RU2555332C2

RU2555332C2 - Композиция, способ и набор для альфа-1 ингибитора протеазы

Info

Publication number: RU2555332C2
Application number: RU2012122793/15A
Authority: RU
Inventors: Цзяньсинь ГО; Энтони КЛОС; Брет КОЛДРЕН; Дебора БАРНЕТТ; Марк МЭННИНГ
Original assignee: Грифольс Терапьютикс Инк.
Priority date: 2009-11-03
Filing date: 2010-11-02
Publication date: 2015-07-10
Also published as: CN102655876B; IL219485A; BR112012010392A2; PL2496246T3; EP2496246B1; US20130131192A1; EP2496246A2; AU2010315325A1; KR20120114235A; WO2011056793A2; CN102655876A; US9616126B2; NZ599783A; CA2779369C; RU2012122793A; TR201809898T4; AU2010315325B2; IL219485A0; WO2011056793A3; JP6030201B2

Abstract

Группа изобретений относится к медицине и касается стабильной композиции для обеспечения субъекта терапевтически или профилактически эффективным количеством альфа-1 ингибитора протеазы (API), содержащей альфа-1 ингибитор протеазы (API) и по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из аланина, треонина, серина или гидроксипролина, где указанная композиция включает одно или более вспомогательных веществ, где по меньшей мере одна аминокислота присутствует в композиции в общем количестве аминокислоты от приблизительно 0,01 М до приблизительно 3 М. Также группа изобретений касается набора для лечения или предотвращения заболевания или состояния, ассоциируемого с API, включающего указанную композицию; применения по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аланина, треонина, серина или гидроксипролина, для стабилизации композиции, содержащей альфа-1 ингибитор протеазы (API). Группа изобретений обеспечивает стабильность состава API. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 27 ил., 5 табл., 8 пр.

Description

Родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет по заявке США № 61/257711, поданной 3 ноября 2009 г., содержание которой включено полностью путем указания ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к композициям, включающим альфа-1 ингибитор протеазы (API), в частности, стабильным композициям API. Настоящее изобретение также относится к способам и наборам для введения API субъекту, в частности, для обеспечения субъекта терапевтическим или профилактическим эффективным количеством API.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Дефицит API является довольно распространенным генетическим нарушением, которое вызывает предрасположенность у индивидуумов с нарушением к заболеванию печени и/или легочной эмфиземе. Наиболее распространенный тип недостаточности API, называемого ингибитором протеаз типа Z (PiZ), передается как аутосомный рецессивный признак и проявляется приблизительно в 1 случае на 1700 живых новорожденных у большинства жителей Северной Европы и Северной Америки. Мутация PiZ представляет собой однонуклеотидную замену, которая приводит к замене одной аминокислоты (глутамат 342 на лизин).

Человеческий API содержит 394 аминокислоты, один цистеиновый остаток и три углеводных боковых цепи, и имеет общую молекулярную массу 52 кДа. Единственная петля реакционного центра (RCL) расположена в последовательности Met-Ser в положении 358-359. Третичная структура API содержит 8 четких α-спиралей (А-Н) и 3 больших β-листа (A-C). Предполагается, что серпины действуют по необратимому механизму "суицидного субстрата". При расщеплении протеазой серпин изменяет конформацию, при этом RCL расщепляется и встраивается в центр А β-листа, и протеаза перемещается к дистальному концу молекулы. Такое структурное перемещение приводит к стабилизации серпина и значительному искажению третичных структур протеазы, которое инактивирует ее каталитическую систему. Считается, что на биологическую активность API может влиять, например, химические модификации, включая меж- или внутримолекулярную полимеризацию, окисление, комплексообразование и/или расщепление неспецифичными протеазами.

Считается, что основная физиологическая функция API заключается в ингибировании эластазы нейтрофила, катепсина G и протеазы 3. API, продуцируемый у индивидуумов с PiZ - недостаточностью API, является функционально активным, хотя может наблюдаться снижение специфичной к эластазе ингибирующей активности. Основным местом синтеза API является печень, однако он также синтезируется в клетках за пределами печени, включая макрофаги, эпителиальные клетки кишечника и кишечные клетки Панета.

Патогенез повреждений легких при недостаточности API относят к значительному снижению активности доступного API. Как было установлено, API составляет более 90% активности ингибитора эластазы нейтрофила в легочно-альвеолярной промывной жидкости. Таким образом, становится очевидным, что деструктивное заболевание легких, наблюдаемое у многих индивидуумов с недостаточностью API, возникает из-за нарушения баланса в легких между эластазой и API. Неингибированная активность эластазы нейтрофила, катепсина G и протеазы 3, в свою очередь, приводит к медленной деструкции целостности соединительной ткани легких. Такое разрушение соединительной ткани приводит к растяжению и снижению сократительной силы легких, что приводит к уменьшению потока выдыхаемого воздуха. Курение усиливает проблему, приводя к окислительной инактивации в присутствии API.

В настоящее время выбор лечения для индивидуумов с патологиями, ассоциируемыми с недостаточностью API, ограничен. Заболевание печени, ассоциируемое с недостаточностью API, лечат ортотопической трансплантацией печени. Обсуждалась также соматическая генотерапия для замены дефектного гена API, но до сих пор успешных примеров применения еще нет.

Таким образом, существует потребность в композициях API, которые стабильны и которые обеспечивали бы желаемые уровни биодоступности API в плазме при введении субъекту.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте обеспечивается композиция, включающая: (a) альфа-1 ингибитор протеазы (API); и (b) по меньшей мере одну аминокислоту.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы получения композиции.

В других аспектах обеспечены наборы, включающие композицию.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Фиг. 1 представляет собой график, показывающий профили агрегации жидких составов API, показанных в таблице 1 из примера 1.

Фиг. 2 представляет собой график, показывающий профили агрегации составов API, содержащих аланин, сахарозу или сахарозу/аланин.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий профили агрегации составов API, содержащих аланин, маннит или маннит/аланин.

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий профили агрегации составов API, содержащих аланин, сахарозу или трегалозу.

Фиг. 5 представляет собой график, показывающий влияние концентрации аминокислоты на агрегацию составов API после инкубирования при 40°C в течение одной недели.

Фиг. 6 представляет собой график, показывающий влияние концентрации аминокислоты на агрегацию составов API после инкубирования при 40°C в течение двух недель.

Фиг. 7 представляет собой график, показывающий профили агрегации составов API, содержащих аланин, не содержащих или содержащих различные концентрации акцептора кислорода.

Фиг. 8 представляет собой график, показывающий профили количества действующих веществ в составе API, описанном в примере 6 при 5°C: "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 9 представляет собой график, показывающий нефелометрические (NTU) профили составов API, описанных в примере 6 при 5°C: "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 10 представляет собой график, показывающий профили удельной активности составов API, описанных в примере 6 при 5°C: "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 11 представляет собой график, показывающий профили дезамидирования составов API, описанных в примере 6 при 5°C: "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 12 представляет собой график, показывающий профили увеличения агрегации составов API, описанных в примере 6 при 5°C: "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 13 представляет собой график, показывающий профили агрегации составов API, описанных в примере 6 при 5°C: "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 14 представляет собой график, показывающий олигомерные профили в составах API, описанных в примере 6 при 5°C: "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 15 представляет собой график, показывающий мономерные профили в составах API, описанных в примере 6 при 5°C: "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 16 представляет собой график, показывающий профили количества активных действующих веществ в составах API, описанных в примере 6 при 25°C: "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 17 представляет собой график, показывающий NTU профили составов API, описанных в примере 6 при 25°C: "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 18 представляет собой график, показывающий профили удельной активности составов API, описанных в примере 6 при 25°C: "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 19 представляет собой график, показывающий профили дезамидирования составов API, описанных в примере 6 при 25°C: "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 20 представляет собой график, показывающий профили увеличения агрегации составов API, описанных в примере 6 при 25°C: "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 21 представляет собой график, показывающий профили агрегации составов API, описанных в примере 6 при 25°C: "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 22 представляет собой график, показывающий олигомерный профиль в составах API при 25°C. "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 23 представляет собой график, показывающий мономерный профиль составов API при 25°C. "Глицин" обозначает состав 1 (API (50 мг/мл)/Глицин (250 мМ)); "Аланин" обозначает состав 2 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (250 мМ)); "Аланин/Сахароза" обозначает состав 3 (API (50 мг/мл)/L-Аланин (125 мМ)/Сахароза (125 мМ)); и "NaCl" обозначает состав 4 (API (50 мг/мл)/NaCl (250 мМ)).

