JPH0357750B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、人間の尿などの粗ウロキナーゼ含有
溶液から、ウロキナーゼを極めて効率よく製造す
る方法に関するものである。さらに詳しくは、セ
フエム骨格を有する物質をリガンドとする水不溶
性担体を用いて、粗ウロキナーゼ含有溶液から、
高純度のウロキナーゼを効率よく分離精製する方
法に関する。 ウロキナーゼは人尿中に存在するプラスミノゲ
ン活性化酵素で、各種血栓症の治療のみならず、
制ガン剤との併用療法にも用途が見い出されるな
ど、その重要性は年々増している。 人尿などからウロキナーゼを分離精製するに
は、シリカゲル、イオン交換体、塩基性アミノ酸
などをリガンドとする水不溶性担体等を使用する
方法がよく知られている。 本発明者らは、より高収率に、高純度のウロキ
ナーゼを得るために、分離精製法の検索を重ね鋭
意研究を行つた結果、従来アフイニテイクロマト
グラフイーのリガンドとして使用し得ることが全
く知られていなかつたセフエム骨格を有する物質
（以下、セフエム系化合物という）を、水不溶性
担体に結合させた吸着体が、ウロキナーゼの吸着
容量、収率、精製度等の点で、以前より知られて
いるウロキナーゼ用吸着体に比べ、極めて優れて
いることを見いだし、これらの新知見に基づいて
本発明を完成するに至つた。 本発明は、粗ウロキナーゼ含有溶液を、式 で表わされるセフエム骨格を有する物質をリガン
ドとする水不溶性担体と接触させ、ウロキナーゼ
を吸着させた後、溶出することを特徴とする高純
度のウロキナーゼの製造法に関する。 本発明において粗ウロキナーゼ含有溶液として
は、尿、粗製ウロキナーゼ含有水溶液などがあげ
られる。 吸着体はセフエム系化合物を直接、水不溶性担
体に結合させたもののほか、スペーサーを介し
て、セフエム系抗生物質を水不溶性担体に結合さ
せたものでも、ウロキナーゼの分離精製に使用す
ることができる。 セフエム系化合物としては、基本骨格として式 を有するものであれば、いずれも本発明に使用で
きる。好適には精製されたものが用いられる。セ
フエム系化合物としては、セフエム系抗生物質
（例えばセフアロチン、セフオチアム、セフオタ
キシム、セフオキシチン等）が好適なものとして
例示される。 水不溶性担体も特に限定されるものでなく、ア
フイニテイクロマトグラフイーの担体として使用
しえるものなら任意に選んで使用できる。例え
ば、セルロース、アガロースなどの多糖類、ポリ
アクリルアミドゲル、さらには、アミノエチルセ
ルロース、アミノエチルポリアクリルアミドゲル
（バイオラツド社）などの陰イオン交換体等が使
用できる。 スペーサーも特に限定されるものでなく、アフ
イニテイクロマトグラフイーのリガントと、担体
間のスペーサーとして使用しえるものなら任意に
選んで使用できる。例えば、Ｌ−リジン、ジアミ
ノエタン、１，６−ジアミノヘキサンなど、一般
式NH2−（CH2）ｎ−NH2〔式中のｎは１〜10の
整数を示す〕で表わされるジアミノ化合物などが
好都合に用いられる。特に、多糖類、ポリアクリ
ルアミドゲルなどアミノ基を有しない水不溶性担
体を使用する時は、上記スペーサーを結合させて
アミノ基の導入を図つた後、セフエム系化合物を
結合させる必要がある。 本発明に使用される吸着体を調製するために
は、セフエム系化合物をそのまま、あるいはスペ
ーサーを介して、上記の水不溶性担体に結合させ
うるいかなる化学的方法を用いてもよく、一般に
は水溶性カルボジイミドによるアミド形成反応
〔Sh−eehan ＆Hlavka（1957）：J.Am.Chem.
