JPS5965066A - プロテア−ゼ吸着体 - Google Patents
プロテア−ゼ吸着体Info
- Publication number
- JPS5965066A JPS5965066A JP57175298A JP17529882A JPS5965066A JP S5965066 A JPS5965066 A JP S5965066A JP 57175298 A JP57175298 A JP 57175298A JP 17529882 A JP17529882 A JP 17529882A JP S5965066 A JPS5965066 A JP S5965066A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protease
- argininal
- adsorbent
- group
- insoluble carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はグロテアーゼ吸着体に関する。
プロテアーゼの精製法として従来から用いられている方
法としては、硫酸塩、例えば硫酸マグネシウム、ベント
ナイトなどの沈澱剤を用いた沈澱法、ケイ酸やシリカゲ
ル、ヒドロキシルアパタイトなどを用いた吸着クロマト
法およびグロテアーゼの電気的解離に関する性質を利用
した陽或いは陰イオン交換クロマト法など、又はそれら
の組み合せが知られている。一般に、これらの方法は精
製工程が多い程純度上昇が期待できるが、その反面収率
が低下する欠点がある。
法としては、硫酸塩、例えば硫酸マグネシウム、ベント
ナイトなどの沈澱剤を用いた沈澱法、ケイ酸やシリカゲ
ル、ヒドロキシルアパタイトなどを用いた吸着クロマト
法およびグロテアーゼの電気的解離に関する性質を利用
した陽或いは陰イオン交換クロマト法など、又はそれら
の組み合せが知られている。一般に、これらの方法は精
製工程が多い程純度上昇が期待できるが、その反面収率
が低下する欠点がある。
さらに精製に長時間を要するため、との精與過程でグロ
テアーゼ自身による自己消化ならびに共存する他のグロ
テアーゼによる消化などによる酵素の変質ならびに失活
など、解決すべき重要な問題が残されている。
テアーゼ自身による自己消化ならびに共存する他のグロ
テアーゼによる消化などによる酵素の変質ならびに失活
など、解決すべき重要な問題が残されている。
近年グロテアーゼの優れた精製法として、グロテアーゼ
に親和力をもつりガンドを不溶性担体に結合させた吸着
体が開発され、この吸着体を用いて酵素を精製する所謂
アフイニテイク口マトグラフィーが選択性が高くしかも
高収率で目的物を得ることができることから優れた高純
度グロテアーゼの精製法として注目されてきている。
に親和力をもつりガンドを不溶性担体に結合させた吸着
体が開発され、この吸着体を用いて酵素を精製する所謂
アフイニテイク口マトグラフィーが選択性が高くしかも
高収率で目的物を得ることができることから優れた高純
度グロテアーゼの精製法として注目されてきている。
具体例を述べれば、
１）ウロキナーゼでは例えばａ）リジン又はアルギニ／
、又はこれらの誘導体をリガンドとする方法（４′！公
昭５１−４４１９３号、特公昭５’ｌ−２０５９６号、
特開昭５１−９５１．８３号、１特開昭５１−３５４８
１ 〜３５４８３号、′ｌ））胎盤組織等に含有されるウロ
キナーゼ阻害因子をリガンドとする方法（特公昭５１−
２０５９７号、ｃ）ペンズグアニジン誘導体をリガンド
とする方法（特開昭５３−８８３８９号）がある。
、又はこれらの誘導体をリガンドとする方法（４′！公
昭５１−４４１９３号、特公昭５’ｌ−２０５９６号、
特開昭５１−９５１．８３号、１特開昭５１−３５４８
１ 〜３５４８３号、′ｌ））胎盤組織等に含有されるウロ
キナーゼ阻害因子をリガンドとする方法（特公昭５１−
２０５９７号、ｃ）ペンズグアニジン誘導体をリガンド
とする方法（特開昭５３−８８３８９号）がある。
２）カリクレインでは、例えば牛組織中或いは人血清中
のカリクレイン阻害物質をリガンドとする方法（特開昭
５０−３１０１７号）３）トリプシンで代表される酵素
ではａ）アルギニンをリガンドとしたＡＰ−セファロー
