JPS5837832B2 - 酵素吸着体及び酵素の精製方法 - Google Patents
酵素吸着体及び酵素の精製方法Info
- Publication number
- JPS5837832B2 JPS5837832B2 JP53143526A JP14352678A JPS5837832B2 JP S5837832 B2 JPS5837832 B2 JP S5837832B2 JP 53143526 A JP53143526 A JP 53143526A JP 14352678 A JP14352678 A JP 14352678A JP S5837832 B2 JPS5837832 B2 JP S5837832B2
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- Japan
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- enzyme
- adsorbent
- urokinase
- naphthamidine
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般式（Ｉ）
（式中、ｒ１、ｒ２及びｒ３は各々、水素原子又はメチ
ル基を示す。
ル基を示す。
）で表わされる化合物をリガンドとする酵素吸着体、及
び該吸着体を用いる酵素の精製方法に関するものである
。
び該吸着体を用いる酵素の精製方法に関するものである
。
近年、アフィニテイークロマトグラフイーによる各種酵
素の精製技術が確立され、トリプシン、カリクレイン、
ウロキナーゼ等のセリンプロテアーゼの精製に関しても
種々の阻害剤をリガンドとするアフイニテイークロマト
グラフイーが報告されている。
素の精製技術が確立され、トリプシン、カリクレイン、
ウロキナーゼ等のセリンプロテアーゼの精製に関しても
種々の阻害剤をリガンドとするアフイニテイークロマト
グラフイーが報告されている。
しかしながら、リガンドとして用いる阻害剤を多量に得
るのが円錐であったり、目的とする酵素との特異的親和
力が充分でなかったり、また、粗酵素含有液に混在する
発熱性物質が完全に除去されない等の欠点を有するもの
が多い。
るのが円錐であったり、目的とする酵素との特異的親和
力が充分でなかったり、また、粗酵素含有液に混在する
発熱性物質が完全に除去されない等の欠点を有するもの
が多い。
本発明の目的は、多量の酵素を効率よく精製し、また発
熱性物質除去率の高いアフィニティークロマトグラフイ
ーを開発することである。
熱性物質除去率の高いアフィニティークロマトグラフイ
ーを開発することである。
本発明者らは、血栓症治療薬、抗ガン剤併用薬として繁
用されているウロキナーゼに注目し、該酵素と特異的な
親和力を有するリガンドの探索及びそのアフイニテイー
クロマトグラフイーについて、検討を重ねたところ、前
記一般式（Ｄで表わされる化合物類をリガンドとして用
いた吸着体が人ウロキナーゼを特異的に吸着するのみで
なく、更にトリプシン、カリクレイン等のセリンプロテ
アーゼ類に対しても強い親和力を有することを見い出し
本発明を完成した。
用されているウロキナーゼに注目し、該酵素と特異的な
親和力を有するリガンドの探索及びそのアフイニテイー
クロマトグラフイーについて、検討を重ねたところ、前
記一般式（Ｄで表わされる化合物類をリガンドとして用
いた吸着体が人ウロキナーゼを特異的に吸着するのみで
なく、更にトリプシン、カリクレイン等のセリンプロテ
アーゼ類に対しても強い親和力を有することを見い出し
本発明を完成した。
前記一般式（Ｉ）において、２・５一置換体、２・３一
置換体、１・５一置換体をリガンドとする吸着体が特に
優れた吸着力を有しており、発熱性物質除去率が高く、
また、酵素収率も高い。
