내에 1개의 차이가 있음이 밝혀졌다 (구체적으로, MUSDHFR 서열의 451 위치에 있는 T가 C로 변화됨). 이후의 서열분석 결과, 이 변화는 공급원 플라스미드에도 존재하는 것으로 나타났다. 그러나, CTT와 CTC 둘 다 루이신을 코딩하기 때문에 그러한 변화가 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열의 변화를 유발하지는 않았다.

1.3 p2-dhfr-CDS의 제조

p1-dhfr-CDS 플라스미드 DNA를EcoRI +SpeI을 이용하여 분해하였다. 생성된 선형화 단편을 정제하고, SV40LT폴리A/IVS (상기 설명함)를 함유하는 증폭된 단편과 라이게이션시켰다. 형질전환 및 선별 후, 생성된 플라스미드를AccI을 이용하여 제한효소 분석하였다 (2994, 855 및 216 bp의 3가지 단편). 몇몇을 선별하여,HincII (각각 3466 bp 및 599 bp의 2가지 단편),AflIII (각각 2872 bp 및 1193 bp의 2가지 단편) 및BglI (각각 2371 bp 및 1694 bp의 2가지 단편)을 이용하여 추가로 분석하였다.

예상된 모든 단편을 올바른 크기로 나타내는 플라스미드 DNA를 서열분석에 의해 추가 확인하였다. 증명된 플라스미드를 p2-dhfr-CDS라 명명하였다.

2. pEpo/dhfr의 작제

2.1 pEpo/dhfr 21의 제조

p5 플라스미드 DNA를BamHI 및EcoRI으로 분해하고, SV40프로모터-Epo유전자-SV40터미네이터의 카세트를 나타내는 1792 bp의 생성 단편을 겔-정제하였다.

플라스미드 p2-dhfr-CDS를 또한BamHI 및EcoRI으로 분해하고, 선형화된 벡터를 겔 정제하여 수펠코 (Supelco) 스핀 컬럼으로 용출하였다. 추가로, 알칼리성 포스파타제를 사용하여 DNA를 탈인산화시키고, 아미콘 마이크로퓨어 (Amicon Micropure) 효소 제거기로 정제하였다.

4053 bp의 p2-dhfr-CDS 벡터와 1792 bp의 p5로부터의 카세트 둘 다의 단편을 라이게이션 (라이게이션 익스프레스; Clontech)시키고, 이. 콜라이 (E. coli) SURE로 형질전환시켰다. 앰피실린 70 mg/ℓ가 보충된 LB 배지에서 배양된 형질전환체 콜로니를, 프로브로서 Epo 유전자 (PCR 산물)를 사용하여 혼성화시켰다. 플라스미드 DNA를 다양한 양성 콜로니로부터 단리하고, 제한효소NcoI을 이용하여 분해함으로써 분석하였다.

예상된 단편 (NcoI: 4085 bp 및 1760 bp)을 나타내는 클론을 선별하고, 이를 pEpo/dhfr-21이라 명명하였다. 추가의 정제를 위해, DNA를 이. 콜라이 (E. coli) SURE로 (상기 참조) 다시 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단일 콜로니에 의해 접종된 배양물로부터 "미디-프렙" 절차 (Qiagen)를 이용하여 제조하였다 (pEpo/dhfr-21-1).

BamHI,HindIII,EcoRI,NcoI,NotI,PstI,SpeI,SphI,PvuII,NarI의 효소를 이용하여 제한효소 분석을 수행하였다. 모든 예상된 단편 및 크기를 확인할 수 있었고, 따라서 이 클론이 올바른 pEpo/dhfr-21임이 증명되었다.

2.2 pEpo/dhfr의 최종 작제

동시에, pEpo/neo의 경우에는 Epo/dhfr-21 중 Epo 유전자의 상류 영역을 출발 ATG를 기준으로 -3 위치에서 변화시켰다. 추가로 뉴클레오티드 A를 도입시켜 출발 ATG로부터 -3 위치에 퓨린 염기 G를 생성하였다. 실시예 1의 4.2 단락에 기재된 바와 같이 Epo 유전자를 다시 증폭시켰다.

pEpo/dhfr-21 플라스미드 DNA를KspI 및NotI으로 분해하여 Epo 유전자를 제거하였다. 이어서, 5259 bp의 단편을 겔-정제하였다.

제조된 DNA 둘 다를 서로 라이게이션 (라이게이션 익스프레스; Clontech)시켰다. 앰피실린 70 mg/ℓ가 보충된 LB 배지에서 배양된 콜로니로부터 형질전환체의 플라스미드 DNA를 단리 및 정제하였다. 1차 스크리닝으로NcoI을 이용한 제한효소 분석을 수행하였다.

양성 클론을 선별하고, "미디-프렙" 절차 (Qiagen)를 이용하여 DNA를 단리하였다.BamHI,HindIII,EcoRI,NcoI,NotI,PstI,SpeI,SphI,PvuII,NarI의 효소를 이용하여 확장된 제한효소 분석을 수행하였다. 예상된 단편 및 크기를 확인할 수 있었고, 따라서 이 클론이 올바른 pEpo/dhfr임이 증명되었다.

pBR322 벡터 부분에 삽입된 전체 카세트 (SV40초기 프로모터 -dhfr 유전자 - SV40LT폴리A/IVS - SV40초기 프로모터 -Epo 유전자- SV40LT폴리A/IVS)의 모든 단일 뉴클레오티드도 서열분석에 의해 확인하였다.

실시예 3 - pEpo/neo 및 pEpo/dhfr로부터 생성된 재조합 CHO 세포

1-5×10⁴개 세포/cm²을 25cm²T-25 플라스크 병 또는 96-웰 플레이트에 시딩하고, 하루가 지난 후에 리포펙션 형질감염을 수행하였다. 2개의 플라스미드를 50:5 = Epo/neo:Epo/dhfr의 비율로 혼합하고, 제조자의 프로토콜에 따라 리포펙틴 시약 (GIBCO/BRL)에 흡착시켰다.

