JPS5965066A - プロテア−ゼ吸着体 - Google Patents

プロテア−ゼ吸着体

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JPS5965066A
JPS5965066A JP57175298A JP17529882A JPS5965066A JP S5965066 A JPS5965066 A JP S5965066A JP 57175298 A JP57175298 A JP 57175298A JP 17529882 A JP17529882 A JP 17529882A JP S5965066 A JPS5965066 A JP S5965066A
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JP
Japan
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protease
argininal
adsorbent
group
insoluble carrier
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JP57175298A
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Tetsuya Someno
哲也 染野
Tadao Yamazaki
山崎 忠雄
Shinichi Ishii
石井 信一
Tomio Takeuchi
富雄 竹内
Hamao Umezawa
梅沢 浜夫
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Nippon Kayaku Co Ltd
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Nippon Kayaku Co Ltd
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    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02PCLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

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  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグロテアーゼ吸着体に関する。
プロテアーゼの精製法として従来から用いられている方
法としては、硫酸塩、例えば硫酸マグネシウム、ベント
ナイトなどの沈澱剤を用いた沈澱法、ケイ酸やシリカゲ
ル、ヒドロキシルアパタイトなどを用いた吸着クロマト
法およびグロテアーゼの電気的解離に関する性質を利用
した陽或いは陰イオン交換クロマト法など、又はそれら
の組み合せが知られている。一般に、これらの方法は精
製工程が多い程純度上昇が期待できるが、その反面収率
が低下する欠点がある。
さらに精製に長時間を要するため、との精與過程でグロ
テアーゼ自身による自己消化ならびに共存する他のグロ
テアーゼによる消化などによる酵素の変質ならびに失活
など、解決すべき重要な問題が残されている。
近年グロテアーゼの優れた精製法として、グロテアーゼ
に親和力をもつりガンドを不溶性担体に結合させた吸着
体が開発され、この吸着体を用いて酵素を精製する所謂
アフイニテイク口マトグラフィーが選択性が高くしかも
高収率で目的物を得ることができることから優れた高純
度グロテアーゼの精製法として注目されてきている。
具体例を述べれば、 1)ウロキナーゼでは例えばa)リジン又はアルギニ/
、又はこれらの誘導体をリガンドとする方法(4′!公
昭51−44193号、特公昭5’l−20596号、
特開昭51−951.83号、1特開昭51−3548
1 〜35483号、′l))胎盤組織等に含有されるウロ
キナーゼ阻害因子をリガンドとする方法(特公昭51−
20597号、c)ペンズグアニジン誘導体をリガンド
