JPH0822382B2 - 金属キレ−ト樹脂 - Google Patents
金属キレ−ト樹脂Info
- Publication number
- JPH0822382B2 JPH0822382B2 JP62169950A JP16995087A JPH0822382B2 JP H0822382 B2 JPH0822382 B2 JP H0822382B2 JP 62169950 A JP62169950 A JP 62169950A JP 16995087 A JP16995087 A JP 16995087A JP H0822382 B2 JPH0822382 B2 JP H0822382B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- carrier matrix
- agarose
- metal chelate
- cooh
- spacer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 229920005989 resin Polymers 0.000 title claims abstract description 36
- 239000011347 resin Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 239000013522 chelant Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 20
- 239000002184 metal Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 21
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 20
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000002815 nickel Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract description 21
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical group OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 20
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 abstract description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 5
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 abstract 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 12
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 8
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- SYFQYGMJENQVQT-UHFFFAOYSA-N 6-amino-2-[bis(carboxymethyl)amino]hexanoic acid Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O SYFQYGMJENQVQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 iminodiacetic acid Chemical compound 0.000 description 4
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 4
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- GKIPXFAANLTWBM-UHFFFAOYSA-N epibromohydrin Chemical compound BrCC1CO1 GKIPXFAANLTWBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N ethyl formate Chemical compound CCOC=O WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- BQDYDULZSDRWMI-UHFFFAOYSA-N 4-amino-2-[bis(carboxymethyl)amino]butanoic acid Chemical compound NCCC(C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O BQDYDULZSDRWMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 238000009903 catalytic hydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241001331845 Equus asinus x caballus Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000080590 Niso Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000004648 butanoic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- KDJVUTSOHYQCDQ-UHFFFAOYSA-N carbamic acid;1h-imidazole Chemical compound NC([O-])=O.[NH2+]1C=CN=C1 KDJVUTSOHYQCDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002668 lysine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L nickel sulfate Chemical compound [Ni+2].[O-]S([O-])(=O)=O LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000363 nickel(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- QBIAZVPERXOGAL-UHFFFAOYSA-N prop-1-ene-1,3-diamine Chemical compound NCC=CN QBIAZVPERXOGAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3828—Ligand exchange chromatography, e.g. complexation, chelation or metal interaction chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
