JPS61236726A - 組織プラスミノーゲン・アクチベータの精製方法 - Google Patents
組織プラスミノーゲン・アクチベータの精製方法Info
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- JPS61236726A JPS61236726A JP61081246A JP8124686A JPS61236726A JP S61236726 A JPS61236726 A JP S61236726A JP 61081246 A JP61081246 A JP 61081246A JP 8124686 A JP8124686 A JP 8124686A JP S61236726 A JPS61236726 A JP S61236726A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、プラスミノーゲン・アクチベータ(PA)の
精製方法に関する。プラスミノーゲン・アクチベータと
いう用語は、ウロキナーゼおよび組織プラスミノーゲン
・アクチベータ(t−PA)活性を有するタンパクおよ
び合成法または遺伝子工学法により得られるそれらの誘
導体を意味する。
精製方法に関する。プラスミノーゲン・アクチベータと
いう用語は、ウロキナーゼおよび組織プラスミノーゲン
・アクチベータ(t−PA)活性を有するタンパクおよ
び合成法または遺伝子工学法により得られるそれらの誘
導体を意味する。
プラスミノーゲンは、プラスミノーゲン・アクチベータ
によりプラスミンに変わる。この反応の触媒にはウロキ
ナーゼおよびt−PAが含まれる。これらのアクチベー
タを線維未溶解剤として治療に用いることは知られてい
る。フィブリンに対するその高い親和性の故に、 t−
PAは溶解療法に特に重要である。
によりプラスミンに変わる。この反応の触媒にはウロキ
ナーゼおよびt−PAが含まれる。これらのアクチベー
タを線維未溶解剤として治療に用いることは知られてい
る。フィブリンに対するその高い親和性の故に、 t−
PAは溶解療法に特に重要である。
細胞培養上清および尿からPAを単離および精製する方
法は既に記載されている(西独特許出願公開筒2,81
5,853号明細書、欧州特許第QQ41,766号明
細書)。これらの方法は複雑であシ従って工業的に用い
るには適していない。
法は既に記載されている(西独特許出願公開筒2,81
5,853号明細書、欧州特許第QQ41,766号明
細書)。これらの方法は複雑であシ従って工業的に用い
るには適していない。
t−PAを単離するための一方法は、欧州特許第0.0
41,766号明細書に記載されている。これには、亜
鉛キレート5epharoseq コンカナバリンA
−Agarose”および5ephadex(9G−1
50(超微粒)が用いられる。これら精製工程にはそれ
ぞれ大きな欠点が伴う。すなわち、亜鉛およびコンカナ
バリンAは生成物に混入する可能性があシ、また8ep
hadex’ [)−150(超微細)は、その能力お
よび流動性の故に工業的方法に用いることはできない。
41,766号明細書に記載されている。これには、亜
鉛キレート5epharoseq コンカナバリンA
−Agarose”および5ephadex(9G−1
50(超微粒)が用いられる。これら精製工程にはそれ
ぞれ大きな欠点が伴う。すなわち、亜鉛およびコンカナ
バリンAは生成物に混入する可能性があシ、また8ep
hadex’ [)−150(超微細)は、その能力お
よび流動性の故に工業的方法に用いることはできない。
欧州特許第0.023,869号明細書には、フィブリ
ンの可溶性断片が共有結合により固定化される担体を用
いたt−PAの精製が記載されている。この方法も同様
に工業的単離方法に適していない。
ンの可溶性断片が共有結合により固定化される担体を用
いたt−PAの精製が記載されている。この方法も同様
に工業的単離方法に適していない。
本発明の目的は、PAの簡単な精製方法を開発すること
にある。
にある。
驚くべきことに、前記したPAがサッカラードのポリサ
ルフェートまたは硫酸化糖に対して高い親和性を示し%
また後者を担体に結合すればこれらPAの精製をとのタ
イプの物質を介して行うことが可能であることを見出し
た。
ルフェートまたは硫酸化糖に対して高い親和性を示し%
また後者を担体に結合すればこれらPAの精製をとのタ
イプの物質を介して行うことが可能であることを見出し
た。
従って、本発明は、プラスミノーゲン・アクチベータの
ひとつを含む溶液を担体に結合されたサッカラードのポ
