JPS58144354A - 高純度ウロキナーゼの製造法及び樹脂 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高純度ウロキナーゼの製造法及びウロキナーゼ
吸着体に関する。さらに詳しくは。

本発明はＬ−ピログルタミル−Ｌ−リジル−１゜−口イ
シル−Ｌ−アルギニナールが水不溶性４［１体に結合し
てなるウロキナーゼ吸着体に粗ウロキナーゼ含有液を接
触させて該吸着体にウロキナーゼを吸着させ１次いで吸
着したウロキナーゼを溶出させることを特徴とする高純
度ウロキナーゼの製造法及び上記吸着体（（関する。

ウロキナーゼは人尿中に微量存在するグロテアーゼであ
り一血中のプラスミノーゲンを活性化してプラスミンを
生成し、生じたプラスミンがフィブリン凝塊を溶解せし
めるので、血栓を溶解する医薬製剤として繁用されてい
る。又最ｊｌＬ：では、抗ガン剤との併用効果が認めら
れるｔ（どの薬効も見い出されており、医薬品として中
波な物質である。

ウロキナーゼの人への投与はもっばら静注でそのため生
体を起源とした医薬製剤に共通な役作時の安全性を勘案
せねばならず、高純度のウロキナーゼを取得することが
要求され１種々の精製法が開発されている。そして近年
、精製目的蛋白質に親和性の高い物質をリガンドとして
担体に結合させたものを用いるアフィニティークロマト
グラフィー技術がウロキナーゼの精製に応用されてきて
いる。例えば ｌ）リジン又はアルギニン等の塩基性アミノ酸又はその
誘導体をリガンドとする方法（特公昭５１−４４１９３
号、特開昭５１−２０５９６号、特開昭５１−９５１８
３号、特開昭５１−３５４８１〜３５４８３ ２）胎盤組織等に含有されるウロキナーゼ阻害因子をリ
ガントとする方法（特公昭５１−２０５９７号）などが
あげら、、、れるが、１）の方法では、ウロキナーゼと
の親和性が十分とは云えず、塩濃度の高い溶液より、ウ
ロキナーゼ？特胃的に吸着せしめることはできない。又
、２）の方法では、動物の組織中に微量にしか（Ｔ在し
ない阻害物質をリガンドとするため必−すしも実用的な
方法とは言い難い。

そこで本発明者らは高純度のウロキナーゼへ′得る方法
に関し１種々のリガンドを合成して検討した結果、Ｌ−
ピログルタミル−Ｌ　−ＩＪジル−Ｌ−ロイシル−し−
アルギニナール（以丁し−アルギニナール誘導体という
）をリガンドとして水不溶性担体に結合させたものがウ
ロキナーゼを特異的に吸着し、又ｐＨを操作するだけで
容易に脱着することを見い出した。

本発明は上記知見に基づいて完成されたも（′）である
。

本発明のウロキナーゼ吸着体はりガントとして用いるア
ルギニナール誘導体中のＬ　　１１ジン部のε−アミノ
基が担体と結合したものであり。

Ｌ−ロイペプチンから大量に合成しうるのて。

製造が容易であるという利点を有する。

又、高純度ウロキナーゼを製造する際に＋発明方法を使
用すると ｆｉｌ　　ウロキナーゼの吸着時における水素イオン濃
度の幅は従来法より広範囲で使用でき１例えば、ｐＨ５
〜１０．より好ましくはｐ）−１６〜８の範囲が用いら
れる。

（２）　　塩濃度の影響が従来法とくらべ少なく、事前
に特別な脱塩工程を必要としない。

（３）　　当該吸着体よりウロキナーゼの脱着はｐＨを
下げることによって高収率に回収される。

（４）　　本発明で使用するリガンドはウロキナーゼ阻
害作用を有するため、ウロキナーゼが樹脂に接触してい
る間は、ウロキナーゼは活性を示さず、従って自己消化
等の低分子化を受けに＜＜、薬効の高い高分子量型のウ
ロキナーゼが得られる。

（５）　　ウロキナーゼを特異的に吸着駕するので精製
効率が高く、従って高品質のウロキナーゼを得ることが
できる。

という利点を有する。

本発明で使用される水不溶性担体としてはＬ−アルギニ
ナール誘導体中のＬ−リジン部のε−アミノ基が結合し
うるものであれば特に制限はなく１例えばメタクリル酸
−ジビニルベンゼン共重合体などの酸性イオン交換樹脂
、カルボキシメチルセルロースナトの酸Ｐ１基ヲ有する
セルロース誘導体、セファロース。

