JPH05990B2 - - Google Patents

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JPH05990B2
JPH05990B2 JP59029935A JP2993584A JPH05990B2 JP H05990 B2 JPH05990 B2 JP H05990B2 JP 59029935 A JP59029935 A JP 59029935A JP 2993584 A JP2993584 A JP 2993584A JP H05990 B2 JPH05990 B2 JP H05990B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なアフイニテイクロマトグラフイ
用吸着体に関する。
更に詳しくは、活性化された担体に、α−位以
外にもアミノ基を有するＬ−又はＤ−α−アミノ
酸を、そのα−位以外のアミノ基を介して固定化
した、遊離のα−アミノ基及び遊離のカルボキシ
ル基の両基をリガンドとして持ち合わせている、
新規なアフイニテイクロマトグラフイ用吸着体及
びその製法、並びにこれを用いるセリントランス
ヒドロキシメチラーゼの精製方法に関する。
近年、蛋白質の精製法の一として、アフイニテ
イクロマトグラフイを利用する方法が一般に広く
行なわれており、その為のアフイニテイクロマト
グラフイ用吸着体が各種開発され、実用化されて
いる。
また、アフイニテイクロマトグラフイを利用す
る酵素の精製法に於ては、担体にアミノ酸を固定
化した吸着体が用いられている例も多い。
然しながら、これら従来から知られているアミ
ノ酸を固定化した吸着体は、いずれもアミノ酸の
アミノ基又はカルボキシル基のどちらか一方が固
定化により塞がれており、また、α−位以外にも
官能基をもつα−アミノ酸を固定化したものでも
α−アミノ基又はカルボキシル基の一方がエステ
ル、アミド等の形になつていて、遊離の形では存
在していないか、或いはこれらのいずれかの官能
基を通じて担体と結合されており、遊離のα−ア
ミノ基及び遊離のカルボキシル基の両基を２つな
がらリガンドとして持ち合わせるような吸着体
は、これまでに全く認められなかつた。
本発明者らは、アミノ酸を基質とする酵素を精
製するための、より一般的なアフイニテイクロマ
トグラフイ用吸着体を開発すべく、その為には、
α−アミノ酸の特徴であるα−位炭素に於ける立
体構造を有効に利用することが望ましいとの着想
から、α−アミノ基とカルボキシル基とがいずれ
も遊離の状態で存在するような吸着体を調製する
必要があると考え、鋭意研究を重ねた結果、本発
明を完成するに到つた。
本発明のアフイニテイクロマトグラフイ用吸着
体は、活性化された担体を用い、α−位以外にも
アミノ基を有するＬ−又はＤ−α−アミノ酸を、
そのα−位以外のアミノ基を介して固定化させた
ものであり、遊離のα−アミノ基及び遊離のカル
ボキシル基の両基をリガンドとして持ち合わせて
いる為、アミノ酸を基質とする酵素（特にピリド
キサール酵素）に対してのアフイニテイクロマト
グラフイに特に有効に用いられ、酵素の分離、精
製等に、その利用範囲は極めて広い。また、本発
明の吸着体を用いたアフイニテイクロマトグラフ
イは、α−アミノ酸のα−位の立体構造を利用す
るアフイニテイクロマトグラフイであるため、α
−アミノ酸としてＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の
いずれかを用いることにより、夫々、Ｌ−アミノ
酸又はＤ−アミノ酸を基質とする酵素を、選択的
に分離することができる点に大きな特徴を有す
る。
このように、α−位炭素に結合したアミノ基と
カルボキシル基が２つとも遊離状態で存在してい
る吸着体は、これまでに未だ知られておらず、本
発明者らが初めて作り出したものである。
本発明に用い得る担体としては、セルロース、
アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミ
ド、多孔性ガラス等のアフイニテイクロマトグラ
フイに於て通常用いられている担体は、いずれも
例外なく用いられるが、中でもアガロースが最も