リサルフェートまたは硫酸化糖(′親和性材料′)と接
触させ、液体を除去しそしてこの材料によ多結合された
アクチイータを溶出することよシなるプラスミノーゲン
・アクチベータの精製方法に関する。
ひとつを含む溶液を担体に結合されたサッカラードのポ
リサルフェートまたは硫酸化糖(′親和性材料′)と接
触させ、液体を除去しそしてこの材料によ多結合された
アクチイータを溶出することよシなるプラスミノーゲン
・アクチベータの精製方法に関する。
プラスミノーゲン・アクチベータとは、ウロキナーゼま
たは組織プラスミノーゲン・アクチヘ−p (t−PA
)活性を有するタンパクおよび合成的にまたは遺伝子工
学的に製造された誘導体を意味する。
たは組織プラスミノーゲン・アクチヘ−p (t−PA
)活性を有するタンパクおよび合成的にまたは遺伝子工
学的に製造された誘導体を意味する。
プラスミノーゲン・アクチベータは好ましくは、ヒト起
源のものである。
源のものである。
プラスミノーゲン・アクチベータが組織プラスミノーゲ
ン・アクチベータまたはその誘導体である本発明の態様
も好ましい。
ン・アクチベータまたはその誘導体である本発明の態様
も好ましい。
プラスミノーゲン・アクテは一夕は、好ましくはウロキ
ナーゼまたはその誘導体であってもよい。
ナーゼまたはその誘導体であってもよい。
親和性材料によ多結合された不純物は、好ましくは前記
アクチベータの溶出前に、洗浄にょシ除去される。
アクチベータの溶出前に、洗浄にょシ除去される。
更に1負荷された親和性材料から、硫酸ナトリウム、硫
酸アンモニウム、Nacj2、LiCj! tたはクエ
ン酸塩を含む緩衝液を用いて不純物を除去し、そして前
記アクチベータを硝酸カリウム、塩化アンモニウム、塩
化バリウム、臭化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグ
ネシウム、チオチアン酸カリウム、尿素またはこれら物
質の混合物を含む緩衝液で溶出する方法が好ましい。
酸アンモニウム、Nacj2、LiCj! tたはクエ
ン酸塩を含む緩衝液を用いて不純物を除去し、そして前
記アクチベータを硝酸カリウム、塩化アンモニウム、塩
化バリウム、臭化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグ
ネシウム、チオチアン酸カリウム、尿素またはこれら物
質の混合物を含む緩衝液で溶出する方法が好ましい。
サッカラードのポリサルフェートまたは硫酸化糖を共有
結合カップリングするための担体材料としては、例えば
不溶性アガロース、デキストラン、アクリルアミドまた
はポリエチレングリコールグリシジルメタクリレートポ
リマーまたはそれらの組合せを用いてもよい。デキスト
ランまたはアガロースマトリックスが好ましい。
結合カップリングするための担体材料としては、例えば
不溶性アガロース、デキストラン、アクリルアミドまた
はポリエチレングリコールグリシジルメタクリレートポ
リマーまたはそれらの組合せを用いてもよい。デキスト
ランまたはアガロースマトリックスが好ましい。
サッカラードのポリサルフェートまたは硫酸化糖のカッ
プリングは、既知の方法により、例えば、臭化シアンで
予め活性化された担体材料に結合するか、またはカルボ
ジイミド縮合によジアミノ−官能化樹脂に結合するなど
して行われるが、カルボジイミド縮合にょシリジン−官
能化担体材料にカップリングすることにょシ行うのが好
ましい。
プリングは、既知の方法により、例えば、臭化シアンで
予め活性化された担体材料に結合するか、またはカルボ
ジイミド縮合によジアミノ−官能化樹脂に結合するなど
して行われるが、カルボジイミド縮合にょシリジン−官
能化担体材料にカップリングすることにょシ行うのが好
ましい。
デキストランサルフェート、ヘパランサルフェート、コ
ンドロイチンサルフェート、ケラタンサルフェート、テ
ルマタンサルフェート、Rントサンサルフェートまたは
ArteparonO%好ましくはヘパリンをサッカ2
イドのポリサルフェートまたは硫酸化糖として用いるこ
とができる。
ンドロイチンサルフェート、ケラタンサルフェート、テ
ルマタンサルフェート、Rントサンサルフェートまたは
ArteparonO%好ましくはヘパリンをサッカ2
イドのポリサルフェートまたは硫酸化糖として用いるこ
とができる。
もうひとつの有利な方法は、プラスミノーゲン・アクチ
ベータ含有溶液を、担体に結合された、サッカラードの
ポリサルフェートまたは硫酸化糖、好ましくはヘノぐリ
ン−リジン−8θpharoseと混合し、負荷された
親和性材料を、所望にょ9 N&01.を含有するri