アガロース、デキストランなどの高分子多糖体にカルボ
ン酸基やスルホン酸基を導入したものなどがあげられる
が、高分子多糖体が好ましい。

これらの不溶性担体とＬ−アルギニナール誘導体を結合
させるにはＬ−アルギニナール誘導体をジブチルアセタ
ール化したものなどアルギニナール部のアルデヒド基が
保護さ＋したＬ−アルギニナール誘導体に酸性基を？Ｍ
　ＶＬ化した上記の不溶性担体と反応させ、その後アル
デヒド基の保護基を除去すればよい。

不溶性担体中の酸性基の活性化方法としては公知の方法
１例えばアガロースに臭化シアンを作用させる方法−カ
ルボキシアルキル１：へ導体をスペーサーにもつアガロ
ースに水溶性カルボジイミドを作用させる方法、　Ｃｌ
−１−七フ了ロース（ファルマシア社製〕に水溶性カル
ボジイミドを作用させる方法などが使用できる。

アルデヒド基の保護されたＩＪ−アルギニナール誘導体
と活性什不溶性担体との反応は。

例えば水溶性カルボジイミドを作用させる場合（、τは
、溶媒中、ｐＨ３〜７．好ましくは４〜６、温度２５〜
４５Ｃ１好ましくは３５〜・１０ｔｌ’で１０〜３０時
間、好１しくは１５〜２５時間反応させればよい。ここ
で用いる溶媒としてはｐＨ３〜７を保持できる塩溶液若
１゜くけ緩衝液からなろ０〜５０％のジメチルホルムア
ミド溶液又はジオキサン溶液などがあけられる。

得らえもだ反応物からアルデヒド基の保護基を除去する
にはｐＨＩ〜４、好ましくは２〜３の緩衝液中、温度２
０〜５０Ｃ１好ましくは；３０〜１１５ｔ：、２４〜１
２０時間、好１しくは４８〜９６時間加水分解すればよ
い。ここで用いる緩衝液としては塩酸、リン酸などの鉱
酸及び酒石酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、酢酸などの
有機酸と、これらのナトリウノ、。

カリウム塩などからなる組成のものなどかあけられる。

一以上のような方法によって得られたつ「キナーゼ吸着
体を使用して高純度のウロキナーゼを得るには１例えば
次のようにすればよい。

先ず、該吸着体をカラムに充填してｐＨ５〜１０、好１
しくはｐＨ６〜８とする。この場合イオン強度は特に制
限されないがｌ）、０２５〜０．５Ｍの緩衝液であらか
じめ平衝化しておくことが好せしい。ここで用いる緩衝
液としては１例えばリン酸ノーダーリン酸、リン酸カリ
ウム−リン酸、酢酸ソーダー酢酸、トリスヒドロキシア
ミンメタン−塩酸などがあけＬ゛）れる。

その後ｐ）１５〜１（Ｌ好ましくは６〜８（・、二、ｌ
ｌ、（整した粗ウロキナーゼ水溶液を該吸着体カラムに
通して該吸着体にウロキナーゼを吸着させる。次いでウ
ロキナーゼを吸着した該吸着体を上記緩衝液で洗浄した
後、ｐ［Ｉ　１〜４．好−チしくはｐＨ２〜３の酸溶液
、水溶性塩溶液もしくは緩衝液でウロキナーゼを溶出さ
せることにより高純度のウロキナーゼ水溶液が得られる
。ここで使用する酸溶液としては例えばクエン酸、酒石
酸、乳酸、コ・・り酸、酢酸−リン酸、塩酸などの水溶
液などがあげられる。

水溶性塩溶液としては例えば塩化ナトリウム−塩酸水溶
液、塩化カリウム−塩酸水溶液。

硫酸ソーダー硫酸水溶液などがあげられる。

又、緩衝液としてはリン酸ソーダーリン酸水溶液、リン
酸カリウｌ、−リン酸水溶液、クエン酸−クエン酸ナト
リウム水溶液、コノ・り酸−ホウ砂、乳酸−乳酸ナトリ
ウム、酢酸−酢酸ナトリウム、酒石酸−酒石酸ナトリウ
ムなどがあげられる。