スを用いる方法（特開昭４８−８２０８３号）、ｂ）バ
ラアミノフェニルグアニジン、バラアミノベンズアミジ
ン、又はメタアミノベンズアミジンをリガンドとした方
法〔アーチブ・ビオケミストリー●アンド・ビオフイジ
ツクス、１５４巻、５０１頁（１９７３）〕などがある
。
のカリクレイン阻害物質をリガンドとする方法（特開昭
５０−３１０１７号）３）トリプシンで代表される酵素
ではａ）アルギニンをリガンドとしたＡＰ−セファロー
スを用いる方法（特開昭４８−８２０８３号）、ｂ）バ
ラアミノフェニルグアニジン、バラアミノベンズアミジ
ン、又はメタアミノベンズアミジンをリガンドとした方
法〔アーチブ・ビオケミストリー●アンド・ビオフイジ
ツクス、１５４巻、５０１頁（１９７３）〕などがある
。
しかしながら従来のアフイニテイクロマトグラフィーで
は、吸着体とグロテアーゼとの親和性が弱く、例えば高
濃度の塩類を含有するプロテアーゼ溶液によってその吸
着能は著しく低下し、予期した収率が得られない。
は、吸着体とグロテアーゼとの親和性が弱く、例えば高
濃度の塩類を含有するプロテアーゼ溶液によってその吸
着能は著しく低下し、予期した収率が得られない。
又、動物組織中に存在するグロテアーゼ阻害物質をリガ
ンドとして用いる試みもみられるがこのリガンドを多量
に取得することは容易でなく到底実用化できるものでは
ない。
ンドとして用いる試みもみられるがこのリガンドを多量
に取得することは容易でなく到底実用化できるものでは
ない。
そこで本発明者らは大量に入手可能なリガンドを用いた
プロテアーゼ吸着体開発のため、種々のりガンドを合成
して検討した。その結果、Ｌ一ロイペプチンから誘導さ
れる下記一般式（Ｉｔ（式中人はフェニルグリシル基又
はフェニルアラニル基を示す） で表わされるアルギニナール誘導体がグロテアーゼを功
率よく吸着し、かつＪ）Ｈの調整により容易に目的とす
るグロテアーゼを脱着することを見い出した。
プロテアーゼ吸着体開発のため、種々のりガンドを合成
して検討した。その結果、Ｌ一ロイペプチンから誘導さ
れる下記一般式（Ｉｔ（式中人はフェニルグリシル基又
はフェニルアラニル基を示す） で表わされるアルギニナール誘導体がグロテアーゼを功
率よく吸着し、かつＪ）Ｈの調整により容易に目的とす
るグロテアーゼを脱着することを見い出した。
本発明は上記知見に基づいて完成されたものである。
本発明のグロテアーゼ吸着体を用いて精製しうるプロテ
アーゼは特に制限されないが、トリプシン、カリクレイ
ン、プラスミン、トロンビンなどが好ましい。
アーゼは特に制限されないが、トリプシン、カリクレイ
ン、プラスミン、トロンビンなどが好ましい。
本発明で使用される水不溶性担体としては特に制限はな
く、例えばメククリル酸一ジビニルベンゼン共重合体な
どの酸性イオン交換樹脂、カルボキシメチルセルロース
などの酸性基を有するセルロース誘導体、セファロース
、アガ０一ス、アキストランなどの高分子多糖体にノノ
ルボン酸基やスルホン酸基を導入したものなどがあげら
れるが、高分子多糖体が好ましい。
く、例えばメククリル酸一ジビニルベンゼン共重合体な
どの酸性イオン交換樹脂、カルボキシメチルセルロース
などの酸性基を有するセルロース誘導体、セファロース
、アガ０一ス、アキストランなどの高分子多糖体にノノ
ルボン酸基やスルホン酸基を導入したものなどがあげら
れるが、高分子多糖体が好ましい。
これらの不溶性担体とＬ−アル，ギニナール誘導体を結
合させるには、例えば下記一般式ｏＩ）（Ｋ中Ａはフェ
ニルグリシル基、フェニルアラニル基を、１もは低級ア
ルキル基を示す）で表わされる１ノーアルギニナール誘
導体をジアルキルアセタール化したものなどアルギニナ
ール部のアルデヒド基が保護されたＬ−アルギニナール
誘導体に酸性基を活性化した上記の不溶性担体と反応さ
せ、その後アルデヒド基の保護基を除去すればよい。
合させるには、例えば下記一般式ｏＩ）（Ｋ中Ａはフェ
ニルグリシル基、フェニルアラニル基を、１もは低級ア
ルキル基を示す）で表わされる１ノーアルギニナール誘
導体をジアルキルアセタール化したものなどアルギニナ
ール部のアルデヒド基が保護されたＬ−アルギニナール
誘導体に酸性基を活性化した上記の不溶性担体と反応さ
