JPS6383100A - ヒト尿中アルブミンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明はヒト尿中アルブミンを高純度かつ高収率に回収
する方法に関する。

（ロ）従来の技術 従来、ヒトアルブミンはヒト血漿より各種分画を行ない
製造している。しかし、このヒト血漿は献血された血液
から得られるもので、大変貴重であり、不足がちである
。そのためわが国においても国内での献血だけではまか
ないきれず大部分海外からの輸入にたよっている。

（ハ）発明が解決しようとする問題点 そこで本発明者らは、この問題を解決するため、ヒトア
ルブミンを血漿からではなく、尿から製造する方法を確
立した。すなわち、ヒト尿中に機種に含まれるアルブミ
ンに注目しそれを効率よく精製する方法を開発したので
ある。

（ニ）問題点を解決するための手段及び作用本発明は以
下の工程からなることを特徴とするヒト尿中アルブミン
を製造する方法である。

（１１ヒト尿を限外ろ過膜により）濃縮する。

１２１　、　＋！ｌの′ｌａ縮液を陽イオン交換体に接
触させ、不純物を除去する。

＋３１　　＋２１の通過液を陰イオン交換体に接触させ
、不純物を除去する。

（４）　　（３）の通過液をＣ１ｂａｃｒｏｎ　Ｂｌｕ
ｅ　Ｆ３Ｇ−Ａ色素を固定化した担体に接触させること
でヒト尿中アルブミンを選択的に吸着させその後溶出す
る。

各工程をより詳細に説明する。

（１）限外ろ過膜による工程はヒト尿中のタンパク賞を
高４度にし、次工程での操作液量を小さくすること、及
び低分子性の不純物を除くことを目的とする。

ここで使用する限外ろ過膜としては、ヒト尿中アルブミ
ンを効率よ＜ｔｒｉｍし、低分子性の不純物が除ければ
良く、通常ＩＸＩＱ’〜３Ｘ１０’ダルトンの限外ろ過
膜が使用される。材質としてはポリアクリロニトリル系
、ポリスルホン酸系などがあげられる。

（２）　　陽イオン交換体の工程はヒトアルブミン（等
電点４．７〜５．２）より等電点の高い不純物を除去す
ることを目的とする。接触時の試料溶液の条件としては
、ｐｕｓ、ｏ〜８．Ｏ１電導度は２５℃において２〜２
０１１Ｓが良い。

ここで使用する陽イオン交換体としては、ヒトアルブミ
ンより等電点の高い不純物を効率よく除ければ良く、交
換基としてはＣＭ　（カルボキシメチル）基、　ＳＰ　
（スルホプロピル）基などがあげられる。担体の材質と
しては、高分子多ＳＩ　ＩＮ　、ポリビニルなどがあげ
られる。

（３）陰イオン交換体の工程はヒトアルブミン（等電点
４．７〜５．２）より等電点の低い不純物を除去するこ
とを目的とする。接触時の試料溶液の条件としてはｐＨ
６，０〜Ｂ、０　、　＠導度は２５℃において２〜２０
ｎ＋Ｓが良い。

ここで使用する陰イオン交換体としては、ヒトアルブミ
ンより等電点の低い不純物を効率よく除ければ良く、交
換基としてはＤＥＡＥ　（ジエチルアミノエチル）基、
　ＱＡＥ（フォータナライズドアミノエチル）基などが
あげられる。担体の材質としては高分子多［１，ポリビ
ニルなどが挙げられる。

＋４１　　Ｃｉ　ｂ　ａ　ｃ　ｒ　ｏ　ｎ　Ｂ　１　ｕ
　ｅ　Ｆ　３　Ｇ−へ色素を固定化した担体を使用する
工程はヒト尿中アルブミンを選択的に吸着させ、その後
溶出し高度精製することを目的とする。

吸着時の試料溶液の条件としてはｐＨ６，Ｑ〜８．０、
電導度は２５℃において２〜２０ｍ５が良い、吸着させ
たアルブミンを溶出させる緩衝液の条件はｐｏｓ、。

〜８．０、電導度は２５℃で３０〜ｌ　００＋ｍＳが良
い。

Ｃ１ｂａｃｒｏｎ　Ｂｌｕｅ　Ｆ３Ｇ−へ色素を固定化
する担体の材質としては高分子多糖類、ポリビニルなど
があげられる。

（ホ）発明の効果 本発明は、尿中から効率的にアルブミンを回収する方法
を提供するものであり、得られたアルブミンの性状分析
は血漿由来のものと同等であることを示した。

（へ）本発明を具体的に示すために実施例及び実験例を
示す。

実施例！ 新鮮尿１０（ｌをポリアクリロニトリル系限外ろ過膜（
分画分子量１万カツト）を用いて濃縮した。

この濃ｉ宿ン伎ｌｌをｐＨ７，０、電導度は２５℃にお
いて４．０’ｍＳに調整した後、あらかじめ０．０５Ｍ
リン酸糧街１ＰＨ７，０で平衡化したＣＭ−５ｅｐｈａ
ｒｏｓｅ　ＣＬ−６８（ファルマシア製）１００ｍｌを
つめたカラムに通し通過液を得た。

