JP2562571B2 - 新規ニトリロトリ酢酸誘導体及びその塩、並びにそれらの製造方法 - Google Patents

新規ニトリロトリ酢酸誘導体及びその塩、並びにそれらの製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は金属キレートクロマトグラフィー
に適した樹脂に用いることのできる新規ニトリロトリ酢
酸誘導体及びその塩、並びにそれらの製造方法に関する
ものである。蛋白質の新しい精製方法として、金属キレ
ートアフィニティークロマトグラフィーはポーラス（Po
rath）等〔Nature 258, 598-599(1975) 〕により1975年
に紹介された。この新技術は多くの所で首尾よく使わ
れ、そして総説論文に〔レエネルダアル．ベー．とキー
ン．ツェー．エル.,（Loennerdal.B. and Keen C.L.,)
J. Appl. Biochem. 4, 203-208(1982)：スルコウスキィ
ー．イー., (Sulkowski.E.,) Trends in Biotechnolog
y. 3, 1-7(1985)〕すでに論じられている。
【０００２】金属キレートアフィニティークロマトグラ
フィーは、キレート結合でクロマトグラフィーゲルに結
合された（固定化された）Ｃｕ2+及びＺｎ2+の如き金属
イオンが蛋白質の表面、特にヒスチジンのイミダゾール
側鎖に位置する電子供与性基との可逆的に相互作用に貢
献し得るという発見に基づいている。電子供与性基が少
なくとも部分的に非プロトン化した形で存在するｐＨ値
で、蛋白質はクロマトグラフィーゲル（例えばアガロー
ス）に結合し、次いで、電子供与性基がプロトン化され
る低いｐＨ値の緩衝液で溶離される。例えば、いわゆる
スペーサーを介して樹脂のキャリアーマトリックス（ca
rrier matrix）に結合しているイミノジ酢酸はキレート
形成体として非常に信頼されていた。
【０００３】従って、生体高分子精製用の理想的な樹脂
としては、一方では金属イオンと強く結合しなければな
らず、他方においては、金属イオンと蛋白質の間での可
逆的相互作用が可能でなければならない。固定化したイ
ミノジ酢酸はＣｕIIイオンに対してこれらの必要条件を
十分に満たすが、ＮｉIIイオンに対しては前記必要条件
を限られた範囲でしか満たさない。これは後者は単に弱
く結合し、蛋白質混合液を導通してすらしばしば洗い出
されてしまう為である。一方、ＮIIキレート樹脂はＮ1
2+イオンが高配位数を有する、即ちＮｉIIイオンは６配
位子と錯体を作り、ＣｕIIイオンはむしろ４配位子と錯
体を作るので生体物質の精製には特に興味深い。ニッケ
ル錯体において、４原子価は樹脂中で金属イオンを結び
つけるのに利用でき、そして、２原子価は金属イオンと
生体高分子間の交換に利用できる。
【０００４】これまで、金属イオンに出来る限り大きい
親和力を持つキレート樹脂製造の試みがなされていた。
錯体形成成分としては、例えば、Ｎ,Ｎ,Ｎ'−エチレン
ジアミン三酢酸〔ハーナー，エム．(Haner, M.) ら、An
al. Biochem. 138, 229-234(1984)〕及び１，３−ジア
ミノプロパンＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−四酢酸〔モイヤス，イ
ー．エム．(Moyers, E.M.) とジェイ．エス．フリッツ
（J.S. Fritz) 、Anal. Chem. 49, 418-423(1977) 〕が
使われていた。しかし、これらの樹脂は金属イオンと生
体高分子間の交換が最適でない欠点があった。
【０００５】ニトリロトリ酢酸は４配位キレート形成体
である。固定化したニトリロトリ酢酸は、２原子価が生
体高分子に可逆的結合のために利用されるので、配位数