とする方法(特開昭53−88389号)がある。
2)カリクレインでは、例えば牛組織中或いは人血清中
のカリクレイン阻害物質をリガンドとする方法(特開昭
50−31017号)3)トリプシンで代表される酵素
ではa)アルギニンをリガンドとしたAP−セファロー
スを用いる方法(特開昭48−82083号)、b)バ
ラアミノフェニルグアニジン、バラアミノベンズアミジ
ン、又はメタアミノベンズアミジンをリガンドとした方
法〔アーチブ・ビオケミストリー●アンド・ビオフイジ
ツクス、154巻、501頁(1973)〕などがある
しかしながら従来のアフイニテイクロマトグラフィーで
は、吸着体とグロテアーゼとの親和性が弱く、例えば高
濃度の塩類を含有するプロテアーゼ溶液によってその吸
着能は著しく低下し、予期した収率が得られない。
又、動物組織中に存在するグロテアーゼ阻害物質をリガ
ンドとして用いる試みもみられるがこのリガンドを多量
に取得することは容易でなく到底実用化できるものでは
ない。
そこで本発明者らは大量に入手可能なリガンドを用いた
プロテアーゼ吸着体開発のため、種々のりガンドを合成
して検討した。その結果、L一ロイペプチンから誘導さ
れる下記一般式(It(式中人はフェニルグリシル基又
はフェニルアラニル基を示す) で表わされるアルギニナール誘導体がグロテアーゼを功
率よく吸着し、かつJ)Hの調整により容易に目的とす
るグロテアーゼを脱着することを見い出した。
本発明は上記知見に基づいて完成されたものである。
本発明のグロテアーゼ吸着体を用いて精製しうるプロテ
アーゼは特に制限されないが、トリプシン、カリクレイ
ン、プラスミン、トロンビンなどが好ましい。
本発明で使用される水不溶性担体としては特に制限はな
く、例えばメククリル酸一ジビニルベンゼン共重合体な
どの酸性イオン交換樹脂、カルボキシメチルセルロース
などの酸性基を有するセルロース誘導体、セファロース
、アガ0一ス、アキストランなどの高分子多糖体にノノ
ルボン酸基やスルホン酸基を導入したものなどがあげら
れるが、高分子多糖体が好ましい。
これらの不溶性担体とL−アル,ギニナール誘導体を結
合させるには、例えば下記一般式oI)(K中Aはフェ
ニルグリシル基、フェニルアラニル基を、1もは低級ア
ルキル基を示す)で表わされる1ノーアルギニナール誘
導体をジアルキルアセタール化したものなどアルギニナ
ール部のアルデヒド基が保護されたL−アルギニナール
誘導体に酸性基を活性化した上記の不溶性担体と反応さ
せ、その後アルデヒド基の保護基を除去すればよい。
ここで1{・とじては、例えばブチル基などがあげられ
る。
不溶性担休中の酸性基の活性化方法としては公知の方法
、例えばアガロースに臭化シアンを作用させる方法、カ
ルボキシアルキル誘導体をスベーザーにもつアガロース
に水溶性力ルポジ−+wM+vvUvリvv\一Iノ イミドを作用させる方法、CI−.1〜セファロース(
ファルマシア社製)K水溶性力ルポジイミドを作用させ
る方法などが使用できる。
アルデヒド基の保護されたL−アルギニナール誘導体と
活性化不溶性担体との反応は、例えば水溶性カルボジイ
ミドを作用させる場合には溶媒中、p■■3〜7、好件
しくは4〜6、温度25〜45C、好ましくは35〜4
0Cで10〜30時間、好葦し〈は15〜25時間反応
させればよい。1二こで用いる溶媒としてはpI−13
〜7を保持できる塩溶液若しくは緩衝液からなるO〜5
0%のジメチルホルムアミド溶液又はジオキサン溶液な
どがあげられる。
得られた反応物からアルデヒド基の保護基を除去するに
はpH1〜4、好ましくは2〜3の緩衝液中、温度20
〜50C、好ましくは30〜45C、24〜120時間
、好ましくは48〜96時間加水分解すればよい。ここ
で用いる緩衝液としては塩酸、リン酸などの鉱酸及び酒
石酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、酢酸などの有機酸と
、これらのナ1・リウム、カリウム塩などからなる組成
のものなどがあげられる。
以」二のような方法によって得られたグロテアーゼ吸着
体を用い、種々のグロテアーゼを得るには、例えば次の
