JPH04506030A - 化学生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 化学生成物 本発明は血漿濃縮物からの血液凝固因子分離用の改良された媒体並びにこれらの 媒体を用いた分離及び単離方法に関する。

血液凝固因子■（以下因子■と略記）は血液のタンパク質成分であって、その不 存在又は不足は血友病になる。

それは血友病患者への投与用に工業的規模で多数の国において献血血漿から得ら れている。因子■は非常に低い濃度で血漿中に存在しており、現プロセスでは因 子■の比活性が他の血漿タンパク質と比較して有意に増加した精製因子■含有産 物を生成しようと試みている。一般に因子■は複合体の形で単離され、その複合 体はフォンビルプラント因子（ｖ　Ｗ　Ｆ　）と共に形成される。

用いられてきた１つの因子■精製方法は因子■に親和性を有する分離媒体への吸 着及びそれからの溶出である。

その場合に他のタンパク質に対する媒体の親和性は因子■に関する場合と通常具 なり、一部の分離は特にクロマトグラフィー技術を用いて行ってもよい。

分離媒体は因子■の吸着にある程度の選択性を示すばかりでなく、多量の因子■ が単位容量当たりの分離媒体で吸着されかつ高回収率で溶出されうろことがこの ような分離技術では重要である。これまで、因子■用のこのような分離媒体は因 子■に親和性を有する官能基、特にアミノアルキル基をもつアガロースのような 不活性物質、例えばセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）から構成されていた。

このタイプの典型的物質はオーステンＤ　Ｅ　Ｃ（ＡｕｓｔｅｎＤＥＧ）　（１ ９７９：Ｂｒ、Ｊ、Ｈａｅｍａｔｏｌ、４３．８６９−６７４）　；オーステン ＤＥＧ及びＳｍ１ｔｈ　ＪＫ（１９８２：Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｓｏｓｔａｓ、 ４８．４６−４８）並びに米国特許１４，５０８．７０９号明細書で記載されて いる。

特に、ニールＧ、Ｇ、らは１９８５年７月にサンジエゴのポスター発表で記載し たが、因子■用の特定な分離媒体は特定のポリアミン類を含めた広範囲のアミン 類に結合されたセファロースであった　（Ｎｅａｌ　ＧＧ、５ｓｉｔｈ　Ｊに及 びＨｅｒｓｅｅ　Ｄ、１９８５．Ｔｈｒｏｓｂ、Ｈａｅｓｏｓｔａｓ、５４，７ ８．Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ＾ｂｓｔｒａｃｔ）。ポリアミン類は単純なモノアミ ン類よりも良い因子■吸着性を示すが、但しアルキレンジアミン類はジエチレン トリアミン又はジ（ｎ−プロピレン）トリアミンのようなジアルキレントリアミ ン類よりも良い結果を示した。

更に我々の研究では、高級ポリアミン基がニールらにより記載されたアミン基よ りも因子■の単離に関して良い結果を示すことができ、しかもメチレン基の数と 比較してプロトン化アミノ基の数の多いことが因子■に関する選択性を決定する 上で重要であることを示した。我々はこの関係から、式Ｉ　Ｎ（ＣＩ　）　ＮＨ （ＣＨ２”）　３ＮＨ２（Ｎ−（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミ ン）を有するポリアミンがＨＮ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ジエチレン トリアミン）又はＩ　Ｎ（Ｃ１２）　３ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２（ジ（ｎ−プロ ピレン）トリアミン）ノいずれかよりも良い結果を示し、トリエチレンテトラア ミン（ＴＥＴＡ）のような４以上の窒素原子を有するポリアミン類がもっと良い 結果を示すことをみつけた。ジエチレントリアミンの場合において各窒素の近接 は大体のｐＨレベル、例えばｐＨ５，５で３つすべての全プロトン化を妨げるが 、一方化合物 ＨＮ（ＣＨ）　ＮＨ（ＣＨ２）　３ＮＨ２を与えるもう１つのメチレン基の導入 は、Ｈ５，５で全プロトン化させる。

したがって本発明によれば、我々は多数のポリアミン基を有する非水溶性マトリ ックスからなるタンパク質分離用の分離媒体を提供するが、上記ポリアミン基は 少なくとも３つの塩基性窒素原子を有しており、上記塩基性窒素原子は少なくと も２つの介在炭素原子の鎖で互いに分離され、各ポリアミン基に全部で３つの窒 素原子がある場合には全部で５つのかかる介在炭素原子が存在する。

ポリアミン基は各々少なくとも４つの窒素原子を含むことが好ましい。

ポリアミン基は各々直鎖状又は分岐鎖状でもあるいは単環式又は多環式の基であ ってもよい。窒素原子は、ボジビニルアミン類又はポリアリルアミン類の場合の ように炭素原子の連続鎖に結合されたアミノ基で供与されても又はトリエチレン テトラアミン及びポリエチレンイミンのようなポリアルキレンポリアミン基の場 合のように炭素鎖を遮断していてもよい。このような基の合成は環構造を生じる 傾向を若干示すが、少なくとも一部のポリアミン基は単環式でもよく、その場合 に全部もしくは一部のポリアルキレンポリアミン基は２以上の窒素を含む単環を 形成するか又は炭素原子もしくは炭素及び窒素原子を介在させることで結合され たいくつかのこのような環が存在している。

マトリックスに結合されたポリアルキレンポリアミン基は同一でも又は異なって いてもよい。

窒素原子対の間に介在する炭素原子（即ち、炭素原子の鎖が側鎖又は置換基を除 いて窒素原子を直接結合している）は一般に直鎖又は分岐鎖アルキレン又はシク ロアルキレン基の部分からなっても又はそれを形成していてもよい。アルキレン 基が好ましい。窒素原子対の間に介在する炭素原子の数は３以下であることが好 ましい。ポリアルキレンポリアミン基が２つの窒素原子を含む環式基を有する場 合、例えば下記基のように２組の介在炭素原子が存在することは明らかであろう ：即ち直鎖ポリアルキレンポリアミンは自ら分岐して直鎖中の炭素又は窒素原子 いずれかに結合されたアミノ、アルキル、アミノアルキル又はポリアルキレンポ リアミン側基を有していてもよい。

ポリアミン基中の炭素原子はヒドロキシ又はオキソ基のような他の非酸性置換基 を有していてもよい。窒素原子は一級、二級、三級又は四級アミン基の中に含ま れる。

このため例えば、二級、三級又は四級アミン基における窒素原子は他の窒素原子 に結合された介在炭素原子に加えて例えば炭素原子１〜３を含むアルキル置換基 を有していてもよい。しかしながら、少なくとも１つの末端−級アミン基が存在 することが好ましく、一般に窒素原子は少なくとも１つの水素原子を有すること が好ましい。

最も好ましいポリアミン基はアルキレン基中に炭素原子２〜５、更に好ましくは 炭素原子２又は３を有する直鎖ポリアルキレンポリアミン基である。特に良い結 果はエチレン及びｎ−プロピレン基が交互になったポリアミン基を用いて得られ るが、これは良好なプロトン化と良好な窒素−炭素比とを組合せたからである。