- B01J20/3265—Non-macromolecular compounds with an organic functional group containing a metal, e.g. a metal affinity ligand
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
- Developing Agents For Electrophotography (AREA)
- Treatment Of Water By Ion Exchange (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Polymerisation Methods In General (AREA)
- Manufacture And Refinement Of Metals (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は金属キレートクロマトグラフィーに適した新
規樹脂及びそれらの製造方法並びに蛋白質、特に近接す
るヒスチジン残基を含む蛋白質の精製のためのこれらの
金属キレート樹脂の使用に関するものである。
規樹脂及びそれらの製造方法並びに蛋白質、特に近接す
るヒスチジン残基を含む蛋白質の精製のためのこれらの
金属キレート樹脂の使用に関するものである。
蛋白質の新しい精製方法として、金属キレートアフィ
ニティークロマトグラフィーはポーラス（Porath）等
〔Nature 258,598〜599（1975）〕により1975年に紹介
された。この新技術は多くの所で首尾よく使われ、そし
て総説論文に〔レエネルダアル．ベー．とキーン．ツェ
ー．エル.,（Ｌnnerdal.B.and Keen C.L.,）J.Appl.B
iochem.4,203〜208（1982）：スルコウスキィー．イ
ー.,（Sulkowski.E.,）Trends in Biotechnology.3,1〜
７（1985）〕すでに論じられている。
ニティークロマトグラフィーはポーラス（Porath）等
〔Nature 258,598〜599（1975）〕により1975年に紹介
された。この新技術は多くの所で首尾よく使われ、そし
て総説論文に〔レエネルダアル．ベー．とキーン．ツェ
ー．エル.,（Ｌnnerdal.B.and Keen C.L.,）J.Appl.B
iochem.4,203〜208（1982）：スルコウスキィー．イ
ー.,（Sulkowski.E.,）Trends in Biotechnology.3,1〜
７（1985）〕すでに論じられている。
金属キレートアフィニティークロマトグラフィーは、
キレート結合でクロマトグラフィーゲルに結合された
（固定化された）Cu2+及びZn2+の如き金属イオンが蛋白
質の表面、特にヒスチジンのイミダゾール側鎖に位置す
る電子供与性基との可逆的に相互作用に貢献し得るとい
う発見に基づいている。電子供与性基が少なくとも部分
的に非プロトン化した形で存在するpH値で、蛋白質はク
ロマトグラフィーゲル（例えばアガロース）に結合し、
次いで、電子供与性基がプロトン化される低いpH値の緩
衝液で溶離される。例えば、いわゆるスペーサーを介し
て樹脂のキャリアーマトリックス（carrier matrix）に
結合しているイミノジ酢酸はキレート形成体として非常
に信頼されていた。
キレート結合でクロマトグラフィーゲルに結合された
（固定化された）Cu2+及びZn2+の如き金属イオンが蛋白
質の表面、特にヒスチジンのイミダゾール側鎖に位置す
る電子供与性基との可逆的に相互作用に貢献し得るとい
う発見に基づいている。電子供与性基が少なくとも部分
的に非プロトン化した形で存在するpH値で、蛋白質はク
ロマトグラフィーゲル（例えばアガロース）に結合し、
次いで、電子供与性基がプロトン化される低いpH値の緩
衝液で溶離される。例えば、いわゆるスペーサーを介し
て樹脂のキャリアーマトリックス（carrier matrix）に
結合しているイミノジ酢酸はキレート形成体として非常
に信頼されていた。
従って、生体高分子精製用の理想用な樹脂としては、
一方では金属イオンと強く結合しなければならず、他方
においては、金属イオンと蛋白質の間での可逆的相互作
用が可能でなければならない。固定化したイミノジ酢酸
はCuIIイオンに対してこれらの必要条件を十分に満たす
が、NiIIイオンに対しては前記必要条件を限られた範囲
でしか満たさない。これは後者は単に弱く結合し、蛋白
質混合液を導通してすらしばしば洗い出されてしまう為
である。一方、NIIキレート樹脂はN1 2+イオンが高配位
数を有する、即ちNiIIイオンは６配位子と錯体を作り、
CuIIイオンはむしろ４配位子と錯体を作るので生体物質
の精製には特に興味深い。ニッケル錯体において、４原
子価は樹脂中で金属イオンを結びつけるのに利用でき、
そして、２原子価は金属イオンと生体高分子間の交換に
利用できる。
一方では金属イオンと強く結合しなければならず、他方
においては、金属イオンと蛋白質の間での可逆的相互作
用が可能でなければならない。固定化したイミノジ酢酸
はCuIIイオンに対してこれらの必要条件を十分に満たす
が、NiIIイオンに対しては前記必要条件を限られた範囲
でしか満たさない。これは後者は単に弱く結合し、蛋白
質混合液を導通してすらしばしば洗い出されてしまう為
である。一方、NIIキレート樹脂はN1 2+イオンが高配位
数を有する、即ちNiIIイオンは６配位子と錯体を作り、
CuIIイオンはむしろ４配位子と錯体を作るので生体物質
の精製には特に興味深い。ニッケル錯体において、４原
子価は樹脂中で金属イオンを結びつけるのに利用でき、
そして、２原子価は金属イオンと生体高分子間の交換に
利用できる。
これまで、金属イオンに出来る限り大きい親和力を持
つキレート樹脂製造の試みがなされていた。錯体形成成
分としては、例えば、N,N,N′−エチレンジアミン三酢
酸〔ハーナー，エム．（Haner,M.）ら、Anal.Biochem.1
38.229〜234（1984）〕及び1,3−ジアミノプロパンN,N,
N′,N′−四酢酸〔モイヤス，イー．エム．（Moyers,E.
M.）とジェイ．エス．フリッツ（J.S.Fritz）、Anal.Ch
em.49,418〜423（1977）〕が使われていた。しかし、こ
れらの樹脂は金属イオンと生体高分子間の交換が最適で
ない欠点があった。
つキレート樹脂製造の試みがなされていた。錯体形成成
分としては、例えば、N,N,N′−エチレンジアミン三酢
酸〔ハーナー，エム．（Haner,M.）ら、Anal.Biochem.1
38.229〜234（1984）〕及び1,3−ジアミノプロパンN,N,
N′,N′−四酢酸〔モイヤス，イー．エム．（Moyers,E.