せ、その後アルデヒド基の保護基を除去すればよい。
ここで１｛・とじては、例えばブチル基などがあげられ
る。
る。
不溶性担休中の酸性基の活性化方法としては公知の方法
、例えばアガロースに臭化シアンを作用させる方法、カ
ルボキシアルキル誘導体をスベーザーにもつアガロース
に水溶性力ルポジ−＋ｗＭ＋ｖｖＵｖリｖｖ＼一Ｉノ イミドを作用させる方法、ＣＩ−．１〜セファロース（
ファルマシア社製）Ｋ水溶性力ルポジイミドを作用させ
る方法などが使用できる。
、例えばアガロースに臭化シアンを作用させる方法、カ
ルボキシアルキル誘導体をスベーザーにもつアガロース
に水溶性力ルポジ−＋ｗＭ＋ｖｖＵｖリｖｖ＼一Ｉノ イミドを作用させる方法、ＣＩ−．１〜セファロース（
ファルマシア社製）Ｋ水溶性力ルポジイミドを作用させ
る方法などが使用できる。
アルデヒド基の保護されたＬ−アルギニナール誘導体と
活性化不溶性担体との反応は、例えば水溶性カルボジイ
ミドを作用させる場合には溶媒中、ｐ■■３〜７、好件
しくは４〜６、温度２５〜４５Ｃ、好ましくは３５〜４
０Ｃで１０〜３０時間、好葦し〈は１５〜２５時間反応
させればよい。１二こで用いる溶媒としてはｐＩ−１３
〜７を保持できる塩溶液若しくは緩衝液からなるＯ〜５
０％のジメチルホルムアミド溶液又はジオキサン溶液な
どがあげられる。
活性化不溶性担体との反応は、例えば水溶性カルボジイ
ミドを作用させる場合には溶媒中、ｐ■■３〜７、好件
しくは４〜６、温度２５〜４５Ｃ、好ましくは３５〜４
０Ｃで１０〜３０時間、好葦し〈は１５〜２５時間反応
させればよい。１二こで用いる溶媒としてはｐＩ−１３
〜７を保持できる塩溶液若しくは緩衝液からなるＯ〜５
０％のジメチルホルムアミド溶液又はジオキサン溶液な
どがあげられる。
得られた反応物からアルデヒド基の保護基を除去するに
はｐＨ１〜４、好ましくは２〜３の緩衝液中、温度２０
〜５０Ｃ、好ましくは３０〜４５Ｃ、２４〜１２０時間
、好ましくは４８〜９６時間加水分解すればよい。ここ
で用いる緩衝液としては塩酸、リン酸などの鉱酸及び酒
石酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、酢酸などの有機酸と
、これらのナ１・リウム、カリウム塩などからなる組成
のものなどがあげられる。
はｐＨ１〜４、好ましくは２〜３の緩衝液中、温度２０
〜５０Ｃ、好ましくは３０〜４５Ｃ、２４〜１２０時間
、好ましくは４８〜９６時間加水分解すればよい。ここ
で用いる緩衝液としては塩酸、リン酸などの鉱酸及び酒
石酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、酢酸などの有機酸と
、これらのナ１・リウム、カリウム塩などからなる組成
のものなどがあげられる。
以」二のような方法によって得られたグロテアーゼ吸着
体を用い、種々のグロテアーゼを得るには、例えば次の
ようにすればよい。ここでは尿ツノリタレインの精製法
について説明する。
体を用い、種々のグロテアーゼを得るには、例えば次の
ようにすればよい。ここでは尿ツノリタレインの精製法
について説明する。
先ず、該吸着体をカラムに充』炉してｐｌ１５〜１０、
夕ｆ寸し〈はｐｌｌ６〜８とする。この場合、・イオン
強度は特に制限されないが、０．０２５〜０．５Ｍの緩
衝液であらかじめ平衡化しておくことがクｒ捷しい。こ
こで用いる緩衝液としては、例えばリン醒ソーダーリン
酸、リン酸カリウム〜リン酸、酢一酸ソーダー酢酸、ト
リスヒドロキンアミンメタンー塩酸などがあげられる。
夕ｆ寸し〈はｐｌｌ６〜８とする。この場合、・イオン
強度は特に制限されないが、０．０２５〜０．５Ｍの緩
衝液であらかじめ平衡化しておくことがクｒ捷しい。こ
こで用いる緩衝液としては、例えばリン醒ソーダーリン
酸、リン酸カリウム〜リン酸、酢一酸ソーダー酢酸、ト
リスヒドロキンアミンメタンー塩酸などがあげられる。
その後ｐ１１５〜１０、好ましくは６〜８に調整した粗
尿カリクレイン水溶液を該吸着体力ラムに通して該吸着
体に尿カリクレインを吸着させる。次いで尿カリクレイ
ンを吸着した該吸着体を」二記緩衝液で洗浄した後、ｐ
ｉ−１１〜４、好ましくは，，１１２〜３の酸溶液、水