13〜9の緩衝液で洗浄し、樹脂上に結合された不純物
を、硫酸す) IJウム、硫酸77モニウム、 nac
l 、 Lionまたはクエン酸塩を含む−3〜9の緩
i液、好ましくは声3〜9のα1〜2モル/Lクエン酸
塩溶液、好ましくはpH3,5〜6の0.5モル/Lク
エン酸塩で溶出し、そしてプラスミノーゲン・アクチベ
ータを、所望により洗剤好ましくは0.1〜1 f/I
t、 Tween’ 80 (ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノオレエート)を含む、KBO2、KS
CN、 11F140n、CaCIL2%MgCIh、
KBr、 BaO12または尿素を含むpH3〜9の緩
衝液好ましくは1〜2モル/LKacN(好ましくはp
H5〜8)で溶出することからなる。
ベータ含有溶液を、担体に結合された、サッカラードの
ポリサルフェートまたは硫酸化糖、好ましくはヘノぐリ
ン−リジン−8θpharoseと混合し、負荷された
親和性材料を、所望にょ9 N&01.を含有するri
13〜9の緩衝液で洗浄し、樹脂上に結合された不純物
を、硫酸す) IJウム、硫酸77モニウム、 nac
l 、 Lionまたはクエン酸塩を含む−3〜9の緩
i液、好ましくは声3〜9のα1〜2モル/Lクエン酸
塩溶液、好ましくはpH3,5〜6の0.5モル/Lク
エン酸塩で溶出し、そしてプラスミノーゲン・アクチベ
ータを、所望により洗剤好ましくは0.1〜1 f/I
t、 Tween’ 80 (ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノオレエート)を含む、KBO2、KS
CN、 11F140n、CaCIL2%MgCIh、
KBr、 BaO12または尿素を含むpH3〜9の緩
衝液好ましくは1〜2モル/LKacN(好ましくはp
H5〜8)で溶出することからなる。
特に好ましい実施態様においては、 PA含有溶液、例
えばメラノーマ細胞培養上清または尿僚望により鉱物質
除去)を、ヘパリンr、デキストランサルフェート−ま
たははントサンプル7■ エート−5epharose 、好ましくはヘパリン
−8epharose■ (ヘパリン−リジン−881
1M!Lrose’が好ましい)と、親和性材料100
fに対し細胞培養上清102の割合で混合し、その樹脂
から不純物を、0.1〜2モル/λクエン酸塩溶液(p
i13〜9)、好ましくは0. Sモル/lクエン酸塩
(pH五5〜6)を用いて除去し、そしてプラスミノー
ゲン・アクチベータを、所望によj5(11〜1 f
/ n Tween” 80を含む1〜2モル/ jB
KB四金含有緩衝液−5〜8)で溶出する方法とする
こともできる。
えばメラノーマ細胞培養上清または尿僚望により鉱物質
除去)を、ヘパリンr、デキストランサルフェート−ま
たははントサンプル7■ エート−5epharose 、好ましくはヘパリン
−8epharose■ (ヘパリン−リジン−881
1M!Lrose’が好ましい)と、親和性材料100
fに対し細胞培養上清102の割合で混合し、その樹脂
から不純物を、0.1〜2モル/λクエン酸塩溶液(p
i13〜9)、好ましくは0. Sモル/lクエン酸塩
(pH五5〜6)を用いて除去し、そしてプラスミノー
ゲン・アクチベータを、所望によj5(11〜1 f
/ n Tween” 80を含む1〜2モル/ jB
KB四金含有緩衝液−5〜8)で溶出する方法とする
こともできる。
もうひとつの特に好ましい実施態様においては、 PA
を、所望によりα1〜1 f / ft Tween■
80を含むpH4〜901〜2モル/ A Ca14
2含有緩衝液、好ましくは−5〜8の2モル/X0aO
jiL2溶液で溶出する方法とすることもできる。
を、所望によりα1〜1 f / ft Tween■
80を含むpH4〜901〜2モル/ A Ca14
2含有緩衝液、好ましくは−5〜8の2モル/X0aO
jiL2溶液で溶出する方法とすることもできる。
この方法は、 PAを、ひとつの精製工程によって、従
来方法ではいくつかの精製工程を行なつ・た後にのみ得
られる純度および比活性で得ることができるという点で
優れている。
来方法ではいくつかの精製工程を行なつ・た後にのみ得
られる純度および比活性で得ることができるという点で
優れている。
本発明のもうひとつの実施態様は組織プラスミノーゲン
・アクチベータまたは開示された方法により得られるそ
の誘導体である。
・アクチベータまたは開示された方法により得られるそ
の誘導体である。
本発明のもうひとつの実施態様はウロキナーゼまたは開