置換体、１・５一置換体をリガンドとする吸着体が特に
優れた吸着力を有しており、発熱性物質除去率が高く、
また、酵素収率も高い。
前記一般式（ ’Ｉ、）で表わされる化合物は新規化＊
＊合物であり下記反応式に従って製造される。
＊合物であり下記反応式に従って製造される。
反応は対応するニトロナフトエ酸アミドをＬ．Ｗｅｉ
ｎｔｒａｕｂらの合戒法（ジャーナル オブ ザオーガ
ニツク ケミストリ−３３巻ｌ６７９頁、１９６８年）
をもとにニトロナフトアミジンとし〔（ａ）工程〕、こ
のニトロナフトアミジンをパラジウムー炭素等−６ｔ元
〔（ｂ）工程コすることにより行※※なわれる。
ｎｔｒａｕｂらの合戒法（ジャーナル オブ ザオーガ
ニツク ケミストリ−３３巻ｌ６７９頁、１９６８年）
をもとにニトロナフトアミジンとし〔（ａ）工程〕、こ
のニトロナフトアミジンをパラジウムー炭素等−６ｔ元
〔（ｂ）工程コすることにより行※※なわれる。
次に製造例を挙げ本発明化合物の製造方法をさらに詳細
に説明する。
に説明する。
製造例 １
（揚 ５−ニトロー１−ナフトアミジン塩酸塩の合成
塩化メチレン９０ｒｆＬｌを攪拌し、これに５−ニトロ
−１−ナフトエ酸アミド１０ｆ（０．０４６モル）ヲ加
え、ついでトリエチルオキンニウムフロルボレート９．
３Ｐ （ ０．０ ４９モル）の塩化メチレン（２５ｍ
の溶液を加え室温で１５時間攪拌した。
−１−ナフトエ酸アミド１０ｆ（０．０４６モル）ヲ加
え、ついでトリエチルオキンニウムフロルボレート９．
３Ｐ （ ０．０ ４９モル）の塩化メチレン（２５ｍ
の溶液を加え室温で１５時間攪拌した。
反応物を減圧下で濃縮乾固し、得られた結晶を乾燥エー
テルで洗い、ついで減圧乾燥した。
テルで洗い、ついで減圧乾燥した。
本結晶の全量をアンモニアのエタノール溶液１７．５１
（アンモニア含有量９％、０．０９３モル）と混合し、
室温で７２時間攪拌した。
（アンモニア含有量９％、０．０９３モル）と混合し、
室温で７２時間攪拌した。
反応物を減圧乾固してアンモニャとエタノールを溜去し
、残渣に水２５ＴｒＬｌを加えて攪拌し、水冷しながら
これに４８％水酸化ナトリウム水溶液７． ５ｆ （
０．０ ９モル）を加え生成した結晶を沢取し、ついで
氷冷水で洗浄した。
、残渣に水２５ＴｒＬｌを加えて攪拌し、水冷しながら
これに４８％水酸化ナトリウム水溶液７． ５ｆ （
０．０ ９モル）を加え生成した結晶を沢取し、ついで
氷冷水で洗浄した。
得られた粗５−ニトロ−１−ナフトアミジンを２０％塩
酸１２ｆ（０．０６６モル）と攪拌混合し、結晶を沢取
し、この結晶を酢酸エチルｌ５ｒｒＬｌと攪拌混合沢別
した。
酸１２ｆ（０．０６６モル）と攪拌混合し、結晶を沢取
し、この結晶を酢酸エチルｌ５ｒｒＬｌと攪拌混合沢別
した。
酢酸エチルによる洗浄を５回くり返した。
結晶を五酸化リン減圧（１１ｎ！ＩＬＨｇ）で恒量にな
るまで乾燥した。
るまで乾燥した。
５−ニトロー１−ナフトアミジン塩酸塩の収量３．ｔｙ
（収率３２％）融点２７７−２７９℃、薄層クロマトグ
ラフィーで＊＊ 単一スポットであった。
（収率３２％）融点２７７−２７９℃、薄層クロマトグ
ラフィーで＊＊ 単一スポットであった。
（ｂ）５−アミノー１−ナノトアミジン塩酸塩の合成
５−ニトロ−１−ナフトアミジン塩酸塩３．５ｆ（０．
０１４モル）メタノールｌ００ｒｒＬｌおよびパラジウ
ム炭素（パラジウム含量１０％）０．２２を内容積３０
０ｒｕｌの耐圧ガラス反応器に入れ、反応器はチッ素置
換した後水素ガスで置換し、水素圧を５ｋ９／ｃ４にし
て室温で５時間還元した。
０１４モル）メタノールｌ００ｒｒＬｌおよびパラジウ
ム炭素（パラジウム含量１０％）０．２２を内容積３０
０ｒｕｌの耐圧ガラス反応器に入れ、反応器はチッ素置
換した後水素ガスで置換し、水素圧を５ｋ９／ｃ４にし
て室温で５時間還元した。