このようなポリアミン基は下記式で表されるニ ーＮＨ−［（ＣＨ）　２ＮＨ（ＣＨ２）　３ＮＨＩ　ｍ−（Ｃ１２）　２ＮＨ２ 上記においてｍは整数である。

非水溶性マトリックスは通常有機マトリックス、例えば臭化シアン、エピクロロ ヒドリン、カルボニルジイミダゾール又は１．４−ブタンジオールジグリシジル エーテルのようなカップリング剤を用いて所要ポリアミン基を結合させるために 用いられるヒドロキシ等の官能基を有したアガロースのようなポリマー物質であ る。このためかかるカップリング剤はポリアミン基の開始部分を形成する結合基 を与える。これは炭素原子１〜１０を有するアルキレン基であることが好ましい が、酸素原子で介在されていても、ヒドロキシ又はオキソ基のような置換基を有 していてもよい。カルボニルジイミダゾールとカップリングさせることで形成さ れるカルバメート基のカルボニル結合基はオキソ置換基を有するメチレン基と考 えることができる。

本発明による媒体用として特に好ましいポリアミン基には以下がある： 表　１ −ｔ、−ＮＩ（（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）、ＮＨ２（Ａ）叱−ＮＩ（（ＣＨ２ ）２１１Ｉｌ（（ＣＩ（２）２Ｎ）Ｉ（１□）２ＮＨ２（Ｂ）−Ｌ−ＮＨ（ＣＨ ２）２ＮＨ（ＣＩ□）３１１１Ｈ（ＣＨ２）２ＮＨ２（Ｃ）−Ｌ−ＮＩ（（ＣＩ （２）３ＮＩ（（可２）−（α２）西　０）−Ｌ−Ｎ）１（０Ｉ２）３Ｎ）１（ ＣＨ２）３Ｎ）Ｉ（鳴）３町　α）（、−ＮＨ（ＣＨ２）２１１ＪＨ（Ｃ）１２ ）２ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２（Ｆ）−Ｌ−ＮＨ（ＣＨ２）２Ｎ Ｈ（ＣＨ２）、ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）へ（Ｇ）−Ｌ −ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（Ｃ）ｔ２）２ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（Ｃ１２）２ＮＨ （ＣＨ２）２ＮＨ２（Ｈ）上記においてＬは前記のような結合基である。

好ましいポリアミン基は上記（Ｂ）及びＣＧ）である。

ポリアミン基を有するマトリックスはポリマー親水性物質であることが好ましい が、これはアガロース、セルロース又はデキストラン（架橋していてもよい）の ような天然源であってもあるいはポリアクリルアミドＸ６よオリゴエチレングリ コール、グリシジルメタクリレート及びペンタエリトロ−ルージメタクリレート のコポリマーのような合成ポリマーであってもよい。マトリックスは大孔質シリ カのような無機物質でもよい。マトリックスは水性ゲルの形であることが好まし い。好ましいマトリックス物質としてはセファロース、セファデックス（Ｓｅｐ ｈａｄｅｘ）、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　、フラクトゲル（Ｐｒａ ｅｔＯｇｅｌ）及びトリスアクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ）の市販名を有する物 質がある。

本発明の分離媒体は適切なポリアミンを非水溶性マトリックスにカップリングさ せて製造されることが有利である。上記のように、カップリングは好ましくは炭 素原子１〜１０を有する二官能性分子、例えばエビクロロヒドリン（Ｌ　−−Ｃ Ｈ２Ｃｌ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、カルボニルジイミダゾール（Ｌ　−−Ｃｏ−） 又は１．４−ブタンジオールジグリシジルエーテル （Ｌ　−−ＣＨ２Ｃｌ（ＯＲ）Ｃ）１２−０−（ＣＨ２）、−０−ＣＨ２Ｃｌ（ ＯＨ）ＣＨ２−）であるカップリング剤を用いて通常行われる。このような試薬 はマトリックス上のヒドロキシ、アミノ又はスルフヒドリル基にカップリングさ せる。

マトリックス上におけるリガンドの担持量は通常１０〜９０、好ましくは２０〜 ６０μｓｏｌ／ｍｌゲルの範囲である。

本発明の分離媒体を製造する上で用いられる多数のポリアミン類は市販されてい る。一般に、それらはエチレンジアミンのような市販短鎖ポリアミン類とエチレ ン又はプロピレンジプロミドのような二官能性アルカン類との反応により合成さ れる。このような反応が混合物、例えば環状生成物を生じる場合、このような副 生成物は分別化により除去しても又は多くは単純に混合物中に残して、混合ポリ アミン基を有する本発明の生成物を得るため活性化マトリックスと反応させても よい。

前記のように、我々の研究では、因子■の比活性増加に関する良い結果のために 、固定化ポリアミンがｐＨ５，５（因子■の精製及びタンパク質沈降の回避のた めに最適のｐＨ）で高比率のプロトン化対非プロトン化窒素原子及び高比率の窒 素対炭素原子を有するべきであることを示した。

我々がこれまで研究してきたポリアミン類に関して、我々は下記式のように定義 される実験関数Ｑを導くことができた： Ｑ＝　１．Ｏｎ　Ｎ”＋　０．３ｎ　Ｎ　−０，３ｎ　Ｃ上記においてｎ　８本 はプロトン化窒素の数であり、ｎ２ＮはｐＨ５，５における非プロトン化窒素の 数であり（実験的に測定されたｐＫａ値から評価：　Ｃｒ１ｔ１ｃａｌＳｔａｂ 目［ｔｙ　Ｃｏｎ５ｔａｎｔｓ、Ｖｏｌｕ＋＊ｅ　２：Ａｍ１ｎｅｓ　ｂｙ　Ｓ ｗＩｔｈ、Ｒ，Ｍ。

及びＭａｒｔｅｌ　ｌ　、＾、Ｅ、、ＰＩｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ　ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ。

１９７５）　、ｎ　ｓ　Ｃは介在炭素原子の総数である。

表１における基の選択性は、Ｑの計算値が汚染タンパク質の相対的非存在率に関 する溶出因子■分画の純度と定性的意味で相関しているらしいことから、Ｑと関 連しているようである。下記表４は汚染タンパク質からの因子■活性の分離に関 する評点及びＱ値について掲載している。一般に、計算されたＱが少なくとも１ ．５であるリガンドを用いることが好ましい。

更に、因子■に対するリガンドのクロマトグラフィー性質は例えばＣｕ２＋等と の遷移金属結合又はＮ−アルキル化等の化学反応によりそれらの化学構造を変え ることで変化させてもよい。このため、例えば、アルキル化は分離媒体上に担持 されるリガンドのアルキル化剤、例えばヨウ化メチルのようなアルキルハライド との反応により行うことができる。

本発明のもう１面によれば、我々は本発明による分離媒体上に因子■含有物質を 担持させ、しかる後洗浄し、電解質濃度を増加させながら溶出させることからな る、因子■を少なくとも部分的に精製する方法を提供する。

本発明による分離媒体は本質的にクロマトグラフィー技術を用いてカラムで通常 用いられる。このため、媒体は通常カラムに充填され、ｐＨ範囲５，０〜８．０ 、最も好ましくはｐＨ５，０〜６．０、最適にはｐＨ５，５において適切な緩衝 液で平衡化される。有用な緩衝液はｐＨが水酸化ナトリウムで５，５に調整され た酢酸緩衝液、例えば１００１Ｍ酢酸である。例えば１００■Ｍで塩酸リジン、 例えば１０％Ｖ／Ｖでグリセロールのようなポリアルコール及び例えば１０ｍＭ でカルシウムイオンが緩衝液中に通常含有される。他の有用な緩衝液はビス−ト リス緩衝液、例えばｐＨ６、Ｏ〜６．５の１００５Ｍビス−トリス及びトリス緩 衝液、例えばｐＨ７〜８の１００厘Ｘトリスである。緩衝液はリガンドに応じて １．０Ｍ以内で塩化ナトリウムを含有していてもよい。