요컨대, 본 발명자들은 0.25 ㎍ DNA/cm²및 1.5 ㎕ 리포펙틴-시약/cm²을 사용하였으며, 이 DNA/지질 칵테일을 세포층 1 cm²당 200 ㎕가 되도록 조정하였다. 이어서, 혈청-무함유 DMEM 배지 중의 세포 위쪽에 형질감염 칵테일을 4시간 동안 첨가한 후, DMEM-함유 배지를 배양용 배지로 교체하였다. 혈청-함유 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 본 발명자들은 선별 배지로 교환하였다. 형질감염된 세포-집합체를 우선 선별 배지에서 플레이트가 가득 차도록 배양한 후, 증폭 배지 (4.8×10^-8M MTX)에서 배양하고, Epo 생산에 대해 ELISA에 의해 세포 배양 상청액을 스크리닝하였다. 생산성이 가장 높은 것을 결정하고, MTX 농도를 2배 증가시켜 가장 우수한 생산자를 추가의 배양에 사용하였다. 7개의 재조합 세포 집합체를 선별하고, 증식 특성, Epo 생산성, 단백질 패턴 (웨스턴 블롯 분석에 의해), Epo 기능성 및 염색체 안정성을 비교하였다.

T25-플라스크에서의 형질감염은 T25-플라스크 당 2.5 ㎍ pEpo/neo, 0.05 ㎍ pEpo/dhfr 및 15 ㎕ 리포펙틴 (09/T25/1 및 09/T25/2)으로 수행하고, T25-플라스크 당 2 ㎍ pEpo/neo, 0.4 ㎍ pEpo/dhfr 및 15 ㎕ 리포펙틴 (09/T25/3 및 09/T25/4)으로 수행하였다.

추가로, 5개의 플레이트를 각각 플레이트 당 10 ㎍ pEpo/neo, 0.2 ㎍pEpo/dhfr 및 60 ㎕ 리포펙틴 (09/96/1 - 09/96/5)으로 형질감염시키고, 5개의 플레이트를 플레이트 당 8 ㎍ pEpo/neo, 1.6 ㎍ pEpo/dhfr 및 60 ㎕ 리포펙틴 (09/96/6 - 09/96/10)으로 형질감염시켰다. 플레이트 11 및 12는 각각 6.25 ㎍ pEpo/neo, 0.08 ㎍ pEpo/dhfr 및 37.5 ㎕ 리포펙틴으로 형질감염시켰다.

요컨대, 0.25 ㎍ DNA/cm²및 1.5 ㎕ 리포펙틴-시약/cm²을 사용하여, 이 DNA/지질 칵테일을 세포층 1 cm²당 200 ㎕가 되도록 조정하였다.

일련의 형질감염은 주로 마이크로타이터 플레이트에서 수행하였는데, 이는 선행 실험에서 1개의 배양 단위 당 클론의 수가 최대 3 내지 5개로 밝혀졌기 때문이었다. 이는 T-플라스크에서의 수백개 클론으로부터 단리하는 것보다 모노 클론성 형질감염체의 단리가 보다 용이함을 의미한다. 표 1은 96-웰 플레이트 당 클론의 수, 및 증폭 압력의 존재 및 부재 하의 ELISA 역가를 기재한 것이다. 형질감염된 세포 집합체를 우선 선별 배지에서 플레이트가 가득 차도록 배양한 후, 증폭 배지 (4.8×10^-8M)에서 배양하고, Epo 생산성에 대해 ELISA에 의해 세포 배양 상청액을 스크리닝하였다. 대략 1000개의 웰을 스크리닝하였고, 상기 배양액 중 50개가 MTX 농도 증가시에 Epo-비(比)생산성을 나타내는 것으로 시험되었다. 생산성이 가장 높은 것을 결정하고, MTX 농도를 2배 증가시켜 가장 우수한 생산자를 추가의 배양에 사용하였다.

선별 및 제1 증폭 단계는 96-웰 플레이트에서 수행하였고, 4.8×10^-8M MTX에서 증식하는 모든 클론을 스크리닝하고, 7개의 클론을 선별하여 09/96/1F5, 09/96/3D5, 09/96/3H5, 09/96/5D4, 09/96/5H1, 09/96/6C5 및 09/96/7E6으로 명명하였으며, 이들의 증식 특성, Epo 생산성, 웨스턴 블롯에서의 단백질 패턴, Epo 기능성 시험 및 염색체 안정성을 비교하였다.

모든 클론에 있어 2배 증식 시간 (doubling time)은 동일한 것으로 보였으며, 이들은 1주일에 1:2 내지 1:5로 2회 분할될 수 있었다. MTX 농도를 9.6×10^-8M에서 1.9×10^-7M로 증대시키는 것도 또한 생산성을 개선시킨 반면, 추가로 MTX 농도의 2배 증가는 ELISA 값에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 3.8×10^-7M MTX에서 서브클로닝을 수행하였다. 단일 배양액이 유의하게 다르지 않은 1.9×10^-7M MTX에서 면역형광을 분석하였다.

광학 현미경 및 코울터 계수기 핵 DNA 분석에 의해 세포 형태를 비교하였다. 클론 09/96/7E9, 09/96/6C5, 09/96/5H1, 09/96/5D4 및 09/96/3D5는 숙주 세포주로서의 CHO-DHFR^-에서 동일한 핵 크기 분포를 나타냈다. 반대로, 세포주 09/96/1F5 및 09/96/3H5는 보다 큰 핵을 가졌다. 선행 실험으로부터, 이러한 결과는 염색체의 수 증가에 기인함이 알려져 있다. 따라서, 추가의 안정화 시험을 위해 09/96/3D5를 사용하기로 결정하였다.

TF-1 세포에서 Epo에 대한 기능성 시험은 모든 7가지 배양 상청액에 있어 재조합 제약 제품과 비교시 동일한 기울기를 나타냈다.

각 MTX 농도에서 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 재조합 단백질을 시험하였으며, 모든 재조합체 배양 상청액에서 미미한 변화만이 관찰되었다. 이 클론들은 Epo를 생산하였다.

요약 및 논의

Epo를 발현하는 재조합 CHO-세포주의 선별 (진핵세포 발현 벡터의 작제에서부터 포유동물 세포의 형질감염까지) 및 폴리 클론성 Epo 발현 세포 집합체에 대해 설명하였다. 분석의 기초는 주로 ELISA, 면역형광법, 웨스턴 블롯팅 및 시험관내 기능성 시험이었다. 이들 모든 방법은 단지 ng/ml 양의 소량 생산 세포 집합체 뿐만 아니라 보다 안정화된 재조합 세포의 배양 상청액을 스크리닝할 수 있는 농도 범위에서 확립되었다.

유전자 카피수가 3.8×10^-7M MTX까지 단계적으로 증폭되는 재조합 CHO-집합체를 생성하였다. 이들 세포는 1주일에 1:3 내지 1:4로 2회 분할될 수 있으며, 매번 ELISA에서 상승된 Epo 수준이 검출되었다.