６を持つ金属イオンに適したキレート樹脂である。この
様な金属キレート樹脂はその表面に２個の近接するヒス
チジンを持つ蛋白質の結合に特に適している。しかしな
がら、ニトリロトリ酢酸はそのキレート形成能力を本質
的に減少させることなく、イミノジ酢酸と同様に担体に
結合できない。この問題は式 NH2-(CH2)X-CH(COOH)-N(CH2COOH)2 （Ｉ） （式中、ｘは２，３又は４を示す） で表わされる新規ニトリロトリ酢酸を製造することによ
って並びに、スペーサーを経たキャリアーマトリックス
にそれらを固定化することによって解決することができ
た。
【０００６】従って、本発明は上記式のニトリロトリ酢
酸誘導体及びその塩並びにそれらの製造方法に関するも
のである。本発明において、特に好ましいニトリロトリ
酢酸誘導体はＮ−〔３−アミノ−１−カルボキシプロピ
ル〕−イミノジ酢酸及びＮ−〔５−アミノ−１−カルボ
キシペンチル〕−イミノジ酢酸である。本発明では、そ
れらの金属キレート基に基づいて、蛋白質の精製、特に
近接するヒスチジン残基を含む蛋白質の精製に適してい
る金属キレート樹脂を得ることができる。
【０００７】本発明のニトリロトリ酢酸誘導体により、
一般式
【０００８】
【化１】
【０００９】（式中、ｘは２，３又は４を示す） で定義される金属キレート樹脂（以下、本発明による金
属キレート樹脂という。）が得られる。キャリアーマト
リックスとしては、アフィニティー及びゲルクロマトグ
ラフィーに使われる物質、例えば架橋したデキストラ
ン、アガロース（特に、商品名セファロース（登録商
標）で知られているもの）或いはポリアクリルアミドが
考えられる。
【００１０】スペーサーとしては、アフィニティークロ
マトグラフィーで既に知られているスペーサー基が考え
られ、特に -O-CH2-CH(OH)-CH2- 基及び -O-CO- 基が好
ましい。本発明において、特に好ましいキレート樹脂
は、式
【００１１】
【化２】
【００１２】で表わされるキレート樹脂である。なお、
セファロース（登録商標）ＣＬ−６Ｂは、架橋アガロー
スを約６％含む、直径45〜165 μｍのビーズ状ゲルであ
る。本発明のニトリロトリ酢酸誘導体の製造は式 R-HN
-(CH2)X-CH(NH2)-COOH（式中、Ｒはアミノ保護基を示
し、ｘは２，３又は４を示す）で表されるＮ−末端保護
化合物をアルカリ性媒質中ブロム酢酸と共に反応させ、
次いで、保護基を脱離させることによるそれ自体は公知
の方法で行うことができる。好ましいアミノ保護基はベ
ンジルオキシカルボニル残基（Ｚ）で、これは接触水素
添加、好ましくはパラジウム／炭素とともに接触水素添
加することにより除去することができる。この方法で、
【００１３】
【化３】
【００１４】は先に述べた特に好ましいニトリロトリ酢
酸誘導体に変換することができる。本発明においてキレ
ート樹脂の製造はそれ自体公知の方法で行うことがで
き、それにより、最初にキャリアーマトリックスは機能
化され（スペーサーの導入）、そして所望のニトリロト
リ酢酸誘導体がスペーサーに共有結合する。アガロース
をキャリアーマトリックスとして使うとき、これを、例
えば、エピブロムヒドリンとアルカリ媒質中で反応させ
ることにより、
【００１５】
【化４】
【００１６】を含むオキシラン（oxirane)−アガロース
が得られる。そして、このオキシラン−アガロースは、
本発明のニトリロトリ酢酸誘導体、好ましくはＮ−〔５
−アミノ−１−カルボキシプロピル〕−イミノジ酢酸又
はＮ−〔５−アミノ−１−カルボキシペンチル〕−イミ
ノジ酢酸とアルカリ性媒質中で反応させ、次いでニッケ
ル塩溶液、例えば硫酸ニッケルで洗浄することによるそ
れ自体は公知の方法で所望のキレート樹脂に変換するこ
とができる。特別な場合、異なる金属イオン（例えば、
Ｃｏ，Ｃｄ) の使用は好都合であり、樹脂を適当な金属