次いで分離用の因子■含有物質はカラムに充填されるが、固体である場合それは 通常適切な緩衝液、好ましくはカラムを平衡化するために用いられる緩衝液に溶 解される。一方、分離媒体はバッチ式でしばらく緩衝液平衡化因子■含有物質と 混ぜ、遠心により集め、カラムに注ぎ、しかる後クロマトグラフィー溶出させて もよい。この技術は特に因子■含有物質が血漿のように低い効力である場合に有 用である。因子■含有物質が血漿である場合、それは例えばセファデックスＧ２ ５のようなセファデックスを用いて適切な緩衝液、例えば塩化ナトリウム　。

と緩衝液交換してよい。それは吸着剤、例えばＤＥＡＥ−セファデックスとの処 理である汚染タンパク質、例えばプロトロンビンを除去するため前処理してもよ い。

充填の後に、望ましくはカラムを平衡化するために用いられた緩衝液で洗浄する 。

カラムの展開は平衡化に用いられた種類の緩衝液中で電解質の濃度を増加させた 溶液により行われる。電解質は慣用的に塩化ナトリウムであるが、但し他の塩、 例えば塩化カルシウムと共に塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニ ウム、クエン酸三ナトリウムも使用可能である。濃度勾配又は濃度の段階的増加 のいずれかが用いられる。電解質濃度の段階的増加が用いられる場合、低濃度の 電解質が因子■以外の結合タンパク質を除去するため最初に用いられ、しかる後 高濃度で因子■を除去するために用いられる。因子■溶出用に加えられる電解質 の濃度は例えばリガンドに応じて塩化ナトリウム０．２〜４．０Ｍの範囲である 。濃度勾配を増加させることによる溶出は２段階以上で行ってもよい。

分離用の因子■含有溶液には、例えば全血漿、プロトロンビンを除去するため前 処理された血漿、寒冷沈降物、中間純度濃縮物（ＩＰＣ）、高純度濃縮物（ＨＰ Ｃ）又はほとんどのフィブリノーゲン、フィブロネクチン及びビタミンに依存性 凝固因子を除去するため前処理された寒冷沈降物の溶液がある。これらの溶液は ウィルス不活性化のために溶媒−界面活性剤系、例えばリン酸トリーｎ−ブチル 及びツイーン（Ｔｖｅｅｎ）　８０で処理してもよく、我々はこれらの物質が因 子■の吸着及び溶出に影響を与えないことを発見した。

因子■は通常フオンビルプラント因子（ｖ　Ｗ　Ｆ　）と共にこのような出発物 質中に存在しており、この形で但し通常因子■対ｖ　Ｗ　Ｆの比率を増加させて 分離される。因子■を汚染するフィブリノーゲン及びフィブロネクチンの量はこ の方法で約５０倍に減少せしめられる。因子■の純度はこの方法で少なくとも５ ０倍まで増加せしめられる。

下記例及び製造は実例及び添付図面により示されているが、その場合に図１は様 々なリガンドからの因子■の溶出に要するＮａＣ１濃度及びＱ値の相互関係につ いて示し、各ポイントによる数値は表４で番号化されたリガンドに関する。

ポリアミン化合物は通常アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から人手し、一方ペン タエチレンへキサミンはフル力（Ｆｌｕｋａ）製であった。ポリアミンＣ及びＧ （表１）はＶａｎ　Ａｌｐｈｅｎ。

Ｊ、（Ｒｅｃｕｅｉｌ　ｄｅｓ　Ｔｒａｖａｕｘ　Ｃｈｌｍｌｑｕｅｓ　ｄｅｓ 　Ｐａｙｓ−Ｂａｓ、５５゜８３５（１９３６）及び同ジャーナル、５６．３４ ３（１９３７））に従い合成し、ポリビニルアミンは通常市販される試薬を用い てＤａｗｓｏｎ、Ｄ、Ｊ、、Ｇｌｅｓｓ、Ｒ，Ｄ、及びＶｌｎｇａａｒｄ、Ｒ， Ｅ、（Ｊ、Ａｓ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、９８．５９９８−６０００（１９７Ｂ））に従い合成した。カップリン グ剤はシグマ（Ｓｉｇ■ａ）（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル及 びカルボニルジイミダゾール）及びＢＤＨ（エビクロロヒドリン）から入手した 。

支持体 セファロース、セファデックス及びセファクリルはファルマシア（Ｐｈａｒ■ａ ｃｉａ）から入手した。トリスアクリルはＩＢＦ−ＬＫＢから入手した。フラク トゲルはＢＤＨから入手した。

一般的カツブリング操作 カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ） ゲルは濃度を増加させながら適切な溶媒、例えばアセトンで及び最後に主溶媒で の連続洗浄により非水性環境に移してもよい。

少量、例えば３．５ｇ／１００ｍ１ゲルのカルボニルジイミダゾールを室温で１ ５分間ゲルと反応させる。次いで活性化されたゲルをアセトンのような多量の溶 媒で迅速に洗浄し、しかる後環境温度で約１７時間ポリアミン化合物の水溶液と 反応させる。この溶液の濃度は約１０％Ｖ／Ｖであることが好ましく、ｐＨは９ 〜１１に調整する。次いでカップリングされたゲルを水、希酢酸及び最後に水で 徹底洗浄する。

ポリアミンが結合されている支持体がセファクリルＳ−５００であった場合には 、活性化、洗浄及びカップリングステップはすべて溶媒として乾燥アセトンを用 ｔ）て行った。更に、カップリングステ・ツブは４℃で行った。

エビクロロヒドリン（ＥＣＨ） 洗浄された吸引乾燥ゲル１００ｇに水素化ホウ素ナトリウム２００■ｇ及び２Ｍ 水酸化ナトリウム溶液５０１を加える。エビクロロヒドリン６Ｘ５＠ｌずつ及び 水酸化ナトリウム溶液５ｘｌＯｍｌずつを２時間かけて加え、その際にゲルを室 温で攪拌する。混合物を更に１５時間攪拌し、しかる後ゲルを水で徹底洗浄する 。

次いで活性化されたゲルを２Ｍ炭酸ナトリウム溶液に溶解されｐＨ約１１に調整 されたポリアミン化合物約１０％及び水素化ホウ素ナトリウム０．１％含有の等 容量の溶液に加え、混合物を６０℃で約２０時間攪拌する。

ゲルを水、水性酢酸及び最後に水で徹底洗浄する。

ポリアミンが結合されている支持体がフラクトゲルＴＳＫ　ＨＷ−５５であった 場合には、下記方法を用いた。洗浄された吸引乾燥ゲル１００ｇを約４０℃の温 度で２時間にわたり９Ｍ水酸化ナトリウム溶液６０１１％水８０１及びＥＣＨ６ Ｃ）＋ｌと混ぜる。ゲルを濾取し、水洗し、しかる後６０℃で３時間にわたりポ リアミンの１０％水溶液１００ｍ１と混ぜる。ゲルを水、しかる後水性酢酸及び 最後に水で徹底洗浄する。

１．４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＥ）１．４−ブタンジオー ルジグリシジルエーテルを用Ｉ＋）るカップリングはエビクロロヒドリンに関し て記載された場合と本質的に同一であるが、但し活性ステップ各；おいて吸引乾 燥ゲルを等容量の０．６Ｍ　ＮａＯＨ溶液及び等容量の１，４−ブタンジオール ジグリシジルエーテルと１ステツプで混ぜる。