溶性塩溶液もしくは緩衝液で尿カリクレインを溶出させ
ることにより高純度の尿カリクレイン水溶液が得られる
。
尿カリクレイン水溶液を該吸着体力ラムに通して該吸着
体に尿カリクレインを吸着させる。次いで尿カリクレイ
ンを吸着した該吸着体を」二記緩衝液で洗浄した後、ｐ
ｉ−１１〜４、好ましくは，，１１２〜３の酸溶液、水
溶性塩溶液もしくは緩衝液で尿カリクレインを溶出させ
ることにより高純度の尿カリクレイン水溶液が得られる
。
ここで団用ずる酸溶液としては例えばクエン酸、酒石酸
、乳酸、コハク酸、酢酸、リン酸、塩酸などの水溶液な
どがあけられる。水溶性塩溶液として′ま例えば塩化ナ
トリウムー塩酸水溶液、塩化ツ１リウムー塩酸水溶液、
硫酸ソーダー硫酸水溶液などがあげられる。又、緩衝液
としては１）７Ｎ／−ダーリン酸水溶液、リン酸カリウ
ムーリン酸水溶液、クエン酸−クエン酸ナトリウム水溶
液、コハク酸−ホウ砂、乳酸一乳酸ナトリウム、酢酸〜
酢酸ナトリウム、酒石酸一酒石酸ナトリウムなどがあげ
られる。
、乳酸、コハク酸、酢酸、リン酸、塩酸などの水溶液な
どがあけられる。水溶性塩溶液として′ま例えば塩化ナ
トリウムー塩酸水溶液、塩化ツ１リウムー塩酸水溶液、
硫酸ソーダー硫酸水溶液などがあげられる。又、緩衝液
としては１）７Ｎ／−ダーリン酸水溶液、リン酸カリウ
ムーリン酸水溶液、クエン酸−クエン酸ナトリウム水溶
液、コハク酸−ホウ砂、乳酸一乳酸ナトリウム、酢酸〜
酢酸ナトリウム、酒石酸一酒石酸ナトリウムなどがあげ
られる。
なお、本発明方法はカラム式の６１か、バノチ式で行っ
てもよい。
てもよい。
本発明のグロテアーゼ吸着体製造の際に使用ず乙アルｆ
ヒド基の保護された１ノーアルギニナール誘導体は例え
ば次の方法により製造することができる。即ち、アごノ
基の保護されたフェニルグリシン又はフエニルアラニン
の活４’Ｊ：エステルとアルデヒド基を保護したし一ロ
イベプチンをザーモライシンで加水分解して得た、アル
デヒ１・基の保護されたＬ一ロイシルーし−アルキニナ
ール（特開昭５５−３７１８５、実施例１参照）とを溶
媒中で縮合させた後、接触還元を行ってアミン基の保護
基を除去することにより得ることができる。ここで使用
さラしるＮ一保護基としてはペンジルオキシ力ルボニル
基、ｐ−メトキシベンジルオキシ力ルボニル基などの接
触還元で除去できる保護基があげられる。活性エステル
トシては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミトエステル、ｐ
一二トロフェニルエステル、２，４．５−｝’ＩＪフロ
ロフェニルエステルなどの使用が簡便であり望ましい。
ヒド基の保護された１ノーアルギニナール誘導体は例え
ば次の方法により製造することができる。即ち、アごノ
基の保護されたフェニルグリシン又はフエニルアラニン
の活４’Ｊ：エステルとアルデヒド基を保護したし一ロ
イベプチンをザーモライシンで加水分解して得た、アル
デヒ１・基の保護されたＬ一ロイシルーし−アルキニナ
ール（特開昭５５−３７１８５、実施例１参照）とを溶
媒中で縮合させた後、接触還元を行ってアミン基の保護
基を除去することにより得ることができる。ここで使用
さラしるＮ一保護基としてはペンジルオキシ力ルボニル
基、ｐ−メトキシベンジルオキシ力ルボニル基などの接
触還元で除去できる保護基があげられる。活性エステル
トシては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミトエステル、ｐ
一二トロフェニルエステル、２，４．５−｝’ＩＪフロ
ロフェニルエステルなどの使用が簡便であり望ましい。
又、縮合に用いられる溶媒は通當用いられる溶媒で特に
差しつかえはない。又、接触還元は、例えばメタノール
などの溶媒中、パラジウム黒などを用いて常法で行うこ
とができる。
差しつかえはない。又、接触還元は、例えばメタノール
などの溶媒中、パラジウム黒などを用いて常法で行うこ
とができる。
なお、アミン基の保護されたフェニルグリシン又はフェ
ニルアラニンとアルデヒド基の゛保護さｉｔだＬ一ロイ
シルーし−アルギニナールとの縮合は、例えばジシクロ
へキシルカルボジイミド、エチルジメチルアミノプロピ
ル力ルボジイミ１゛などつカルポジイミド類を単独で用