M.）とジェイ．エス．フリッツ（J.S.Fritz）、Anal.Ch
em.49,418〜423（1977）〕が使われていた。しかし、こ
れらの樹脂は金属イオンと生体高分子間の交換が最適で
ない欠点があった。
ニトリロトリ酢酸は４配位キレート形成体である。固
定化したニトリロトリ酢酸は、２原子価が生体高分子に
可逆的結合のために利用されるので、配位数６を持つ金
属イオンに適したキレート樹脂である。この様な金属キ
レート樹脂はその表面に２個の近接するヒスチジンを持
つ蛋白質の結合に特に適している。
定化したニトリロトリ酢酸は、２原子価が生体高分子に
可逆的結合のために利用されるので、配位数６を持つ金
属イオンに適したキレート樹脂である。この様な金属キ
レート樹脂はその表面に２個の近接するヒスチジンを持
つ蛋白質の結合に特に適している。
しかしながら、ニトリロトリ酢酸はそのキレート形成
能力を本質的に減少させることなく、イミノジ酢酸と同
様に担体に結合できない。この問題は式 NH2−(CH2)x−CH（COOH）−N(CH2COOH)2 （Ｉ） （式中、ｘは、2,3又は４を示す） で表わされる新規ニトリロトリ酢酸を製造することによ
って並びに、スペーサーを経たキャリアーマトリックス
にそれらを固定化することによって解決することができ
た。
能力を本質的に減少させることなく、イミノジ酢酸と同
様に担体に結合できない。この問題は式 NH2−(CH2)x−CH（COOH）−N(CH2COOH)2 （Ｉ） （式中、ｘは、2,3又は４を示す） で表わされる新規ニトリロトリ酢酸を製造することによ
って並びに、スペーサーを経たキャリアーマトリックス
にそれらを固定化することによって解決することができ
た。
従って、本発明は上記式のニトリロトリ酢酸誘導体及
びその塩並びにそれらの製造方法に関するものである。
本発明において、特に好ましいニトリロトリ酢酸誘導体
はＮ−〔３−アミノ−１−カルボキシプロピル〕−イミ
ノジ酢酸及びＮ−〔５−アミノ−１−カルボキシペンチ
ル〕−イミノジ酢酸である。
びその塩並びにそれらの製造方法に関するものである。
本発明において、特に好ましいニトリロトリ酢酸誘導体
はＮ−〔３−アミノ−１−カルボキシプロピル〕−イミ
ノジ酢酸及びＮ−〔５−アミノ−１−カルボキシペンチ
ル〕−イミノジ酢酸である。
本発明は、更にまた、それらの金属キレート基に基づ
いて、蛋白質の精製、特に近接するヒスチジン残基を含
む蛋白質の精製に適している金属キレート樹脂及びそれ
らの製造方法に関するものである。
いて、蛋白質の精製、特に近接するヒスチジン残基を含
む蛋白質の精製に適している金属キレート樹脂及びそれ
らの製造方法に関するものである。
本発明の金属キレート樹脂は一般式 キャリアーマトリックス−スペーサー−NH−(CH2)x−CH
（COOH）−N(CH2COO-)2Ni2+ で定義される。（式中、ｘは、2,3又は４を示す） キャリアーマトリックスとしては、アフィニティー及
びゲルクロマトグラフィーに使われる物質、例えば架橋
したデキストラン、アガロース（特に、商品名セファロ
ース（登録商標）で知られているもの）或いはポリアク
リルアミドが考えられる。
（COOH）−N(CH2COO-)2Ni2+ で定義される。（式中、ｘは、2,3又は４を示す） キャリアーマトリックスとしては、アフィニティー及
びゲルクロマトグラフィーに使われる物質、例えば架橋
したデキストラン、アガロース（特に、商品名セファロ
ース（登録商標）で知られているもの）或いはポリアク
リルアミドが考えられる。
スペーサーとしては、アフィニティークロマトグラフ
ィーで既に知られているスペーサー基が考えられ、特に
−O-CH2‐CH（OH）‐CH2−基及び−O-CO−基が好まし
い。
ィーで既に知られているスペーサー基が考えられ、特に
−O-CH2‐CH（OH）‐CH2−基及び−O-CO−基が好まし
い。
本発明において、特に好ましいキレート樹脂は、式
〔アガロース又はセファロース CL-6B〕−O-CH2‐CH
（OH）‐CH2‐NH−(CH2)4−CH（COOH）−N(CH2COO-)2Ni
2+及びアガロース−O-CO-NH−(CH2)2−CH（COOH）−N(C
H2COO-)2Ni2+で表わされるキレート樹脂である。
〔アガロース又はセファロース CL-6B〕−O-CH2‐CH
（OH）‐CH2‐NH−(CH2)4−CH（COOH）−N(CH2COO-)2Ni
2+及びアガロース−O-CO-NH−(CH2)2−CH（COOH）−N(C
H2COO-)2Ni2+で表わされるキレート樹脂である。
なお、セファロース CL-6Bは、架橋アガロースを約