リガンド（Ｃ）及びＣＧ）の合成（表１）構造Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２ ）３ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２（Ｃ）及びＨＮ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ （ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＩ　）ＮＨ（ＣＨ２）　２ＮＨ２（Ｇ）を有するこれらの リガンドはＶａｎ　ＡＩｐｈｅｎ、Ｊ、のＲｅｃｕｅｌｌ　ｄｅｓ　Ｔｒａｖａ ｕｘＣｈｌｓｔｑｕｅｓ　ｄｅｓ　Ｐａｙｓ−Ｂａｓ、５５．８３５（１９３８ ）及び同著者の同ジャーナル、５８，３４３（１９３７）に従い合成した。実験 の詳細は簡単には下記のとおりである＝１，２−ジアミノエタン（４５ｍｌ、　 ０．　６７ｓｏｌ）及び無水エタノール（４０ｇ＋Ｉ）を２５０１丸底フラスコ にいれ、それに水冷コンデンサー及び１．３−ジブロモプロパン（１２，５ｍｌ 、０．１２４＊ｏｌ）含有均圧化滴下漏斗を装備した。フラスコの内容物を磁気 攪拌し、１，３−ジブロモプロパンを穏やかな還流を維持するように滴下した。

添加終了後、混合物を還流下で１時間加熱した。攪拌を続け、水酸化カリウム３ ５ｇを加え、混合物を再度還流下で３０分間加熱した。固体ＫＢｒを濾取し、エ タノール及び１．２−ジアミノエタンを留去した。残渣を冷却して固体物及び黄 色液体を得たが、その液体はデカントした。液体を減圧（約１８　ｍａＨｇ）蒸 留により分別化した。沸点範囲１６４−１６６℃及び約２０８℃（１８ｍｓＨｇ ）を有する２分画を集めた。第一分画は第二の約２倍容量であり、双方とも淡黄 色であった。第一分画の沸点は常圧で２８０−２９０℃の範囲内であったが、こ れはそれが化合物（Ｃ）であることを同定する。Ｖａｎ　Ａｌｐｈｅｎの研究か ら判断して、高沸点側の分画は化合物（Ｇ）であろう。

タール様残渣は減圧蒸留後にフラスコ内に残留した。

アッセイ １、因子■アッセイは２段階凝固アッセイに関する標準的方法又はＰｒｏｖｓｅ 、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、５０．２ｌ−２５（１９８Ｂ）の方法に 従うコーチスト（Ｃｏａｔｅｓｔ）因子■アッセイキット（Ｋａｂｉ）の使用の いずれかにより行った。

２、全タンパク質はブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｒｏｒｄ　、　Ｍ、Ｍ 、　、　Ａｎａｌ　、Ｂｌｏｃｈｅｓ、　、　７２　、２４８−２５４（１９７ Ｂ）　）を用いて測定した。

３、ゲル上に固定されたリガンド濃度は一級アミノ基を検出するためビクリルス ルホン酸を用いて測定した。

湿潤静置ゲル０．５０ｍ１を室温で約１時間にわたり飽和水性テトラホウ酸ナト リウム中ピクリルスルホン酸の２　、　５　ｍｇ／ｓｌ溶液９．５１と混ぜた。

ゲルを遠心で集め、ペレットを上澄が無色になるまで数回水洗した。ペレットの 溶解は５Ｍ　ＨＣｌ　９．５ｍｌの添加及び７５℃加熱により行った。サンプル を５Ｍ　ＨＣＩで更に希釈しく２０又は４０倍のいずれか）、ＯＤ　値を測定し た。

ε−アミノカプロン酸の４０ｍＭ溶液を標準として用いた。

この溶液０．　５ｍｌをビクリルスルホン酸溶液９．５ｍｌと反応させた。この 溶液０．５１をサンプルの場合のように５Ｍ　ＨＣＩ　９．５ｍｌで処理し、Ｏ Ｄ　値を読取す、必要であれば５Ｍ　ＨＣＩで溶液を２倍希釈した。

ビクリルスルホン酸試薬ブランクも調製し、ＯＤ　値をサンプルではなく標準に 関する場合から差し引いた。

熱５Ｍ　ＭＣＩに不溶性である３種のゲル、即ちＴＥＴＡ−セファクリルＳ−５ ００、ＴＥＴＡ−フラクトゲルＴＳＫ　ＨＷ−５５及びＴＥＴＡ−トリスアクリ ルＧＦ２０００に関して、リガンド濃度を酸／塩基滴定により測定した。

４、特定のタンパク質（フィブリノーゲン、フィブロネクチン及びｖ　Ｗ　Ｆ　 ）をＬａｕｒｅｌｌ、Ｃ−Ｂ（１９７２）　５ｃａｎｄ、Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、１ｎｖｅｓｔ、、２９．５ｕｐｐ１．．１２４．２１−３７の方法に より分析した。

緩衝液 緩衝液Ａ：０．ＩＭ酢酸、０．１ＭリジンＨＣＩ。

１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、 １０５ＭＣａＣ１ｐＨ５，５０ ２ゝ 緩衝液Ｂ：０．ＩＭ酢酸、０．１ＭリジンＨＣＩ。

ｐＨ５，５０ 緩衝液Ｃ：０．２Ｍ酢酸、１ｓＭイミダゾール、ｐＨ５，５０ 緩衝液Ｄ＝緩衝液Ａと同様だが、但しｐＨ５，０緩衝液Ｅ：０．１Ｍビス−トリ ス、 ０．１ＭリジンＨＣＩ。

１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、 １０ｍＭＣａＣ１ｐＨ６，０ ２ゝ 緩衝液Ｆ：緩衝液Ｅと同様だが、但しｐＨ６，５緩衝液Ｇ：０．１Ｍトリス、０ ．１ＭリジンＨＣＩ。

１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、 １０５ＭＣａＣ１ｐＨ７，０ ２ゝ 緩衝液Ｈ：緩衝液Ｇと同様だが、但しｐＨ７，９すべての緩衝液は更に保存剤と して０．０２％アジ化ナトリウムを含有していた。

因子■含有溶液の調製方法 “寒冷沈降物”は解凍物の温度が０〜２℃に保たれるように新鮮凍結血漿を解凍 することで形成した。寒冷沈降物を遠心により解凍懸濁物から集め、２４１緩衝 液／ｋｇ血漿を用いてｐＨ７，０の２０ｍＭ）リス緩衝液に溶解した。この溶液 は“寒冷溶液”と呼ばれ、更に溶液を１０℃に冷却して遠心により生じた沈降物 を除去することにより精製した。上澄をｐＨ７，０に調整し、５１ゲル／ｋｇ原 血漿の割合でアルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）　（デンマークのスーパ ーホス（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ）製の２．０％ＡＩ（ＯＨ）３）で処理した。アルヒ ドロゲルを遠心除去し、上澄を膜濾過により滅菌し、ガラスバイアルに分配し、 凍結乾燥した。この調製物は“中間純度因子■濃縮物”　（ＩＰＣ）と呼ばれ、 原容量に再調製した場合におよそ下記の組成を有する： 因子■　：　５．６　ｔｕ／ｍｌ 全タンパク質　：２１層ｇ／ｍｌ ｖ　Ｗ　Ｆ　：　１２．５　ｕ／ｍｌ フィブリノーゲン：　１９　ｍｇ／−１フィブロネクチン二４．３−ｇ／ｍ１ 代わりに、寒冷溶液中の因子■をｐＨ６，４〜６．６及び温度２５〜３０℃で０ ．６〜０　、　９　Ｂ／ｍｌの最終濃度までのヘパリンナトリウムＵＳＰの添加 と沈降フィブリノーゲン及びフィブロネクチンの遠心除去により精製した。この 因子■に富む上澄は“ヘパリン上澄”と呼ばれ、およそ下記の組成を有する： 因子■　：　７．２　ｉｕ／■ｌ 全タンパク質　：　１２．２　ｍｇ／５ｌｖＷＦ　：　３３　ｕ／ｍｌ フィブリノーゲン：　４．５　ｓｇ／ｍｌフィブロネクチン＝１．９虐ｇ／ｍ１ 代わりに、寒冷溶液中の因子■を前記のようなヘパリンナトリウムの添加しかる 後濃度２〜１２％Ｖ／Ｖでアルヒドロゲルの添加により精製した。フィブリノー ゲン、フィブロネクチン及びアルヒドロゲルの重沈降物を遠心除去した。得られ た因子■に富む上澄は“ヘパリン／アルヒドロゲル上澄°と呼ばれ、ヘパリン上 澄の場合と同様の組成を有するが、但しビタミンに依存性凝固因子（例えば、因 子■、■及びＸ）は欠乏していた。