なお、本発明方法はカラム式のほか、バッチ人で行って
もよい。

本発明のウロキナーゼ吸着体のりガントとして使用する
Ｌ−アルギニナール誘導体、即ち。

Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−ＩＪジル−Ｌ−ロイツルーＬ
−アルギニナールの製法は例１えば次のとおりである。

先ずＮ−保護又は保護されていない−Ｌ−ピログルタミ
ン酸のカルボキシル基における反応性誘導体とε−Ｎ−
保１−Ｌ−１ジンとを溶媒中で反応させてＮ−保護又は
保護されていない−１−ピログルタミル−ε−Ｎ−保護
一保護−ジ−リジンうここで使用されるＮ−保護基とし
てはベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキノベンジ
ルオキシカルボニル基などの接触還元で除去できる保護
基があげられる。反応性誘導体としては、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステ
ル−２，４，５−トリフロロフェニルエステルナトの活
性エステル類があげられる。

又、溶媒としてジオキサン、ジメチルホル・′、アミド
、ジメチルアセタミドの様な溶媒と水（′）混合溶媒が
使用できる。次に得られたＮ−保護又は保護されていな
い−Ｌ−ピログルタミル−ε−Ｎ−１１ｊ−Ｌ−リジン
と、アルデヒド基ヲ保護したＬ−ロイペプチンをサーモ
ライシンで加水分解して得た。アルデヒド基の保護され
たＬ−ロイシル−Ｌ−アルギニナール（特開昭５５−３
１４１８５．実施例１参照）とを溶媒中で縮合させる。

縮合方法としては１例えばジシクロへキシルカルボジイ
ミド、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミドな
どのカルボジイミド類を単独で用いる方法又は、Ｎ−ヒ
ドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−
ジカルポキサミドなどと組み合わせて用いる方法、ある
いはジフェニルホスホリルアジド、１−エトキシカルボ
ニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリンなどの
縮合剤を用いる方法などのペプチド結合形成に一般的に
用いられている方法を使用することができる。ここで用
いられるアルデヒドの保護基としては、ジ−ローブチル
アセタールなどのジアルキルアセタールなどがあけられ
る。又、縮合に用いられる溶媒は通常用いられる溶媒で
特に差しつがえない。その後接触還元を行ってＮ−保護
基を除去し、さらに加水分解してアルデヒド基の保護基
を除去することによりＬ−アルギニナール誘導体が得る
ことができる。接触還元は、メタノールなどの溶媒中、
パラジウム黒などを用いて常法で行うことができる。さ
らに加水分解は、メタノール、エタノール、アセトン、
アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロ
フラン、ジオキサンなどの水と混合する溶媒中０．３規
定〜０．５規定程度の鉱酸、あるいは、クエン酸、シー
ウ酸などの有機酸を用いて行えば良い。

次に本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１゜ （ａｌ　　Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ピログ
ルタミル−ε−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ　−
ＩＪレジン合成 Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ピログルタミン酸
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル３．５　ｇ　及
ヒε−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン２．
５ｇを水冷下Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド１００　
ｍｌ及び水Ｌ　ＯＯｍｌの混液に懸？蜀させ次いで１．
４ｍｌのトリエチルアミンを加え、室温でさらに２０時
間攪拌した。反応液に１０１００Ｏの水を加え塩酸でｐ
Ｈを２に調整し析出した沈殿を戸数した。沈殿をメタノ
ールより再結晶し、無色針状結晶２．６ｇを得た。

ｍｐ　　２０６〜２０８ｔｌ： ＠”　”　＝−９，７°（Ｃ＝０．３．ＤＭＦ）７８ 元素分析（Ｃ２□Ｈ３１Ｎ３０８）　　Ｃ）Ｊ　　　Ｎ
Ｃａ１ｃＬ　　６１，６８　　５．０４　８．００Ｆｏ
ｕｎｄ　　６１．７０　６，０３　７．９８Ｆ＋）ｌ　
　Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ピログルタミル
−ε−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル−し
−口イシル−Ｌ−フルギニナールジブチルアセタール塩
酸塩の合成 実施例１（ａ）および特開昭５５−３７１８５で記載し
た方法で得られたＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
ピログルタミル−ε−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−
Ｌ　−ＩＪ　シン２．２ｇおよびＬ−〇　イシル−Ｌ　
−７ルキニナールシフチルアセタール塩酸塩１．９　ｇ
を酢酸エチル５０ｍ１、ジオキサン５０ｍ１の混液に懸
濁させ１次いでＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール５７
０■及びトリエチルアミン５９０μｍを加え、水冷下ジ
シクロへキシルカルボジイミド８７０■を加えたのち、
室温にもどし、２０時間攪拌を行った。溶媒を減圧で留
去した後、シリカゲルを担体とするカラムクロマトグラ
フィーに附し−ブタノール；酢酸ブチル；酢酸；水＝４
：２：１：１（ｖ／ｖ）で展開し−Ｒｆ０．６の板目試
薬陽性の画分９５０ｍｇを得た。