塩と共に反応させることにより、相当する金属キレート
樹脂を容易に得ることができる。また、エピクロルヒド
リンをエピブロムヒドリンの代りに使用することも出来
る。アガロースとしては、標定化した製品、好ましくは
スウェーデン，アプサラ(Uppsala),ファルマシア社のセ
ファロース（登録商標）が有利に使える。セファロース
（登録商標）ＣＬ−６Ｂは特に好ましい。同様の方法に
より、遊離の水酸基を含むポリアクリルアミド樹脂を先
に示した如く本発明によるキレート樹脂に変換すること
ができる。陽イオン交換樹脂をマトリックス（matrix)
として使用する場合、ニトリロトリ酢酸誘導体のカップ
リングはアミド結合の形成により直接行わせることがで
きる。
【００１７】本発明によるキレート樹脂の製造には、市
販のすでに機能化したキャリアーマトリックスも使用す
ることができる。本発明において、特に好ましい機能化
したキャリアーマトリックスは、
【００１８】
【化５】
【００１９】を有するイミダゾールカルバメイト−アガ
ロースで、これは米国イリノイ，ロックフォード（Rock
ford), ピアース社（Pierce) の商品名リアクチゲルTM
(ReactigelTM) として販売されている。本発明によるキ
レート樹脂は近接するヒスチジン残基を含むペプチドと
蛋白質に対する特に高い特異性によって区別される。従
って、近接するヒスチジン残基、とりわけ２個の近接す
るヒスチジン残基を含有する蛋白質の精製に特に適して
いる。“近接するヒスチジン残基”の用語は、特定のペ
プチドと蛋白質の三次元空間、即ち化合物の表面上のヒ
スチジン残基の配列を意味している。ヒスチジン残基の
近接は一次構造に基づいてすでに定められるか、或いは
二次及び／又は三次構造によってのみ実現される。従っ
て、本発明によるキレート樹脂は数個、特に近接する、
好ましくはすぐ隣接するヒスチジン残基を有する自然及
び変性蛋白質の精製に適している。
【００２０】本発明によるキレート樹脂はバッチ式ある
いは連続的カラム操作に使用することができる。蛋白質
の導通に先きだち、本発明によるキレート樹脂をそれ自
体はニッケルによってキレート形成しない緩衝液、好ま
しくはｐＨ８のリン酸緩衝液で都合よく平衡化させる。
平衡化緩衝液（並びに溶出緩衝液）は変性因子或いはデ
タージェント、例えばグアニジン塩酸、尿素或いはトリ
トン（triton) を含む。このような変性因子又はデター
ジェントを加えても、例えば膜蛋白質の如く水に極めて
難溶な蛋白質についてすら操作になんら問題はない。蛋
白質の溶離は一定のｐＨ値、或いは直線又は不連続的下
降ｐＨ勾配で行うことができる。至適溶出条件は存在す
る不純物の量と種類、精製する物質の量、カラムの大き
さ等に依存するので、場合毎に適宜決めればよい。
【００２１】以下の実施例は本発明のニトリロトリ酢酸
誘導体の製造、本発明による金属キレート樹脂の製造並
びに近接するヒスチジン残基を持つ蛋白質の精製におけ
るそれらの使用を示すものである。
【００２２】
【実施例】
（実施例１）ブロム酢酸41.7gを150mlの２Ｎ水酸化ナト
リウムに溶解し、０℃に冷却した。これに、42ｇの
【００２３】
【化６】
【００２４】を225 mlの２Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し
た溶液を攪拌しながら０℃でゆっくり滴下した。２時間
後冷却を止め、この混合液を一夜攪拌した。この反応混
合液は50℃に２時間保ち、続いて、 450mlの１Ｎ塩酸を
加えた。混合液を冷却した後、析出した結晶を濾別し
た。この生成物を１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に溶解し、
同量の１Ｎ塩酸で再沈殿させ、濾別した。白色結晶、m.