ヘパリン上澄中の因子■をｐＨ７，０及び３０℃で各々１．４８Ｍ及び２．３６ Ｍの最終濃度までのグリシン及びＮａＣ１の添加と遠心による因子■に富む沈降 物の回収によって更に精製した。沈降物を原血漿容量の約１１５２０で０．１０ Ｍ塩化ナトリウム、０．ＯＩＭ）リス、０．０１Ｍクエン酸ナトリウム、１．２ ｍＭ塩化カルシウム、１．５％（ｖ／ｖ）スクロース、ｐＨ６，９緩衝液に再溶 解し、しかる後ゲル濾過媒体セファデックスＧ−２５を用いて同緩衝液で脱塩し た。

因子■溶液を膜濾過により滅菌し、無菌ガラスバイアルに分配し、凍結乾燥し、 ８０℃で７２時間加熱してウィルスを不活性化した。この調製物は“高純度濃縮 物”（ＨＰＣ）と呼ばれ、原容量に再調製した場合におよそ下記の組成を有する ： 因子■　：　２３．５１ｕ７１１ 全タンパク質　二６．０１ｇ／ｇＪ Ｖ　Ｗ　Ｆ　：　６２．３　ｕ／ｍｌ フィブリノーゲン：　４．６　ｓｇ／ｍｌフィブロネクチン：　０．３１　Ｂ７ ｍｌカラムクロマトグラフィー すべてのクロマトグラフィーは室温及びカラムサイズに適した流速で行った。溶 出液中における全タンパク質はＬＫＢユビコード（ＬＫＢ　Ｕｖ［ｃｏｒｄ）を 用いて２８０　ｎｗでモニターした。高純度濃縮因子■サンプルを室温３７℃で 適切な充填緩衝液に溶解し、不溶性物質をカラム充填前に遠心で除去した。充填 後、カラムをＯＤ　がべ−スライン近くになるまで充填緩衝液で洗浄した。次い でタンパク質を塩濃度のステップ又は勾配増加のいずれかにより溶出させた。勾 配は螺動ポンプ〔ギルソン（Ｇｉ　１ｓｏｎ））の３チヤンネルを用いて形成さ せた。次いで溶出因子■活性の位置を測定し、ＯＤ　）レース上にプロットした 。分画中の塩化ナトリウム濃度は導電率計及び適切な検量曲線を用いて決定した 。溶出を段階的に行った場合には、低濃度側は約５％以上の充填因子■活性を除 去せずに結合タンパク質を溶出させるために最初に用い、しかる後高濃度側を因 子■を除去するために用いた。適切な電解質濃度は各マトリックス毎に決定した 。

前記カップリング方法、リガンド及び支持体を用いて、下記分離媒体を合成した 。

ポリアミンリガンドＡ−セファロース４Ｂ−ＥＣＨカップリングポリアミンリガ ンドＢ−セファロース４Ｂ−ＥＣＨカップリングポリアミンリガンドＣ−セファ ロース４Ｂ−ＥＣＨカップリングポリアミンリガンドＤ−セファロース４Ｂ−Ｅ ＣＩＩカップリングポリアミンリガンドＥ−セファロース４Ｂ−ＥＣＨカップリ ングポリアミンリガンドＦ−セファロース４Ｂ−ＥＣＩ（カップリングポリアミ ンリガンドＧ−セファロース４Ｂ−ＥＣＩカップリングポリアミンリガンドＨ− セファロース４Ｂ−ＥＣ）Ｉ力・ｙプリングポリアミンリガンドＩ−セファロー ス４Ｂ−ＥＣＨカップリングポリエチレンイミン−セファロース６Ｂ−ＥＣＨカ ップリングポリアリルアミン−セファロース４Ｂ−ＥＣＨカップリングポリビニ ルアミン−セファロース４Ｂ−ＥＣＨカップリングＴＥＴＡ−）リスアクリルＧ Ｐ２０００−ＣＤＩカップリングＴＰＴＡ−セファデックスＧ２５−　ＥＣＨカ ップリングＴＥＴＡ−セファクリルＳ−５００−ＣＤ１カツプリングＴＥＴＡ　 −７ラ’）　）　’７’　ルＴＳＫ　ＨＷ５５−ＥＣ）（カップリングＴＥＴＡ −セファロース６Ｂ−ＥＣＨカップリングＮ−メチル化ＴＥＴＡ−セファロース ４Ｂ−ＥＣＨカップリングＴＥＴＡ−セファロース４Ｂ−ＢＤＢカップリングＴ ＥＴＡ−セファロースＣＬ−８８−ＣＤＩカップリング帆１ ＥＣＨカップリングされたＴＥＴＡ−セファロース４Ｂ１ＲＰＣの精製 ＴＥＴＡ−セファロース４Ｂ　（ＥＣＨカップリング、２７　μｓｏｔ／ｍｌリ ガンド濃度）の１０ｍ１カラム（１，６Ｘ５．０ｃｍ）を緩衝液Ａ約５０１で充 填かつ平衡化した。

緩衝液Ａ２０１に溶解された２バイアルの高純度濃縮物のサンプル（バッチ８Ｙ ２２７８）をカラムに流速６０　ｍｌ／ｈｒで充填した。次いでカラムを緩衝液 Ａ（５０■１）、緩衝液Ａ＋０．２５Ｍ　ＮａＣｌ　（１００ｍｌ）及び最後に 緩衝液Ａ＋１．０Ｍ　ＮａＣ１（４０ｍｌ）で連続的に洗浄かつ溶出した。１０ −１分画を集め、塩濃度の変化に従いプールした。因子■活性及び全タンノくり 質量を出発物質及びプールされた分画において測定した。結果は表２で示されて いる。

色ｌ 因子■　全タンパク質　比活性 （Ｉｕ）　（ｍｇ）　（ｉｕｌｌｇ） 出発サンプル　４３ｇ（１００％）　７３　８．０非吸着　３Ｂ（８％） ０．２５Ｍ　ＮａＣｌ溶出液　７（１，８％）１．００Ｍ　ＮａＣｌ溶出液　２ ９Ｇ（６８％）　０．８６　３４４ＴＥＴＡ−セファロース４Ｂ（３３μｓｏｌ ／ｍｌ、ＥＣＨ力・ノブリング）の１．０１１カラム（０，７Ｘ２．６ｃｍ）を 緩衝液Ａで平衡化した。