＠２３−−２９．０°（Ｃ＝１．ｌＡｃ０Ｈ）７８ ｍ、ｐ、　−７７−８１Ｃ（分解〕 （Ｃ）　　実施例１　（ｂｌで得られた粉末９００■を
メタノール２５　ｍｌに溶解し、パラジウム黒を用いて
２時間接触還元を行った。反応終了後パラジウト黒を除
去し、溶媒を留去し、Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−リジル
−Ｌ−口イシル−Ｌ−フルギニナールジブチルアセター
ル塩酸塩７００１１１ｇを得た。Ｒｆ；０．０５（実施
例１と同溶媒）ｍ、ｐ、　　１０３〜１０５Ｃ ３５ （ロ）５７８＝−２９，５°（Ｃ＝　０．８．　Ａｃ　
ＯＨ）上記実施例１（Ｃ）で得られたＬ−ピログルタミ
ル−Ｌ　　’）シルーＬ−ロイシルーＬ−アルギニナー
ルジプチルアセタール塩酸塩７００■を０．１Ｍモルホ
リノエタンスルホン酸２００　ｍｌ及びジオキサン２０
０　ｍｌの混液に懸濁させｐＨを５に調整し１次いで、
ＣＨ−セファ０−Ｊ　４　Ｂ、５．Ｑｍｌを加え。

攪拌しながら１時間かけて、少量ずつ全量５ｇの水溶性
カルボジイミドを加え、３７Ｃで２０時間攪拌をした。

樹脂を水で洗滌後、０．２Ｍクエン酸ソーダ緩衝液ｐＨ
２，５で４０Ｃ６０時間加水分解を行い標記樹脂６０ｍ
１を調整した。

実施例２゜ 実施例１　（ｃ）により調整したウロキナーゼ吸着体１
０ｍ１をカラムに充填し、０．１Ｍ食塩を含むｐＨ７，
５の０．１　Ｍ　ＩＪン酸ソーダ緩衝液で充分に緩衝化
を行った。その後ｐＨ７，５に調整した力価１９６００
００ＩＴＪの粗製ウロキナーゼ（比活性９５７５ＩＴＪ
／■蛋白）含有溶液をそのカラムに通過させ、該吸着体
にウロキナーゼを吸着させた。次いで上記緩衝液でカラ
ムを洗滌した後０．２　Ｍのクエン酸を用いてカラムに
吸着したウロキナーゼを脱着させ、力価１８８０００Ｉ
Ｕの精製ウロキナーゼ（比活性１１５１３８ＩＵ／■蛋
白）を得た。回収率は９６％であり、比活性は約１２倍
上昇した。又精製後のウロキナーゼ中の高分子量型の含
有率は９５％であり、粗製品の含有率と同一であった。

実施例３゜ 実施例Ｌ　（ｃｌにより調整したウロキナーゼ吸着体３
０ｍ１をカラムに充填し−０，１Ｍ食塩を含むｐＨ７，
５のリン酸緩衝液で充分緩衝化を行った。その後ｐＨ７
，５に調製した力価１５５０００００ＩＵの粗製ウロキ
ナーゼ（７４９５ＩＵ／ｍｇ蛋白）含有溶液をそのカラ
ムに通過させ、該吸着体にウロキナーゼを吸着させた。

次いで上記緩衝液でカラムを洗滌した後０．２　Ｍのク
エン酸（ｐＨ２，５）を用いてカラムに吸着したウロキ
ナーゼを脱着させ、力価１４７０００００１Ｕの精製ウ
ロキナーゼ（９７７６３ＩＵ／ｍｇ蛋白）を得た。回収
率は９５％であり、比活性は約１３倍上昇した。又高分
子量型ウロキナーゼの含有率は９６％であり、精製前と
後で変化は認められなかった。

