JPH0214034B2

JPH0214034B2 -

Info

Publication number: JPH0214034B2
Application number: JP2676582A
Authority: JP
Inventors: Tetsuya Someno; Kazuo Kato; Tetsuyuki Saino; Shinichi Ishii; Tomio Takeuchi; Hamao Umezawa
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1982-02-23
Filing date: 1982-02-23
Publication date: 1990-04-05
Also published as: JPS58144354A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は高純度ウロキナーゼの製造法及び樹脂
に関する。さらに詳しくは、本発明のＬ−ピログ
ルタミル−Ｌ−リジル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アル
ギニナールが水不溶性担体に結合してなる樹脂に
粗ウロキナーゼ含有液を接触させて該樹脂にウロ
キナーゼを吸着させ、次いで吸着したウロキナー
ゼを溶出させることを特徴とする高純度ウロキナ
ーゼの製造法及び上記樹脂に関する。ウロキナーゼは人尿中に微量存在するプロテア
ーゼであり、血中のプラスミノーゲンを活性化し
てプラスミンを生成し、生じたプラスミンがフイ
ブリン凝塊を溶解せしめるので、血栓を溶解する
医薬製剤として繁用されている。又最近では、抗
ガン剤との併用効果が認められるなどの薬効も見
い出されており、医薬品として重要な物質であ
る。ウロキナーゼの人への投与はもつぱら静注でそ
のため生体を起源とした医薬製剤に共通な投与時
の安全性を勘案せねばならず、高純度のウロキナ
ーゼを取得することが要求され、種々の精製法が
開発されている。そして近年、精製目的蛋製白質
に親和性の高い物質をリガンドとして担体に結合
させたものを用いるアフイニテイークロマトグラ
フイー技術がウロキナーゼの精製に応用されてき
ている。例えば (1) リジン又はアルギニン等の塩基性アミノ酸又
はその誘導体をリガンドとする方法（特公昭51
−44193号、特開昭51−20596号、特開昭51−
95183号、特開昭51−35481〜35483 (2) 胎盤組織等に含有されるウロキナーゼ阻害因
子をリガンドとする方法（特公昭51−20597号）
などがあげられるが、(1)の方法では、ウロキナ
ーゼとの親和性が十分とは云えず、塩濃度の高
い溶液より、ウロキナーゼを特異的に吸着せし
めることはできない。又、(2)の方法では、動物
の組織中に微量しか存在しない阻害物質をリガ
ンドとするため必ずしも実用的な方法とは言い
難い。そこで本発明者らは高純度のウロキナーゼを得
る方法に関し、種々のリガンドを合成して検討し
た結果、Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−リジル−Ｌ−
ロイシル−Ｌ−アルギニナール（以下Ｌ−アルギ
ニナール誘導体という）をリガンドとして水不溶
性担体に結合させたものがウロキナーゼを特異的
に吸着し、又PHを操作するだけで容易に脱着する
ことを見い出した。本発明は上記知見に基づいて完成されたもので
ある。本発明の樹脂はリガンドとして用いるアルギニ
ナール誘導体中のＬ−リジン部のε−アミノ基が
担体と結合したものであり、Ｌ−ロイペプチンか
ら大量に合成しうるので、製造が容易であるとい
う利点を有する。又、高純度ウロキナーゼを製造する際に本発明
方法を使用すると (1) ウロキナーゼの吸着時における水素イオン濃
度の幅は従来法より広範囲で使用でき、例え
ば、PH５〜10、より好ましくはPH６〜８の範囲
が用いられる。 (2) 塩濃度の影響が従来法とくらべ少なく、事前
に特別な脱塩工程を必要としない。 (3) 当該樹脂よりウロキナーゼの脱着はPHを下げ