Фиг. 24 представляет собой 2D контурную диаграмму pH и концентрации белка при агрегации в течение 1 недели, 2 недель и 3 недель в растворе API при 40°C.

Фиг. 25 представляет собой диаграмму влияния pH и агрегации раствора API при 40°C в течение 1 недели, 2недель и 3 недель.

Фиг. 26 показывает влияние pH на агрегацию в растворе API при 40°C в течение 1 недели, 2 недель и 3 недель.

Фиг. 27 показывает влияние концентрации белка на агрегационный профиль в растворе API при 40°C в течение 1 недели, 2 недель и 3 недель.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на том открытии, что относительно стабильная композиция, включающая API, может быть получена при добавлении в композицию также одной или более аминокислот. В частных вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает стабильную фармацевтическую композицию, содержащую API, подходящую для введения API субъекту в терапевтических или профилактических целях. Неограничивающие примеры нарушений и заболеваний, ассоциируемые с API (например, уровни API в плазме ниже нормы) и для которых настоящие варианты осуществления могут быть особенно применимы, без ограничения включают заболевание легких, такое как хроническое обструктивное заболевание легких (COPD) (например, эмфизема), заболевание печени, заболевание сосудов (например, внутричерепные аневризмы, артериальная фиброзно-мышечная дисплазия, тяжелые нарушение кровотечения и гипертензия), панникулит, заболевание глаз (например, передний увеит), системный некротический васкулит и гранулематоз Вегенера.

I. Композиция

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию, включающую:

(i) API; и

(ii) по меньшей мере одну аминокислоту.

В некоторых вариантах осуществления композиция состоит или по существу состоит из API и по меньшей мере одной аминокислоты.

Композиция по настоящему изобретению может быть получена в относительно чистой форме. Например, в некоторых вариантах осуществления композиция может быть фармацевтического качества.

Композиция может быть получена в твердой, жидкой или полутвердой форме. Например, композиция может иметь жидкую форму, без ограничения включая водный раствор, водную суспензию, масляную суспензию и т.д. Альтернативно, композиция может быть в форме лиофилизированного препарата, сухого порошка, твердых частиц и т.д. Другие примеры без ограничения включают коллоиды, эмульсии, гели и мази.

В одном варианте осуществления композиция представляет собой жидкий состав, предпочтительно водный раствор. В другом варианте осуществления композиция подходит для фармацевтического применения, например, является фармацевтической композицией, включающей фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В одном варианте осуществления композиция представляет собой фармацевтическую композицию, включающую API, аминокислоту и фармацевтически приемлемый носитель. Как здесь используется, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые растворители, дисперсионные среды, покрытия и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Тип носителя выбирается в зависимости от предполагаемого пути введения. В некоторых вариантах осуществления носитель является подходящим для введения посредством, включая без ограничения, внутривенного, ингаляционного, парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисетчатого, внутрибронхиального, интраабдоминального, интракапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, интрацелиального, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, внутрикишечного (внутрь толстой кишки), интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, внутриперикардиального, интраперитонеального, внутриплеврального, внутрипростатного, внутрилегочного, интраректального, внутрипочечного, интраретинального, интраспинального, внутрисиновиального, внутригрудного, внутриматочного, внутрипузырного, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального или трансдермального средства. Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсию и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсии.

В некоторых вариантах осуществления композиция стерильна и стабильна при одном или более параметрах производства и хранения. Композиция может быть получена в форме раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры. Например, стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены стерилизацией фильтрованием. Дисперсия может быть приготовлена включением API в стерильный носитель, который содержит дисперсионную среду. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления будут сушка в вакууме и сушка замораживанием, которые обеспечивают композицию, включающую порошок API и аминокислоту плюс любой необходимый дополнительный ингредиент, полученный предпочтительно из его предварительно стерилизованного фильтрованием раствора.

Примеры разбавителей (например, для разбавления, восстановления и т.д. композиции) могут без ограничения включать стерильную воду, бактериостатическую воду для инъекции (BWFI), pH буферный раствор (например, фосфатно-буферный солевой раствор), стерильный солевой раствор и раствор Рингера или декстрозный раствор. Разбавитель необязательно содержит консервант. Количество используемого консерванта определяют с учетом различных концентраций консерванта для совместимости с API и исследования эффективности консерванта.

Ингаляционная терапия заключается во введении лекарственного средства в форме аэрозоля в дыхательные пути. Аэрозольная доставка препарата основывается на той концепции, что доставка в глубокие области легких (альвеолы), которые насчитывают 95% эпителиальных тканей легких, может значительно усилить транспорт белка через эпителиальную мембрану, если молекула является биодоступной. Жидкие аэрозоли образуются распылением растворов API. Альтернативно, аэрозоли твердых частиц могут быть как в форме порошка, суспендированного в пропелленте, который вводится из дозирующего ингалятора, так и просто в форме порошка, который вводится из ингалятора сухого порошка. Например, аэрозоли твердых частиц могут быть получены лиофилизацией (например, сушка замораживанием) API из раствора и с последующим измельчением или размолом лиофилизированного лекарственного средства до желаемого гранулометрического состава для введения в легкие. По другой методике используют сушку распылением, в которой процесс дегидратации происходит под воздействием нагрева горячим потоком газа (обычно воздухом) для испарения диспергированных капель, создаваемых пульверизацией поданной жидкости. Этими методами композиция, включающая API, может быть высушена с получением мелких частиц, предпочтительно с желаемыми типами и количествами вспомогательных веществ, проявляющими свойства водозаменяющих средств.

В настоящее время в данной области широко известны дозирующие ингаляторы под давлением. Может быть использован любой герметичный дозирующий ингалятор под давлением, который подходит для доставки лекарственных средств в легкие или нос пациента. Состав аэрозоля и дозирующий клапан могут быть подобраны так, чтобы обеспечить терапевтически или профилактически эффективное количество API.

A. API

Термин "API", как здесь используется, должен пониматься широко, если конкретно не указано иное. Термин относится ко всем природным полиморфам API. Термин также включает функциональные фрагменты API, химерные белки, включающие API или его функциональные фрагменты, гомологи, полученные аналогичным замещением одной или более аминокислот API, и гомологичные виды. Термин также относится ко всем полипептидам API, которые представляют собой продукт технологии рекомбинантной ДНК, включая API, который представляет собой продукт трансгенной технологии. Например, ген, кодирующий API, может быть включен в ген млекопитающего, кодирующий сывороточный белок молока, так, чтобы последовательность ДНК экспрессировалась в молочной железе, как описано, например, в патенте США номер 5322775, содержание которого включено сюда путем указания ссылки, раскрывающего способ получения белкового соединения. Термин также относится ко всем белкам API, синтезируемым химическими способами, известными в данной области, такими как, например, твердофазный пептидный синтез. Термин также относится к API, полученному из плазмы. Термин также относится к API, который коммерчески доступен. API может относится как к человеческому, так и нечеловеческому API.