ようにすればよい。ここでは尿ツノリタレインの精製法
について説明する。
先ず、該吸着体をカラムに充』炉してpl15〜10、
夕f寸し〈はpll6〜8とする。この場合、・イオン
強度は特に制限されないが、0.025〜0.5Mの緩
衝液であらかじめ平衡化しておくことがクr捷しい。こ
こで用いる緩衝液としては、例えばリン醒ソーダーリン
酸、リン酸カリウム〜リン酸、酢一酸ソーダー酢酸、ト
リスヒドロキンアミンメタンー塩酸などがあげられる。
その後p115〜10、好ましくは6〜8に調整した粗
尿カリクレイン水溶液を該吸着体力ラムに通して該吸着
体に尿カリクレインを吸着させる。次いで尿カリクレイ
ンを吸着した該吸着体を」二記緩衝液で洗浄した後、p
i−11〜4、好ましくは,,112〜3の酸溶液、水
溶性塩溶液もしくは緩衝液で尿カリクレインを溶出させ
ることにより高純度の尿カリクレイン水溶液が得られる
ここで団用ずる酸溶液としては例えばクエン酸、酒石酸
、乳酸、コハク酸、酢酸、リン酸、塩酸などの水溶液な
どがあけられる。水溶性塩溶液として′ま例えば塩化ナ
トリウムー塩酸水溶液、塩化ツ1リウムー塩酸水溶液、
硫酸ソーダー硫酸水溶液などがあげられる。又、緩衝液
としては1)7N/−ダーリン酸水溶液、リン酸カリウ
ムーリン酸水溶液、クエン酸−クエン酸ナトリウム水溶
液、コハク酸−ホウ砂、乳酸一乳酸ナトリウム、酢酸〜
酢酸ナトリウム、酒石酸一酒石酸ナトリウムなどがあげ
られる。
なお、本発明方法はカラム式の61か、バノチ式で行っ
てもよい。
本発明のグロテアーゼ吸着体製造の際に使用ず乙アルf
ヒド基の保護された1ノーアルギニナール誘導体は例え
ば次の方法により製造することができる。即ち、アごノ
基の保護されたフェニルグリシン又はフエニルアラニン
の活4’J:エステルとアルデヒド基を保護したし一ロ
イベプチンをザーモライシンで加水分解して得た、アル
デヒ1・基の保護されたL一ロイシルーし−アルキニナ
ール(特開昭55−37185、実施例1参照)とを溶
媒中で縮合させた後、接触還元を行ってアミン基の保護
基を除去することにより得ることができる。ここで使用
さラしるN一保護基としてはペンジルオキシ力ルボニル
基、p−メトキシベンジルオキシ力ルボニル基などの接
触還元で除去できる保護基があげられる。活性エステル
トシては、N−ヒドロキシスクシンイミトエステル、p
一二トロフェニルエステル、2,4.5−}’IJフロ
ロフェニルエステルなどの使用が簡便であり望ましい。
又、縮合に用いられる溶媒は通當用いられる溶媒で特に
差しつかえはない。又、接触還元は、例えばメタノール
などの溶媒中、パラジウム黒などを用いて常法で行うこ
とができる。
なお、アミン基の保護されたフェニルグリシン又はフェ
ニルアラニンとアルデヒド基の゛保護さitだL一ロイ
シルーし−アルギニナールとの縮合は、例えばジシクロ
へキシルカルボジイミド、エチルジメチルアミノプロピ
ル力ルボジイミ1゛などつカルポジイミド類を単独で用
いる方法又は、N−ヒト口キシベンズトリアゾール、N
−ヒドロキシヌクシンイミド、N−ヒドロキシ−5−ノ
ルボルネン−2.3−ジカルボキサミドなどと組み合わ
せて用いる方法、あるいはジフェニルホスホリルアジド
、1−エトキシカルボニル−2−エトキシ−1,2−ジ
ヒドロキノリンなどの縮合剤を用いる方法などのペプチ
ト結合形成に一般的に用いられる方法によっても行うこ
とができる。
次に本発明を実施例及び夷験例により具体的に説明する
実施例1. L−7ェニルアラニルーL一ロイシル−1ノ7ルギニナ
ールセファロースの調製 (11N−ペンジルオキシ力ルボニルーL−7エニルア
ラニンN−ヒドロキシスクシンイミドエスデル2/IO
m9および、竹開llf;5537185で11f2載
した方法で得らJしたL−ロイシルーし−アルギニナー
ルジプチルアセクール塩酸塩220m9を水冷下N,N
’−ジメチルホルムアミド10meに溶解し次いで、7
0mlのトリエチルアミンを加え、?;{温でさもVC
20時間、攪拌を行う。溶媒を減圧で留去した後、シリ
カゲルな担体とするカラl1クロマトグラフィーに附し
、ブタノール;酢酸ブチル:酢酸:水=4:2:1:1