反応物をチッ素気流下に沢別し、ｒ液を減圧下に濃縮乾
固した。
固した。
得られた結晶を少量の冷メタノールで洗って５−アミノ
ー１−ナフトアミジン塩酸塩２．６Ｐ（収率８４％）を
得た。
ー１−ナフトアミジン塩酸塩２．６Ｐ（収率８４％）を
得た。
融点２３０℃（分解）
製造例 ２
（ａ） Ｎ−メチル−５−ニトロ−２−ナフトアミジ
ン塩酸塩の合成 塩化メチレン４０ｍ＆攪拌し、これにＮ−メチル−５−
ニトロー２−ナフトエ酸アミド３．６？（０．０１６モ
ル）ヲ加エ、ついでトリエチルオキソニウムフロルボレ
ー｝ ３．０ Ｐ（ ０．０ １ ６モル）の塩化メチ
レン（ＩＱｍＡ）溶液を加え、室温で１５時間攪拌した
。
ン塩酸塩の合成 塩化メチレン４０ｍ＆攪拌し、これにＮ−メチル−５−
ニトロー２−ナフトエ酸アミド３．６？（０．０１６モ
ル）ヲ加エ、ついでトリエチルオキソニウムフロルボレ
ー｝ ３．０ Ｐ（ ０．０ １ ６モル）の塩化メチ
レン（ＩＱｍＡ）溶液を加え、室温で１５時間攪拌した
。
反応物を減圧下で濃縮乾固し、得られた結晶を乾燥エー
テルで洗い、ついで減圧乾燥した。
テルで洗い、ついで減圧乾燥した。
本結晶の全量をアンモニアのエタノール溶液５．８ｆ（
アンモニア含有量９％、０．０３１モル）と混合し、室
温で７２時間攪拌した。
アンモニア含有量９％、０．０３１モル）と混合し、室
温で７２時間攪拌した。
反応物を減圧乾固し、残渣に水ｌｏＷＬｌを加え攪拌し
、氷冷しなから５規定の水酸化ナトリウム水溶液Ｉ Ｑ
ｍＡ！ （ ０．０ ５モル）を加え、生成した結晶を
沢取し、ついで氷冷水で洗浄した。
、氷冷しなから５規定の水酸化ナトリウム水溶液Ｉ Ｑ
ｍＡ！ （ ０．０ ５モル）を加え、生成した結晶を
沢取し、ついで氷冷水で洗浄した。
得られた粗Ｎ−メチル−５−ニトロー２−ナフトアミジ
ンを２０％塩酸３Ｓ’（０．０１６モル）と攪拌混合し
、以下実施例１の後処理に準じてＮ−メチルー５−ニト
ロー２−ナフトアミジン塩酸塩２．５１（収率５９％）
を得た。
ンを２０％塩酸３Ｓ’（０．０１６モル）と攪拌混合し
、以下実施例１の後処理に準じてＮ−メチルー５−ニト
ロー２−ナフトアミジン塩酸塩２．５１（収率５９％）
を得た。
融点２７０−２７２℃
（ｂ） Ｎ−メチル−５−アミノー２−ナフトアミジ
ン塩酸塩の合成 Ｎ−メチル−５−ニトロ−２−ナフトアミジン塩酸塩１
．７Ｐ（６．４ミリモル）エタノール４０ｍｌおよびパ
ラジウム炭素（パラジウム含量１０％）０．１ｆを内容
積１００１７１７の耐圧ガラス反応器に入れ、以下実施
例１に準じて還元してＮ−メチル−５−ニトロー２−ナ
フトアミジン塩酸塩１．３ｆＩ（収率８７％）を得た。
ン塩酸塩の合成 Ｎ−メチル−５−ニトロ−２−ナフトアミジン塩酸塩１
．７Ｐ（６．４ミリモル）エタノール４０ｍｌおよびパ
ラジウム炭素（パラジウム含量１０％）０．１ｆを内容
積１００１７１７の耐圧ガラス反応器に入れ、以下実施
例１に準じて還元してＮ−メチル−５−ニトロー２−ナ
フトアミジン塩酸塩１．３ｆＩ（収率８７％）を得た。
融点２８９−２９２℃（分解）
第１表に本発明の代表化合物を示す。
第１表に示した化合物を製造するために使用される中間
体を第２表に示す。
体を第２表に示す。
本発明で使用される担体としては、前記一般式（Ｉ）で
表わされる化合物を、直接又は間隔子を介して、結合し
得る水不溶性のものであればいずれでもよく、例えば、
アガロース、架橋化デキストラン、セルローズ類、寒天
等の多糖類、ポリアクリルアマイド等の高分子、その他
ガラス粉末等が使用できるが、通常アガロースが使用さ
れる。
表わされる化合物を、直接又は間隔子を介して、結合し
得る水不溶性のものであればいずれでもよく、例えば、
アガロース、架橋化デキストラン、セルローズ類、寒天
等の多糖類、ポリアクリルアマイド等の高分子、その他
ガラス粉末等が使用できるが、通常アガロースが使用さ