よく用いられる。アガロース系担体の具体的商品
としては、セフアロース（Pharmacia社）、バイ
オゲルＡ（BIO−RAD社）等があり、デキストラ
ン系のものとしては、セフアデツクス
（Pharmacia社）、セフアクリル（Pharmacia
社）、ポリアクリルアミド系のものとしては、エ
ンザフイツクスＰ（和光純薬(株)）、バイオゲルＰ
（Pharmacia社）等が夫々市販されているが、こ
れらに限定されるものではない。また、これら担
体の活性化法は種々あり、特に限定されるもので
はないが、例えば、アガロース系担体の場合に
は、CNBrにる活性化が最も一般的でよく用いら
れる。また、活性化アガロースとしては他にエポ
キシ活性化アガロース等もあるが、同様に本発明
に於て用い得ることはいうまでもない。
本発明に用いるα−位以外にもアミノ基を有す
るα−アミノ酸としては、例えば、リジン、オル
ニチン、アルギニン、ｐ−アミノフエニルアラニ
ン、α・ω−ジアミノカプロン酸、ω−グリシル
リジン等のＤ体及びＬ体アミノ酸が挙げられる
が、これらに限定されるものではない。
本発明の吸着体の調製法は、例えば、α−位以
外にもアミノ基を有するα−アミノ酸としてＬ−
リジン又はＤ−リジンを用い、活性化された担体
としてCNBr活性化アガロースを用いた場合を例
にして示すと下記のとおりである。
即ち、Ｌ−（又はＤ−）リジンを、塩基性炭酸
銅、又は塩化第二銅、硫酸第二銅の如き銅の鉱酸
塩等と、弱塩基性下、攪拌反応させて銅錯体と
し、これをCNBr活性化アガロースと、室温下
（要すれば冷却下）、１〜10時間（要すれば一昼
夜）振とう又は攪拌して反応させ、次いで、未反
応の銅イオン及びＬ−（又はＤ−）リジンを洗浄
除去した後、EDTA（エチレンジアミン四酢酸）
水溶液等の脱銅イオン剤で洗浄することにより、
銅イオンを除き、要すれば、未反応のCNBrを除
く為に、エタノールアミン水溶液等で洗浄し、目
的物を得ることができる。
本発明の吸着体は、通常０〜10℃の低温で保存
することが望ましい。
本発明の吸着体に於て、固体化されるα−アミ
ノ酸の量は、その吸着体の使用目的によつて異な
るが、通常、担体である膨潤ゲル１ml当り、１〜
10μｍolである。
本発明の吸着体は、一般に、アミノ酸を基質と
する酵素の分離、精製に幅広く利用され得るが、
特にピリドキサール酵素、例えば、Ｄ−アスパラ
ギン酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダー
ゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、リジンデヒドロ
ゲナーゼ、グリシンアセチルトランスフエラー
ゼ、セリントランスヒドロキシメチラーゼ、セリ
ンアセチルトランスフエラーゼ、バリンデカルボ
キシラーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、
グルタミン酸・ピルビン酸トランスアミナーゼ
（GPT）、グルタミン酸・オキザロ酢酸トランス
アミナーゼ（GOT）等に対してのアフイニテイ
クロマトグラフイに特に効果的に用い得ることが
期待できる。
例えば、ピリドキサール酵素の一であり、生体
内のアミノ酸代謝、即ち、セリン、〓グリシンに
重要な位置を占める、セリントランスヒドロキシ
メチラーゼの精製に関しては、これまでに、ラツ
ト肝からの抽出より７工程を経て、その比活性を
1600倍まで高めた（収率４％）という報告がある
が（Palekar，A.G.etal.，J.Biol.Chem.，248(4)
1158〜1167（1973））、本発明の吸着体、即ち、Ｌ
−リジンをそのω−位のアミノ基でアガロースに
固定化した吸着体（前記Ｌ−吸着体）を用いた精
製法では、５工程で比活性を4800倍まで高めるこ
とができる（収率9.4％）。
従来法及び本法についての精製順序及び収率を
下記に示す。
（） 従来法（J.Biol.Chem.，248，1158
（1973））ラツト肝抽出（比活性9.85units／mg）
→硫安分画→熱処理→硫安分画→DEAEセルロ
ースカラム→セフアデツクスＧ−150カラム→
DEAEセルロースカラム（比活性15500units／