В одном варианте осуществления API представляет собой API, полученный из плазмы. В другом варианте осуществления API получают из IV-1 фракции Коэна. В других вариантах осуществления API получают из безальбуминовой фракции плазмы, преципитата V Коэна или предварительно очищенной фракции получения API. Патент США номер 6974792, включенный сюда путем указания ссылки, раскрывает способ получения API.

В других вариантах осуществления API представляет собой рекомбинантный API. Аминокислотная и нуклеотидная последовательность для API и/или получения рекомбинантного API описаны, например, в патентах США №№ 4711848; 4732973; 4931373; 5079336; 5134119; 5218091; 6072029 и Wright et al, Biotechnology, 9:830 (1991); и Archibald et al., PNAS, 87:5178 (1990), включенных сюда посредством указания ссылки, раскрывающих последовательности API, рекомбинантного API и/или рекомбинантную экспрессию API.

В одном варианте осуществления композиция охарактеризована как включающая API с чистотой более 90%. В других вариантах осуществления чистота API более чем 95%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99%. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 50%, например, от приблизительно 50% до приблизительно 100%, от приблизительно 60% до приблизительно 90%, от приблизительно 70% до приблизительно 80% от общего количества API в композиции представляет собой активный API.

В одном варианте осуществления композиция включает терапевтически эффективное количество API. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству эффективному, в необходимых дозировках и продолжительности, для достижения желаемого терапевтического эффекта, такого как, например, снижение или замедление эмфиземы, ассоциируемой с врожденной недостаточностью API. Терапевтически эффективное количество API может изменяться в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и масса отдельного субъекта, и способность API вызвать желаемый ответ у субъекта. Терапевтически эффективное количество также может быть таким, при котором терапевтически благоприятный эффект преобладает над любыми токсическими или нежелательными эффектами API.

В других вариантах осуществления композиция включает профилактически эффективное количество API. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству эффективному, в необходимых дозировке и продолжительности, для получения требуемого профилактического эффекта, такого как, например, предотвращение или ингибирование эмфиземы, ассоциируемой с врожденной недостаточностью API. Профилактически эффективное количество может быть определено, как описано выше для терапевтически эффективного количества.

Одним из факторов, который следует учитывать при определении терапевтически или профилактически эффективного количества API, является концентрация функционально активного API, выделенного из биологического образца субъекта, получающего лечение, такого как, например, из бронхоальвеолярной промывной жидкости (ELF) субъекта. Другим фактором, который также можно учитывать, при определении терапевтически или профилактически эффективного количества API, является фармакология (например, фармакокинетика) API.

Фармакокинетика API касается концентрации или уровней API в крови субъекта. Фармакокинетические параметры или измерения уровней API в крови включают область под кривой (AUC), C_min (то есть, низший порог) и C_max. AUC показывает воздействие общего количества API в крови субъекта за определенный период дозирования (например, 8, 12 и 24 часа). C_min (то есть, низший порог) представляет собой самым низкий уровень API в крови за определенный период времени дозирования. C_max представляет собой самое высокое или пиковое содержание, достигнутое API в крови субъекта за определенный период дозирования.

В одном варианте осуществления терапевтически или профилактически эффективное введенное количество достаточно для достижения или обеспечения в крови (например, плазме) низшего порога API, которое будет выше целевого порогового значения. В одном варианте осуществления целевое пороговое значение составляет по меньшей мере приблизительно 10 мг/дл, иллюстративно, приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 и 200 мг/дл.

В другом варианте осуществления терапевтически или профилактически эффективное количество достаточно для достижения или обеспечения нижнего порога API в крови по меньшей мере приблизительно 50 мг/дл. В других вариантах осуществления терапевтически или профилактически эффективное количество API достаточно для обеспечения низшего порога API в крови по меньшей мере приблизительно 80 мг/дл.

В одном варианте осуществления концентрация API в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 0,1 мг/мл, иллюстративно, по меньшей мере приблизительно: 0,1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 и 1000 мг/мл. В одном варианте осуществления удельная активность API в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 0,05 мг активного API на мг общего белка, иллюстративно, по меньшей мере приблизительно 0,05, 0,1, 0,2 мг, 0,3 мг, 0,4 мг, 0,5 мг, 0,6 мг, 0,7 мг или более активного API на мг общего белка.

В некоторых вариантах осуществления концентрация API, содержавшегося в композиции, составляет, из расчета по массовому проценту (масс./об.), по меньшей мере приблизительно 1%, иллюстративно, от приблизительно 1 до приблизительно 60%, от приблизительно 5 до приблизительно 55%, от приблизительно 10 до приблизительно 45%, от приблизительно 20 до приблизительно 30% (масс./об.).

B. Аминокислота

Должно быть понятно, что аминокислоты, конкретно указаны здесь только в иллюстративных целях и не служат для ограничения аминокислот, которые могут быть использованы по настоящему изобретению. Другие аминокислоты, конкретно не указанные здесь, могут быть легко подобраны на основании проявляемых ими физических и химических свойств. Дополнительно, некоторые из аминокислот, упомянутые здесь, были указаны в терминах генетически кодируемых аминокислот, однако, аминокислоту не должна ограничиваться генетически кодируемыми аминокислотами, но также может включать генетически некодируемые аминокислоты. Например, аминокислота также может включать природные некодируемые аминокислоты и синтетические аминокислоты (например, β-аланин, гидроксипролин). Также могут рассматриваться L-энантиомерные аминокислоты (L-аминокислоты) и D-аминокислоты, а также свободные аминокислотные формы и/или физиологически приемлемые солевые формы и/или их смеси.

В таблице 1 перечислены некоторые неограничивающие примеры аминокислот.

Таблица 1 Аминокислоты
Аминокислота	Трехбуквенный код	Однобуквенный код
Глицин	Gly	G
Аланин	Ala	A
Валин	Val	V
Лейцин	Leu	L
Изолейцин	Ile	I
Метионин	Met	M
Фенилаланин	Phe	F
Триптофан	Trp	W
Пролин	Pro	P
Серин	Ser	S
Треонин	Thr	T
Цистеин	Cys	C
Тирозин	Tyr	Y
Аспарагин	Asn	N
Глутамин	Gln	Q
Лизин	Lys	K
Аргинин	Arg	R
Гистидин	His	H
Аспарагиновая кислота	Asp	D
Глутаминовая кислота	Glu	E

В одном варианте осуществления композиция включает по меньшей мере одну аминокислоту, где каждая выбрана из группы, состоящей из Ala (A), Thr (T), гидроксипролина, Gly (G), Ser (S), Gln (Q), Phe (F), Trp (W), Met (M), ацетилцистеина, Leu (L), Ile (I), Val (V), Lys (K), Pro (P), Tyr (Y), His (H), Glu (E), Asn (N), Asp (D) и Arg (R).

В другом варианте осуществления по меньшей мере каждая одна аминокислота выбирается из группы, состоящей из Ala (A), Thr (T), гидроксипролина, Gly(G) и Ser(S).

В других вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой Ala (A) или Gly (G).

В некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой нейтральную аминокислоту или гидрофильную аминокислоту. В другом варианте осуществления гидрофильная аминокислота представляет собой аминокислоту, которая проявляет гидрофобность менее нуля по общей шкале гидрофобности.

В одном варианте осуществления по меньшей мере одна аминокислота присутствует в композиции в общем количестве аминокислоты, которое достаточно для обеспечения стабильной композиции API, например, как определено при сравнении с композицией API, не содержащей по меньшей мере одну аминокислоту.