れる。
本発明の吸着体は、上記の担体に直接又は間隔子（スペ
ーサー）を介して一般式（Ｉ）で示される化合物を通常
の方法で結合させることによって得られる。
ーサー）を介して一般式（Ｉ）で示される化合物を通常
の方法で結合させることによって得られる。
例えば、アガロースを担体とするときは、臭化シアンで
アガロースを活性化した後、一般式（Ｉ）の化合物を反
応させるか、あるいは間隔子である一般式 で表わされる基を結合させた後一般式（Ｉ）の化合物を
反応させることにより、本発明の酵素吸着体が得られる
。
アガロースを活性化した後、一般式（Ｉ）の化合物を反
応させるか、あるいは間隔子である一般式 で表わされる基を結合させた後一般式（Ｉ）の化合物を
反応させることにより、本発明の酵素吸着体が得られる
。
前記一般式で示した間隔子としては、通常、ｍが３〜１
０のものが用いられる。
０のものが用いられる。
本発明の方法を実施するにあたっては、前述の如くして
得られた吸着体をカラムに充填し、これに粗酵素含有液
を流下する等の方法により、充分吸着体と接触させる。
得られた吸着体をカラムに充填し、これに粗酵素含有液
を流下する等の方法により、充分吸着体と接触させる。
吸着されない不純物を充分洗浄除去した後、適当な溶離
液を用いて酵素な溶出させる。
液を用いて酵素な溶出させる。
カラムに流す粗酵素含有液及び溶離液は、塩濃度及びｐ
Ｈを特ｋ狭い範囲に限定する必要はないが、それぞれの
酵素に応じて適当に調整される。
Ｈを特ｋ狭い範囲に限定する必要はないが、それぞれの
酵素に応じて適当に調整される。
ウロキナーゼの精製においては、粗酵素含有液の塩濃度
は０．２〜２Ｍ、好ましくは０．２〜ＩＭに、ｐＨは５
．５〜ｌＯ、好ましくは６〜８．５に、溶離液の塩濃度
は０．５ Ｍ以下で、ｐＨは３．５〜５．５、好まし《
は４〜５の酢酸緩衝液が使用される。
は０．２〜２Ｍ、好ましくは０．２〜ＩＭに、ｐＨは５
．５〜ｌＯ、好ましくは６〜８．５に、溶離液の塩濃度
は０．５ Ｍ以下で、ｐＨは３．５〜５．５、好まし《
は４〜５の酢酸緩衝液が使用される。
溶出した酵素含有液を、限外濾過、凍結乾燥等の通常の
方法で処理すれば高純度の酵素粉末が得られる。
方法で処理すれば高純度の酵素粉末が得られる。
更に本発明者らは、本発明の酵素吸着体の有利な使用法
について研究した結果、本発明のクロマトグラフイーに
よる方法と組み合わせた場合、効率よく、精製効果を一
段と高めることのできる他のクロマトグラフィーによる
方法を見い出した。
について研究した結果、本発明のクロマトグラフイーに
よる方法と組み合わせた場合、効率よく、精製効果を一
段と高めることのできる他のクロマトグラフィーによる
方法を見い出した。
即ち、粗酵素含有液を、一般式（■） ＊（式
中、Ｘはアミノ基又はカルボキシル基を、Ｙはアルキル
アミノ基、アルキル置換四級アンモニウム又はアルコキ
シカルボニル基を示す。
中、Ｘはアミノ基又はカルボキシル基を、Ｙはアルキル
アミノ基、アルキル置換四級アンモニウム又はアルコキ
シカルボニル基を示す。
）で表わされる化合物と水不溶性担体との結合体の充填
層（１）を通過させ、該充填層（１）からの流出液をそ
のまま、前記本発明の酵素吸着体の充填層（２）に通し
、該吸着体に吸着した酵素を溶出させる。
層（１）を通過させ、該充填層（１）からの流出液をそ
のまま、前記本発明の酵素吸着体の充填層（２）に通し
、該吸着体に吸着した酵素を溶出させる。
充填層（１）の前記結合体は、通常、リガンドである一
般式（ＩＩ）で表わされる化合物を間隔子を介して水不
溶性担体に結合させてなる。
般式（ＩＩ）で表わされる化合物を間隔子を介して水不
溶性担体に結合させてなる。
例えば、該結合体は一般式
（式中、ｍは３〜１０の整数、Ｙは前記と同一）で表わ
される基が水不溶注担体に結合したものである。