実施例４゜ 実施例１（Ｃ）により調整したウロキナーゼ吸着体１０
ｍ１をカラムに充填し、０１Ｍ食塩を含むｐＨ７５の酢
酸緩衝液で充分緩衝化を行った。その後ｐｌ＋　７．５
に調製した力価７５００００　ＩＵの粗ウロキナーゼ（
３７３７１１Ｕ／■蛋白）含有溶液をそのカラムに通過
させた後、該カラムを上記緩衝液で洗滌し１次いで０．
２Ｍのリン酸緩衝液（ｐ）Ｊ　２．５　）を用いて該カ
ラムからウロキナーゼを溶出させ、力価７１００００Ｉ
Ｕの精製ウロキナーゼ（１１５８０５ＩＵ／■蛋白〕を
得た。回収率は９５％であり、比活性は約４倍上昇した
。又、高分子量型ウロキナーゼの含有率は９８％であり
、精製前と後で変化は認められなかった。

実施例５゜ 実施例１（ｃ）で得たＬ−ピログルタミル−Ｌ−１ジル
−Ｌ−口イシル−Ｌ−アルギニナールジブチルアセター
ル塩酸塩２７０■を０．１　Ｍモルホリノエタンスルホ
ン酸７８ｍ」およびジオキサン７８　ｍｌの混液に懸濁
させｐＨを５，０に調節し、ついで。

ＣＭ−Ｂｉｏｇｅｌ■Ａ（１００〜２００メソシユ）　
（Ｉｌｉ。

＝　Ｒａｄ　Ｌａｂ−社Ｍ）３０ｍｌを加え、攪拌しな
がら少量づつ３ｇの水溶性カルボジイミドを１時間を要
して添加し、３７Ｃで２４時間攪拌をした。

反応終了後樹脂を水で洗浄後、０．２Ｍクエン酸ソ−ダ
緩衝液ｐ１１２．５で４０ｔニア０時間加水分解を行っ
た。

得られたＬ−ピログルタミル−Ｌ−リジル−Ｌ−ロイシ
ル−Ｌ−アルギニナール−ＣＭ　−Ｂｉｏｇｅｌ■Ａは
３Ｑｍｌであった。

実施例６゜ 実施例５で得られた該樹脂ウロキナーゼ吸着体１、　Ｑ
　ｍｌをカラムに充填し、０．１Ｍ食塩を含むｐＨ７，
５００，Ｉ　Ｍ　リン酸ソーダ緩衝液で充分に緩衝化を
行った。その後ｐ）１７．５に調整した１３９２０００
ＩＵの部分精製ウロキナーゼ（比活性５０，４５０　Ｉ
Ｕ／呵フオフオーリンローリ白）含有溶液をそりカラム
上に導入し、該吸着体にウロキナーゼを吸着させた。つ
いで上記同じ緩衝液でカラムを充分に洗浄したのち、０
．２Ｍのクエン酸を用いて、カラム内（（吸着したウロ
キナーゼを脱着させた。

得られたウロキナーゼは比活性１３４２０８ｉＵ／ｎｗ
蛋白で１２６７０００ＩＵ　（収率９１％）であった。

精製後のウロキナーゼ中の高分子型の含有率は９５、３
４であり、出発物質との差はみとめられなかった。

特許出願人　日本化薬株喪会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （Ｉ）１、−ピログルタミル−Ｌ−リジル−Ｌ−口イシ
   ル−Ｌ−アルギニナールが水不溶性担体ε・こ結合して
   なるウロキナーゼ吸着体に粗ウロキナーゼ含有液を接触
   させて該吸着体にウロキナーゼを吸着させ１次いで吸着
   したウロキナーゼを溶出させることを特徴とする高純度
   ウロキナーゼの製造法 （２）　　ウロキナーゼの溶出をクエン酸で行うことを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の高神度ウロキナ
   ーゼの製造方法。 （３）　ｌ、−ピログルタミル−１ｉ　　’）　ｙル−
   Ｌ−ロインルーＩ７−アルギニナールが水不溶性担体に
   結合してなるウロキナーゼ吸着体。 （，１１Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−リジル−Ｌ−口イシ
   ル−Ｌ−アルギニナールジアルキルアセクール