p. 172〜174℃（分解）、〔α〕D ＝＋9.９（ｃ＝１：
0.1N NaOH) のＮ−〔５−ベンジルオキシカルボニルア
ミノ−１−カルボキシペンチル〕−イミノジ酢酸40ｇが
得られた。
【００２５】得られたリジン誘導体 7.9ｇを49mlの１Ｎ
水酸化ナトリウムに溶解し、スパーテルの先一杯分の５
％パラジウム／炭素を添加後、室温、常圧下で水素添加
させた。触媒を濾別し、そして濾液を蒸発させた。かく
して、 6.2ｇのＮ−〔５−アミノ−１−カルボキシペン
チル〕−イミノジ酢酸が得られた。その構造式 NH2-(CH2)4-CH(COOH)-N-(CH2COOH)2 をＮＭＲスペクトルにより確認した。
【００２６】（試験例１）100ml のセファロース ＣＬ
−６Ｂ（ファルマシア製）をガラス吸引濾過器上で、約
500mlの水で２回洗浄し、次いで 500ml丸フラスコ中16
mlの４Ｎ水酸化ナトリウムと8.22mlのエピブロムヒドリ
ンと共に30℃で、４時間反応させた。反応混合液の全量
は 200mlであった。次いで、活性化させたセファロース
を濾別し、水で中性に洗浄して、そして反応容器にもど
した。実施例１で得られたＮ−〔５−アミノ−１−カル
ボキシペンチル〕−イミノジ酢酸 6.5ｇを50mlの水に溶
解し、10.6ｇの固体炭酸ナトリウムと共に活性化させた
セファロースに加えた。この混合物を60℃で一夜ゆっく
りと攪拌した。得られた式
【００２７】
【化７】
【００２８】（ＮＴＡ樹脂）のキレート樹脂をクロマト
グラフィーカラム中で連続的に、 500mlの水、100mlの
NiSO4・6H2O（２重量％）水溶液、200mlの水、200mlの
0.2Ｍ酢酸（0.２Ｍ塩化ナトリウムと0.１重量／容量％
ツィーン20含有）及び 200mlの水で洗浄した。得られた
式
【００２９】
【化８】
【００３０】のキレート樹脂のニッケルイオン濃度は約
7.1μM/mlになった。 （試験例２）固定化したイミノジ酢酸（ＩＭＡ）と固定
化したニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）のニッケル錯体の安
定性の定量的比較のため、この２種のニッケルキレート
樹脂をイミノジ酢酸の水溶液で溶離し、ニッケルイオン
の流失を追跡した。
【００３１】50mlの式 -O-CH2-CH(CO)-CH2-N(CH2COOH)2 （調製方法：ヨーロッパ特許出願番号84101814.6, 公開
番号118 808参照）のＩＭＡ樹脂をクロマトグラフィー
カラム（ｄ＝1.６cm）に入れ、水で十分に洗浄した。そ
して、10mlの0.012M NiSO4・5H2O 水溶液を 100ml／時
間の流速で導入し、続いて70mlの水で洗浄した。それを
0.１Ｍイミノジ酢酸水溶液、ｐＨ7.0 で溶出した。10ml
の分画を集めた。ニッケルイオンは画分10〜19に検出
（UV390nm)された。
【００３２】同様の方法で、50mlの式
【００３３】
【化９】
【００３４】のＮＴＡ樹脂をクロマトグラフィーカラム
（ｄ＝1.６cm）に入れ、洗浄して、その後、10mlの0.01
2M NiSO4・5H2O 水溶液を充填し、再び水洗し、そして
0.１Ｍイミノジ酢酸水溶液、ｐＨ7.0 で溶出した。ニッ
ケルイオンは画分30〜34にのみ検出（UV390nm ）され、
このことから、ニッケルイオンが既知ＩＭＡ樹脂よりも