mg、収率４％） （） 本法（前記Ｌ−吸着体使用） ラツト肝抽出（比活性2.55units／mg）→熱処
理→硫安分画→DEAEセルロースカラム→本発明
のアフイニテイカラム（比活性12.229units／mg、
収率9.4％） 尚、上記実験は、ラツト肝由来のセリントラン
スヒドロキシメチラーゼに関して行なつたもので
あるが、本発明のアフイニテイクロマトグラフイ
用吸着体は、ラツト肝に限らず、如何なる動植物
由来のセリントランスヒドロキシメチラーゼの精
製にも用い得ることはいうまでもない。
斯くの如く、Ｌ−リジンをそのω−位のアミノ
基で固定化した本発明の吸着体は、セリントラン
スヒドロキシメチラーゼを特異的に認識（アフイ
ニテイ、吸着）するが、一方、Ｄ−リジンをその
ω−位のアミノ基で固定化した本発明の吸着体は
本酵素に対し全くアフイニテイを示さない。この
ことは、本酵素の精製過程で、Ｌ−吸着体のリガ
ンドが、立体構造をも含めて本酵素の活性中心と
相互作用していることを示唆しており、本酵素の
活性中心を特異的に認識する効果的なアフイニテ
イクロマトグラフイであることを明確に示してい
るものである。
更にまた、セリントランスヒドロキシメチラー
ゼのみならず、本発明の吸着体を用いて高度に精
製した各種酵素は、要すれば、各種マトリツクス
に固定化させるなどして、アミノ酸合成、ペプチ
ド合成等の工業的分野や、肝機能検査等の臨床検
査の分野などに幅広く、且つ効果的に利用するこ
とが可能である。
以上述べたとおり、本発明は、新規で、且つ極
めて有用なアフイニテイクロマトグラフイ用吸着
体を提供するものであり、斯業に貢献するところ
極めて大なるものである。
以下に実施例を挙げる。
実施例 １ Ｌ−リジン塩酸塩72.6mg、塩化銅（）26.9
ｇ、炭酸水素ナトリウム1.26ｇ、1/10Ｎ水酸化ナ
トリウム８mlをフラスコに入れ、0.5N塩化ナト
リウム水溶液を加えて全量を100mlとし、攪拌し
て溶解させる。次いで、これにCNBr活性化セフ
アロース4B（フアルマシア・ジヤパン(株)）３ｇを
加え、水を加えて全量を150mlとした後、室温下、
５時間振とうする（PH8.06）。反応後、未反応の
銅イオン（）及びＬ−リジンが検出されなくな
るまで、水及び塩化ナトリウム水溶液で交互に洗
浄する。（洗浄液の全量は、各500mlとなる。） 未反応原料を除いた後、0.01N−EDTA水溶液
（全量250ml）で洗浄することにより、銅イオンを
脱離させる。全洗液中の銅イオン量を定量するこ
とにより、担体に固定化されたＬ−リジンの量を
知ることができる。（２〜4μｍolml） 脱銅イオン後、５％エタノールアミン水溶液
（全量250ml）で充分洗浄して、未反応のCNBrを
除去する。水及び0.5N塩化ナトリウム水溶液で
交互に洗浄して（洗浄液の全量は、各500mlとな
る。）、目的とするＬ−リジン固定化吸着体（遊離
のα−アミノ基及び遊離のカルボキシル基の両基
を、夫々リガンドとして有する）2.96ｇを得る。
（Ｌ−吸着体）。生成物は４〜８℃で冷蔵保存す
る。
実施例 ２ 実施例１に於て、Ｌ−リジン塩酸塩72.6mgを用
いる代りに、Ｄ−リジン塩酸塩72.6mgを用いる以
外は実施例１と全く同様にして、Ｄ−リジン固定
化吸着体2.96ｇを得る。（Ｄ−吸着体）。
実施例３ セリントランスヒドロキシメチラーゼ
の精製 ラツト肝及びトウモロコシ発芽体より調製した
セリントランスヒドロキシメチラーゼの粗酵素液
を用い、実施例１及び実施例２で夫々得られたＬ
−吸着体及びＤ−吸着体を用いて、アフイニテイ
クロマトグラフイを行なう。結果を第１図及び第
２図に示す。
第１図及び第２図から明らかな如く、PH5.7〜
7.5の10mMリン酸緩衝液で平衡化したＤ−吸着
体、及びPH7.2以上で平衡化したＬ−吸着体は、
ラツト肝及びトウモロコシ発芽体の本酵素に対し
アフイニテイを示さないが（第１図及び第２図の
ａ，ｄ，ｅ，ｆ）、PH5.7〜6.8で平衡化したＬ−
吸着体は、ラツト肝及びトウモロコシ発芽体の本
酵素を特異的に吸着する（第１図及び第２図の
ｂ，ｃ）。
Ｄ−吸着体→いかなるPHでもアフイニテイな
し。
溶出は、ラツト肝の本酵素の場合は0.2MkClを