ヘパリン上澄（８倍容ｉｉ）をグリセロール（１倍容量）、ｐＨ５，５のＩＭリ ジンＨＣ１／ＩＭ酢酸（１倍容量）及び１Ｍ塩化カルシウム（０，１倍容ｉｔ） の混合物の添加によりクロマトグラフィー用に調製した。因子■約１００ｉｕ含 有サンプルをカラムに流速１０ｓｌ／ｈｒで充填した。次いでカラムを緩衝液Ａ （１０ｍｌ）、緩衝液Ａ十０．２０Ｍ　ＮａＣ１（１０ｍｌ）及び最後に緩衝液 Ａ＋１．０Ｍ　ＮａＣ１（５ｍｌ）で連続的に洗浄した。

分画ブールを例２のように処理し、因子■活性、全タンパク質、ｖＷＨ，フィブ ロネクチン及びフィブリノーゲンに関して試験した。結果は表３で示されている 。

表３ 因子　全タン　ｖＷＰフィブ　フィブリ■　バク質　ロネク　ノーゲン （ｉｕ）　（ａｇ）　（ｕ）チン（ｍｇ）　（ｍｇ）出発サンプル　９８　１１ ２　３４２　６．５　４７非吸着　１．５　１０４　１４９　４．９　４８０． ２０Ｍ　ＮａＣ１溶出液０．９　２　３７　１．１　０．６８種のポリアミンリ ガンドにＥＣＨカップリングされたセファロース４８％ＲＰＣの精製 一連の８種の異なるポリアミンリガンド（表１）がＥＣＨカップリングにより結 合されたセファロース４Ｂゲルを下記方法で因子■精製に関して試験した。１０ １カラム（１，６Ｘ５．Ｏｃ■）を緩衝液Ｂで充填し、平衡化させた。サンプル は高純度濃縮物、バッチ８Ｙ２２７８であり、緩衝液Ｂ１０１中１バイアル濃縮 物の溶解により調製した。カラムを流速６０ＰＩ／ｈｒで充填し、しかる後溶出 液のＯＤ　がベースラインに近づくまで緩衝液Ｂで洗浄した。次いで結合タンパ ク質の溶出を緩衝液Ｂ中で通常全容３１１３０＊Ｉの直線塩化ナトリウム勾配に より行った。

勾配はすべてのケースで０．０〜１．０Ｍであったが、但し化合物Ｇの場合には カラムを最初０．５０ＭＮａＣ１（４０ｍｌ）で洗浄してから０．５０〜１．５ Ｍ勾配（１３０ｍｌ）を用い、化合物Ｈの場合には０．０〜１．３Ｍ勾配（１３ ０ｍｌ）を用いた。

勾配は螺動ポンプ（ギルソン）の３チヤンネルを用いて形成し、１０１分画を集 めた。溶出因子■活性及び塩化ナトリウム濃度（導電率計及び適切な検量曲線を 用いて決定）をＯＤ　トレース上に分画数値に対してプロツトした。結果は表４ で示されているが、その場合に“相対的能力“と記載された欄は溶出タンパク質 のピークからの溶出因子■活性のピークの分離の目視評価に関する。

表４ セファロース４Ｂ　ピーク因子■　相対的リガンド　上のリガンド　が溶出した 　Ｑ値濃度（μｌ１ｏｌ／ｍｌ）　［ＮａＣｌ］（ｓ＋Ｍ）　能力１　１．４． ８−）リアザオクタン　３０　５３０　＃＊　Ｊ、、５ａ−ｗＱ値は仮想ｐＫａ 値を用いて計算した：６窒素原子はりガント７の場合ｐＨ５，５でプロトン化し た；４窒素原子はリガンド８の場合ｐ）ｌ’３．　５でプロトン化した。

これらの結果から、計算Ｑ値、とリガンドの能力との間に良好な関係が存在する ことがわかる。因子■ピークが図１で示されたように溶出され・た塩化ナトリウ ムの濃度とＱ値との間にも直線的関係が存在する。

小さな方のポリアミンに関する場合と同様の方法を用いて、セファロースゲルを ３種のポリマーアミノ化合物：ポリエチレンイミン（ＰＥ　Ｉ）　、ポリビニル アミン及びポリアリルアミンを用いて製造した。これらのマトリックスは例２及 び４の一般的方法を用いて因子■精製に関し試験した。

ＰＥｌ−セファロース６Ｂ　（ＥＣＭカップリング）２．０１のカラム（１，６ Ｘ１．Ｏｃ■）を緩衝液Ａ＋０．５Ｍ　ＮａＣ１で平衡化させた。２バイアルの 高純度濃縮物（バッチ８Ｙ２２７８）を同緩衝液２ｏ１１に溶解し、そのカラム に流速１８ｍ１／ｈｒで充填した。カラムを短い（２８ｍｌ）０．５〜０．７Ｍ 　ＮａＣ１勾配しかる後０．７〜２．０Ｍ　ＮａＣ１勾配（２５ｍｌ）で連続的 に溶出させた。結果は表５で示されている。

表５ 因子■　全タンパク質　比活性 （［ｕ）　（−ｇ＞　（ｉｕ／１ｇ） 出発サンプル　４５４（１００％）　１５２　２．９７非吸着　３Ｂ（８％）　 ｔｉｌｌ　Ｏ，３００，５−０，７Ｍ　ＮａＣｌ溶出液　３（０，７％）　３． ３　０．９２０．７−２．０Ｍ　ＮａＣｌ溶出液３７４（８２％）　０．７６　 ４９２（１６６倍） このゲルを例５（１）の方法と同様にして試験した。緩衝液Ａ＋０．９０Ｍ　Ｎ ａＣ１を用いてサンプルを調製しかりカラムを平衡化し、サンプルの充填後にカ ラムを充填緩衝液で洗浄し、しかる後結合タンパク質を０．９〜２．３ＭＮａＣ １勾配で溶出させた。充填された因子■の６％が吸着されず、８２％が約５０倍 の精製度で溶出液中に回収された。

このゲルを例５　（ｉｆ）の方法と同様にして試験したが、但し初期ＮａＣ１濃 度は１．０Ｍであり、１．０〜３．５ＭＮａＣ１勾配を溶出に用いた。因子■の １１％は未結合のままであり、６６％が更に約５０倍の精製度で溶出液中に回収 された。

例６ ＴＥＴＡはセファロース以外の支持体に結合させてもよく、そのマトリックスは 因子■精製に用いることかで例２を繰り返したが、但し支持体としてトリスアク リルＧＦ２０００を用い、それにＴＥＴＡがＣＤＩ法により５７μｓｏｌ／ｍｌ のレベルで結合された。充填された因子■の５３％が８０倍の比活性増加で溶出 した。

例２を繰り返したが、但し支持体としてセファデックスＧ２５を用い、それにＴ ＥＴＡがＥＣＨ法により８９μｓｏｌ／ｍｌのレベルで結合された。カラムを緩 衝液Ｂで平衡化させ、緩衝液Ｂ１０１に溶解された高純度濃縮物１バイアルのサ ンプルを充填した。カラムを充填緩衝液で洗浄し、緩衝液＋０．３０Ｍ　ＮａＣ １で溶出させた。

適用された因子■の４７％が約５０倍の比活性増加で回収された。

ＣＤＩ法を用いて製造されかつ２８μｍｏ１／ｇ＋ｌの置換レベルを有するＴＥ ＴＡ−セファクリルＳ　−５００の２．０ｍｌ　（１，ＯＸ２．５ｃｍ）カラム を緩衝液Ａで平衡化させた。高純度濃縮物１バイアルを例２で記載されたように 調製、充填かつ溶出させたが、但し０．３０ＭＮａＣ１を洗浄緩衝液に用いた。