いる方法又は、Ｎ−ヒト口キシベンズトリアゾール、Ｎ
−ヒドロキシヌクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノ
ルボルネン−２．３−ジカルボキサミドなどと組み合わ
せて用いる方法、あるいはジフェニルホスホリルアジド
、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジ
ヒドロキノリンなどの縮合剤を用いる方法などのペプチ
ト結合形成に一般的に用いられる方法によっても行うこ
とができる。
ニルアラニンとアルデヒド基の゛保護さｉｔだＬ一ロイ
シルーし−アルギニナールとの縮合は、例えばジシクロ
へキシルカルボジイミド、エチルジメチルアミノプロピ
ル力ルボジイミ１゛などつカルポジイミド類を単独で用
いる方法又は、Ｎ−ヒト口キシベンズトリアゾール、Ｎ
−ヒドロキシヌクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノ
ルボルネン−２．３−ジカルボキサミドなどと組み合わ
せて用いる方法、あるいはジフェニルホスホリルアジド
、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジ
ヒドロキノリンなどの縮合剤を用いる方法などのペプチ
ト結合形成に一般的に用いられる方法によっても行うこ
とができる。
次に本発明を実施例及び夷験例により具体的に説明する
。
。
実施例１．
Ｌ−７ェニルアラニルーＬ一ロイシル−１ノ７ルギニナ
ールセファロースの調製 （１１Ｎ−ペンジルオキシ力ルボニルーＬ−７エニルア
ラニンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエスデル２／ＩＯ
ｍ９および、竹開ｌｌｆ；５５３７１８５で１１ｆ２載
した方法で得らＪしたＬ−ロイシルーし−アルギニナー
ルジプチルアセクール塩酸塩２２０ｍ９を水冷下Ｎ，Ｎ
’−ジメチルホルムアミド１０ｍｅに溶解し次いで、７
０ｍｌのトリエチルアミンを加え、？；｛温でさもＶＣ
２０時間、攪拌を行う。溶媒を減圧で留去した後、シリ
カゲルな担体とするカラｌ１クロマトグラフィーに附し
、ブタノール；酢酸ブチル：酢酸：水＝４：２：１：１
（ｖ／ｖ）で展開し、Ｒｆ０．８の坂口試薬陽性の両分
を減圧で濃縮し、Ｎ−ペンジルオキシ力ルボニル−１ノ
ーフエニルアラニルーＬ一ロイシル−Ｌ一アルギニナー
ルジブチルアセタール塩酸塩１５０ｍｇをイ■７だ。
ールセファロースの調製 （１１Ｎ−ペンジルオキシ力ルボニルーＬ−７エニルア
ラニンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエスデル２／ＩＯ
ｍ９および、竹開ｌｌｆ；５５３７１８５で１１ｆ２載
した方法で得らＪしたＬ−ロイシルーし−アルギニナー
ルジプチルアセクール塩酸塩２２０ｍ９を水冷下Ｎ，Ｎ
’−ジメチルホルムアミド１０ｍｅに溶解し次いで、７
０ｍｌのトリエチルアミンを加え、？；｛温でさもＶＣ
２０時間、攪拌を行う。溶媒を減圧で留去した後、シリ
カゲルな担体とするカラｌ１クロマトグラフィーに附し
、ブタノール；酢酸ブチル：酢酸：水＝４：２：１：１
（ｖ／ｖ）で展開し、Ｒｆ０．８の坂口試薬陽性の両分
を減圧で濃縮し、Ｎ−ペンジルオキシ力ルボニル−１ノ
ーフエニルアラニルーＬ一ロイシル−Ｌ一アルギニナー
ルジブチルアセタール塩酸塩１５０ｍｇをイ■７だ。
（ロ）よ−：二一２５，５°（Ｃ＝０．４ＡＣＯＩ−１
）＋１１．ｌ）＝８８〜９１Ｃ（分解） ト１）−ＭＳ；Ｉｌｌ／ｚ＝：Ｇ８，３（Ｍ＋１１）（
１００％，６８４（３９．３％） （２｝得られた粉末１２０ｍ９をメタノール１０ｒｎ．
ｌに６解し、パラジウム黒を用いて２時間接触還元を行
った。反応終了後パラジウム黒を除去し、溶媒を留去し
てＬ−フェニルアラニルーし一口イシル−１ノ−アルギ
ニナールジブチルアセクール塩酸塩７０ｍｇを得た。
）＋１１．ｌ）＝８８〜９１Ｃ（分解） ト１）−ＭＳ；Ｉｌｌ／ｚ＝：Ｇ８，３（Ｍ＋１１）（
１００％，６８４（３９．３％） （２｝得られた粉末１２０ｍ９をメタノール１０ｒｎ．
ｌに６解し、パラジウム黒を用いて２時間接触還元を行