실시예 4 - 재조합 세포주의 추가 선별

재조합 세포 집합체 09/96/3D5를 추가의 안정화 시험에 사용하였다. MTX의 농도는 0.38 μM까지 단계적으로 증가하였다. 이 증폭 수준에서 재조합 3D5 세포를 웰 1개 당 10 및 20개의 세포로 서브클로닝하였다. ELISA에 의해, 웰의 배양 상청액을 단일 클론으로 스크리닝하였다. 표 2는 서브클로닝 조건, 및 0.38 μM MTX 존재 하의 재조합 세포 집합체 3D5의 효율을 나타낸 것이다. 단일 클론의 상청액 300가지를 시험하였다. 계대 배양 4일 후에 상승된 Epo 역가를 갖는 클론을,24 웰 플레이트에서 0.77 μM MTX로 선별하였다.

이들 클론 중 7개를 액체 질소에 보관하고, MTX 농도를 1.54 μM까지 증가시켜 유전자 카피수의 추가 증폭에 대해 선별하였다.

표 3은 플레이팅 조건 및 제2 라운드 안정화 시험 효율을 작성한 것이다. 여기서, 클론 09/96/3D5/1H9 및 09/96/3D5/18E5는 1.54 μM MTX로 최종 서브클로닝하였다. 웰 당 세포의 계수값이 4개의 세포로 감소하였다. 260가지 단일 클론을 스크리닝하였으며, 이중 각 계대배양액에서 20개를 초과하는 클론을 T-플라스크로 옮기고 비(比)생산성에 대해 스크리닝하였다. 최종 생성 클론을 비(比)발현율, 배양 조건 및 핵 크기 분포와 같은 기준에 따라 분류하였다. 4배체성 (tetraploidy)을 나타내는 클론은, 이러한 세포들이 생물반응기에서 복잡한 증식 패턴을 나타내는 경향이 있다는 경험상의 이유로 폐기하였다. 하기 6개의 서브클론 (1H9 서브클론 4가지 및 18E5 서브클론 2가지)을 선택하여 액체 질소에 동결시켰다.

09/96/3D5/1H9/4C2 09/96/3D5/1H9/6C2 09/96/3D5/1H9/6D4

09/96/3D5/1H9/15B4 09/96/3D5/18E5/7A6 09/96/3D5/18E5/15C3

실시예 5 - 혈청-무함유 배양 배지에 대한 적응

실시예 4로부터의 최종 재조합 세포주 6개를, 마지막 서브클로닝 단계 이후에 혈청-무함유 배양 조건에 대한 적응을 위해 선택하였다.

T25-플라스크 내에 약 5×10⁴개 세포/cm²으로 서브클로닝한 후 7 내지 12회 계대배양으로 세포를 시딩하고, 플레이트가 가득 차도록 3 내지 4일 배양하였다. 이 시점에서 배지를 혈청-무함유 적응 배지로 완전히 교체하고, 그 후 80％의 배지를 매일 새로 교체하였다. 현탁된 모든 세포를 배양하였다. 적응 시간 후 거의 모든 세포가 현탁액 중에 배양될 때, 클론을 1주일에 2회 계대배양하여 현탁 배양액으로 배양하였다.

동결보관 전에 클론을 혈청-무함유 적응 배지에서 11 내지 13회 계대배양하였다. 각 세포 5×10⁶개가 들어있는 6개의 앰풀을 혈청-무함유 동결 배지를 사용하여 모든 세포주에 대해 액체 질소로 동결시켰다. 해동 후, 클론을 혈청-무함유 생산 배지에서 배양하였다. 생산 클론을 선별하기 위한 분석용 특성화는 해동 후 2회 또는 3회 계대배양액의 상청액을 사용하여 수행하였다.

분석 시험에는 하기 시험이 포함되었다.:

ㆍ비(比)증식율 [μ] - (μ=ln(X₂/X₁)/일)

ㆍ비(比)생산성 [q_p] - (q_p= 산물-생성량×10⁶/(세포 계수값×일))

ㆍ웨스턴 블롯

ㆍ등전점 집속 (isoelectric focusing)

ㆍDNA 함량 및 안정성

ㆍ클론 안정성

모든 6가지 세포주는 혈청-무함유 배지에서 증식할 수 있었고, 1주일에 2회 분할되었다. 또한, 동결보관도 혈청없이 수행하였으며, 해동 후에 배양 배지를 혈청-무함유 생산 배지로 교환하였다. 이 제제는 글루코스 및 아미노산이 풍부화된 것이었다.

5회 계대배양 후, 다른 단백질 및 세포성 파라미터를 측정하고, 하나의 생산 클론 (09/96/3D5/1H96C2; 6C2로 약기함) 및 하나의 대용 (back up) 클론 (09/96/3D5/1H9/4C2; 4C2로 약기함)을 선별하였다.

실시예 6 - 재조합 세포주의 비교

실시예 4 및 5에서 유래한 6가지 세포주의 증식 특성을, 배양액 중 세포의 계수값을 측정할 뿐만 아니라 계대 배양시의 분할 비율을 측정함으로써 수주에 걸쳐 계산하였다. Epo 생산성은 ELISA에 의해 시험하였다. 이 데이타로부터 상기 설명한 바와 같은 비생산성 및 비증식율을 계산하였다.

표 4는 1:3의 분할 비율로 표준 배양 조건하에서 3일 동안 배양한 후에 얻은 데이타를 요약한 것이다.

분할 후 및 추가의 3일 후에 측정한 세포 계수값 (코울터 계수기에 의해 측정함)을 나타냈다.

환원 조건 하에서의 SDS-PAGE

6가지 세포주의 상청액을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 분자량의 차이를 비교하였다. 6가지 상청액은 고도로 글리코실화된 단백질에서 통상적으로 나타나는 번지는 (smear) 형태의 동일한 SDS 패턴을 나타냈다 (데이타 도시하지 않음).

이에 필적하는 시판품은 보다 뚜렷한 밴드를 나타내며 이동하였는데, 이는 이후의 프로세싱 단계 동안 뚜렷한 밴드를 분리하여 생긴 것으로 추정된다.