充填因子■活性の９９％が少なくとも５０倍の比活性増加で溶出液中に回収さＥ ＣＨ法を用いて製造されかつ５７μｓｏｔ／ｓｏｌの置換レベルを有するＴＥＴ Ａ−フラクトゲルＴＳＫ　ＨＷ−５５の２．０ｍｌ　（１，ＯＸ２．５ｃｍ）カ ラムを緩衝液Ａで平衡化させた。因子■１６６１ｕ含有ヘパリン上澄のサンプル を例３の方法に従い調製し、カラムに充填した。

非吸着タンパク質は緩衝液Ａを用いて除去し、洗浄を緩衝液Ａ＋０．２５Ｍ　Ｎ ａＣ１を用いて行い、緩衝液Ａ＋１．０Ｍ　ＮａＣ１を用いて因子■を溶出させ た。充填因子■活性の７０％が１１５倍の精製度で溶出液中に回収された。

前例で記載された場合以外の因子■出発物質も用いることができる。

（ｉ）ＥＣＨカップリングされたＴＥＴＡ−セファロース４Ｂで精製されたＩＰ Ｃ 中間純度濃縮物１バイアルを緩衝液８３０ｍ１に溶解し、例２で記載されたよう にクロマトグラフィーに付したが、但し緩衝液Ｂを緩衝液Ａの代わりに用い、０ ．３０ＭＮａＣｌを低塩洗浄に用いた。結果は表６で示されている。

表６ 因子■　全タンパク質　比活性 （ｉｕ）　（−ｇ）　（ｉｕ／−ｇ） 出発サンプル　２０ｇ（１００％）　１０１７　０．２１非吸着　２３（１１％ ） ０．３０Ｍ　ＮａＣｌ溶出液　ｌｏ（５％）１．００Ｍ　ＮａＣｌ溶出液　１０ ０（４８％）　１．２　８４血漿２０ｍ１をセファデックスＧ−２５のカラム（ ２，０Ｘ１８．Ｏｃｍ）を用いてｐＨ７，４の水中７５ｍＭＮ　ａ　Ｃｌと緩衝 液交換した。プールされた溶出液（３２ｍｌ）を１．０Ｍ酢酸、１．０Ｍリジン ＨＣＩ。

ｐＨ５，５０（４，０ｍ１）　、グリセロール（４，０膳１）及びＩ　Ｍ　Ｃａ 　Ｃｌ　２　（０，４ｍ１）と同時に混ぜた。混合物のｐＨはｐＨ５，０の１． ０Ｍ酢酸を用いて５．５０に調整した。ＴＥＴＡ−セファロース６Ｂ（ＥＣＨカ ップリング、リガンド濃度４８μｇｏｌ／ｍｌ）のサンプルを各々５倍容量の０ ．１Ｍ　ＮａＯＨ，水、０．１ＭＨＣｌ及び緩衝液Ａで洗浄した。ゲル１．０ｇ を調整された血漿３９１と１時間混ぜ、しかる後遠心（１５０ｇ、１５分間）に より集め、カラムに注いだ。

カラムを緩衝液Ａ（６ｍｌ）で洗浄し、しかる後緩衝液Ａ＋ｌ、ＯＭ　ＮａＣ１ （１０ｍｌ）で溶出させた。結果は表７で示されている。

色ユ 因子■　全タンパク質　比活性 （Ｉｕ）　（ｍｇ）　、　、　（ｔｕ／ｓｇ）血漿　１３．５（１００％）　２ ０２５　０．００８７調整血漿　１０．１（７５％）　１９８４　０．００５２ 溶出液　１１．４（８５％）　１１．４　１．００ＤＥＡＥセファデックスＡ− ５０１，５ｇのサンプルを７５５ＭＮａＣ１１００ｍ１で前膨潤させた。この懸 濁液１．６６ｍ１を新鮮解凍血漿５０１と２時間混ぜた。

ＤＥＡＥ−セファデックスを遠心により除去し、上澄２２−１を等容量の水で希 釈した。そのｐＨを５．５に調整した後、血漿調製物を例７　（１１）で記載さ れたようにＴＥＴＡ−セファロース６Ｂ１．０ｇに吸着させて、クロマトグラフ ィーに付したが、但しカラムを溶出前に緩衝液Ａ中０．２Ｍ　ＮａＣ１で更に洗 浄した。調整された血漿中で因子■活性の７５％が比活性２．４１ｕ／■ｇで溶 出液中に回収された。プロトロンビンの測定では、９８．５％がＤＥＡＥ−セフ ァデックスによる血漿の処理で除去され、原血漿プロトロンビンの０．４％のみ がＴＥＴＡ−セファロースから溶出液中に回収されたことを示した。

（ｉｖ）Ｔ　Ｅ　Ｔ　Ａ−セファロース４Ｂで精製されたヘノくリン／アルヒド ロゲル上澄 ヘパリン／アルヒドロゲル上澄のサンプルを室温で一夜０．３％リン酸トリーｎ −ブチル（ＴＮＢＰ）及び１％ツイーン８０で処理し、しかる後サンプルを例３ で記載されたようにクロマトグラフィー用に調製した。次いでこの溶液２３１を 緩衝液Ａで平衡化されたＴＥＴＡ−セファロース４Ｂ（ＥＣＨカップリング、３ ２μｍ０１１ＩＴＥＴＡ）１．Ｃ１＋１のカラムに充填した。カラムを例２で記 載されたように展開したが、但し低塩洗液は０．２０Ｍ　ＮａＣ１を含有してい た。結果は表８で示されている。

因子　全タン　ｖＷＦフイブ　フィブリ■　バク質　ロネク　ノーゲン 出発物質　１３３　２２４　２７３　１Ｂ、６　２０．１混合未結合及び　９． ７　１７ｇ　２８４　１２．６　１５．１１０．２Ｍ　ＮａＣｌ溶出液 １．０Ｍ　ＮａＣ１溶出液８８　１．９　３７　Ｇ、２７　０．１３例８及び９ 化合物２のようなポリアミンリガンド（ＴＥＴＡ）の因子■に対するクロマトグ ラフィー性質を変えることは遷移金属結合及び化学反応により可能である。

吋 ＥＣＨカップリングされＣｕＩ＋で担持されたＴＥＴＡ−セファロース４Ｂ、Ｉ ＰＣの精製 ＴＥＴＡ−セファロース４Ｂのサンプルを常法で但し緩衝液ではなく水を用いて カラム（１０ｍｌ）に充填し、しかる後水中Ｃｕ　Ｃｌ　２の１０−ｇ／ｍｌ溶 液の通過によりＣｕＩ＋イオンで担持させた。ＣｕＩ＋イオンによるマトリック スの飽和は、マトリックスがブリリアントブルーになるため容易に観察できた。

カラムを水、１．０ＭＮａＣ１含有ｐＨ７，０の１００ｍＭイミダゾール緩衝液 及び最後に緩衝液Ｃで洗浄した。中間純度濃縮物のサンプルを緩衝液Ｃで調製し 、カラムに充填した。カラムを緩衝液で洗浄し、結合タンパク質を０．０〜１． ０ＭＮａＣｌ勾配で溶出させた。ピーク因子■活性は０．３８Ｍ　ＮａＣ１の濃 度で溶出し、全体回収率は６１％であった。

