JPS5824176B2 - 酵素吸着体及び酵素の精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なトリプシン様酵素吸着用吸着体及び該吸
着体を用いる酵素の精製方法に関する。

本発明のトリプシン様酵素吸着用吸着体は式で表わされ
る化合物をリガンドとするものである。

近年、ファイニテイークロマトグラフイーによる各種酵
素の精製技術が研究され、トリプシン、カリクレイン、
ウロキナーゼ等のセリンプロテアーゼの精製に関しても
、これらの酵素に対する種種の阻害剤をリガンドとする
アフィニティークロマトグラフィーが報告されている。

しかしながら、リガンドとして用いるこれらの阻害剤を
多量に得るのが困難であったり、目的とする酵素との特
異的親和力が充分でない等の欠点を有するものが多く、
効率よく多量の酵素を精製するに充分なアフィニティー
クロマトが求められている。

本発明者らは、血栓治療薬、抗ガン剤併用薬として繁用
されているウロキナーゼに注目し、該酵素と特異的な親
和力を有するリガンドの探索及びそのアフィニティーク
ロマトグラフィーについて検討を重ねた結果、前記式（
Ｉ）で表わされる化合物をリガンドとして用いた吸着体
が人ウロキナーゼを特異的に吸着するのみでなく、更に
、トリプシン、カリクレイン等のトリプシン様酵素類に
対しても強い親和力を有することを見い出し、本発明を
完成した。

本発明に係る式（１）で表わされる化合物は例えば下記
反応式に従って合成される。

前記式（Ｉ）で表わされる化合物は下記の如く、異性体
構造をとりうる。

本発明で用いられる式（Ｉ）の化合物の代表例を下記に
示す。

本発明で使用される担体としては、前記式（１）で表わ
される化合物を結合し得るもの、即ち、式（１）におけ
るフェニル基に結合したアミン基と反応し結合し得る水
不溶性のものであればいずれでもよく、例えば、アガロ
ース、架橋化デキストラン、セルロース類、寒天等の多
糖類、架橋ポリアクリルアミド等の高分子、その他ガラ
スピーズ等が使用できるが、通常アガ爾−スが使用され
る。

本発明の吸着体は、上記の担体に間隔子を介して前記式
（Ｉ）で示される化合物を通常の方法で結合させること
によって得られる。

例えばアガ冶−スを担体とするときは、臭化シアンでア
ガロースを活性化した後、一般式 ％式％ （式中、ｎは３〜１０の整数を示す。

）で表わされる間隔子を結合させ、該間隔子を介して前
記化合物（Ｉ）を結合させることによって得られる。

本発明の方法を実施するにあたっては、前述の如くして
得られた吸着体をカラムに充填し、これに粗酵素含有液
を流下する等の方法により充分吸着体と接触させて酵素
を該吸着体に吸着させる。

吸着されない不純物を充分洗浄除去した後、適当な溶離
液を用いて酵素を溶出させる。

カラムに流す粗酵素含有液及び溶離液は、塩濃度及びｐ
Ｈを特に狭い範囲に限定する必要はないが酵素により適
当に調整される。

ウロキナーゼの精製においては、粗酵素含有液の塩濃度
は０．２〜２Ｍ、好ましくは０．２〜ＩＭに、ｐＨは５
．５〜１０好ましくは６〜８．５に、溶離液の塩濃度は
０．５Ｍ以下、好ましくは０．３ Ｍ以下でｐＨは３．
５〜５．５゜好ましくは４〜５の酢酸緩衝液が使用され
る。

溶出した酵素含有液を、限外ｐ過、凍結乾燥等の通常の
方法で処理すれば高純度の酵素粉末が得られる。

また、本発明者らは、酵素の精製率を更に高めることの
できる、酵素に対する親和力の異る二種のクロマトグラ
フィーの極めて有利な組み合せを見い出した。

即ち、粗酵素含有液を、一般式（ＩＩ）（式中、Ｘはア
ミノ基又はカルボキシル基を、Ｙはアルキルアミノ基、
アルキル置換四級アンモニウム又はアルコキシカルボニ
ル基を示す。

）で表わされる化合物と水不溶性担体との結合体の充填
層１を通過させ、該炙填層からの流出液をそのまま、前
記本発明の吸着体の充填層２を通して該吸着体に酵素を
吸着させ１．次いで、吸着した酵素を溶出させる。