新規なＮＴＡ樹脂中でより強く結合していることは明ら
かである。
【００３５】（実施例２）6.5ｇのブロム酢酸を8.１ml
の４Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し、０℃に冷却した。そ
れに、4.1 ｇの
【００３６】
【化１０】
【００３７】を24.4mlの２Ｎ水酸化ナトリウム溶液に溶
解した溶液を攪拌しながら滴下した。２時間後、冷却を
止め、混合物を一夜攪拌した。次に、この反応混合物を
50℃２時間保持し、そして12.2mlの４Ｎ塩酸を加えた。
この混合物を冷却した後、分離した結晶を濾別した。生
成物は２Ｎ水酸化ナトリウム溶液に溶解し、6.１mlの４
Ｎ塩酸で再沈殿し、濾別した。白色結晶、m.p. 136〜13
8℃（分解）のＮ−〔３−ベンジルオキシカルボニルア
ミノ−１−カルボキシプロピル〕−イミノジ酢酸５ｇを
得た。
【００３８】得られた酪酸誘導体 2.9ｇを16mlの１Ｎ水
酸化ナトリウム溶液に溶解し、スパーテルの先一杯分の
５％パラジウム／炭素を添加後、室温、常圧下で水素添
加させた。触媒を濾別し、濾液を蒸発させた。かくし
て、 2.2ｇのＮ−〔３−アミノ−１−カルボキシプロピ
ル〕−イミノジ酢酸が得られた。その構造 NH2-(CH2)2-CH(COOH)-N(CH2COOH)2 をＮＭＲスペクトルで確認した。
【００３９】（試験例３）50mlの水に、実施例２で得ら
れたＮ−〔３−アミノ−１−カルボキシプロピル〕−イ
ミノジ酢酸 1.9ｇを溶解した溶液を 2.6ｇの固体炭酸ナ
トリウムで処理した。混合物を０℃に冷却し、これにイ
ミダゾールカルバメイト（ピアース社製のリアクチーゲ
ルTM) で活性化させたアガロース50mlを加えた。０℃、
15時間インキュベーション後、得られた、式 アガロース-0-CO-NH-(CH2)2-CH(COOH)-N(CH2C00H)2 のキレート樹脂を濾別し、水洗して、試験例１で記載し
た如くＮｉIIイオンを導通した。得られた、式 アガロース-0-CO-NH-(CH2)2-CH(COOH)-N(CH2C00-)Ni2+ のキレート樹脂のニッケルイオン濃度は 3.1μM/mlにな
った。
【００４０】（試験例４）カラム（直径＝１cm、長さ＝
4.８cm）に式
【００４１】
【化１１】
【００４２】（ＮＴＡ樹脂）の金属を含まないキレート
樹脂を満たし、カラム三倍容量の0.1MNiSO4・5H2Oで洗
い、次いで、カラム三倍容量の0.２Ｍ酢酸で洗浄するこ
とによりニッケル型とした。次に0.１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ8.０) と0.５Ｍ塩化ナトリウムの溶液で
（それぞれの流速：13.2ml／時間）で平衡化させた。 １mgの式 His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Glu-Ala-Gly-Asp-Val のモデルペプチドを１mlの平衡緩衝液に溶解し、カラム
に付した。このモデルペプチドは0.２Ｍイミダゾール、
0.１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ8.０と0.５Ｍ塩化ナトリ
ウムの溶液で溶離できた。溶離液の検出はムーレ．エ
ス．及びステェイン．ダブリュ（Moore.S. and Stein.