В другом варианте осуществления общее количество аминокислоты составляет количество, достаточно для сохранения API по меньшей мере приблизительно 5% активности API в течение определенного периода времени при определенной температуре, иллюстративно, по меньшей мере от приблизительно 5% до приблизительно 100%, от приблизительно 10% до приблизительно 95%, от приблизительно 20% до приблизительно 90%, от приблизительно 30% до приблизительно 80%, от приблизительно 40% до приблизительно 70% и от приблизительно 50% до приблизительно 60% активности API в течение определенного периода времени при определенной температуре. В некоторых вариантах осуществления период времени и/или температура определены как срок и/или температура хранения (например, срок годности). В одном варианте осуществления период времени составляет по меньшей мере приблизительно 1 день, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 8 месяцев, 1 год, 2 года и 3 года. В другом варианте осуществления температура равна или более чем приблизительно -120°C, -70°C, -20°C, 0°C, 5°C, 25°C, 37°C, 40°C и 50°C.

В одном варианте осуществления активность API может быть определена по ингибированию свиной панкреатической эластазы, как описано, например, в Coan et al., Vox Sang., 48:333 (1985), содержание которого включено полностью путем указания ссылки. В некоторых вариантах осуществления активность API может быть оценена как активность или токсичность in vitro, in vivo и/или ex vivo исследованиями (например, терапевтический индекс, LD₅₀, ED₅₀ и т.д.) на животных. Например, при последовательных разведениях из исходного или основного раствора, или восстановлении лиофилизированных или высушенных под вакуумом композиций, содержащих API, содержание API в ресуспендированной или водной композиции (в присутствии по меньшей мере одной аминокислоты и/или по меньшей мере одной аминокислоты от общего количества) составляет более чем по меньшей мере приблизительно от 5% до приблизительно 100% активности или токсичности, которую биологически активный API проявлял до включения в композицию.

В других вариантах осуществления стабильность API может быть определена, например, методами определения разложения API, без ограничения включающими образование продуктов окисления, протеолиз и/или дезамидирование, изменение в распределении молекулярной массы, изменение активности, изменение функциональных групп, увеличение нерастворимых субстанций, таких как агрегаты, или модификацию продукта, обусловленную вспомогательными веществами, такую как неферментативное гликозилирование. Кроме того, стабильность может быть определена как изменение концентрации, обусловленное, например, испарением, адсорбцией, химической модификацией и т.п. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления стабильные при хранении композиции API представляют собой композиции, в которых наблюдается менее чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70% разложения API. В стабильных при хранении композициях также может наблюдаться любая комбинация этих характеристик.

В другом варианте осуществления общего количество аминокислот в композиции представляет собой количество, достаточное для повышения точки плавления API по сравнению с композицией, не содержащей по меньшей мере одной аминокислоты. Специалист в данной области легко может определить точку плавления, например, при помощи дифференциального сканирующего калориметра (DSC). В одном варианте осуществления общее количество аминокислоты композиции достаточно для увеличения точки плавления на по меньшей мере приблизительно 0,01°C, 0,1°C, 1°C, 1,2°C, 1,4°C, 1,6°C, 1,8°C и 2°C.

В других вариантах осуществления общее количество аминокислоты в композиции после хранения композиции за определенный период времени при определенной температуре составляет количество, достаточное для того, чтобы процент мономерного API в композиции составлял по меньшей мере приблизительно 50%, иллюстративно, от приблизительно 50% до приблизительно 100%, от приблизительно 60% до приблизительно 99%, от приблизительно 98%, от приблизительно 70% до приблизительно 98%, от приблизительно 80% до приблизительно 95% и от приблизительно 85% до приблизительно 90%. В одном варианте осуществления период времени составляет по меньшей мере приблизительно 1 день, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 8 месяцев, 1 год, 2 года и 3 года. В другом варианте осуществления температура равна или более чем приблизительно -120°C, -70°C, -20°C, 0°C, 5°C, 25°C, 37°C, 40°C и 50°C.

В другом варианте осуществления общее количество аминокислоты в композиции составляет количество, достаточное, чтобы после хранения композиции за определенный период времени при определенной температуре процент агрегатов белка в композиции составлял менее чем или равно приблизительно 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% и 0%. В одном варианте осуществления период времени составляет по меньшей мере приблизительно 1 день, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 8 месяцев, 1 год, 2 года и 3 года. В другом варианте осуществления температура равна или более чем приблизительно -120°C, -70°C, -20°C, 0°C, 5°C, 25°C, 37°C, 40°C и 50°C.

Уровни агрегации белка в композиции могут быть определены любой обычной в данной области методикой, например, эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографией (SE-HPLC).

В одном варианте осуществления общее количество аминокислоты, присутствующей в композиции, составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 3 М, от приблизительно 0,03 до приблизительно 1 М, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,5 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М.

В другом варианте осуществления общее количество аминокислоты, присутствующей в композиции, составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М, по меньшей мере приблизительно 0,03 М или по меньшей мере приблизительно 0,3 М.

В других вариантах осуществления композиция включает аланин, где общая концентрация аланина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М аланина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,75 М аланина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет аланин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением аланина.

В одном варианте осуществления композиция включает треонин, где общая концентрация треонина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М треонина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М треонина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой треонин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением треонина.

В другом варианте осуществления композиция включает гидроксипролин, где общая концентрация гидроксипролина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М гидроксипролина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М гидроксипролина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой гидроксипролин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением гидроксипролина.

В одном варианте осуществления композиция включает глицин, где общая концентрация глицина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М глицина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М глицина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой глицин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением глицина.

В других вариантах осуществления композиция включает серин, где общая концентрация серина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М серина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М серина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой серин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением серина.

В одном варианте осуществления композиция включает глютамин, где общая концентрация глютамина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М глютамина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М глютамина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой глютамин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением глютамина.

В других вариантах осуществления композиция включает фенилаланин, где общая концентрация фенилаланина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М фенилаланина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М фенилаланина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой фенилаланин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением фенилаланина.

В одном варианте осуществления композиция включает триптофан, где общая концентрация триптофана составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М триптофана, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М триптофана. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой триптофан, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением триптофана.

В другом варианте осуществления композиция включает метионин, где общая концентрация метионина составляет приблизительно 0,01 М метионина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М метионина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой метионин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением метионина.

В других вариантах осуществления композиция включает ацетилцистеин, где общая концентрация ацетилцистеина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М ацетилцистеина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М ацетилцистеина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой ацетилцистеин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением ацетилцистеина.

В одном варианте осуществления композиция включает лейцин, где общая концентрация лейцина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М лейцина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,15 М лейцина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой лейцин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением лейцина.

В другом варианте осуществления композиция включает изолейцин, где общая концентрация изолейцина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М изолейцина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М изолейцина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой изолейцин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением изолейцина.

В других вариантах осуществления композиция включает валин, где общая концентрация валина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М валина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М валина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой валин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением валина.

В одном варианте осуществления композиция включает лизин, где общая концентрация лизина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М лизина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М лизина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой лизин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением лизина.

В другом варианте осуществления композиция включает пролин, где общая концентрация пролина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М пролина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М пролина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой пролин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением пролина.

В других вариантах осуществления композиция включает тирозин, где общая концентрация тирозина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М тирозина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М тирозина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой тирозин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением тирозина.

В одном варианте осуществления композиция включает гистидин, где общая концентрация гистидина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М гистидина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М гистидина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой гистидин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением гистидина.

В другом варианте осуществления композиция включает глутаминовую кислоту, где общая концентрация глутаминовой кислоты составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М глутаминовой кислоты, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М глутаминовой кислоты. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой глутаминовую кислоту, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением глутаминовой кислоты.