示された方法により得られるその誘導体である。
示された方法により得られるその誘導体である。
本発明を以下の実施例により説明する。
実施例 1
t−PA産生メラノーマ細胞の細胞培養上清10℃を攪
拌しながら室温で100fのヘパリン−8epharo
se■ と混合した。タンパク液を除去後。
拌しながら室温で100fのヘパリン−8epharo
se■ と混合した。タンパク液を除去後。
親和性材料をα1%Twean” 80を含む0.1モ
ル/ A trio・HCj!、α1モル/ RNaC
Jl (pH7,5)で洗浄し、次いでO,Sモル/l
クエン酸塩(pH5,0)を用いて不純物を除いた。P
Af:0.1モル/4tris−acn 、 z−e
ニル7tt xsayおよび0.01 % Twae
n■80を含む緩衝液(pH7,5)を用いて溶出した
。その溶出液を透析し、濃縮しそしてt−PA活性を試
験した。出発溶液中に存在、するt−PA活性のうち、
99%はヘパリン−8epharoaeに結合した。溶
出後、 t−PA活性の約90g6が回収された。
ル/ A trio・HCj!、α1モル/ RNaC
Jl (pH7,5)で洗浄し、次いでO,Sモル/l
クエン酸塩(pH5,0)を用いて不純物を除いた。P
Af:0.1モル/4tris−acn 、 z−e
ニル7tt xsayおよび0.01 % Twae
n■80を含む緩衝液(pH7,5)を用いて溶出した
。その溶出液を透析し、濃縮しそしてt−PA活性を試
験した。出発溶液中に存在、するt−PA活性のうち、
99%はヘパリン−8epharoaeに結合した。溶
出後、 t−PA活性の約90g6が回収された。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動は異なる分子量の2つ
のタンパクのバンドを示した。ひとつのバンドは免疫学
的にt−PAに帰属するものとされた。
のタンパクのバンドを示した。ひとつのバンドは免疫学
的にt−PAに帰属するものとされた。
実施例 2
実施例1に記載と同様の方法により101.の細胞培養
上清を処理し、次いで0.1モル/ ft tris(
ptii ’)および0.1%Twsen” 80を含
む2モル/ i、 0aCA2溶液で溶出した。その結
果は実施例1に示したものと比較しうるものでおった。
上清を処理し、次いで0.1モル/ ft tris(
ptii ’)および0.1%Twsen” 80を含
む2モル/ i、 0aCA2溶液で溶出した。その結
果は実施例1に示したものと比較しうるものでおった。
実施例 3
102の尿から透析により塩を除去し、次いで攪拌しな
から% 100fのへA IJンー日epharos
e@を室温で添加した。タンパク液を除去した後、親和
性材料を、0.1モル/ 1 tris・HOj! (
pH7,5)で洗浄し、次いで2モル/βに8ON 、
01モル/J! tris・HClを含む緩衝液(
pH7,5) で溶出した。
から% 100fのへA IJンー日epharos
e@を室温で添加した。タンパク液を除去した後、親和
性材料を、0.1モル/ 1 tris・HOj! (
pH7,5)で洗浄し、次いで2モル/βに8ON 、
01モル/J! tris・HClを含む緩衝液(
pH7,5) で溶出した。
出発時活性の80優がヘパリン−8epharoseに
結合した。溶出の後、ウロキナーゼ活性の約80qbが
回収された。
結合した。溶出の後、ウロキナーゼ活性の約80qbが
回収された。
実施例 4
t−PA産生メラノーマ細胞の細胞培養上清10fit
”500fのはントサンサルフエートー日epharo
seと混合し、実施例3と同様に処理した。約80チの
活性がその樹脂に結合した。
”500fのはントサンサルフエートー日epharo
seと混合し、実施例3と同様に処理した。約80チの
活性がその樹脂に結合した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン・アクチベー
タ(t−PA)またはそれらの誘導体を含む溶液を、担
体に結合されたサッカラードのポリサルフェートまたは
硫酸化糖(“親和性材料”)と接触させ、液体を除去し
、その親和性材料から不純物を除去し、そしてこの材料
により結合されたPAを溶出することからなる、プラス
ミノーゲン・アクチベータ(PA)の精製方法。 2)サッカラードのポリサルフェートまたは硫酸化糖が
リジンを介して担体に結合される特許請求の範囲第1項
記載の方法。 3)サッカラードのポリサルフェートがヘパリンである