この通過液をあらかじめ０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ，
７，０で千１）ｉ化した［１ＥＡＥ　５ｅｐｈａｄｅｘ
　Ａ−２５（ファルマシア製）をつめたカラムに通し通
過液を得た。

その後、この液をｐＨ７，５、電導度は２５℃において
８．５ｍＳに調整し、あらかじめ０．ＩＭ　Ｔｒｉｓ塩
酸暖衝液ｐＨ７，５で平衡化したＭａｔｒｅｘ　Ｇｅｌ
　Ｂｌｕｅ　Ａ（アミコン製）１２０■ｌをつめたカラ
ムに通し、吸着させ、次にＩＭＮａＣＩを含んだ０．１
Ｍ　Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液で溶出させヒト尿中アルブミン
の精製品１．２ｇを得た。

この時の成績を表１に示す。ヒト尿中アルブミンの定量
法はヒト血漿由来アルブミン製剤を標準品として抗ヒト
血漿由来アルブミン抗体を用いたマンシー二法を用いた
。純度は各工程の試料を濃縮して純度検定の試料とし、
それらをセルロースアセテート膜による電気泳動の結果
から下式より求めた。

アルフミンの１届ｒＸ＠計十大維）万頁のｌ扉Ｊ又箭肛
また、回収率は より求めた。

表１　ヒト尿中アルブミン製造各工程の回収率と純度　
その１ 実施例２ 新鮮尿１０’ｌをポリスルホン酸系限外ろ過膜（分画分
子量３万カツト）を用いて濃縮した。

この濃縮液２．５１をｐＨ７，０、電導度は２５℃にお
いて８．０ｓＳに調整した後、あらかじめ０．１Ｍ＋Ｊ
ン酸緩衝液ｐｌ＋７．０で平衡化した５Ｐ−５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　Ｃ−２５（ファルマシア製）　５０ｍ１を加え
１時間攪拌後、静置し上清液を取った。

次に、この上清液をあらかじめ０．１ｉリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７，０で平衡化したＱＡＥ　５ｅｐｈａｄｅｘ＾−５
０（ファルマシア製）　５０１Ｉｌをつめたカラムに通
し通過液を得た。

その後、この通過液をＰＨ７，５、電導度は２５℃にお
いて８．５＋ｍＳに調整し、あらかじめＯ，１Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ塩酸緩衝液ＰＩＩ７．５で平衡化した５ｅｐａｂｅ
ａｄｓ　ＢＬ４３（三菱化成製）１００ｍｌをつめたカ
ラムに通しヒト尿中アルブミンを吸着させ、ＩＭＮａＣ
ｌを含んだ０．１Ｍ　ＴｒｉＳ塩酸緩衝液で溶出させ、
ヒト尿中アルブミンの精製品０．５ｇを得た。

この時の成績を表２に示す、ヒト尿中アルブミンの定量
法と純度測定法は実施例１と同じ。

表２　ヒト尿中アルブミン製造各工程の回収率と純度　
その２ 実験例１精製された尿中アルブミンの性状分析実施例１
で得られた精製尿中アルブミンとヒト血漿由来アルブミ
ンとを、 ■　セルロースアセテート膜による電気泳動分析 ■　分子ふるいタイプのＩＩＰＬｃ　ＴＳＫ−３０００
Ｓ讐（東洋曹達型）カラムによる分子量分析 の２点について比較したところ、 ■においては、両者の泳動結果に差がみとめられなかっ
た。

■においては、０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ１，０、流速
０．５ｍｌ／分の条件で両者の溶出時間に差がみとめら
れなかった。

実施例２の精製尿中アルブミンに関しても同じ結果であ
った。

従って精製尿中アルブミンは血漿由来アルブミンと電気
的性質及び、分子量が同しであることが分かった。

また、実施例１．２において尿中アルブミンは、抗ヒト
血漿由来アルブミン抗体を使用した測定法（マンシー二
法）で検出されたので、血漿由来アルブミンと抗原性が
同じであることが分かった。

以上より、精製尿中アルブミンと血漿由来アルブミンは
同等のものと判断された。

実験例２ ウロキナーゼに対する尿中アルブミンの安定効果をみる
ため以下の様な実験を行った。

ウロキナーゼ６万単位と、実施例１と同じ方法で精製し
た尿中アルブミン４０＋ｎｇを含むＯ，ＬＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）２ｍｌを調整した後、凍結乾燥を行っ
た。対照として、アルブミンを含まないものと、尿中ア
ルブミンをヒト血漿由来アルブミンに置き換えたものを
作成した。