В других вариантах осуществления композиция включает аспарагин, где общая концентрация аспарагина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М аспарагина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М аспарагина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой аспарагин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением аспарагина.

В одном варианте осуществления композиция включает аспарагиновую кислоту, где общая концентрация аспарагиновой кислоты составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М аспарагиновой кислоты, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 М аспарагиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой аспарагиновую кислоту, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением аспарагиновой кислоты.

В другом варианте осуществления композиция включает аргинин, где общая концентрация аргинина составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М аргинина, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,17 до приблизительно 0,3 М аргинина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой аргинин, где композиция не содержит каких-либо аминокислот, за исключением аргинина.

C. Вспомогательные вещества

В других вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает композицию, включающую:

(i) API;

(ii) по меньшей мере одну аминокислоту, где композиция дополнительно включает одно или более вспомогательных веществ. Неограничивающие примеры вспомогательных веществ включают полиолы, сахара, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, соли (например, неорганические соли), хелатные комплексы металлов, полимеры (например, полиэтиленгликоль (PEG), циклодекстрин, декстран), мочевину, хлорид гуанидия, полипептиды (например, антитела) и их комбинации. Соответственно, специалисту в данной области понятно, что указанный здесь термин "вспомогательные вещества" используется в широком смысле и может включать средства, обычно используемые специалистами в данной области для получения композиций, содержащих белок.

В некоторых вариантах осуществления вспомогательное вещество представляет собой полиол или сахар. Например, полиол или сахар могут без ограничения быть представлены сахарозой, маннитом, трегалозой, сорбитом, сорбозой, мелезитозой, глицерином, фруктозой, маннозой, мальтозой, лактозой, арабинозой, ксилозой, рибозой, рамнозой, галактозой, глюкозой, ксилитом, эритритом, треитолом, рафинозой и/или т.п.

В одном варианте осуществления каждое одно или более вспомогательных веществ выбирается из группы, состоящей из сахарозы, маннита, глицерина, сорбита, декстрана, трегалозы, гидроксиэтилкрахмала (HES), сахарина натрия, полиэтиленгликоля (PEG) (например, полиэтиленгликоля 3350, полиэтиленгликоля 2000, полиэтиленгликоля 8000) и 1,2-пропандиола. В другом варианте осуществления вспомогательное вещество представляет собой сахарозу или маннит.

В других вариантах осуществления общее количество сахарозы, если она присутсвует в композиции, составляет меньше чем 20% (масс./об.), иллюстративно, от приблизительно 0% до приблизительно 15% (масс./об.), от приблизительно 2,5% до приблизительно 7,5% и от приблизительно 4% до приблизительно 5% (масс./об.). В одном варианте осуществления композиция не содержит сахарозы.

Общее количество каждого вспомогательного вещества и/или общее количество вспомогательных веществ в композиции может изменяться, например, в зависимости от типа и/или количества используемых вспомогательных веществ и/или типа и/или количества другого присутствующего компонента в композиции, включающей API.

В одном варианте осуществления композиция включает сахар, где общая концентрации сахара составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М сахара, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,125 до приблизительно 0,75 М сахара. В некоторых вариантах осуществления сахар представляет собой сахарозу. В других вариантах осуществления сахар представляет собой сахарозу, где композиция не содержит какого-либо сахара, за исключением сахарозы.

В другом варианте осуществления композиция включает полиол, где общая концентрация полиола составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М полиола, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,25 до приблизительно 0,75 М полиола. В некоторых вариантах осуществления полиол представляет собой маннит. В других вариантах осуществления полиол представляет собой маннит, где композиция не содержит каких-либо полиолов, за исключением маннита.

В других вариантах осуществления композиция включает полиол, где общая концентрация полиола составляет по меньшей мере приблизительно 0,25% (масс./об.) полиола, иллюстративно, от приблизительно 0,25 до приблизительно 5% (масс./об.) полиола. В некоторых вариантах осуществления полиол представляет собой глицерин. В других вариантах осуществления полиол представляет собой глицерин, где композиция не содержит каких-либо полиолов, за исключением глицерина.

В одном варианте осуществления композиция включает полиол, где общая концентрация полиола составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М полиола, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,27 до приблизительно 0,55 М полиола. В некоторых вариантах полиола представляет собой сорбит. В других вариантах осуществления полиол представляет собой сорбит, где композиция не содержит каких-либо полиолов, за исключением сорбита.

В другом варианте осуществления композиция включает полимер, где общая концентрация полимера составляет по меньшей мере приблизительно 0,25% (масс./об.) полимера, иллюстративно, от приблизительно 0,25 до приблизительно 5% (масс./об.) полимера. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой декстран. В других вариантах осуществления полимер представляет собой декстран, где композиция не содержит каких-либо полимеров, за исключения декстрана.

В других вариантах осуществления композиция включает сахар, где общая концентрация сахара составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,15 до приблизительно 0,75 М сахара. В некоторых вариантах осуществления сахар представляет собой трегалозу. В других вариантах осуществления сахар представляет собой трегалозу, где композиция не содержит какого-либо сахара, за исключением трегалозы.

В одном варианте осуществления композиция включает HES, где общая концентрация HES составляет по меньшей мере приблизительно 0,25% (масс./об.) HES, иллюстративно, от приблизительно 0,25 до приблизительно 5% (масс./об.) HES.

В другом варианте осуществления композиция включает сахарин натрия, где общая концентрация сахарина натрия составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М сахарина натрия, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,15 до приблизительно на 0,75 М сахарина натрия.

В других вариантах осуществления композиция включает PEG, где общая концентрации PEG составляет по меньшей мере приблизительно 0,25% (масс./об.) PEG, иллюстративно, от приблизительно 0,25 до приблизительно 10% (масс./об.) PEG и от приблизительно 1 до приблизительно 5% (масс./об.) PEG. В некоторых вариантах осуществления PEG представляет собой PEG 3350. В других вариантах осуществления PEG составляет приблизительно 5% (масс./об.) PEG 3350, где композиция не содержит каких-либо PEG, за исключением PEG 3350.

В одном варианте осуществления композиция включает 1,2-пропандиол, где общее концентрация 1,2-пропандиола составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 М 1,2-пропандиола, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 М и от приблизительно 0,125 до приблизительно 0,3 М 1,2-пропандиола.

Поверхностно-активные вещества без ограничения могут включать, например, блок-полимеры полиэтилен- и полипропиленгликоля (например, Pluronic F68); или сорбитанмонолаурат полиэтиленгликоля (например, Tween 80), полиоксиэтиленсорбитанмоноолеаты (например, Tween 20) и/или т.п. В одном варианте осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой Pluronic F68 или Tween 80 (т.е. Полисорбат 80).

В одном варианте осуществления композиция дополнительно включает поверхностно-активное вещество, где общая концентрации поверхностно-активного вещества составляет по меньшей мере приблизительно 0,0025% (об./об.) поверхностно-активного вещества, иллюстративно, от приблизительно 0,0025 до приблизительно 1% (об./об.) поверхностно-активного вещества, от приблизительно 0,025 до приблизительно 0,1% (об./об.) поверхностно-активного вещества и от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,075% (об./об.) поверхностно-активного вещества. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой Pluronic F68 или Tween 80.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает композицию, включающую:

(i) API;

(ii) по меньшей мере одну аминокислоту, где композиция дополнительно включает соль, предпочтительно неорганическую соль. Неограничивающие примеры неорганических солей включают хлорид натрия или фосфат натрия.

В одном варианте осуществления неорганическая соль присутствует в композиции в общем количестве неорганической соли по меньшей мере 0,01 М, иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,5 М, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,4 М и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,15 М неорганической соли. В некоторых вариантах осуществления неорганическая соль представляет собой хлорид натрия, фосфат натрия или их комбинацию.