(v/v)で展開し、Rf0.8の坂口試薬陽性の両分
を減圧で濃縮し、N−ペンジルオキシ力ルボニル−1ノ
ーフエニルアラニルーL一ロイシル−L一アルギニナー
ルジブチルアセタール塩酸塩150mgをイ■7だ。
(ロ)よ−:二一25,5°(C=0.4ACOI−1
)+11.l)=88〜91C(分解) ト1)−MS;Ill/z=:G8,3(M+11)(
100%,684(39.3%) (2}得られた粉末120m9をメタノール10rn.
lに6解し、パラジウム黒を用いて2時間接触還元を行
った。反応終了後パラジウム黒を除去し、溶媒を留去し
てL−フェニルアラニルーし一口イシル−1ノ−アルギ
ニナールジブチルアセクール塩酸塩70mgを得た。
■もf;0.3((I]の展開溶媒と同じ)m.p.−
−−82〜84C FD−MS;nVz=549(M+)l)(100%)
,550(38.6%).551(8.7%)(3)得
ラhタ.1,−フエニルアラニルーJJ−oイシルーL
−アルギニナールジブチルアセクール塩lm50m9ヲ
O.1Mモルホリノエタンスルホン酸25ae及びジオ
キサン25meの混液に懸濁させpHを5に調整し、次
いでCll−セファロース4B15mIl!を加え、攪
拌しながら1時間かけて全量500mgの水溶性力ルボ
ジイミトを加エ、37trで20時間攪拌する。樹脂を
水で洗滌後0.2Mクエン酸ソーダ緩衝液5’Oml3
pH2.5で40℃60時間浸漬させたのち、緩衝液を
除去し、水洗をくり返し標記樹脂15m6を得た。
゛ノXかh例2 1,1,L−フェニルグ1ノシルー1」一ロイシルーL
−アルギニナールセファロースの調製 N−ヘンシ/l/オキシヵルボニル−1),L−7エニ
/L,クIJンンN−ヒドロキシスクシンイミトエステ
ル210mgオ.J:UL一ロイシルーL−アルギニナ
ールジブチルアセクール塩酸塩200mgおよび、1・
リエチルアミン62μkを実施例1と同様に10m/!
のN,J〜′−ジメチルホルムアミド中で反応させ、次
いで天施例1と同様な処理をし、N−ペンジルオキシ力
ルボニル−1),L〜フェニルグリシルー1ノーロイン
ルーし−アルギニナールジプチルアセクール塩酸塩を1
30m9得た。
TLf;0.8(実施例1(1)と同溶媒)+11.I
J.=84〜87C 1’L)一MS;nV7.=669(M+}I)(10
0%).67’0(482%).671(12.7%)
,595(15.7%) 得られた粉末110mgをメタノール10mlに溶解し
、パラジウム黒を用いて2時間接触還元を行った。反応
終了後、パラジウム黒を除去し、溶媒を留去シてD,L
−フェニルグリシルーL一口イシル−L−ア,ルギニナ
ールジプチルアセクール塩酸塩60m9を得t0 Iもf;++,3(実施例1(1)と同溶媒)m.i)
.=70〜75C FDMS;r+〆z=535(M−i−H)(100%
),536(239%),537(5.6%), 461(4.8%) 得ラレたI),I,−フェニルグリシルーL一口イシル
ーL−アルギニナールジブチルアセタール塩酸塩50m
9を用い実施例1と同様の操作を行い標記樹脂15ml
を得た。
実施例3. D−ンエニルアラニルーL一ロイ、シルーL−7ルギニ
ナールセファロースの調製 N−ペンジルオキシ力ルボニルーD−フェニルアラニン
N−ヒドロキシスクシンイミドエステル2l8m9i6
.J:.ヒ、L一口イシルーL−7ルギニナールジブチ
ルアセクール塩酸塩200m9および、1・レエチルア
ミン62/teを実施例1と同様に10meのN,N’
−ジメチルボルムアミド中で反応させ、実施例1と同様
な処理をし、吸湿性粉末状のNーペンジルオキシ力ルボ
ニルーD−7ェニルアラニル−1ノーロイシル−1ノー
アルギニナールンフチルアセタール塩酸塩を125mg
得た。
1もr;o.s(実施例1(1)と同溶媒)ト11)一
八4S;+11/′z=683(M@−4−1)(10
0%).684(4.0.5%).685(10.6%
),609(5.5易冫 得られた粉末105m9を実施例1と同様に接触還元を
行い吸湿性粉末状の1〕−フェニルアラニルー1ノー口
イシル−1ノーアルギニナールシフチルアセタール塩酸