った。反応終了後パラジウム黒を除去し、溶媒を留去し
てＬ−フェニルアラニルーし一口イシル−１ノ−アルギ
ニナールジブチルアセクール塩酸塩７０ｍｇを得た。
■もｆ；０．３（（Ｉ］の展開溶媒と同じ）ｍ．ｐ．−
−−８２〜８４Ｃ ＦＤ−ＭＳ；ｎＶｚ＝５４９（Ｍ＋）ｌ）（１００％）
，５５０（３８．６％）．５５１（８．７％）（３）得
ラｈタ．１，−フエニルアラニルーＪＪ−ｏイシルーＬ
−アルギニナールジブチルアセクール塩ｌｍ５０ｍ９ヲ
Ｏ．１Ｍモルホリノエタンスルホン酸２５ａｅ及びジオ
キサン２５ｍｅの混液に懸濁させｐＨを５に調整し、次
いでＣｌｌ−セファロース４Ｂ１５ｍＩｌ！を加え、攪
拌しながら１時間かけて全量５００ｍｇの水溶性力ルボ
ジイミトを加エ、３７ｔｒで２０時間攪拌する。樹脂を
水で洗滌後０．２Ｍクエン酸ソーダ緩衝液５’Ｏｍｌ３
ｐＨ２．５で４０℃６０時間浸漬させたのち、緩衝液を
除去し、水洗をくり返し標記樹脂１５ｍ６を得た。
−−８２〜８４Ｃ ＦＤ−ＭＳ；ｎＶｚ＝５４９（Ｍ＋）ｌ）（１００％）
，５５０（３８．６％）．５５１（８．７％）（３）得
ラｈタ．１，−フエニルアラニルーＪＪ−ｏイシルーＬ
−アルギニナールジブチルアセクール塩ｌｍ５０ｍ９ヲ
Ｏ．１Ｍモルホリノエタンスルホン酸２５ａｅ及びジオ
キサン２５ｍｅの混液に懸濁させｐＨを５に調整し、次
いでＣｌｌ−セファロース４Ｂ１５ｍＩｌ！を加え、攪
拌しながら１時間かけて全量５００ｍｇの水溶性力ルボ
ジイミトを加エ、３７ｔｒで２０時間攪拌する。樹脂を
水で洗滌後０．２Ｍクエン酸ソーダ緩衝液５’Ｏｍｌ３
ｐＨ２．５で４０℃６０時間浸漬させたのち、緩衝液を
除去し、水洗をくり返し標記樹脂１５ｍ６を得た。
゛ノＸかｈ例２
１，１，Ｌ−フェニルグ１ノシルー１」一ロイシルーＬ
−アルギニナールセファロースの調製 Ｎ−ヘンシ／ｌ／オキシヵルボニル−１），Ｌ−７エニ
／Ｌ，クＩＪンンＮ−ヒドロキシスクシンイミトエステ
ル２１０ｍｇオ．Ｊ：ＵＬ一ロイシルーＬ−アルギニナ
ールジブチルアセクール塩酸塩２００ｍｇおよび、１・
リエチルアミン６２μｋを実施例１と同様に１０ｍ／！
のＮ，Ｊ〜′−ジメチルホルムアミド中で反応させ、次
いで天施例１と同様な処理をし、Ｎ−ペンジルオキシ力
ルボニル−１），Ｌ〜フェニルグリシルー１ノーロイン
ルーし−アルギニナールジプチルアセクール塩酸塩を１
３０ｍ９得た。
−アルギニナールセファロースの調製 Ｎ−ヘンシ／ｌ／オキシヵルボニル−１），Ｌ−７エニ
／Ｌ，クＩＪンンＮ−ヒドロキシスクシンイミトエステ
ル２１０ｍｇオ．Ｊ：ＵＬ一ロイシルーＬ−アルギニナ
ールジブチルアセクール塩酸塩２００ｍｇおよび、１・
リエチルアミン６２μｋを実施例１と同様に１０ｍ／！
のＮ，Ｊ〜′−ジメチルホルムアミド中で反応させ、次
いで天施例１と同様な処理をし、Ｎ−ペンジルオキシ力
ルボニル−１），Ｌ〜フェニルグリシルー１ノーロイン
ルーし−アルギニナールジプチルアセクール塩酸塩を１
３０ｍ９得た。
ＴＬｆ；０．８（実施例１（１）と同溶媒）＋１１．Ｉ
Ｊ．＝８４〜８７Ｃ １’Ｌ）一ＭＳ；ｎＶ７．＝６６９（Ｍ＋｝Ｉ）（１０
０％）．６７’０（４８２％）．６７１（１２．７％）
，５９５（１５．７％） 得られた粉末１１０ｍｇをメタノール１０ｍｌに溶解し
、パラジウム黒を用いて２時間接触還元を行った。反応
終了後、パラジウム黒を除去し、溶媒を留去シてＤ，Ｌ
−フェニルグリシルーＬ一口イシル−Ｌ−ア，ルギニナ
ールジプチルアセクール塩酸塩６０ｍ９を得ｔ０ Ｉもｆ；＋＋，３（実施例１（１）と同溶媒）ｍ．ｉ）
．＝７０〜７５Ｃ ＦＤＭＳ；ｒ＋〆ｚ＝５３５（Ｍ−ｉ−Ｈ）（１００％
），５３６（２３９％），５３７（５．６％）， ４６１（４．８％） 得ラレたＩ），Ｉ，−フェニルグリシルーＬ一口イシル
ーＬ−アルギニナールジブチルアセタール塩酸塩５０ｍ
９を用い実施例１と同様の操作を行い標記樹脂１５ｍｌ
を得た。
Ｊ．＝８４〜８７Ｃ １’Ｌ）一ＭＳ；ｎＶ７．＝６６９（Ｍ＋｝Ｉ）（１０
０％）．６７’０（４８２％）．６７１（１２．７％）
，５９５（１５．７％） 得られた粉末１１０ｍｇをメタノール１０ｍｌに溶解し
、パラジウム黒を用いて２時間接触還元を行った。反応
終了後、パラジウム黒を除去し、溶媒を留去シてＤ，Ｌ