Как здесь используется, термин "антиоксидант" относится к средству, которое уменьшает или предотвращает окисление. "Антиоксиданты" без ограничения включают метионин, глутатион, ацетилцистеин, аскорбиновую кислоту, бутилгидроксианизол (BHA), бутилгидрокситолуол (BHT) и малеиновую кислоту.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает композицию, включающую:

(i) API;

(ii) по меньшей мере одну аминокислоту, где композиция дополнительно включает антиоксидант. В некоторых вариантах осуществления антиоксидант представляет собой метионин. В других вариантах осуществления антиоксидант представляет собой глутатион. В другом варианте осуществления антиоксидант присутствует в композиции в общем количестве антиоксиданта по меньшей мере приблизительно 0,01% (масс./об.), иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 5% (масс./об.) и от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,7% (масс./об.).

Неограничивающие примеры хелатных комплексов металлов включают этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), (0,1-0,5%), [этиленбис(оксиэтиленнитрило)]тетрауксусную кислоту (EGTA), 1,2-бис(2-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (BAPTA), гидроксиэтилентриаминдиуксусную кислоту (HEDTA) или их соли. В одном варианте осуществления хелатный комплекс металла представляет собой двухвалентный металлический хелатный комплекс. В другом варианте осуществления металлический хелатный комплекс представляет собой EDTA, EGTA, BAPTA, HEDTA или их соли. В некоторых вариантах осуществления композиция включает комбинацию хелатных комплексов металлов. В других вариантах осуществления хелатный комплекс металлов присутствует в композиции в общем количестве хелатного комплекса металлов по меньшей мере приблизительно 0,01% (масс./об.), иллюстративно, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1% (масс./об.), от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,5% (масс./об.) и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,25%.

(i) API;

(ii) по меньшей мере одну аминокислоту, где композиция дополнительно включает хелатный комплекс металла.

Соответственно, в других вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает композицию, включающую:

(a) API; и

(b) аминокислоту,

где композиция дополнительно включает или необязательно дополнительно включает одно или более вспомогательных веществ.

Различные композиции, содержащие API, могут обеспечиваться в соответствии с настоящим изобретением. Активный компонент в таких составах представляет собой API, который может быть человеческим или нечеловеческим рекомбинантным API, но, как указано выше, также может включать API, экстрагированный из плазмы. Хотя API может присутствовать как единственный активный компонент, но API может присутствовать также с одним или более дополнительными активными компонентами.

II. Способ получения композиции

В других аспектах настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции, включающей API и по меньшей мере одну аминокислоту.

В одном варианте осуществления способ включает диализ первой композиции, включающей API, для удаления соли, если она присутствует в композиции.

Например, первая композиция может представлять собой композицию, содержащую API, полученную в или взаимодействием с буфером, где первая композиция включает соль. Композиция может без ограничения представлять собой композицию, приготовленную методом получения в потоке для получения API из плазмы (например, человеческой плазмы) или получения рекомбинантного API.

В одном варианте осуществления первая композиция включает API в фосфатном буфере (например, фосфат натрия 20 мМ, pH 7), где хлорид натрия содержится в буфере, например, в количестве приблизительно 100 мМ NaCl. В некоторых вариантах осуществления диализ выполняют методами ультрафильтрации/диафильтрации (UF/DF).

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает обеспечение по меньшей мере одной аминокислоты в композиции, после стадии диализа. Вспомогательные вещества и/или любые другие реагенты и т.д. могут быть добавлены вместе с аминокислотой, сразу же за добавлением аминокислоты или затем после добавления аминокислоты.

В других вариантах осуществления способ включает диализ первой композиции, включающей API, буфером (например, фосфатным буфером 20 мМ, pH 7), включающей по меньшей мере одну аминокислоту и/или вспомогательное вещество и/или любой другой реагент.

В одном варианте осуществления способ дополнительно включает поддержание pH композиции, содержащей API, от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, предпочтительно от приблизительно 6,6 до приблизительно 7,4. Например, в другом варианте осуществления буферная соль может быть добавлена для достижения эффективного диапазона pH, с последующим добавлением аминокислот и/или вспомогательных веществ и/или любых других реагентов/ингредиентов. В других вариантах осуществления аминокислоты и/или вспомогательные вещества, и/или другие реактивы могут быть объединены для добавления в композицию, содержащую API.

III. НАБОР

В других аспектах настоящее изобретение дополнительно обеспечивает набор, например, набор для лечения заболевания или состояния, ассоциируемого с экспрессией или активностью API. В одном варианте осуществления набор включает композицию в соответствии с настоящим изобретением, в частности, фармацевтическую композицию, включающую API и аминокислоту; и, необязательно, инструкцию по применению для лечения или предотвращения заболевания или состояния, ассоциируемого с API, например, заболевания или состояния, ассоциируемого с или вызванного снижением ниже нормального содержания API в плазме.

В других вариантах осуществления отдельные контейнеры обеспечиваются в наборе, где по меньшей мере одна емкость включает композицию, включающую API, и, в одной или более дополнительных емкостях, другую композицию, в частности, композицию, включающую активный компонент, отличный от API. Необязательно, набор может содержать другие дополнительные фармацевтически приемлемые носители и разбавители в комбинации с активными компонентами и/или отдельно от них в отдельной емкости.

Настоящее изобретение далее будет подробно раскрыто в примерах, при этом следует отметить, что изобретение не ограничено данными примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Стабильность жидких составов, содержащих API

Ускоренное исследование стабильности выполняли для определения стабильности жидких составов, включающих API.

API, полученный из фракции IV-1, подготавливали и макро-партию диализировали фосфатным буфером (20 мМ, pH 7) для удаления соли, а затем концентрировали до 100 мг/мл. После диализа получали различные составы API, содержащие другие ингредиенты, путем добавления 2-кратного раствора, содержащего другой ингредиент(ы). В полученном составе API затем исследовали стабильность API путем добавления приблизительно 2 мл полученного состава в 10 мл пробирку, которую затем инкубировали в терморегулируемой камере при 40°C в течение ~3-4 недель. Образцы отбирали каждую неделю для определения уровня, используя SEC-HPLC.

Результат показан на фиг. 1 и данные объединены в таблице 2.

Таблица 2 Процентное содержание агрегатов в жидких составах API
Состав (50 мг/мл API)	% агрегации при 40°C
Состав (50 мг/мл API)	Неделя 0	Неделя 1	Неделя 2	Неделя 3
API только	0,1	1,6	3,9	5,7
API+0,1 M NaCl	0,2	1,8	4,0	6,9
API+0,3 M Гидроксипролин	0,3	1,1	2,5	4,3
API+0,3 M Серин	0,3	1,0	2,2	4,2
API+0,3 M Глицин	0,2	1	2,2	4,0
API+0,3 M Аланин	0,2	1	2,1	3,8
API+0,3 M Маннит	0,2	1	2,2	3,6
API+0,3 M Треонин	0,3	1	2	3,6
API+0,3 M Сахароза	0,2	0,7	1,5	2,6

Как показано на фиг. 1 и в таблице 2, состав, содержащий только API, и состав, содержащий 0,1 М NaCl, показали наибольшую агрегацию. Состав API, содержащий сахарозу, был самым стабильным с наименьшим количеством агрегатов, сформированных при хранении.

Ускоренное исследование стабильности также проводят при 40°C для жидких составов API, содержащих API (50 мг/мл); API (50 мг/мл) плюс аланин (0,25M) или сахароза (0,25M); и API (на 50 мг/мл) плюс аланин (0,125M)/сахароза (0,125M).