IEF-웨스턴 블롯

IEF-웨스턴 블롯 분석은 당단백질의 미세 불균질성 (microheterogeneity)을반영할 것이다. 겔에 로딩된 단백질의 양에 따라 14개의 밴드가 가시화되었다. 겔의 중간 부근에서 웨스턴 블롯 상에 특징적인 이중 밴드 1개가 나타났는데, 이 이중 밴드의 바로 아래 밴드를 밴드 번호 1로 정의하였고, 겔의 산성 부분에서 9 내지 10개의 밴드가 가시화되었다. 필적하는 시판품은 불균질 산물에서 밴드 번호 6 내지 9에 상응하는 4개의 주요 밴드를 나타냈다.

재조합 세포의 DNA 함량

DNA 함량은 세포주의 염색체 수와 비례한다. 재조합 세포주의 안정성은 부분적으로 염색체 계수값에 의해 영향을 받고, DNA 함량의 동일성은 숙주 세포주 (CHO dhfr^-)와의 비교에 의해 입증되었다.

요약 및 논의

Epo를 발현하는 CHO 세포주의 재조합체 단리는 본원에 설명되어 있다. 2 라운드 서브클로닝 후에, 6가지 세포주를 하나의 최종 생산 클론의 지정을 기초로 상이한 특성에 대해 비교하였다. 분석의 기초는 주로 ELISA, 웨스턴 블롯팅 및 IEF 시험 뿐만 아니라, FACS 분석에 의한 DNA 측정이었다.

재조합 배양 상청액의 웨스턴 블롯 패턴은 시판되는 정제 단백질에 비해 저분자량의 몇몇 부가 밴드를 나타냈다. 한가지 가능한 설명은 이들 부가 밴드가 이후의 프로세싱 단계에서 제거되어 비교 대상인 시판품과 동일한 패턴을 초래하는 이소형을 나타낸다는 것이다. 다른 가능성은 인공 밴드가 SDS의 불완전한 흡수에 의해 검출된다는 것이다. 등전점 집속은 모든 세포 배양 상청액에 대해 이들의 Qp와 무관하게 동일한 이소형 분포를 나타냈다.

가장 우수한 생산 클론이며 취급이 가장 용이한 클론은 클론 6C2이며, 이것을 생산 클론으로서 선택하였다. 대용 클론 4C2를 선택하였다. 이들 클론 둘 다는 롤러 병에서 증식할 수 있다.

실시예 7 - T-플라스크에서의 CHO 세포 배양

재조합 인간 에리트로포이에틴은 T-플라스크 중의 차이니즈 햄스터 난소 세포주 (CHO)에서 혈청-무함유 조건 하에 생산되었다. 이 배양액은 2.67×10⁵개 세포/ml로 시딩되었다. 인큐베이션 기간 3일 후, 최종 세포 밀도 9.35×10⁵개 세포/ml에 도달하였다 (μ = 0.42 일^-1)

실시예 1 내지 6은 Epo를 발현하는 다수의 CHO 클론의 제조를 설명한 것이다. 실시예 4 및 5에서 얻은 6가지 클론 중에서, 클론 CHO 6C2는 매우 높은 세포 비생산성 및 높은 비증식율로 인하여 선택되었다.

실시예 8 - 생물반응기에서의 CHO 세포 배양

아미노산이 보충된 50:50 DMEM/Hams F12로 구성되고 0.25％ 식물 펩티드, 0.1％ 루트롤 (lutrol), 1.54 M 메토트렉세이트 (MTX), 1 g/L 글루코스, 2.5 g/L NaHCO₃, 에탄올아민, 시트르산 제2철, 아스코르브산 및 아셀렌산나트륨을 함유하는 세포 배양 배지를 이용하여, CHO 세포주 6C2를 공급-배치식 (Fed-Batch)(T43C6C2) 모드로 150 L 생물반응기에서 배양하였다. 이 배지는 어떠한 값비싼 기능성 단백질 (재조합체 또는 천연 공급원으로부터 유래)도 함유하지 않았다. 동물 기원으로부터 유래한 성분들이 존재하였다. 이 세포들을 약 5×10⁵개 세포/mL로 56 L 배지 중에 시딩하였다. pO₂는 50％ 공기 포화로 설정하였고, 온도는 37℃로 설정하였고, pH는 7.0으로 설정하였으며, 이들을 발효 기간 동안 일정하게 유지하였다.

글루코스 농도는 1 g/L가 넘도록 유지하였다. 4일 후, 반응기를 150 L의 신선한 배지로 채웠다. 9일 후, 아미노산, 탄수화물 및 식물 유래 펩톤을 함유하는 양분 농축물 1875 mL를 첨가하여 배치를 확장시켰다. 10일 후, 양분 농축물 1875 mL을 더 첨가하였다. 2일 후 (12일), 에리트로포이에틴 함유 상청액을 수확하였다.

실시예 9 - 메토트렉세이트 부재 하 생물반응기에서의 에리트로포이에틴 생산

CHO 세포주 6C2를 공급-배치식 (Kamp 4 B5-1 및 2) 모드로 5 L 생물반응기에서 배양하였다. 배지는 실시예 9에서와 같았다. 제1 생물반응기 (Kamp 4 B5-1)는 배지 중 1.54 μM MTX가 되도록 설정하였고, 제2 생물반응기 (Kamp 4 B5-2)는 MTX가 부재하도록 설정하였다.

글루코스 농도는 1 g/L가 넘도록 유지하였다. 이 세포들을 약 5×10⁵개 세포/mL로 1250 mL 배지 중에 시딩하였다. pO₂는 50％ 공기 포화로 설정하였고, 온도는 37℃로 설정하였고, pH는 7.0으로 설정하였으며, 이들을 발효 기간 동안 일정하게 유지하였다. 2일 후, 반응기를 5 L의 신선한 배지로 채웠다. 6, 7, 8, 9 및 10일 후, 아미노산, 탄수화물 및 식물 유래 펩톤을 함유하는 양분 농축물 50 내지122 mL를 첨가하여 배치를 확장시켰다. 11일째에, 에리트로포이에틴 함유 상청액을 수확하였다.

메토트렉세이트 부재 하의 배양은 더 양호한 글리코실화 패턴으로 인해 보다 우수한 것으로 나타났다.