充填層１の前記結合体は、通常、一般式（Ｉｔ）で表わ
される化合物を間隔子を介して水不溶性の担体に結合さ
せてなる。

例えば、該結合体は一般式 （式中、ｎは３〜１０の整数を、Ｙは前記と同一の意味
を示す。

）で表わされる基が水不溶性の担体に結合したものであ
る。

該結合体における水不溶性担体の種類、また、該結合体
の製造方法は本発明の吸着体の場合と同様である。

本発明の精製法が適用できる酵素としては、ウロキナー
ゼの他、カリクレイン、トリプシン、トロンビン、プラ
スミン、エラスターゼ等種々のセリンプロテアーゼ類が
挙げられる。

以下に実施例を示し、本発明について更に詳しく説明す
る。

実施例 １ セファロース４Ｂ（商品名、スエーデ゛ン国ファルマシ
アファインケミカル社製）１００ｍｌをｐＨ１１におい
て臭化シアン１（ｌで１０分間活性化し、次いでｐＨ９
，５でヘキサメチレンジアミン５ｇを加え、撹拌下、４
°Ｃで２０時間反応させた。

反応物を水洗した後１００ｍ１の水に懸濁させ、無水コ
ハク酸１０ｇを加え、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを６
．０に１時間維持し、次いで４℃で２０時間反応させた
。

反応物を１１の水で洗浄しサクシンアミドへキシルアミ
ノ−アガロースを得た。

これに水１００ｍｊ？を加えて懸濁させ、（３−（４−
アミノフェノキシ）ベンゾイル〕グアニジン・１塩酸塩
５００ｍ９を加え、ｐＨを４，５に調整し、撹拌下に、
■−エチルー５−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩５６７ｇを加え、室温下で２０時間反
応させた。

反応終了後、得られたゲル体を０．０１規定塩酸、０．
０１規定水酸化すｌ−ＩＪウム、１規定塩化ナトリウム
、ｐＨ８）ＩＪス緩衝液、次いで、ｐＨ５酢酸緩衝液で
洗浄し、本発明の吸着体を得た。

実施例 ２ 実施例１で得られた吸着体１ｒｎｌを直径５ｍｍのプラ
スチックチューブに詰め、セライト等を吸着剤として人
尿から得た粗ウロキナーゼ水溶液４ｍ１（ウロキナーゼ
２，０００国際単位含有、比活性５．０００国際単位／
■蛋白）を流下させ、ついで２０ｍ１の０．３モル塩化
ナトＩＪウムを含むｐＨ７，５リン酸緩衝液、１２ｍ１
の０．２モル塩化ナトリウムを含むｐＨ４，０酢酸緩衝
液およびｐＨ４の６モル尿素水溶液を順次流下させた。

流出後の２８０ ｎｍにおける吸光度並びにウロキナー
ゼ活性を第１図に示した。

第１図から、流出液２８ｍ１から３６ｒｄにおける蛋白
単位当りのウロキナーゼ活性は、粗ウロキナーゼに比べ
て約１０倍に高められたことがわかった。

実施例 ３ セファロース４Ｂ（商品名、ファルマシアファインケミ
カル社製）に式 で表わされる基を、常法により結合させて得た結合体１
０ｍ１を直径０．９２ｃｆｆＬのカラム（以下、Ａカラ
ムという）に充填した。

別に、実施例２で使用したと同じ結合体１０ｍ１を直径
０．９２ｃｒｒｔのカラム（以下、Ｂカラムという）に
充填した。

セライトを吸着剤として人尿から得た粗ウロキナーゼ（
ウロキナーゼ１．０Ｘ１０６国際単位含有、比活性５，
０００国際単位／Ｔｎ９蛋白）を、０．４Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．１ Ｍ ＋、１ン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）５０ｍｌに溶解し、Ａカラムに通し、次いで、０．４
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）をＡカラムに通した。

この間、Ａカラムからの流出液はそのままＢカラムに通
した。

次に、Ｂカラムを１Ｍ食塩を含有するリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）で洗浄後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５
）を流し、ウロキナーゼを溶出させた。

ウロキナーゼ活性分画を集め透析濃縮、凍結乾燥し、０
．７５Ｘ１０６国際単位のウロキナーゼ粉末（比活性８
８，０００国際単位／ｍ９蛋白）を得た。

得られたウロキナーゼは、投与量ｓ、ｏｏｏ国際単位／
ｋｇ家兎体重で、発熱性物質試験は陰性であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２における流出液の、２８０ｎｍにおけ
る吸光度及びウロキナーゼ活性を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １式 で表わされる化合物が水不溶性の担体に間隔子を介して
   結合してなるトリプシン様酵素吸着用吸着体。