Как показано на фиг. 2, при включении одного аланина была улучшена степень стабильности композиции, содержащей API, как определено процентным содержанием агрегатов по времени. Кроме того, объединение некоторого количества сахарозы с аланином также придавало степень стабильности, которая была больше, чем в случае только одного аланина.

Пример 2

Ускоренное исследование стабильности, описанное в примере 1, также проводили при 40°C для жидких составов API, содержащих API (50 мг/мл); API (50 мг/мл) плюс аланин (0,25M) или маннит (0,25M); и API (50 мг/мл) плюс аланин (0,125M)/маннит (0,125M).

Как показано на фиг. 3, при включении одного аланина была улучшена степень стабильности композиции, содержащей API, как определено процентным содержанием агрегатов по времени. Кроме того, объединение некоторого количества маннита с аланином также придавало степень стабильности, которая была больше, чем в случае только одного аланина.

Пример 3

Ускоренное исследование стабильности, описанное в примере 1, также проводили при 40°C для определения эффекта стабилизации сахарозой, трегалозой и аланином при различных концентрациях. Для оценки эффектов стабилизации сахарозой, трегалозой и аланином, готовили десять составов, содержащих эти ингредиенты в количестве 0,25 М, 0,5 М и 0,75 М, соответственно, и асептически заполняли в пробирки объемом 5 мл. Исследовали агрегацию этих образцов при 40°C в течение 4 недель.

Результаты показаны на фиг. 4. Начальная агрегация составляла 0. Во время 4-недельной инкубации не наблюдали агрегацию API в составах с 0,75 М сахарозы или 0,75 М трегалозы. В первую неделю при 40°C не наблюдали агрегации. API без добавок подвергался агрегации в первую неделю, и уровень агрегации был самым высоким при каждом измерении. Уровень агрегации уменьшался при увеличении концентрации добавок. Трегалоза показала наилучшую стабилизацию против агрегации, а затем сахароза и аланин.

Пример 4

Ускоренное исследование стабильности, описанное в примере 1, также проводили при 40°C для определения эффекта концентрации аланина или глицина на составы API. Аланин или глицин в количестве 0 М, 0,1 М, 0,15 М, 0,2 М, 0,25 М или 0,3 М добавляли в жидкие составы API и уровни агрегации сравнивали в различные периоды времени при 40°C. Уровни агрегации всех составов начались с приблизительно 1,3-1,4%.

На фиг. 5 показаны уровни агрегации в жидких растворах API, приготовленных с различными концентрациями аланина или глицина, после инкубирования при 40°C в течение 1 недели. Уровни агрегации уменьшались при увеличении концентрации глицина или аланина. На фиг. 6 показаны уровни агрегации на 2 неделе. Результаты согласуются с данными по 1 неделе. Уровни агрегации уменьшались при увеличении концентрации глицина или аланина. Агрегация через 3 и 4 недели также показала, что агрегация меньше при добавлении большего количества аланина или глицина (данные не показаны).

Пример 5

Ускоренное исследование стабильности, описанное в примере 1, также проводили при 40°C для определения влияния поглотителей кислорода на агрегацию. Таким образом, готовили жидкие составы, содержащие API (50 мг/мл) и аланин (0,25 M), которые дополнительно содержали 0,3%, 0,5% и 0,7% метионина.

На фиг. 7 показаны профили агрегации при 40°C. Влияния метионина на агрегацию был минимален. Не наблюдалось какого-либо значительного снижения уровня агрегации.

Пример 6

Рабочий раствор, включающий альфа-1 ингибитор протеазы (API) (полученный из плазмы человека; активность 65 мг/мл), получали в буфере 20 мМ фосфата натрия, содержащего 100 мМ хлорида натрия. Использовали ультрафильтрацию/диафильтрацию (UF/DF) для диализа рабочего раствора (30 л) фосфатным буфером (20 мМ, pH 7), используя 240 л фосфатного буфера для достижения конечной точки. Затем добавляли аминокислоты и/или другие ингредиенты, и конечную концентрацию белка доводили до 50 мг/мл. Полученный раствор фильтровали через 0,22 мкм фильтр и расфасовывали в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Заполняющий объем составлял 20,0 мл. Пробирки закупоривали и маркировали.

Состав 1 содержал 250 мМ глицина; состав 2 содержал 250 мМ L-аланина; состав 3 содержал 125 мМ L-аланина и 4,2% сахарозы; и состав 4 содержал 100 мМ хлорида натрия. Для каждого состава количество API составляло 50 мг/мл, и буфер представлял собой 20 мМ фосфат-натриевый буфер (смесь одноосновного и двухосновного гептагидрата). Для лиофилизированного продукта выполняли дополнительные исследования, включая время растворимости/визуальный контроль после восстановления и оценку влажности.

Образцы закладывали для оценки стабильности при 5°C и 25°C. В начальный момент времени (время 0) проводили следующие исследования образцов состава: внешний вид, фибриллы, активность, pH, SEC-HPLC, измерение при поглощении света при A₂₈₀, нефелометрические (NTU) измерения, белковый состав капиллярным зонным электрофорезом (CZE), дезамидированием и динамическим рассеянием света (DLS). Определение натрия выполняли атомно-абсорбционной спектрофотометрией; определение сахарозы выполняли ионной хроматографией; нефелометрия: определения мутности выполняли, используя HACH нефелометр, измеряющий соотношения; и количественное определение API выполняли, используя метод определения активности на 96-луночной плашке.

Таблица 3 показывает результаты, полученные в исследованиях, проведенных в начальный момент.

Данные по стабильности при 5°C: При 5°C наблюдалось незначительное количество фибрилл в составах API с аланином/сахарозой (состав 3) через 3 и 6 месяцев. Не наблюдалось каких-либо фибрилл в других составах за весь период хранения. Не наблюдали какого-либо значительного изменения активности (фиг. 8), NTU (фиг. 9), pH, удельной активности (фиг. 10), измеренные DLS и дезамидирование (фиг. 11). Результирующая контейнерная точность активности (BCS) составила 5%. Промежуточная точность для NTU и дезамидирования составила 3,0% и 18,5%, соответственно. Наблюдаемые различия были в пределах погрешности исследований.

Эксклюзионной хроматографией (SEC-HPLC) разделяли белок образца по гидродинамическому объему молекулы. При SEC-HPLC молекулы с большим гидродинамическим объемом минимально взаимодействуют (если вообще есть взаимодействие) с упаковывающей колонкой и вымываются в объем пустот колонки (V₀). Молекулы с меньшим гидродинамическим объемом сильнее взаимодействуют с упаковывающей колонкой и вымываются из колонки после объема пустот.

В соответствии с данными по стабильности, состав API c NaCl (состав 4), показывал немного более высокие уровни агрегации по сравнению с другими составами, как определено SEC-HPLC. После 6 месяцев уровни агрегации увеличились на 0,66%, 0,58%, 0,43% и 0,42% в образцах с NaCl (состав 4), глицином (состав 1), аланином (состав 2) и аланином/сахарозой (состав 3) (фиг. 12 и 13), соответственно; как видно, олигомерные пики оставались неизменными (фиг. 14); а мономерные уровни уменьшились на 0,87%, 0,61%, 0,57% и 0,65%, соответственно (фиг. 15).

Данные по стабильности при 25°C: При 25°C не наблюдали каких-либо фибрилл во всех составах после 6 месяцев. Наблюдали незначительное изменение активности (фиг. 16), pH и DLS. NTU увеличилось при NaCl, показав наиболее высокое значение 7,88 (фиг. 17).

Удельная активность уменьшилась на 0,2-0,3 во всех составах через 6 месяцев (фиг. 18). Такое уменьшение может быть обусловлено увеличением поглощения при A₂₈₀, которое увеличилось с 25 AU до приблизительно 28 AU во всех составах через 6 месяцев (фиг. 19).