실시예 10 - 풍부화 배지를 사용한 생물반응기에서의 에리트로포이에틴 생산

CHO 세포주 6C2를 공급-배치식 (Kamp 11B 5-1 및 2) 모드로 5 L 생물반응기에서 배양하였다. 생물반응기 1은 실시예 10 (Kamp 4 B5-2)에서와 같이 작동시켰다. 생물반응기 2에서는 풍부화 아미노산이 보충된 50:50 DMEM/Hams F12로 구성되고 0.325％ 식물 펩티드, 0.1％ 루트롤, 6.4 g/L 글루코스, 2.5 g/L NaHCO₃, 에탄올아민, 시트르산 제2철, 아스코르브산 및 아셀렌산나트륨과 0.6 g/L 포스페이트를 함유하는 배양 배지를 사용하였다. 이 세포들을 약 5×10⁵개 세포/mL로 1250 mL 배지 중에 시딩하였다. pO₂는 50％ 공기 포화로 설정하였고, 온도는 37℃로 설정하였다. pH는 초기에 7.1로 설정하였다. 발효 과정 동안 pH를 6.9로 단계적으로 감소시켰다.

배양 과정에 걸쳐 생물반응기 2의 글루코스 농도는 3 내지 4 g/L 사이로 유지하였다. 2.5일 후, 반응기를 5 L의 신선한 배지로 채웠다. 6, 7, 8, 9 및 10일 후, 아미노산, 탄수화물 및 식물 유래 펩톤을 함유하는 양분 농축물을 첨가하여 배치를 확장시켰다. 11일째에, Epo 함유 상청액을 수확하였다.

양분이 풍부화된 배지 (아미노산, 글루코스, 식물 펩톤 및 포스페이트) 뿐만 아니라 7.1에서 6.9로의 pH 이동을 이용한 배양은 필적하는 글리코실화 프로파일에서 최종 Epo 농도를 2배가 넘게 증가시킴을 확인하였다.

실시예 11 - 동물로부터의 성분이 결핍된 생물반응기에서의 에리트로포이에틴 생산

CHO 세포주 6C2를 공급-배치식 (Kamp 17 B5-1 및 3) 모드로 5 L 생물반응기에서 배양하였다. 모든 파라미터는 달리 기재하지 않는 한 실시예 10 (Kamp 4 B5-2)에서와 같이 설정하였다. 생물반응기 2에서는 동물로부터 유래한 어떤 성분도 함유하지 않는 세포 배양 배지를 사용하였다. 예를 들어, 통상적으로 동물 (예를 들어, 연어 또는 인간 모발)에서 유래한 아미노산인 티로신 또는 시스테인은 합성 아미노산으로 치환하였다.

2.5일 후, 반응기를 5 L의 신선한 배지로 채웠다. 5, 6, 7, 8 및 9일 후, 아미노산, 탄수화물 및 식물 유래 펩톤을 함유하는 양분 농축물을 첨가하여 배치를 확장시켰다. 9일 내지 10일째에, 에리트로포이에틴 함유 상청액을 수확하였다.

동물 기원의 어떠한 성분도 함유하지 않는 배지는 필적할만한 최종 Epo 농도를 수득함이 밝혀졌다. 그러나, 배양물은 더 서서히 증식하였고, 부가의 양분 농축물을 첨가할 필요가 있었다.

실시예 12 - 풍부화된 배지 (비타민, 미량 원소)를 사용한 생물반응기에서의 에리트로포이에틴 생산

CHO 세포주 6C2를 공급-배치식 (Kamp 12 C) 모드로 10 L 생물반응기에서 배양하였다. 생물반응기는 하기 예외사항을 제외하고는 실시예 11 (Kamp 11 B5-2)에서와 같이 작동시켰다.

세포 배양 배지는, 풍부화 아미노산이 보충된 50:50 DMEM/Hams F12로 구성되고 0.325％ 식물 펩티드, 0.1％ 루트롤, 6.4 g/L 글루코스, 2.5 g/L NaHCO₃, 에탄올아민, 시트르산 제2철, 미량 원소 및 아셀렌산나트륨과 0.6 g/L 포스페이트를 함유하는 것을 사용하였다. 농축물의 함량을 2배로 하고, 비타민을 풍부화시켰다.

이 세포들을 약 5×10⁵개 세포/mL로 4500 mL 배지 중에 시딩하였다. pO₂는 50％ 공기 포화로 설정하였고, 온도는 37℃로 설정하였다. pH는 초기에 7.1로 설정하였다. 발효 과정 동안 pH를 6.9로 단계적으로 감소시켰다.

배양 과정에 걸쳐 생물반응기의 글루코스 농도는 3 내지 4 g/L 사이로 유지하였다. 3일 후, 반응기를 10 L의 신선한 배지로 채웠다. 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12일 후, 풍부화된 양분 농축물을 첨가하여 배치를 확장시켰다. 13일째에, 에리트로포이에틴 함유 상청액을 수확하였다.

실시예 13 - Epo의 단리

세포 분리

재조합 인간 에리트로포이에틴은 차이니즈 햄스터 난소 세포주 (CHO)에서 불연속 공급 배치 발효에 의해 혈청-무함유 조건 하에서 생산하였다. 발효 (4회, 약 1+2 배치 방식, 확장 단계, 2개의 다른 생물반응기 중에서) 후 1 L 당 약 200 내지 300 mg의 rhEpo를 함유한 수확된 브로쓰 (broth)를 2 내지 8℃로 냉각시키고, 중간보관 기간 없이 먼저 디스크 퇴적 분리기를 통한 원심분리에 의해, 그 후 심층 여과 (Seitz Bio 10 또는 Cuno A90M08, 처리량 = 약 300 L/m²필터 면적) 및 0.2 μ 여과 [PP 폴리그라드 (Polygrad) 0.1 ㎛, 사토브란 (Satobran) P (Satorius) 또는 듀로포어 (Duropore) 0.22 μ (Milipore)]에 의해 투명하게 하였다. 과도한 세포 용해 및 그에 따른 다량의 HCP (숙주 세포 단백질; host cell protein) 산물 오염을 피하기 위해, 먼저 최적 시점 (주 배양액 중에서 약 12일, 산소 소모 정체)에서 수확하는 것과, 두번째로 연약한 진핵 세포의 분리를 위해 특별히 디자인된 분리 장비 [예를 들어, 수소밀봉 (hydrohermetic) 공급 유입구가 설치된 CSC6 (6000 m²ECA, 15500 xg, 약 200 L/h, Westfalia) 또는 부드러운 디스크 유입구 및 가시형 (porcupine) 유출구가 설치된 BTPX 250 (11000 m²ECA, 13000 xg, 300 L/h, Alfa Laval)]를 사용하는 것이 중요하다. 접선 흐름 여과 (tangential flow filtration) 및 원심분리를 비롯한 다른 분리 기술의 비교 결과, 전단 응력 (세포내 마커 효소인 LDH의 방출에 의해 측정)에 의한 세포 용해의 차이가 밝혀졌다. 원심분리는 가장 부드러운 분리 (< 3U LDH/mg rhEpo)를 제공하며, 따라서 바람직하다.