ることによつて高収率に回収される。 (4) 本発明で使用するリガンドはウロキナーゼ阻
害作用を有するため、ウロキナーゼが樹脂に接
触している間は、ウロキナーゼは活性を示さ
ず、従つて自己消化等の低分子化を受けにく
く、薬効の高い高分子量型のウロキナーゼが得
られる。 (5) ウロキナーゼを特異的に吸着するので精製効
率が高く、従つて高品質のウロキナーゼを得る
ことができる。という利点を有する。本発明で使用される水不溶性担体としてはＬ−
アルギニナール誘導体中のＬ−リジン部のε−ア
ミノ基が結合ししうるものであれば特に制限はな
く、例えばメタクリル酸−ジビニルベンゼン共重
合体などの酸性イオン交換樹脂、カルボキシメチ
ルセルロースなどの酸性基を有するセルロース誘
導体、セフアロース、アガロース、デキストラン
などの高分子多糖体にカルボン酸基やスルホン酸
基を導入したものがあげられるが、高分子多糖体
が好ましい。これらの不溶性担体とＬ−アルギニナール誘導
体を結合させるにはＬ−アルギニナール誘導体を
ジブチルアセタール化したものなどアルギニナー
ル部のアルデヒド基が保護されたＬ−アルギニナ
ール誘導体に酸性基を活性化した上記の不溶性担
体と反応させ、その後アルデヒド基の保護基を除
去すればよい。不溶性担体中の酸性基の活性化方法としては公
知の方法、例えばアガロースに臭化シアンを作用
させる方法、カルボキシアルキル誘導体をスペー
サーにもつアガロースに水溶性カルボジイミドを
作用させる方法、CH−セフアロース（フアルマ
シア社製）に水溶性カルボジイミドを作用させる
方法などが使用できる。アルデヒド基の保護されたＬ−アルギニナール
誘導体と活性化不溶性担体との反応は、例えば水
溶性カルボジイミドを作用させる場合には、溶媒
中、PH３〜７、好ましくは４〜６、温度25〜45
℃、好ましくは35〜40℃で10〜30時間、好ましく
は15〜25時間反応させればよい。ここで用いる溶
媒としてはPH３〜７を保持できる塩溶液若しくは
緩衝液からなる０〜50％のジメチルホルムアミド
溶液又はジオキサン溶液などがあげられる。得られた反応物からアルデヒド基の保護基を除
去するにはPH１〜４、好ましくは２〜３の緩衝液
中、温度20〜50℃、好ましくは30〜45℃、24〜
120時間、好ましくは48〜96時間加水分解すれば
よい。ここで用いる緩衝液としては塩酸、リン酸
などの鉱酸及び酒石酸、クエン酸、乳酸、コハク
酸、酢酸などの有機酸と、これらのナトリウム、
カリウム塩などからなる組成のものなどがあげら
れる。以上のような方法によつて得られた樹脂を使用
して高純度のウロキナーゼを得るには、例えば次
のようにすればよい。先ず、該樹脂をカラムに充填してPH５〜10、好
ましくはPH６〜８とする。この場合イオン強度は
特に制限されないが、0.025〜0.5Mの緩衝液であ
らかじめ平衡化しておくことが好ましい。ここで
用いる緩衝液としては、例えばリン酸ソーダーリ
ン酸、リン酸カリウム−リン酸、酢酸ソーダー酢
酸、トリスヒドロキシアミノメタン−塩酸などが
あげられる。その後PH５〜10、好ましくは６〜８に調整した
粗ウロキナーゼ水溶液を該樹脂カラムに通して該
樹脂にウロキナーゼを吸着させる。次いでウロキ
ナーゼを吸着した該樹脂を上記緩衝液で洗浄した
後、PH１〜４、好ましくはPH２〜３の酸溶液、水
溶性塩溶液もしくは緩衝液でウロキナーゼを溶出
させることにより高純度のウロキナーゼ水溶液が
得られる。ここで使用する酪溶液としては例えば
クエン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、酢酸、リン
酸、塩酸などの水溶液などがあげられる。水溶性
塩溶液としては例えば塩化ナトリウム−塩酸水溶
液、塩化カリウム−塩酸水溶液、硫酸ソーダー硫
酸水溶液などがあげられる。又、緩衝液としては
リン酸ソーダーリン酸水溶液、リン酸カリウム−
リン酸水溶液、クエン酸−クエン酸ナトリウム水
溶液、コハク酸−ホウ砂、乳酸−乳酸ナトリウ
ム、酢酸−酢酸ナトリウム、酒石酸−酒石酸ナト