Дезамидирование может происходить в процессе получения исходного продукта, что может объяснить приблизительно 6% уровень дезамидирования исходного материала. Дезамидирование увеличилось с начального среднего значения 6% до 20% через 6 месяцев (фиг. 19). Даже при том, что состав 4 показывал немного более низкий уровень дезамидирования (17%) по сравнению с другими составами (приблизительно 20%), разница находится в пределах вариабельности исследования 18,5%.

Уровни агрегации и олигомерные уровни увеличились (фиг. 21-23). Мономерные уровни снижались (фиг. 23) со временем. Уменьшение мономерного уровня сопоставимо с суммой увеличения олигомерного уровня и агрегации. Через 6 месяцев уровни агрегации увеличилось на 3,52%, 3,12%, 2,6% и 2,25% в составе 4, составе 1, составе 2 и составе 3, соответственно (фиг. 20).

После инкубации при 5°C в течение 6 месяцев не наблюдалось каких-либо заметных изменений активности, NTU, pH, удельной активности, DLS и измеренного дезамидирования. Наблюдали незначительное увеличение (<1%) уровня агрегации и соответствующего уменьшения мономерного уровня. Эти результаты показывают стабильность составов API при 5°C в течение 6 месяцев.

После инкубации при 25°C в течение 6 месяцев наблюдали значительное увеличение уровня агрегации и NTU в Составе 4 (то есть, API плюс NaCl). Глицин, аланин и аланин/сахароза сокращали агрегацию и NTU, где аланин/сахароза являлись самым эффективным стабилизатором. Дезамидирование значительно выросло. Эти результаты указывают, что жидкие составы, включающие API, подвержены агрегации и дезамидированию при 25°C, и что аминокислоты предотвращают агрегацию. Экстраполяция данных агрегации при 5°C (фиг. 13) показывает, что предсказанное время достижения 5% уровня агрегации составляет 25 месяцев для Состава 4, 44 месяца для Состава 2 и 51 месяц для Состава 3. Таким образом, ожидается, что аминокислоты обеспечат значительную стабилизацию белка и существенно увеличат срок хранения.

Пример 7

Температура плавления жидких составов, включающих API

Выполняли DSC для измерения средней точки перехода (T_m) для различных составов API, чтобы определить их температуру плавления.

Готовили составы API, содержащие API (50 мг/мл), с различными ингредиентами. Кратко, растворы API диализировали фосфатным буфером (20 мМ, pH 7), каждый из которых содержал ингредиенты, перечисленные в таблице 4. Результаты показаны в таблице 4.

Таблица 4 Температура плавления составов API
Ингредиент	Концентрация (мМ)	Точки плавления (°C)
-	0	61,54
Аланин	300	64,10
Треонин	300	64,36
Гидроксипролин	300	64,07
Глицин	300	64,43
Серин	300	64,37
Сахароза	300	64,29
Глутамин	30	62,13
Фенилаланин	30	62,02
Триптофан	30	61,26
Метионин	30	61,32
Ацетилцистеин	30	63,91
Лейцин	30	62,24
Изолейцин	30	62,50
Валин	300	62,70
Лизин	30	63,61
Аргинин	300	62,88

Точка плавления белка API в pH 7 фосфатном буфере составила 61,54°C. Повышение точки плавления можно использовать в качестве индикатора усиления конформационной стабильности белка API.

Пример 8

Влияние pH и концентрации белка в жидких составах, включающих API

Чтобы определить влияние pH и концентрации белка на агрегацию, растворы API, приготовленные при различном pH и концентрациях белка, инкубировали при 40°C, и данные об агрегации анализировали E-CHIP. Концентрацию белка рассчитывали измерением поглощения света при 280 нм, где A280/0,53 соответствует значению концентрации 50 мг/мл. Данные агрегации при 40°C определяли для исследований, перечисленных в таблице 5.

Таблица 5 Исследование влияния pH и концентрации белка на агрегацию составов API
Исследование	Концентрация API (мг/мл)	pH
3	50	6,3
9A	50	6,7
9B	50	6,7
6	25	7,1
4	50	7,1
8	25	6,3
5	75	7,1
7	75	6,3
9C	50	6,7
9D	50	6,7
1	25	6,7
2	75	6,7
9E	50	6,7

Согласно E-CHIP модели, предположенный оптимальный pH для минимальной агрегации API при 50 мг/мл составил 6,9 (фиг. 24). Агрегацию наблюдали при pH 6,3 и значение агрегации были намного меньше при pH 6,7 и 7,1 (фиг. 25). Агрегация уменьшалась с увеличением pH и достигала минимального значения при pH 6,9 (фиг. 26). На фиг. 27 показано, что агрегация увеличилась почти линейно с концентрацией белка.

Claims

1. Стабильная композиция для обеспечения субъекта терапевтически или профилактически эффективным количеством альфа-1 ингибитора протеазы (API), содержащая
(a) альфа-1 ингибитор протеазы (API); и
(b) по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из аланина, треонина, серина или гидроксипролина, где указанная композиция включает одно или более вспомогательных веществ, где по меньшей мере одна аминокислота присутствует в композиции в общем количестве аминокислоты от приблизительно 0,01 М до приблизительно 3 М, которого достаточно для сохранения API по меньшей мере 50% его активности, когда композиция подвергается температурному воздействию от приблизительно 5°C до приблизительно 40°C в течение по меньшей мере приблизительно 6 месяцев.

2. Композиция по п. 1, где аминокислота представляет собой аланин.

3. Композиция по п. 1, дополнительно включающая одно или более вспомогательных веществ.

4. Композиция по п. 1, где одно или более вспомогательных веществ выбраны из группы, состоящей из: сахарозы, маннита, глицерина, сорбита, декстрана, трегалозы, гидроксиэтилированного крахмала (HES) и 1,2-пропандиола.

5. Композиция по п. 1, где композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель.

6. Композиция по п. 1, где композиция подходит для внутривенного введения субъекту.

7. Композиция по п. 1, где по меньшей мере одна аминокислота присутствует в композиции в общем количестве аминокислоты, достаточном для общей агрегации белка менее чем приблизительно 5%, после температурного воздействия на композицию в течение некоторого периода времени.

8. Композиция по п. 7, где температура составляет приблизительно 25°C, где период времени составляет приблизительно 6 месяцев.

9. Композиция по п. 7, где температура составляет приблизительно 5°C, где период времени составляет приблизительно 6 месяцев.

10. Композиция по п. 7, где по меньшей мере одна аминокислота присутствует в композиции в общем количестве аминокислоты, достаточном, чтобы обеспечить общую агрегацию общего белка менее чем приблизительно 2%, после температурного воздействия на композицию в течение некоторого периода времени.

11. Композиция по п. 7, где pH композиции составляет от приблизительно 6,3 до приблизительно 7,4.

12. Композиция по п. 7, где pH композиции составляет от приблизительно 6,7 до приблизительно 7,1.

13. Композиция по п. 1, где композиция приготовлена в лиофилизированной форме.

14. Набор для лечения или предотвращения заболевания или состояния, ассоциируемого с API, включающий композицию по п. 1, в качестве фармацевтической композиции, подходящей для внутривенного введения и инструкцию по применению указанного набора.

15. Применение по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аланина, треонина, серина или гидроксипролина, для стабилизации композиции, содержащей альфа-1 ингибитор протеазы (API), где указанная по меньшей мере одна аминокислота применяется в композиции в общем количестве аминокислоты от приблизительно 0,01 М до приблизительно 3 М, которого достаточно для сохранения API по меньшей мере 50% его активности, когда композиция подвергается температурному воздействию от приблизительно 5°C до приблизительно 40°C в течение по меньшей мере приблизительно 6 месяцев.