별법으로, 상기 설명한 디스크 퇴적 분리기를 통한 원심분리만을 (심층 여과 단계 없음) 세포 분리 단계에 이용하였다. 별법으로, 상기 설명한 심층 여과 단계 (원심분리 단계 없음)를 이용하였다.

음이온 교환 크로마토그래피 (AEX)에 의한 포획

투명하게 한 후, 조 상청액을 약 3배 부피의 물로 희석하여 최종 전도율이 5 mS/cm 이하가 되도록 하고, Tris 염기를 사용하여 pH를 7.5로 조정한 후, AEX-포획 수지에 로딩하였다.

사용된 AEX-컬럼의 베드 (bed) 높이는 약 10 내지 20 cm였고, 이 컬럼은 유동성이 양호한 Q 세라믹 하이퍼D F (Q Ceramic HyperD F; Biosepra)로 패킹하였다. 이 컬럼을 20 mM Tris (pH 7.5), 50 mM NaCl로 평형화시켰다. 이어서, 희석된 세포 상청액을 4 내지 8 cm/분의 유속으로 컬럼에 로딩 (수지 1 mL 당 10 내지 15 mg의 rhEpo)하고, 컬럼을 10 내지 15배 컬럼 부피 (CV)의 평형 완충액으로 세척하였다. 고전도율의 완충액 (20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl)으로 교환함으로써 달성된 단계 용출에 의해 산물을 용출하였다. 피크 분획을 수집하였고, 그 수율은 약 50 내지 60％였다.

별법으로, 분획 수집액을 한외여과에 의해 농축시켜 중간 부피를 감소시키고 하기 침전 조건으로 표준화시켰다. 바람직하게는 5 내지 10 kDa 컷오프의 막을 사용하고, 약 20 mg/ml의 표적 산물 농도로 조정하였다.

황산 암모늄 침전

이전 단계로부터의 포획 수집액을, 통상적으로 2.4 M (NH₄)₂SO₄를 사용하여 숙주 세포의 오염 단백질을 침전시킴으로써 추가로 정제하였다. 이 황산 암모늄-농축 결과, 침전물에는 산물이 거의 발견되지 않고 순수한 HCP-무함유 상청액만 잔존시켰으며, 이는 하기 RPC 정제 전에 RPC 로딩액 중 (NH₄)₂SO₄의 농도가 240 mM미만이 되도록 희석해야만 했다.

침전은 1.5배 부피의 황산 암모늄 원액 (4 M (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris (pH 7.5))을 1배 부피의 포획 수집액에 첨가하고, 10 내지 15℃에서 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 수행하였고, 침전물의 분리는 심층 여과 (Seitz Bio 10 또는 Cuno A90M08) 및 0.2 μ 여과 (사토브란 P; Satorius) 또는 듀로포어 0.22 μ; Milipore)에 의해 수행하였다. 용출 부피가 큰 경우에는, rhEpo 용출 수집액을 희석 (< 5 mg rhEpo/ml)하고 HCP 침전은 임의의 UF-여과 단계 (10 kDa 컷오프)에 의해 개선될 수 있다.

황산 암모늄 침전은 소수성 상호작용 크로마토그래피보다 효과적이다.

선행 침전 단계에서 황산 암모늄의 함량을 감소시키기 위해, 산물을 함유하는 상청액은 상기 언급한 바와 같이 희석해야만 한다. 다른 방법은 한외여과/투석여과 단계를 거치는 것이다. 바람직하게는 5 내지 10 kDa 컷오프 막을 사용하고, 표적 황산 암모늄 농도를 240 mM 미만으로 하며, 산물 농도를 약 30 mg/ml로 조정한다. 투석여과 단계에 사용된 완충액은 20 mM Tris/HCl (pH 7.0)이다.

역상 크로마토그래피

다음 정제 단계는 하기의 몇몇 관점에서 유용한 역상 크로마토그래피이다: a) 상이한 이소형이 당 골격에 따라 잘 분리됨 (낮게 글리코실화/사알릴화된 형태 이전에 고도로 글리코실화/시알릴화된 용출액), b) 잔류 숙수 세포 단백질이 고성능 크로마토그래피에 의해 제거됨, 및 c) 크로마토그래피가 바이러스 제거 뿐만 아니라 유기 용매에 의한 바이러스 불활성화를 위해 강력한 단계임. 공급원 30RPC(Amersham Biosciences)는 중합체 수지로, a) 중간 압력 (< 10 bar)에서 러닝될 수 있고, b) 높은 NaOH 농도에서 제거될 수 있다. 바람직한 베드 높이는 10 내지 15 cm이며, 권장 로딩 범위는 패킹된 수지 1 ml 당 rhEpo 8 내지 12 mg이다.

RPC 단계 이전에, 산물을 함유하는 상청액은 황산 암모늄의 최종 농도를 0.24 M 미만으로 조정해야 한다. 이러한 조건화는, RPC 로딩 단계에서 이후의 온라인 희석 단계 (1배 부피의 rhEpo-상청액 + 4배 부피의 20 mM Tris/HCl pH 7.0 + 5배 부피의 20 mM Tris/HCl pH 7.0 중 50 부피/부피％ ACN)에 의해, 또는 값비싼 유기 용매를 절약하기 위해서 바람직하게는 로딩 단계 전에 다시 20 mM Tris/HCl pH 7.0에 대한 투석여과/농축 (10 kDa을 컷오프하는 UF)에 의해 수행될 수 있다. 컬럼은 20 mM Tris/HCl pH 7.0 중 25 부피/부피％ 아세토니트릴 (ACN)을 로딩하기 전에 평형화시켰고, 로딩한 후에 세척하였다. 산물은 ACN 25％에서 50％로의 선형 구배로 용출시켰고, 용매 농도를 즉각 감소시키기 위해 미리 4배 부피의 희석 완충액 (50 mM Tris pH 7.0)을 채워놓고 작은 분획으로 (특히 약 0.2 CV, 별법으로 약 0.3 내지 0.5 CV) 수집하였는데, 이는 응집을 유도하여 하기 AEX 크로마토그래피에 좋지 않은 영향을 미칠 수 있다. 용출 피크의 대략 처음 절반의 분획을 수집하여 RPC-수집액으로 하고, 이를 추가로 가공하였다. 이 수집액은 고도의 글리코실화를 선호하는 이소형을 함유하고 있었다. 이 분획화 체계에 의해, 세포 배양액에서 최대 20％까지 존재하는 O-글리칸이 Ser126 위치에서 손실된 des-O-글리코실화 rhEpo 산물이 제거되었다.