W.)〔J.Biol. Chem. 176, 367-388(1948)〕に従いニン
ヒドリンで行った。
【００４３】（試験例５）試験例４と同様の方法で、カ
ラム（直径＝１cm，長さ4.８cm）にＮＴＡ樹脂を満た
し、ニッケル型とした。0.２Ｍ酢酸で洗浄後、このカラ
ムを７Ｍグアニジン塩酸、0.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液の溶液（ｐＨ8.０）で平衡化させた。 種々の量（12.7mgまで）の式 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-Hi
s-Ser のモデルペプチドを１mlの７Ｍグアニジン塩酸、0.１Ｍ
リン酸ナトリウム（ｐＨ8.０）の溶液に溶解し、このカ
ラムに付した。このペプチドは７Ｍグアニジン塩酸に易
溶であるが、0.１Ｍリン酸ナトリウムと0.５Ｍ塩化ナト
リウムには難溶である。溶出は段階的にｐＨを下げるこ
とによって行った。ペプチドはλ＝280nmのＵＶスペク
トロメトリーにより検出された。
【００４４】牛膵臓由来トリプシンと馬心臓由来チトク
ロームＣを比較物質として使用した。２種類の蛋白質と
もＮＴＡ樹脂にｐＨ８で結合しない。明らかにヒスチジ
ンの配列が決定的な役割をはたしている。トリプシンの
場合、３個のヒスチジンは29, 46及び79位に位置してい
るが、それは７Ｍグアニジンで構造をこわしても安定な
錯体を形成する位置ではない。チトクロームＣの場合で
は、２個のヒスチジンが空間的に近接（18と26位）して
いるが、１個のヒスチジンがヘム−鉄（haem-iron）に
結合しているので、それは２配位子を形成する位置では
ない。
【００４５】（試験例６）乳酸脱水素酵素イソ酵素は分
子量140,000の４量体蛋白質である。豚由来のこのイソ
酵素はアミノ末端領域を除いてほとんど相同である。こ
れは、この蛋白質表面上に位置している。心臓型イソ酵
素はこの領域にヒスチジンを持たないが、筋肉型は３個
持ち、その中には His-Val-Pro-Hisの配列がある〔エ
ル．リー（L.Li) ら、J.Biol. Chem. 258, 7029-7032(1
983)〕。
【００４６】試験例４に記載した如く、カラム（直径＝
１cm，長さ＝4.８cm）にＮＴＡ樹脂を満たし、ニッケル
型とし、そして0.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.
５）と0.5Ｍ塩化ナトリウムの溶液で平衡化させた。２m
gの豚心臓（H4-LOH) 又は豚筋肉（M4-LOH) 由来の乳酸
脱水素酵素を1.5mlの平衡緩衝液に溶解し、上記カラム
に付した。 H4-LOHはその28個のヒスチジン残基にもか
かわらず吸着しないが、 M4-LOHはｐＨ7.５で吸着し、
ｐＨ６に下げることで溶離させた。
【００４７】本実験はＮＴＡ樹脂が構造要素として蛋白
質表面上に隣接するヒスチジン残基を持つ蛋白質にきわ
めて選択的であることを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｒ // Ｃ０９Ｋ 3/00 １０８ Ｃ０９Ｋ 3/00 １０８

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式 H2N-(CH2)x-CH(COOH)-N(CH2COOH)2 （式中、ｘは２，３又は４を示す） で表される化合物及びその塩。
  2. 【請求項２】 式 R-HN-(CH2)x-CH(NH2)-COOH （式中、Ｒはアミノ保護基を示し、ｘは２，３又は４を
    示す） で表される N−末端保護化合物を少なくとも２当量のブ
    ロム酢酸と反応させ、生じた生成物から保護基を脱離さ
    せることを特徴とする式 H2N-(CH2)x-CH(COOH)-N(CH2COOH)2 （式中、ｘは２，３又は４を示す） で表される化合物の製造方法。
  3. 【請求項３】 保護基がベンジルオキシカルボニル
    （Ｚ）で、その脱離をパラジウム／炭素の存在下、水素
    添加によって行なわせる特許請求の範囲第２項に記載の
    方法。
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