Soc.79，4528〕によるのが好都合に用いられる。 本発明に係るセフエム系化合物を結合させた吸
着体によるウロキナーゼの分離精製を実施するに
際し、上記吸着体をウロキナーゼ含有溶液と接触
させるには、バツチ式で行つてもよく、またカラ
ム法で行つてもよい。 本発明のウロキナーゼの分離精製法の概略は下
記のとおりである。 粗ウロキナーゼ含有水溶液、たとえば人尿、粗
製ウロキナーゼ水溶液をセフエム系化合物結合吸
着体と接触させる。この時、粗ウロキナーゼ溶液
のpHは４〜９とするのがよい。ウロキナーゼを
吸着させた後、未吸着物質を洗浄により除去す
る。ウロキナーゼは溶出剤（たとえば、1.0M塩
化ナトリウム溶液、0.1Mアルギニン溶液、0.1M
酢酸ナトリウム溶液など）などで溶出される。こ
のようにして得られた精製ウロキナーゼ溶液よ
り、ウロキナーゼを採取するには、硫安塩析、限
外濾過、凍結乾燥など公知の方法が用いられる。 本発明に係るセフエム系化合物結合吸着体は、
新しい物質をリガンドとして使用したもので、簡
便な操作により、高純度のウロキナーゼを高収率
で分離、精製することができる。 以下に本発明の方法を実施例によつてより具体
的に示すが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。なお、実施例中のウロキナーゼ活性はジ
ヨンソンらの方法〔Johnson，A.J.et al.，Thr−
omb.Diath，Haemorrh，21，259（1969）〕によ
り測定し、力価表示は国際単位（IU）表示とし
た。蛋白質の定量は、Lowryらの方法により行
つた。 実施例 １ アミノエチル・セルロース（半井化学薬品製）
5gを蒸留水500mlに膨潤させた。膨潤セルロース
を0.5M塩化ナトリウム溶液1000mlで洗浄したの
ち、蒸留水200mlに懸濁した。この懸濁液のpHを
1N−塩酸で4.5に調整した。pH調整後、懸濁液
に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩（財団法人蛋白質研究
奨励会ペプチド研究所製）2gとセフアロチン1g
を添加し、pH4.5、４℃で24時間撹拌した。0.5M
塩化ナトリウム溶液2000mlで洗浄して、セフアロ
チンが150mg／ｇセルロースの割合で結合した吸
着体を得た。セフアロチンを結合させた吸着体
1gを、カラム（φ2.0×10cm）に充填し、４℃にお
いてウロキナーゼの吸着量を調べた。すなわち、
0.5M塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液
（pH7.4）1000mlをカラムに流し、吸着体を平衡
化させた後、粗ウロキナーゼ溶液（50000IU／
ml、比活性5000IU／mg蛋白）10を流した。カ
ラムを上記緩衝液300mlで洗浄したのち、吸着ウ
ロキナーゼを0.5M塩化ナトリウムを含む0.1M酢
酸緩衝液（pH5.5）で溶出した。この時の吸着体
のウロキナーゼ吸着量は、480000IU／mg吸着体
であつた。得られたウロキナーゼの比活性は、
130000IU／mg蛋白で、収率は92％であつた。 実施例 ２ １，６−ジアミノヘキサンをスペーサーとして
導入したAH−セフアロース（フアルマシア製）
50mlに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド塩酸塩500mgと、セフ
アゾリン0.5gを加え、pH4.5で24時間、４℃で反
応させて、セフアゾリン結合セフアロースを得
た。0.5M塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝
液（pH7.4）でセフアゾリン結合セフアロース50
mlを平衡化させたのち、全量をpH6.5の新鮮人尿
10（7IU／ml）に添加し、バツチ式でウロキナ
ーゼを吸着させた。ウロキナーゼ吸着・セフアゾ
リン結合セフアロースを、上記緩衝液でカラム内
で洗浄した後、ウロキナーゼを0.1Mアルギニン
を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出した。
得られたウロキナーゼの比活性は、80000IU／mg
蛋白で、収率は75％であつた。 実施例 ３ 実施例１で得たセフアロチン結合セルロース
3gを新鮮人尿50（8IU／ml）に加え、４℃で５
時間撹拌した。ウロキナーゼ吸着・セフアロチン
結合セルロースを遠心により分離した後、0.5M
塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液
（pH7.4）で洗浄し、ウロキナーゼを0.1Mアルギ
ニンを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）１でバ
ツチ式に溶出した。溶出液中のウロキナーゼの比
活性は75000IU／mg蛋白で、収率は85％であつ
た。この溶出液を限外濾過により濃縮し、0.05M
リン酸緩衝液（pH7.2）に対し透析し、凍結乾燥
を行い、ウロキナーゼ標品を得た。この標品につ
き、日本薬局法（第９改正）記載の方法に従つて
発熱性物質試験を行つた結果、本標品は発熱性物
質陰性であつた。 比較例 １ 実施例１のセフアロチン結合セルロースと従来
よりウロキナーゼ精製に使用されているアミノベ
ンズアミジン結合セルロースとのウロキナーゼ吸
着容量、得られるウロキナーゼの比活性およびウ
ロキナーゼの収率について比較した。結果は表１
のようにセフアロチン結合セルロースはアミノベ
ンズアミジン結合セルロースより優れたウロキナ
ーゼ吸着容量、精製度、収率を示した。 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 粗ウロキナーゼ含有溶液を、式 で表わされるセフエム骨格を有する物質をリガン
   ドとする水不溶性担体と接触させ、ウロキナーゼ
   を吸着させた後、溶出することを特徴とする高純
   度のウロキナーゼの製造法。