별법으로, 유기 용매에 노출시킴으로써 바이러스의 불활성화를 유도하기 위해, 분획을 미리 4배 부피의 상기 동일한 완충액 대신 0.5배 부피의 20 mM Tris pH 7.0으로 채워놓고 20 내지 40분 이상 인큐베이션시켰다. 이 인큐베이션 단계 후, 희석되지 않은 원래 분획의 부피를 기준으로 3.5배 부피의 20 mM Tris pH 7.0을 추가로 첨가하여 바이러스 불활성화를 중지시켰다.

바이러스가 불활성화된 분획 또는 불활성화되지 않은 분획을 수집하여 추가로 정제하였다. 수집은 대체로 상승 부위 중 최대 OD의 50 내지 100％에서 시작하여, 대략 하강 부위에서 70 내지 80％가 넘는 분획으로 종결하였다. 초기 용출 분획은 숙주 세포 단백질을 함유할 수 있는 반면, 후기 용출 분획은 낮은 시알릴화의 낮은 활성 이소형을 함유한다. 추가로, CZE 분석을 수행하여 특정 이소형에 대한 수집을 지지할 수 있다.

음이온 교환 크로마토그래피

이어서, 희석된 RPC-수집액을 고성능 AEX 컬럼에 로딩하였는데, 이 컬럼은 특정 이소형에 대한 선택을 추가로 보조하고 숙주 세포 단백질을 제거한다. 이때, 이소형은 등전점에 따라 (즉, 글리코실화의 등급에 비례하는 시알산의 수에 따라) 분리된다. 훌륭한 분리 효율을 나타내는 고성능 수지 Q-세파로스 HP (Amersham Biosciences)를 사용하였다. 베드 높이는 15 내지 20 cm 사이였다. 로딩량, 구배 및 베드 높이와 같은 모든 조건은 다소 낮은 산물 농도를 유지하도록 규정하였는데, 이와 같이 하지 않으면 용출시 용매에 의한 산물의 응집으로 인해 상당량의 포스트-피크 (post-peak)가 초래된다.

RPC-수집액은, 20 mM Tris pH 7.0으로 평형화된 Q 세파로스 HP에서 수지 1mL 당 2 내지 4 mg의 Epo로 로딩되었다. 평형 완충액을 사용한 세척 단계 후, 산물을 평형 완충액 중 0에서 300 mM NaCl로의 선형 염 구배 10 CV로 용출하였다. 용출 피크는 0.1 CV 또는 0.25 CV 분획으로 수집하였고, 분석 도구는 CZE에 의해 분석하여 원하는 에리트로포이에틴 이소형을 함유하는 올바른 분획 수집액을 찾아내었다. AEX-수집액은 통상 용출 분획의 제2 절반으로 구성되며, 여기서 고도로 글리코실화되고 시알릴화된 이소형이 용출된다.

상이한 발효 조건 또는 숙주 시스템으로 인해 공급원이 고도로 시알릴화된 이소형을 단지 소량으로만 함유하더라도, 정제 과정 중의 대조군으로서 모세관 구역 전기영동 (CZE)을 이용하여, 정확하게 규정된 에리트로포이에틴 이소형들의 혼합물을 제조하는 것이 가능하다.

CZE는 상이하게 대전된 이소형들을 분리할 수 있는 고해상도 방법이다. CZE는 각 분획에서 모든 단일 이소형에 대한 정량적 결과를 제공한다. 이 정보는 배치들 사이에서 일관된 이소형 프로필을 나타내는 특별한 분획의 수집을 가능하게 한다. 통상적으로, 후기 용출 분획만을 수집하기 때문에 초기에 용출되는 낮은 시알릴화 이소형은 누락된다.

크기 배제 크로마토그래피

마지막 크로마토그래피 단계에서, AEX-수집액을 크기 배제에 의해 마무리 처리하여 잠재적 이량체 및 고분자량 응집물을 제거하고 최종 제제를 위해 완충액 교환을 수행하였다. 이 단계에 사용된 수퍼덱스 (Superdex) 75 정제 등급 (Pharmacia)은 컬럼 부피의 15％까지의 높은 로딩 부피에서도 양호한 해상도를 나타낸다. 바람직한 베드 높이는 60 내지 80 cm 사이이다.

AEX-수집액 중에 산물이 높은 농도로 존재하도록 이전 단계의 AEX-크로마토그래피를 수행하는 것이 불가능하기 때문에, 겔 여과 전에 수집액을 농축해야만 했다. 이는 10 kDa UF-막을 사용한 한외 여과 단계에 의해 수행하여, 에리트로포이에틴이 약 10 mg/mL로 약 10배 농축된 UF-체류물을 얻었다.

약 3 내지 7 CV의 UF-체류물을, 20 mM Na-포스페이트 pH 7.0, 75 mM NaCl로 미리 평형화된 수퍼덱스 75 pg 컬럼에 직접 로딩하였다. 약 1 내지 1.5 CV 후에, 산물이 컬럼으로부터 용출되기 시작하였으며, 용출 피크를 수집하여 SEC-수집액을 얻었다.

나노 여과

잠재적 바이러스 로드 (load)를 제거하기 위해, 추가로 데드-엔드 (dead-end) 바이러스-여과 단계를 수행하였다. 이 여과는 15 nm만큼 작은 입자를 제거하도록 디자인된 특별한 막, 예를 들어 플라노바 (Planova) 15N (Asahi)을 사용하여 수행하였다. 다른 데드-엔드 나노여과 단위로는 PALL 울티포르 (Ultipor) VF 등급 DV20 또는 밀리포어 비레솔브 (Millipore Viresolve) NEF 카트리지 또는 캡슐이 있다. 특히 외피가 없는 작은 바이러스 (예를 들어, 파르보바이러스)의 경우, 바이러스를 제거하거나 불활성화시키는 다른 도구가 거의 없다.