含むリン酸緩衝液を、また、トウモロコシ発芽体
の本酵素の場合は0.05MKClを含むリン酸緩衝液
を夫々使用。
尚、活性が存在するフラクシヨンについては、
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動から、純
粋なものに精製されていることが確められた。
これらの実験結果から明らかな如く、ラツト
肝、トウモロコシ発芽体のいずれのセリントラン
スヒドロキシメチラーゼも、Ｌ−吸着体に対して
は相互作用するが、Ｄ−吸着体とは相互作用はせ
ず、このことは、本酵素の精製に於ては、Ｌ−吸
着体を用いることが必須条件であることを示して
いる。
【図面の簡単な説明】
第１図及び第２図は、夫々ラツト肝及びトウモ
ロコシ発芽体から調製したセリントランスヒドロ
キシメチラーゼの、Ｌ−吸着体、及びＤ−吸着体
を用いた場合のアフイニテイクロマトグラフイを
示し、ａ，ｂ，ｃはＬ−吸着体を用いた場合の、
またｄ，ｅ，ｆはＤ−吸着体を用いた場合のもの
であり、ａ及びｄはPH7.3の、ｂ及びｅはPH6.8
の、ｃ及びｆはPH6.4の10mMリン酸緩衝液で
夫々平衡化したときのもので、溶離液は、第１図
のｂ及びｃの場合は、0.2MKClを含むPH6.8及び
PH6.4の10mMリン酸緩衝液（イオン強度μ＝
0.21）であり、第２図のｂ及びｃの場合は、
0.05MKClを含むPH6.8及びPH6.4の10mMリン酸緩
衝液（μ＝0.06）を使用している。また、横軸は
フラクシヨンナンバー（2.1ml／フラクシヨン）
を示し、縦軸○―○は280nmに於ける吸光度を示
し、●―●は酵素活性値（unit）を示す。但し、
上記酵素活性値（unit）は、１分間に1nmolのア
セトアルデヒドを生成させるに要する酵素量を１
ユニツトとした。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 活性化された担体に、Ｌ−又はＤ−α−アミ
    ノ酸をα−位のアミノ基、カルボキシル基以外の
    置換基を介して固定化して成る、α−アミノ基及
    びカルボキシル基をそれぞれ遊離の状態で有す
    る、アフイニテイクロマトグラフイ用吸着体。 ２ α−位以外にもアミノ基を有するＬ−又はＤ
    −α−アミノ酸を銅の錯体とすることにより、そ
    のα−位の反応性を抑え、α−位以外のアミノ基
    により活性化担体と結合させ、次いで銅イオンを
    除くことから成る、α−アミノ基及びカルボキシ
    ル基をそれぞれ遊離の状態で有する、アフイニテ
    イクロマトグラフイ用吸着体の製法。 ３ 活性化された担体に、Ｌ−又はＤ−α−アミ
    ノ酸をα−位のアミノ基、カルボキシル基以外の
    置換基を介して固定化して成る、α−アミノ基及
    びカルボキシル基をそれぞれ遊離の状態で有す
    る、アフイニテイクロマトグラフイ用吸着体を用
    いる、セリントランスヒドロキシメチラーゼの精
    製方法。
JP59029935A 1984-02-20 1984-02-20 新規なアフイニテイクロマトグラフイ用吸着体 Granted JPS60173465A (ja)

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JP59029935A JPS60173465A (ja) 1984-02-20 1984-02-20 新規なアフイニテイクロマトグラフイ用吸着体

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JPS60173465A JPS60173465A (ja) 1985-09-06
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CN104399283B (zh) * 2014-12-04 2016-02-17 江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所 黄曲霉毒素b1适配体亲和柱的制备方法

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