リウムなどがあげられる。なお、本発明方法はカラム式のほか、バツチ式
で行つてもよい。本発明の樹脂のリガンドとして使用するＬ−ア
ルギニナール誘導体、即ち、Ｌ−ピログルタミル
−Ｌ−リジン−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニナー
ルジブチルアセタールの製法は例えば次のとおり
である。先ずＮ−保護又は保護されていない−Ｌ−ピロ
グルタミン酸のカルボキシル基における反応性誘
導体とε−Ｎ−保護−Ｌ−リジンとを溶媒中で反
応させてＮ−保護又は保護されていない−Ｌ−ピ
ログルタミル−ε−Ｎ−保護−Ｌ−リジンを得
る。ここで使用されるＮ−保護基としてはベンジ
ルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオ
キシカルボニル基などの接触還元で除去できる保
護基があげられる。反応性誘導体としては、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−ニトロ
フエニルエステル、２，４，５−トリフロロフエ
ニルエステルなどの活性エステル類があげられ
る。又、溶媒としてジオキサン、ジメチルホルムア
ミド、ジメチルアセタミドの様な溶媒と水の混合
溶媒が使用される。次に得られたＮ−保護又は保
護されていないＬ−ピログルタミル−ε−Ｎ−保
護−Ｌ−リジンと、アルデヒド基を保護したＬ−
ロイペプチンをサーモライシンで加水分解して得
た、アルデヒド基の保護されたＬ−ロイシル−Ｌ
−アルギニナール（特開昭55−37185、実施例１
参照）とを溶媒中で縮合させる。縮合方法として
は、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、エ
チルジメチルアミノプロピルカルボジイミドなど
のカルジイミド類を単独で用いる方法又は、Ｎ−
ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボル
ネン−２，３−ジカルボキサミドなどと組み合わ
せて用いる方法、あるいはジフエニルホスホリル
アジド、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ
−１，２−ジヒドロキノリンなどの縮合剤を用い
る方法などのペプチド結合形成に一般的に用いら
れている方法を使用することができる。ここで用
いられるアルデヒドの保護基としては、ジ−ｎ−
ブチルアセタールなどのジアルキルアセタールな
どがあげられる。又、縮合に用いられる溶媒は通
常用いられる溶媒で特に差しつかえない。その後
接触還元を行つてＮ−保護基を除去し、さらに加
水分解してアルデヒド基の保護基を除去すること
によりＬ−アルギニナール誘導体を得ることがで
きる。接触還元は、メタノールなどの溶媒中、パ
ラジウム黒などを用いて常法で行うことができ
る。さらに加水分解は、、メタノール、エタノー
ル、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルム
アミド、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの
水と混合する溶媒中0.3規定〜0.5規定程度の鉱
酸、あるいは、クエン酸、シユウ酸などの有機酸
を用いて行えば良い。次に本発明を実施例により具体的に説明する。実施例１ (a) Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ピログ
ルタミル−ε−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル
−Ｌ−リジンの合成Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ピログ
ルタミル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル3.5ｇ及びε−Ｎ−ベンジルオキシカルボ
ニル−Ｌ−リジン2.5ｇを氷冷下Ｎ，N′−ジメ