멸균 여과된 SEC-수집액을 적합한 막으로 데드-엔드 필터를 통과시켰고, 여액은 최종 벌크 약물 물질을 나타냈다. 별법으로, 나노여과는 UF-농축과 크기 배제 크로마토그래피 사이에 삽입될 수도 있다.

상기 명세서에 언급한 모든 문헌은 본원에 참고로 포함된 것으로 간주한다. 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않는 본 발명의 바람직한 방법 및 시스템에 대한 다양한 변형 및 변화가 당업자에게는 명백할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 청구된 본 발명은 그러한 특정 실시양태로만 한정되는 것이 아님을 이해해야 한다. 더욱이, 분자생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한, 본원에 기재된 본 발명의 실시 모드에 대한 다양한 변형도 하기 청구항의 범위 내에 포함되는 것이다.

Claims

진핵 숙주 세포에

(a) (i) 목적 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 선별가능 마커를 코딩하며, 숙주 세포가 선별제와 접촉할 때 증폭되는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터; 및

(b) 제2 뉴클레오티드 서열이 다른 선별가능 마커를 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열로 치환된 것을 제외하고는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터와 본질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 폴리뉴클레오티드 벡터

를 도입하는 것을 포함하며, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 벡터와 제2 폴리뉴클레오티드 벡터가 숙주 세포의 게놈 내에 통합되는 것인, 목적 재조합 폴리펩티드를 발현하는 형질전환 진핵 숙주 세포의 제조 방법.
제1항에 있어서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 벡터를 숙주 세포 내로 동시에 도입하는 방법.
제1항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이 디히드로폴레이트 환원효소 폴리펩티드를 코딩하는 것이고, 선별제가 메토트렉세이트인 방법.
제1항에 있어서, 목적 재조합 폴리펩티드가 인간 에리트로포이에틴인 방법.
제1항에 있어서, 제3 뉴클레오티드 서열이 항생물질에 대한 내성을 코딩하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 항생물질이 G-418, 네오마이신, 또는 네오마이신 군의 다른 항생물질인 방법.
제1항에 있어서, 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 방법.
CHO 숙주 세포에

(a) (i) 인간 에리트로포이에틴을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 디히드로폴레이트 환원효소를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터; 및

(b) 디히드로폴레이트 환원효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이, G-418, 네오마이신, 또는 네오마이신 군의 다른 항생물질에 대한 내성을 부여하는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열로 치환된 것을 제외하고는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터와 본질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 폴리뉴클레오티드 벡터

를 도입하는 것을 포함하며, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 벡터와 제2 폴리뉴클레오티드 벡터가 숙주 세포의 게놈 내에 통합되는 것인, 인간 에리트로포이에틴을 발현하는 형질전환 진핵 숙주 세포의 제조 방법.
제8항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제2 뉴클레오티드 서열 및 제3 뉴클레오티드 서열이 SV40 초기 프로모터와 작동가능하게 연결된 것인 방법.
제8항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제2 뉴클레오티드 서열 및 제3 뉴클레오티드 서열이 SV40 거대 (large) T 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결된 것인 방법.
제1항의 방법에 의해 제조된 형질전환 숙주 세포를 제1 뉴클레오티드 서열이 발현되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 목적 재조합 폴리 펩티드의 생산 방법.
제11항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열의 증폭을 유발하는 선별제의 존재 하에 숙주 세포를 배양하는 방법.
제12항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이 디히드로폴레이트 환원효소 폴리펩티드를 코딩하는 것이고, 선별제가 메토트렉세이트인 방법.
제11항에 있어서, 목적 재조합 폴리펩티드가 에리트로포이에틴인 방법.
제11항에 있어서, 발현된 목적 재조합 폴리펩티드가 배양 배지 내로 분비되는 것인 방법.
제15항에 있어서, 발현된 목적 재조합 폴리펩티드를 배양 배지로부터 회수하는 것을 더 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 목적 재조합 폴리펩티드가 에리트로포이에틴인 방법.
(a) (i) 목적 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 숙주 세포의 게놈 내에 통합시 숙주 세포가 뉴클레오티드 서열의 증폭을 유발하는 선별제와 접촉할 때 증폭되는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터; 및

(b) 제2 뉴클레오티드 서열이 다른 선별가능 마커를 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열로 치환된 것을 제외하고는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터와 본질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 폴리뉴클레오티드 벡터

를 하나 이상의 염색체 내에 통합시켜 포함하는 형질전환 진핵 숙주 세포.
제18항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이 디히드로폴레이트 환원효소 폴리펩티드를 코딩하는 것인 숙주 세포.
제18항에 있어서, 목적 재조합 폴리펩티드가 에리트로포이에틴인 숙주 세포.
제18항에 있어서, CHO 세포인 숙주 세포.
(a) 디히드로폴레이트 환원효소 폴리펩티드 및 에리트로포이에틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및

(b) 상기 (a)의 폴리뉴클레오티드 서열과 다르며 에리트로포이에틴 및 항생물질에 대한 내성 부여 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열

을 하나 이상의 염색체 내에 안정하게 통합시켜 포함하는, 형질전환 포유동물 숙주 세포.
제22항에 있어서, 항생물질이 G-418, 네오마이신, 또는 네오마이신 군의 다른 항생물질인 숙주 세포.
제22항에 있어서, CHO 세포인 숙주 세포.
제22항에 따른 숙주 세포를, 인간 에리트로포이에틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 재조합 인간 에리트로포이에틴의 생산 방법.
제25항에 있어서, 숙주 세포를 메토트렉세이트의 존재 하에 배양하는 방법.
제25항에 있어서, 발현된 목적 재조합 폴리펩티드가 배양 배지 내로 분비되는 것인 방법.
제27항에 있어서, 발현된 목적 재조합 폴리펩티드를 배양 배지로부터 회수하는 것을 더 포함하는 방법.
(a) (i) 목적 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 숙주 세포의 게놈 내에 통합시 숙주 세포가 뉴클레오티드 서열의 증폭을 유발하는 선별제와 접촉할 때 증폭되는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터; 및

(b) 제2 뉴클레오티드 서열이 다른 선별가능 마커를 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열로 치환된 것을 제외하고는 제1 폴리뉴클레오티드 벡터와 본질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 폴리뉴클레오티드 벡터

를 포함하는 조성물.
제29항에 있어서, 목적 재조합 폴리펩티드가 인간 에리트로포이에틴인 조성물.
제29항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이 디히드로폴레이트 환원효소를 코딩하는 것인 조성물.
제29항에 있어서, 제3 뉴클레오티드 서열이 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 것인 조성물.