される基が水不溶注担体に結合したものである。
該結合体における水不溶性担体の種類、またその製造方
法は本発明の酵素吸着体の場合と同様である。
法は本発明の酵素吸着体の場合と同様である。
本発明の精製方法が適用できる酵素としては、ウロキナ
ーゼの他、カリクレイン、トリプシン、キモトリプシン
、トロンビン、クラスミン、エラスターゼ等種々のセリ
ンプロテアーゼが挙げられる。
ーゼの他、カリクレイン、トリプシン、キモトリプシン
、トロンビン、クラスミン、エラスターゼ等種々のセリ
ンプロテアーゼが挙げられる。
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
実施例 １
セファロース４Ｂ（商品名、スウェーデン、ファルマシ
アファインケミカル社製）１００ｍｌをｐＨ１１におい
て臭化シアンｌＯグで１０分間活性化し、次いで、ｐＨ
９．５でヘキサメチレンジアミン５グを加え４℃で２０
時間反応させた。
アファインケミカル社製）１００ｍｌをｐＨ１１におい
て臭化シアンｌＯグで１０分間活性化し、次いで、ｐＨ
９．５でヘキサメチレンジアミン５グを加え４℃で２０
時間反応させた。
水洗した反応物を１００ｍｌの水に懸濁させ、無水コハ
ク酸１０１を加え、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．０
に維持しながら７時間反応させた後、１ｌの水で洗浄し
た。
ク酸１０１を加え、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．０
に維持しながら７時間反応させた後、１ｌの水で洗浄し
た。
生成物１０ＴＩＬｌに蒸留水ｌｏ７７ｌｌを加えて懸濁
させ、攪拌下、これに５−アミノー２ナフトアミジン塩
酸塩６０■を加え、１Ｎ＝塩酸又は１Ｎ−水酸化ナトリ
ウムで液のｐＨを４．７に保ち、更にｌ一エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
５７０■を水１献に溶かした液を５分間で加えた後、室
温２０℃で２０時間攪拌を続けた。
させ、攪拌下、これに５−アミノー２ナフトアミジン塩
酸塩６０■を加え、１Ｎ＝塩酸又は１Ｎ−水酸化ナトリ
ウムで液のｐＨを４．７に保ち、更にｌ一エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
５７０■を水１献に溶かした液を５分間で加えた後、室
温２０℃で２０時間攪拌を続けた。
反応物を瀘別した後、０．０１Ｎ−塩酸、０．０ ＩＮ
水酸化ナトリウム、ＩＭ一塩化ナトリウム水溶液、０．
１Ｍ＝酢酸緩衝液、ＩＭ一塩化ナトリウム水溶液、０．
１ Ｍ一トリス緩衝液（ ｐＨ ８．０ ）、次＊＊
いでＩＭ一塩化ナトリウム水溶液各１ 次洗浄し、アガロースに ＯＯｍｌで順 が結合してなる本発明の酵素吸着体を得た。
水酸化ナトリウム、ＩＭ一塩化ナトリウム水溶液、０．
１Ｍ＝酢酸緩衝液、ＩＭ一塩化ナトリウム水溶液、０．
１ Ｍ一トリス緩衝液（ ｐＨ ８．０ ）、次＊＊
いでＩＭ一塩化ナトリウム水溶液各１ 次洗浄し、アガロースに ＯＯｍｌで順 が結合してなる本発明の酵素吸着体を得た。
実施例 ２
実施例ｌの５−アミノー２−ナフトアミジン塩※※酸塩
の代りに５−アミノー１−ナフトアミジン塩酸塩６０ｍ
９を加え、実施例１と同様に処理し、アガロースに が結合してなる本発明の酵素吸着体を得た。
の代りに５−アミノー１−ナフトアミジン塩酸塩６０ｍ
９を加え、実施例１と同様に処理し、アガロースに が結合してなる本発明の酵素吸着体を得た。
実施例 ３
実施例ｌで得た吸着体１ｍｌを直径５間のプラスチック
チューブに詰めたアフイニテイーカラムに、セライトを
吸着剤として人尿から得た粗ウロキナーゼ溶液４ｍｌ（
ウロキナーゼ２０００国際単位含有、比活性５０００国