カップリング剤としてＥＣＭを用い前記のように製造されたＴＥＴＡ−セファロ ース４Ｂのサンプルは、すべての窒素を完全にメチル化して下記リガンド構造： を与えることが予想される条件下でヨウ化メチルと反応させた。ゲル２０１をメ タノールの環境下に移し、同溶媒８０−１に懸濁した。ヨウ化メチル４．０ａｔ 及び炭酸水素カリウム４．０ｇを加え、混合物を４０℃で３日間攪拌した。ゲル を水性環境に戻し、（ａ）　Ｃｕ”イオンと結合する及び（ｂ）ビクリルスルホ ン酸と反応するその能力に関して試験したが、双方とも陰性であることが判明し た。

改良ゲルのカラムは高純度濃縮物のサンプルを緩衝液Ｂにいれ、カラムを更に緩 衝液Ｂ、緩衝液Ｂ＋Ｏ，ＩＭＮａＣ１及び最後に緩衝液Ｂ＋０．２Ｍ　ＮａＣ１ で洗浄することにより試験した。充填された活性の４６％が適切な条件下におい て未改良ＴＥＴＡで得られた場合と同様の純度で０．２Ｍ　ＮａＣ１分画中に回 収された。

ＴＥＴＡ−セファロース４Ｂは前記のようにカップリング剤として１，４−ブタ ンジオールジグリシジルエーテルを用いて製造した。カップリングされたＴＥＴ Ａの量は１８．０μｓｏｌ／ｓｌであった。ゲルは例４の方法を用いて因子■精 製に関して試験した。結果は、ＥＣＨがゲルの製造でカップリング剤として用い られた場合よりも因子■及び全タンパク質の双方が強固に結合していないことを 示した。ピーク因子■は１６５ｍＭＮａＣ１で溶出し、全体回収率は８９％であ った。

例１１ クロマトグラフィーに関するｐＨのバリエーション異なるｐＨ５，０〜７．９の 緩衝液をクロマトグラフィーに用いた。ＣＤＩ法を用いて製造されかつ３９μｍ ０１７ａｔの置換レベルを有するＴＥＴＡ−セファロースＣＬ−６Ｂの２．０＋ Ｉ　Ｃ１，ＯＸ２．５ｃｍ）カラムを具体的実験のため適切な緩衝液で充填かつ 平衡化した。１バイアルの高純度濃縮物（バッチ８Ｙ３４９２）を適切な緩衝液 １０−１で再調製し、カラムに流速２４　ｍｌ／ｈｒで充填した。未結合タンパ ク質を更に充填緩衝液で除去し、０．２５Ｍ　ＮａＣ１洗浄を行い、しかる後１ ．０ＭＮａＣ１で溶出させた。未結合のまま残留した充填因子■の率及び１，０ ＭＮａＣ１溶出液中に回収された率は表９で示されている。試験されたｐＨの中 では、ｐＨ５，５が１．ＯＭ　ＮａＣ１溶出液中における因子■の回収率及びそ の未結合残留による損失の最少化にとり最適である。

Ｄ　５．０　２４　１７　２９５ Ａ　５．．５　１９　４２　３５５ Ｅ　８．０　３３　３８　３０８ Ｆ　６．５　３７　１７　１１７ Ｇ　７．０　４２　１０　１６４ いくつかの実験を例６　（ｉｉｉ）で記載されたように行った。０．３０Ｍ　Ｎ ａＣ１洗浄後、結合因子■は緩衝液Ａを用いて回収し、特定の塩について試験し た。因子■の回収率は表１０で示されている。

表１０ （Ｎｌ（４）ＣＩ　１．０　８８　１１４Ｎａ２ｓｏ４０−３３　１２　２０ （ＮＨ４）２Ｓ０．　０．２０　６１　５６クエン酸トリナト０．１６７＋　３ ３　１６２リウム＋ＣａＣ１ｚ　Ｏ，０２Ｏ ＮａＣＩ　１．０　７５　５８１ このようにＮａＣ１以外の塩も因子■の溶出に用いてよいが、溶出液中で達成さ れる回収率は塩の同一性に依存している。

Ｑ値 国際調査報告 一一−ａｍｍ−ｗ−ｍ　ＰＣＴ／ＥＰ　９０１００９１０−２−国際調査報告 ＥＰ　９０００９１０ Ｓ＾　３７７５４ ６１頁の続き Ｇｊ）Ｉｎ、ｉ：。ａ、’　識別記号　庁内整理番号クス、ザフロン、ウオルデ ン、ヘンブスデッド、（番地なし）

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．多数のポリアミン基を有する非水溶性マトリックスからなるタンパク質分離 用の分離媒体であって、上記ポリアミン基が少なくとも３つの塩基性窒素原子を 有し、上記塩基性窒素原子が少なくとも２つの介在炭素原子の鎖で互いに分離さ れ、各ポリアミン基に全部で３つの窒素原子がある場合には全部で５つのかかる 介在炭素原子が存在することを特徴とする分離媒体。
2. ２．マトリックスが有機マトリックスである、請求項１に記載の分離媒体。
3. ３．各ポリアミン基が少なくとも４つの窒素原子を有する、請求項１又は２に記 載の分離媒体。
4. ４．各ポリアミンが直鎖、分岐鎖、単環式又は多環式ポリアミン基である、請求 項１、２又は３に記載の分離媒体。
5. ５．マトリックスに結合されたポリアミン基が異なる、請求項１〜４のいずれか 一項に記載の分離媒体。
6. ６．窒素原子対間の介在炭素原子がアルキレン又はシクロアルキレン基を形成し ている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離媒体。
7. ７．ポリアミン基がアルキレン基中に炭素原子２又は３を有する直鎖ポリアルキ レンポリアミン基である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離媒体。
8. ８．ポリアミン基がトリエチレンテトラアミンである、請求項１〜７のいずれか 一項に記載の分離媒体。
9. ９．非水溶性マトリックスが親水性ポリマー物質である、請求項１〜８のいずれ か一項に記載の分離媒体。
10. １０．マトリックス物質がアガロース、セルロース、デキストラン、大孔質シリ カ又はポリアクリルアミドである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離媒 体。
11. １１．ポリアミンが炭素原子１〜１０を有する二官能性カップリング試薬を用い てマトリックスにカップリングされる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の 分離媒体。
12. １２．カップリング試薬がエピクロロヒドリン、カルボニルジイミダゾール又は １，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルである、請求項１１に記載の分離 媒体。
13. １３．エピクロロヒドリンを介してトリエチレンテトラアミンにカップリングさ れたアガロースゲルである、請求項１に記載の分離媒体。
14. １４．請求項１に記載された分離媒体上に因子ＶＩＩＩ含有サンプルを担持させ 、洗浄し、因子ＶＩＩＩに■む分画を溶出させることからなる、少なくとも部分 的な因子ＶＩＩＩ精製方法。
15. １５．因子ＶＩＩＩ含有物質が全血漿、寒冷沈降物又は部分的精製因子ＶＩＩＩ である、請求項１４に記載の方法。
16. １６．カラムクロマトグラフィーにより実施される、請求項１４又は１５に記載 の方法。
17. １７．因子ＶＩＩＩ含有物質がｐＨ５．０〜８．０の充填緩衝液存在下で分離媒 体上に担持される、請求項１４、１５又は１６に記載の方法。
18. １８．ｐＨが５．５である、請求項１７に記載の方法。
19. １９．充填緩衝液が０．２Ｍのイオン強度である、請求項１７又は１８に記載の 方法。
20. ２０．溶出が電解質の濃度を増加させながら行われる、請求項１４〜１９のいず れか一項に記載の方法。
21. ２１．電解質濃度が０．２〜４．０Ｍである、請求項２０に記載の方法。