チルホルムアミド100ml及び水100mlの混液に懸
濁させ次いで1.4mlのトリエチルアミンを加え、
室温でさらに20時間撹拌した。反応液に1000ml
の水を加え塩酸でPHを２に調整し析出した沈殿
を取した。沈殿をメタノールより再結晶し、
無色針状結晶2.6ｇを得た。 mp206〜208℃ 〔α〕^24.5 ₅₇₈＝−9.7゜（Ｃ＝0.3、DMF）元素分析（C₂₇H₃₁N₃O₈）ＣＨＮ Calct 61.68 5.94 8.00 Found 61.70 6.03 7.98 (b) Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ピログ
ルタミル−ε−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル
−Ｌ−リジン−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニナ
ールジブチルアセタール塩酸塩の合成実施例１(a)および特開昭55−37185で記載し
た方法で得られたＮ−ベンジルオキシカルボニ
ル−Ｌ−ピログルタミル−ε−Ｎ−ベンジルオ
キシカルボニル−Ｌ−リジン2.2ｇおよびＬ−
ロイシル−Ｌ−アルギナールジブチルアセター
ル塩酸塩1.9ｇを酢酸エチル50ml、ジオキサン
50mlの混液に懸濁させ、次いでＮ−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール570mg及びトリエチルアミ
ン590μを加え、氷冷下ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド870mgを加えたのち、室温にもど
し、20時間撹拌を行つた。溶媒を減圧で留去し
た後、シリカゲルを担体とするカラムクロマト
グラフイーに附し、ブタノール；酢酸ブチル；
酢酸；水＝４：２：１：１（ｖ／ｖ）で展開し、
Rf0.6の坂口試薬陽性の画分950mgを得た。〔α〕²³ ₅₇₈＝−29.0゜（Ｃ＝1.1AcOH） m.p.＝77−81℃（分解） (c) 実施例１(b)で得られた粉末900mgをメタノー
ル25mlに溶解し、パラジウム黒を用いて２時間
接触還元を行つた。反応終了後パラジウム黒を
除去し、溶媒を留去し、Ｌ−ピログルタミル−
Ｌ−リジル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニナー
ルジブチルアセタール塩酸塩700mgを得た。
Rf；0.05（実施例１と同溶媒） m.p.103〜105℃ 〔α〕^23.5 ₅₇₈＝−29.5゜（Ｃ＝0.8、AcOH） (d) Ｌピログルタミル−Ｌ−リジル−Ｌ−ロイシ
ル−Ｌ−アルギニナールをリガンドとするウロ
キナーゼ吸着用樹脂の調製上記実施例１(c)で得られたＬ−ピログルタミル
−Ｌ−リジル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニナー
ルジブチルアセタール塩酸塩700mgを0.1Mモルホ
リノエタンスルホン酸200ml及びジオキサン200ml
の混液に懸濁させPHを５に調整し、次いで、CH
−セフアロース 4B、60mlを加え、撹拌しなが
ら１時間かけて、少量ずつ全量５ｇの水溶性カル
ボジイミドを加え、37℃で20時間撹拌した。樹脂
を水で洗滌後、0.2Mクエン酸ソーダ緩衝液PH2.5
で40℃60時間加水分解を行い標記樹脂60mlを調製
した。

【表】実施例２実施例１(c)により調整した樹脂10mlををカラム
に充填し、0.1M食塩を含むPH7.5の0.1Mリン酸ソ
ーダ緩衝液で充分に緩衝化を行つた。その後PH
7.5に調整した力価1960000IUの粗製ウロキナーゼ
（比活性9575IU／mg蛋白）含有溶液をそのカラム
に通過させ、該樹脂にウロキナーゼを吸着させ
た。次いで上記緩衝液でカラムを洗滌した後
0.2Mのクエン酸を用いてカラムに吸着したウロ
キナーゼを脱着させ、力価188000IUの精製ウロ
キナーゼ（比活性115138IU／mg蛋白）を得た。