際単位／ｍ９蛋白）を流下し、次いで８ｍｌの０．３Ｍ
−ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ ｐＨ ７．
５ ）、１２１ＩＬ！！の０．４Ｍ−ＮａＣｌを含む０
．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）、１２ｒｕｌの１．
５ Ｍ − ＮａＣ ｌを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４．０）、更に４ｍｌの６Ｍ尿素水溶液（ｐＨ４．０
）を順次流下した。
チューブに詰めたアフイニテイーカラムに、セライトを
吸着剤として人尿から得た粗ウロキナーゼ溶液４ｍｌ（
ウロキナーゼ２０００国際単位含有、比活性５０００国
際単位／ｍ９蛋白）を流下し、次いで８ｍｌの０．３Ｍ
−ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ ｐＨ ７．
５ ）、１２１ＩＬ！！の０．４Ｍ−ＮａＣｌを含む０
．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）、１２ｒｕｌの１．
５ Ｍ − ＮａＣ ｌを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４．０）、更に４ｍｌの６Ｍ尿素水溶液（ｐＨ４．０
）を順次流下した。
流出液の２８０ｎｍにおける吸光度及びウロキナーゼ活
性を第１図に示した。
性を第１図に示した。
第１図から蛋白単位当りウロキナーゼ活性は約１０倍に
精製されたことが解った。
精製されたことが解った。
実施例 ４
実施例２で得た吸着体を用い、実施例３と同様に粗ウロ
キナーゼを処理し精製した。
キナーゼを処理し精製した。
蛋白単位当りウユキナーゼ活性は約１０倍に精製された
。
。
実施例 ５
セファロース４Ｂ（商品名、ファルマシアファインケミ
カル社製）に式 で表わされる基を、常法により結合させて得た結合体１
０ｍｌを直径０．９２ｃｆｒＬのカラム（以下、Ａカラ
ムという）に充填した。
カル社製）に式 で表わされる基を、常法により結合させて得た結合体１
０ｍｌを直径０．９２ｃｆｒＬのカラム（以下、Ａカラ
ムという）に充填した。
別に、実施例１で得た吸着体１ ０ｍＪを直径０，９２
ｃｒＩＬのカラム（以下、Ｂカラムという）に充填した
。
ｃｒＩＬのカラム（以下、Ｂカラムという）に充填した
。
セライトを吸着剤として人尿から得た粗ウロキナーゼ（
ウロキナーゼ１，Ｏ ｘ １ ０６国際単位含有、比活
性５０００国際単位／１ｒ＆？蛋白）を、０．４Ｍ塩化
ナトリウムを含む０． １ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０ ） ５ ０ｍｌに溶解し、Ａカラムに通し、次い
で、０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む０． １ Ｍ ＩＪ
ン酸緩衝液（ ｐＨ ７． ０ ）をＡカラムに通した
。
ウロキナーゼ１，Ｏ ｘ １ ０６国際単位含有、比活
性５０００国際単位／１ｒ＆？蛋白）を、０．４Ｍ塩化
ナトリウムを含む０． １ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０ ） ５ ０ｍｌに溶解し、Ａカラムに通し、次い
で、０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む０． １ Ｍ ＩＪ
ン酸緩衝液（ ｐＨ ７． ０ ）をＡカラムに通した
。
この間、Ａカラムからの流出液はそのままＢカラムに通
した。
した。