−フェニルグリシルーＬ一口イシル−Ｌ−ア，ルギニナ
ールジプチルアセクール塩酸塩６０ｍ９を得ｔ０ Ｉもｆ；＋＋，３（実施例１（１）と同溶媒）ｍ．ｉ）
．＝７０〜７５Ｃ ＦＤＭＳ；ｒ＋〆ｚ＝５３５（Ｍ−ｉ−Ｈ）（１００％
），５３６（２３９％），５３７（５．６％）， ４６１（４．８％） 得ラレたＩ），Ｉ，−フェニルグリシルーＬ一口イシル
ーＬ−アルギニナールジブチルアセタール塩酸塩５０ｍ
９を用い実施例１と同様の操作を行い標記樹脂１５ｍｌ
を得た。
実施例３．
Ｄ−ンエニルアラニルーＬ一ロイ、シルーＬ−７ルギニ
ナールセファロースの調製 Ｎ−ペンジルオキシ力ルボニルーＤ−フェニルアラニン
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル２ｌ８ｍ９ｉ６
．Ｊ：．ヒ、Ｌ一口イシルーＬ−７ルギニナールジブチ
ルアセクール塩酸塩２００ｍ９および、１・レエチルア
ミン６２／ｔｅを実施例１と同様に１０ｍｅのＮ，Ｎ’
−ジメチルボルムアミド中で反応させ、実施例１と同様
な処理をし、吸湿性粉末状のＮーペンジルオキシ力ルボ
ニルーＤ−７ェニルアラニル−１ノーロイシル−１ノー
アルギニナールンフチルアセタール塩酸塩を１２５ｍｇ
得た。
ナールセファロースの調製 Ｎ−ペンジルオキシ力ルボニルーＤ−フェニルアラニン
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル２ｌ８ｍ９ｉ６
．Ｊ：．ヒ、Ｌ一口イシルーＬ−７ルギニナールジブチ
ルアセクール塩酸塩２００ｍ９および、１・レエチルア
ミン６２／ｔｅを実施例１と同様に１０ｍｅのＮ，Ｎ’
−ジメチルボルムアミド中で反応させ、実施例１と同様
な処理をし、吸湿性粉末状のＮーペンジルオキシ力ルボ
ニルーＤ−７ェニルアラニル−１ノーロイシル−１ノー
アルギニナールンフチルアセタール塩酸塩を１２５ｍｇ
得た。
１もｒ；ｏ．ｓ（実施例１（１）と同溶媒）ト１１）一
八４Ｓ；＋１１／′ｚ＝６８３（Ｍ＠−４−１）（１０
０％）．６８４（４．０．５％）．６８５（１０．６％
），６０９（５．５易冫 得られた粉末１０５ｍ９を実施例１と同様に接触還元を
行い吸湿性粉末状の１〕−フェニルアラニルー１ノー口
イシル−１ノーアルギニナールシフチルアセタール塩酸
塩５５ｍｇを得た。
八４Ｓ；＋１１／′ｚ＝６８３（Ｍ＠−４−１）（１０
０％）．６８４（４．０．５％）．６８５（１０．６％
），６０９（５．５易冫 得られた粉末１０５ｍ９を実施例１と同様に接触還元を
行い吸湿性粉末状の１〕−フェニルアラニルー１ノー口
イシル−１ノーアルギニナールシフチルアセタール塩酸
塩５５ｍｇを得た。
１で・ｒ；０．３（実施例１と同溶媒）円）一ＭＳ；ｎ
Ｖ’Ｚ−５４９（Ｍ−１−１１）（１００％），５５０
（２８９％）．５５１（６．５％），４４７（３．８％
） 実験例１． 実施例１により調製したグロテアーゼ吸着体１０ｍｇを
カラムに充填し、ｐａ１７．５に調整した５０ｔｎＭｌ
−リスヒドロキシメタン−Ｌ２Ａ酸緩衝液で充分に緩衝
化を行った。その後ρＩＩ７．５に調整した力価４一 ５００カリクレイン単位の粗製人尿リクレイン（比活性
１７カリクレイン単位／ｍク蛋白）含有溶液をそのカラ
ムに通過させ、該吸着体に人尿カリクレインを吸着させ
た。次いで上記緩衝液でカラムを洗滌した後、０．２Ｍ
のクエン酸を用いてカラムに吸着した人尿カリクレイン
を脱着させ、力価４２４４カリクレイン単位（比活性１
３３カリクレイン単位／ｍｙｍ白）を得た。回収率は８
５％であり、比活性は約８倍上列した。
Ｖ’Ｚ−５４９（Ｍ−１−１１）（１００％），５５０
（２８９％）．５５１（６．５％），４４７（３．８％
） 実験例１． 実施例１により調製したグロテアーゼ吸着体１０ｍｇを
カラムに充填し、ｐａ１７．５に調整した５０ｔｎＭｌ
−リスヒドロキシメタン−Ｌ２Ａ酸緩衝液で充分に緩衝
化を行った。その後ρＩＩ７．５に調整した力価４一 ５００カリクレイン単位の粗製人尿リクレイン（比活性
１７カリクレイン単位／ｍク蛋白）含有溶液をそのカラ
ムに通過させ、該吸着体に人尿カリクレインを吸着させ
た。次いで上記緩衝液でカラムを洗滌した後、０．２Ｍ
のクエン酸を用いてカラムに吸着した人尿カリクレイン