これらを４０℃３力月間保存した後、ウロキナーゼの活
性残存率を測定した。測定に際しては、各種［３横体ず
つ実施した。結果を表３に示す。

なお、ウロキナーゼの活性は国際単位（＋、ｔｊ。

）で表示し、フィブリン溶解法により測定した。

表　　　　３ 検　　体　　　　活性残存率（％） アルブミン無添加　　　５７．７±７．６　　（ｎ−３
）尿中アルブミン添加　　８６．６±３．９　　（ｎ−
３）尿中アルブミン添加検体の活性残存率は、アルブミ
ン無添加検体の活性残存率より有意に高かった。一方、
尿中アルブミン添加検体とヒト血漿由来アルブミン添加
検体の活性残存率の間には、差はなかった。

実験例３ プロウロキナーゼに対する尿中アルブミンの安定効果を
みるため以下の様な実験を行った。

プロウロキナーゼ１０万単位と、実施例１と同じ方法で
精製した尿中アルブミン５０■を含むＯＩ　Ｍ　＋Ｊン
酸緩衝液（ｐＨ６，０）２ｍｌを調整した後、凍結乾燥
を行った。対照として、アルブミンを含まな゛いものと
、尿中アルブミンをヒト血漿由来アルブミンに置き換え
たものを作成した。

これらを４０℃３力月間保存した後、プロウロキナーゼ
の活性残存率を測定した。測定に際しては、各種Ｒ３検
体ずつ実施した。結果を表４−に示す、なお、プロウロ
キナーゼの活性はウロキナーゼ国際単位（１，Ｕ、）で
表示し、ペプチドＭＣＡ　　（Ｇｌｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−門ＣＡ（グルタリルーグリンルーフルギニルーアミノ
メチルクーマリ）〕（ペプチド研２発売元）を使用した
、合成基質法で測定した。

表　　　　４ 検　　体　　　　活性残存率（％） アルブミン無添加　　　５２．０±４．６　　（ｎ・３
）′尿中アルブミン添加　　８９．０±３．６　　（ｎ
・３）尿中アルブミン添加検体の活性残存率は、アルブ
ミン無添加検体の活性残存率より有意に高かった。一方
、尿中アルブミン添加検体とヒト血漿由来アルブミン添
加検体の活性残存率の間には、差はなかった。

実験例４ テイソシュブラスミノーゲンアクチベータ（以下　ＴＰ
Ａ）に対する尿中アルブミンの安定効果をみるため次の
様な実験を行った。

ＴＰＡ２０，０００単位と、実施例１と同じ方法で精製
した尿中アルブミン５０ｗを含むＱ、　　ＩＭ　リン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）２ｍｌを調整した後、凍結乾燥を
行った。対照として、アルブミンを含まないものと、尿
中アルブミンをヒト血漿由来アルブミンに置き換えたも
のを作成した。

これらを４０℃３力月間保存した後、ＴＰＡの活性残存
率を測定した。測定に際しては、各種類３検体ずつ実施
した。結果を表５に示す。なお、ＴＰＡの活性はウロキ
ナーゼ国際単位（１−、Ｕ。

）で表示し、フィブリン溶解法により測定した。

表　　　　５ 検　　体　　　　活性残存率（％） アルブミン無添加　　　２６．０±５．０　　（ｎ＝３
）尿中アルブミン添加　　８３．６±２．０　　（ｎ＝
３）尿中アルブミン添加検体の活性残存率は、アルブミ
ン無添加検体の活性残存率より千「意に高かった。一方
、尿中アルブミン添加検体とヒト血漿由来アルブミン添
加検体の活性残存率の間には、差はなかった。

実験２，３．４より、尿中アルブミンは、ウロキナーゼ
、プロウロキナーゼ、ＴＰＡに対し安定剤として使用可
能であり、その効果は、ヒト血ユ４由来アルブミンと同
等であると判断された。

代　理　人　　弁理士（８１０７）　　佐々木　清　隆
（ほか２名） 手続補正書 昭和６１年１１月１１日 昭和６１年特許願第２２７４４０号 ２、　発明の名称 ヒト尿中アルブミンの製造方法 名称　株式会社ミドリ十字 ６、　補正により増加する発明の数：　０７、　補正の
対象：　明ＩＩｍの「発明の詳細な説明」の欄８、　補
正の内容： 明１ｆｆｉの「発明の詳細な説明」の欄を、次のように
補正する。

（２）　同害第７頁の表１を、下記のｊ；うに補正する
。

純度　その１ 」 頁第５〜６１１目、ｒ（１，ＬＪ、）Ｊを１（ＩＵ）Ｊ
と抽出する。

（５）　同婁第１１頁の表３を、下記のように補正り′
る。

検　　体　　　　活性残存率（％） アルブミン無添加　　　５７．７±７．６　　（ｎ・３
）と補正する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒト尿を限外濾過膜により濃縮し、その後、陽イオン交
   換体、陰イオン交換体及びＣｉｂａｃｒｏｎ　Ｂｌｕｅ
   Ｆ３Ｇ−Ａ色素を固定化した担体を使用し精製すること
   を特徴とする尿中アルブミンの製造方法。