次に、ＢカラムをＩＭ塩化ナトリウムを含有するリン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、１．５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４、５）を流し
ウロキナーゼを溶出させた。
緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、１．５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４、５）を流し
ウロキナーゼを溶出させた。
ウロキナーゼ活性分画を集め、透析濃縮、凍結乾燥し、
０，７５ｘｌＯ’国際単位のウロキナーゼ粉末（比活性
１１３５００国際単位／■蛋白）を得た。
０，７５ｘｌＯ’国際単位のウロキナーゼ粉末（比活性
１１３５００国際単位／■蛋白）を得た。
実施例３、４及び５で得られたウロキナーゼは、投与量
８０００国際単位／ｋｇ家兎体重で発熱性物質試験は陰
性であった。
８０００国際単位／ｋｇ家兎体重で発熱性物質試験は陰
性であった。
第１図は実施例３における流出液の吸光度（２８０ｎｍ
）及びウロキナーゼ活性を示す。
）及びウロキナーゼ活性を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （式中、ｒ１、ｒ２及びｒ３は各々水素原子又はメチル
基を示す。 ）で表わされる化合物を′サガンドとする酵素吸着体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53143526A JPS5837832B2 (ja) | 1978-11-22 | 1978-11-22 | 酵素吸着体及び酵素の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53143526A JPS5837832B2 (ja) | 1978-11-22 | 1978-11-22 | 酵素吸着体及び酵素の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5572145A JPS5572145A (en) | 1980-05-30 |
| JPS5837832B2 true JPS5837832B2 (ja) | 1983-08-18 |
Family
ID=15340782
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53143526A Expired JPS5837832B2 (ja) | 1978-11-22 | 1978-11-22 | 酵素吸着体及び酵素の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5837832B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104311444B (zh) * | 2014-09-27 | 2016-05-18 | 张远强 | 硝基取代萘环的丁二酸酰胺衍生物、其制备方法及用途 |
| CN104311445B (zh) * | 2014-09-27 | 2016-04-13 | 张远强 | 含萘环的丁二酸酰胺衍生物、其制备方法及用途 |
| CN104311443B (zh) * | 2014-09-27 | 2016-03-09 | 张远强 | 一类含萘环的丁二酸酰胺衍生物、其制备方法及用途 |
-
1978
- 1978-11-22 JP JP53143526A patent/JPS5837832B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5572145A (en) | 1980-05-30 |
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