特許請求の範囲第1項記載の方法。 4)担体がアガロースである特許請求の範囲第1項記載
の方法。 5)プラスミノーゲン・アクチベータを溶出する前に、
結合した不純物を、NaCl、硫酸ナトリウム、硫酸ア
ンモニウム、LiClまたはアルカリ金属クエン酸塩、
および所望により0.1〜1g/lのポリオキシエチレ
ンソルビタンモノオレエートを含む緩衝液で親和性材料
を洗浄することにより除去する特許請求の範囲第1項記
載の方法。 6)プラスミノーゲン・アクチベータを溶出する前に、
結合した不純物を、所望により0.1〜1g/lのポリ
オキシエチレンソルビタンモノオレエートを含む0.1
〜2モル/lクエン酸塩溶液(pH3〜9)で親和性材
料を洗浄することにより除去する特許請求の範囲第1項
記載の方法。 7)プラスミノーゲン・アクチベータを溶出する前に、
結合した不純物を、所望により0.1〜1g/lのポリ
オキシエチレンソルビタンモノオレエートを含む0.4
〜0.6モル/lクエン酸塩溶液(pH3.5〜6)で
親和性材料を洗浄することにより除去する特許請求の範
囲第1項記載の方法。 8)負荷された親和性材料から緩衝液を用いて不純物を
除去し、そしてプラスミノーゲン・アクチベータを、所
望により0.1〜1g/lのポリオキシエチレンソルビ
タンモノオレエートを含む硝酸カリウム、塩化アンモニ
ウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化カリウ
ム、塩化バリウム、尿素またはチオシアン酸カリウムま
たはこれら物質の混合物の溶液で溶出する特許請求の範
囲第1項記載の方法。 9)負荷された親和性材料から緩衝液を用いて不純物を
除去し、そして、プラスミノーゲン・アクチベータを、
0.5〜2モル/lKSCN(pH4〜9)および所望
により0.1〜1g/lのポリオキシエチレンソルビタ
ンモノオレエートを含む緩衝液で溶出する特許請求の範
囲第1項記載の方法。 10)負荷された親和性材料を、所望によりNaClを
含むpH4〜9の緩衝液で洗浄し、結合した不純物を、
所望により0.1〜1g/lのポリオキシエチレンソル
ビタンモノオレエートを含む0.4〜0.6モル/lア
ルカリ金属クエン酸塩溶液(pH3.5〜6)で親和性
材料を洗浄することにより除去し、そしてプラスミノー
ゲン・アクチベータを所望により0.1〜1g/lのポ
リオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含む、0
.5〜2モル/lKSCN含有緩衝液(pH4〜9)で
溶出する特許請求の範囲第1項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3512910.7 | 1985-04-11 | ||
DE19853512910 DE3512910A1 (de) | 1985-04-11 | 1985-04-11 | Verfahren zur reinigung von plasminogenaktivatoren |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61236726A true JPS61236726A (ja) | 1986-10-22 |
JPH084500B2 JPH084500B2 (ja) | 1996-01-24 |
Family
ID=6267676
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61081246A Expired - Lifetime JPH084500B2 (ja) | 1985-04-11 | 1986-04-10 | 組織プラスミノーゲン・アクチベータの精製方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5015583A (ja) |
EP (1) | EP0210332B1 (ja) |
JP (1) | JPH084500B2 (ja) |
AT (1) | ATE49420T1 (ja) |
AU (1) | AU603544B2 (ja) |
DE (2) | DE3512910A1 (ja) |
DK (1) | DK161986A (ja) |
ES (1) | ES8703522A1 (ja) |
IL (1) | IL78452A (ja) |
MX (1) | MX167325B (ja) |
NO (1) | NO174111C (ja) |
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