回収率は96％であり、比活性は約12倍上昇した。
又精製後のウロキナーゼ中の高分子量の含有率は
95％であり、粗製品の含有率と同一であつた。実施例３実施例１(c)により調製した樹脂30mlをカラムに
充填し、0.1M食塩を含むPH7.5のリン酸緩衝液で
充分緩衝化を行つた。その後Hz7.5に調製した力
価15500000IUの粗製ウロキナーゼ（7495IU／mg
蛋白）含有溶液をそのカラムに通過させ、該樹脂
にウロキナーゼを吸着させ。次いで上記緩衝液で
カラムを洗滌した後0.2Mのクエン酸（PH2.5）を
用いてカラムに吸着したウロキナーゼを脱着さ
せ、力価14700000IUの精製ウロキナーゼ
（97763IU／mg蛋白）を得た。回収率は95％であ
り、比活性は約13倍上昇した。又高分子量型ウロ
キナーゼの含有率は96％であり、精製前と後で変
化は認められなかつた。実施例４実施例１(c)により調製した樹脂10mlをカラムに
充填し、0.1食塩を含むPH7.5の酢酸緩衝液で充分
緩衝化を行つた。その後PH7.5に調製した力価
750000IUの粗ウロキナーゼ（37371IU／mg蛋白）
含有溶液をそのカラムに通過させた後、該カラム
を上記緩衝液で洗滌し、次いで0.2Mのリン酸緩
衝液（PH2.5）を用いて該カラムからウロキナー
ゼを溶出させ、力価710000IUの精製ウロキナー
ゼ（115805IU／mg蛋白）を得た。回収率は95％
であり、比活性は約４倍上昇した。又、高分子量
型ウロキナーゼの含有率は98％であり、精製前と
後で変化は認められなかつた。実施例５実施例１(c)で得たＬ−ピログルタミル−Ｌ−リ
ジル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニナールジブチ
ルアセタール塩酸塩270mgを0.1Mモルホリノエタ
ンスルホン酸78mlおよびジオキサン78mlの混液に
懸濁させPHを5.0に調節し、ついで、CM−Biogel
Ａ（100〜200メツシユ）（Bio−Rad Lab.社製）
30mlを加え、撹拌しながら少量づつ３ｇの水溶性
カルボジイミドを１時間要して添加し、37℃で24
時間撹拌をした。反応終了後樹脂を水で洗浄後、0.2Mクエン酸
ソーダ緩衝液PH2.5で40℃70時間加水分解を行つ
た。得られたＬ−ピログルタミル−Ｌ−リジル−Ｌ
−ロイシル−Ｌ−アルギニナール−CM−Biogel
Ａは30mlであつた。

【表】実施例６実施例５で得られた該樹脂10mlをカラムに充填
し、0.1M食塩を含むPH7.5の1Mリン酸ソーダ緩
衝液で充分に緩衝化を行つた。その後PH7.5に調
整した1392000IUの部分精製ウロキナーゼ（比活
性50450IU／mgフオーリンローリー蛋白）含有溶
液をそのカラム上に導入し、該樹脂にウロキナー
ゼを吸着させた。ついで上記と同じ緩衝液でカラ
ムを充分に洗浄したのち、0.2Mのクエン酸を用
いて、カラム内に吸着したウロキナーゼを脱着さ
せた。得られたウロキナーゼは比活性134208IU／mg
蛋白で1267000IU（収率91％）であつた。精製後
のウロキナーゼ中の高分子型の含有率は95，３％
であり、出発物質との差はみとめられなかつた。

Claims

【特許請求の範囲】１Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−リジル−Ｌ−ロイ
シル−Ｌ−アルギニナールが水不溶性担体に結合
してなる樹脂に粗ウロキナーゼ含有液を接触させ
て該樹脂にウロキナーゼを吸着させ、次いで吸着
したウロキナーゼを溶出させることを特徴とする
高純度ウロキナーゼの製造法。２ウロキナーゼの溶出をクエン酸で行うことを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の高純度ウ
ロキナーゼの製造方法。３Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−リジル−Ｌ−ロイ
シル−Ｌ−アルギニナールが水不溶性担体に結合
してなるウロキナーゼ吸着用樹脂。