を脱着させ、力価４２４４カリクレイン単位（比活性１
３３カリクレイン単位／ｍｙｍ白）を得た。回収率は８
５％であり、比活性は約８倍上列した。
実験例２，
実施例２で調製したプロテアーゼ吸着体１０ｍｅをカラ
ムに充填し、ｐｉ｛８．２に調整した。５０ｍへ４トリ
スヒドロキシメタンー塩酸緩？Ｊｊ液（０．０２Ｍ塩化
カルシウム含有）で充分に緩衝化を行った。
ムに充填し、ｐｉ｛８．２に調整した。５０ｍへ４トリ
スヒドロキシメタンー塩酸緩？Ｊｊ液（０．０２Ｍ塩化
カルシウム含有）で充分に緩衝化を行った。
その後、同緩衝液２ｍｅに溶解した活性トリプシン含：
１ｆ，’７５ｑＯの市販１・リプシン１０ｍ夕を吸着さ
せた。
１ｆ，’７５ｑＯの市販１・リプシン１０ｍ夕を吸着さ
せた。
次いて−１二記緩衝液で、カラムを洗滌した後、０１ヘ
４Ｈ１：酸を用いてカラムに吸着したトリプシンを脱，
？１ｊさせた。活性はペンゾイルーＬ−アルギニンエチ
ルエステルを基質に用い測定した。精製された１・リプ
シンは純度９５％であり回収率は９１％でル〕った。
４Ｈ１：酸を用いてカラムに吸着したトリプシンを脱，
？１ｊさせた。活性はペンゾイルーＬ−アルギニンエチ
ルエステルを基質に用い測定した。精製された１・リプ
シンは純度９５％であり回収率は９１％でル〕った。
Claims (2)
- （１）一般式 （式中人はフェニルグリシル基又はフエニルアラニル基
を示す） で表わされるアルギニナール誘導体が水不溶性担体に結
合してなるグロテアーゼ吸着体。 - （２）一般式 （氏中Ａハフェニルグリシル基又ハフェニルアラニル基
を示し、几は低級アルキル基を示す） で表わされるアをギニナールジアルキルアセタール誘導
体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57175298A JPS5965066A (ja) | 1982-10-07 | 1982-10-07 | プロテア−ゼ吸着体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57175298A JPS5965066A (ja) | 1982-10-07 | 1982-10-07 | プロテア−ゼ吸着体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5965066A true JPS5965066A (ja) | 1984-04-13 |
| JPH0153666B2 JPH0153666B2 (ja) | 1989-11-15 |
Family
ID=15993651
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57175298A Granted JPS5965066A (ja) | 1982-10-07 | 1982-10-07 | プロテア−ゼ吸着体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5965066A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5592230A (en) * | 1994-11-22 | 1997-01-07 | Victor Company Of Japan, Ltd. | High definition television receiver |
-
1982
- 1982-10-07 JP JP57175298A patent/JPS5965066A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5592230A (en) * | 1994-11-22 | 1997-01-07 | Victor Company Of Japan, Ltd. | High definition television receiver |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0153666B2 (ja) | 1989-11-15 |
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