塩55mgを得た。
1で・r;0.3(実施例1と同溶媒)円)一MS;n
V’Z−549(M−1−11)(100%),550
(289%).551(6.5%),447(3.8%
) 実験例1. 実施例1により調製したグロテアーゼ吸着体10mgを
カラムに充填し、pa17.5に調整した50tnMl
−リスヒドロキシメタン−L2A酸緩衝液で充分に緩衝
化を行った。その後ρII7.5に調整した力価4一 500カリクレイン単位の粗製人尿リクレイン(比活性
17カリクレイン単位/mク蛋白)含有溶液をそのカラ
ムに通過させ、該吸着体に人尿カリクレインを吸着させ
た。次いで上記緩衝液でカラムを洗滌した後、0.2M
のクエン酸を用いてカラムに吸着した人尿カリクレイン
を脱着させ、力価4244カリクレイン単位(比活性1
33カリクレイン単位/mym白)を得た。回収率は8
5%であり、比活性は約8倍上列した。
実験例2, 実施例2で調製したプロテアーゼ吸着体10meをカラ
ムに充填し、pi{8.2に調整した。50mへ4トリ
スヒドロキシメタンー塩酸緩?Jj液(0.02M塩化
カルシウム含有)で充分に緩衝化を行った。
その後、同緩衝液2meに溶解した活性トリプシン含:
1f,’75qOの市販1・リプシン10m夕を吸着さ
せた。
次いて−1二記緩衝液で、カラムを洗滌した後、01ヘ
4H1:酸を用いてカラムに吸着したトリプシンを脱,
?1jさせた。活性はペンゾイルーL−アルギニンエチ
ルエステルを基質に用い測定した。精製された1・リプ
シンは純度95%であり回収率は91%でル〕った。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)一般式 (式中人はフェニルグリシル基又はフエニルアラニル基
    を示す) で表わされるアルギニナール誘導体が水不溶性担体に結
    合してなるグロテアーゼ吸着体。
  2. (2)一般式 (氏中Aハフェニルグリシル基又ハフェニルアラニル基
    を示し、几は低級アルキル基を示す) で表わされるアをギニナールジアルキルアセタール誘導
    体。
JP57175298A 1982-10-07 1982-10-07 プロテア−ゼ吸着体 Granted JPS5965066A (ja)

Priority Applications (1)

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JP57175298A JPS5965066A (ja) 1982-10-07 1982-10-07 プロテア−ゼ吸着体

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JP57175298A JPS5965066A (ja) 1982-10-07 1982-10-07 プロテア−ゼ吸着体

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JPS5965066A true JPS5965066A (ja) 1984-04-13
JPH0153666B2 JPH0153666B2 (ja) 1989-11-15

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ID=15993651

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5592230A (en) * 1994-11-22 1997-01-07 Victor Company Of Japan, Ltd. High definition television receiver

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5592230A (en) * 1994-11-22 1997-01-07 Victor Company Of Japan, Ltd. High definition television receiver

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