６％含む、直径45〜165μｍのビーズ状ゲルである。
６％含む、直径45〜165μｍのビーズ状ゲルである。
本発明のニトリロトリ酢酸誘導体の製造は式R-HN−(C
H2)x−CH（NH2）−COOH（式中、Ｒはアミノ保護基を示
し、ｘは2,3又は４を示す）で表されるＮ−末端保護化
合物をアルカリ性媒質中ブロム酢酸と共に反応させ、次
いで、保護基を脱離させることによるそれ自体は公知の
方法で行うことができる。好ましいアミノ保護基はベン
ジルオキシカルボニル残基（Ｚ）で、これは接触水素添
加、好ましくはパラジウム／炭素とともに接触水素添加
することにより除去することができる。この方法で、Ｎ
γ−Ｚ−2,4−ジアミノ酢酸及びＮε−Ｚ−Ｌ−リジン
は先に述べた特に好ましいニトリロトリ酢酸誘導体に変
換することができる。
H2)x−CH（NH2）−COOH（式中、Ｒはアミノ保護基を示
し、ｘは2,3又は４を示す）で表されるＮ−末端保護化
合物をアルカリ性媒質中ブロム酢酸と共に反応させ、次
いで、保護基を脱離させることによるそれ自体は公知の
方法で行うことができる。好ましいアミノ保護基はベン
ジルオキシカルボニル残基（Ｚ）で、これは接触水素添
加、好ましくはパラジウム／炭素とともに接触水素添加
することにより除去することができる。この方法で、Ｎ
γ−Ｚ−2,4−ジアミノ酢酸及びＮε−Ｚ−Ｌ−リジン
は先に述べた特に好ましいニトリロトリ酢酸誘導体に変
換することができる。
本発明においてキレート樹脂の製造はそれ自体公知の
方法で行うことができ、それにより、最初にキャリアー
マトリックスは機能化され（スペーサーの導入）、そし
て所望のニトリロトリ酢酸誘導体がスペーサーに共有結
合する。
方法で行うことができ、それにより、最初にキャリアー
マトリックスは機能化され（スペーサーの導入）、そし
て所望のニトリロトリ酢酸誘導体がスペーサーに共有結
合する。
アガロースをキャリアーマトリックスとして使うと
き、これを、例えば、エピブロムヒドリンとアルカリ媒
質中で反応させることにより、 を含むオキシラン（oxirane）−アガロースが得られ
る。そして、このオキシラン−アガロースは、本発明の
ニトリロトリ酢酸誘導体、好ましくＮ−〔５−アミノ−
１−カルボキシプロピル〕−イミノジ酢酸又はＮ−〔５
−アミノ−１−カルボキシペンチル〕−イミノジ酢酸と
アルカリ性媒質中で反応させ、次いでニッケル塩溶液、
例えば硫酸ニッケルで洗浄することによるそれ自体は公
知の方法で所望の本発明キレート樹脂に変換することが
できる。特別な場合、異なる金属イオン（例えば、Co,C
d）の使用は好都合であり、樹脂を適当な金属塩と共に
反応させることにより、相当する金属キレート樹脂を容
易に得ることができる。また、エピロクロルヒドリンを
エピブロムヒドリンの代りに使用することも出来る。ア
ガロースとしては、標定化した製品、好ましくはスウエ
ーデン，アプサラ（Uppsala），ファルマシア社のセフ
ァロース（登録商標）が有利に使える。セファロース
（登録商標）CL-6Bは特に好ましい。同様の方法によ
り、遊離の水酸基を含むポリアクリルアミド樹脂を先に
示した如く本発明のキレート樹脂に変換することができ
る。陽イオン交換樹脂をマトリックス（matrix）として
使用する場合、ニトリロトリ酢酸誘導体のカップリング
はアミド結合の形成により直接行わせることができる。
き、これを、例えば、エピブロムヒドリンとアルカリ媒
質中で反応させることにより、 を含むオキシラン（oxirane）−アガロースが得られ
る。そして、このオキシラン−アガロースは、本発明の
ニトリロトリ酢酸誘導体、好ましくＮ−〔５−アミノ−
１−カルボキシプロピル〕−イミノジ酢酸又はＮ−〔５
−アミノ−１−カルボキシペンチル〕−イミノジ酢酸と
アルカリ性媒質中で反応させ、次いでニッケル塩溶液、
例えば硫酸ニッケルで洗浄することによるそれ自体は公
知の方法で所望の本発明キレート樹脂に変換することが
できる。特別な場合、異なる金属イオン（例えば、Co,C
d）の使用は好都合であり、樹脂を適当な金属塩と共に
反応させることにより、相当する金属キレート樹脂を容
易に得ることができる。また、エピロクロルヒドリンを
エピブロムヒドリンの代りに使用することも出来る。ア
ガロースとしては、標定化した製品、好ましくはスウエ
ーデン，アプサラ（Uppsala），ファルマシア社のセフ
ァロース（登録商標）が有利に使える。セファロース
（登録商標）CL-6Bは特に好ましい。同様の方法によ
り、遊離の水酸基を含むポリアクリルアミド樹脂を先に
示した如く本発明のキレート樹脂に変換することができ
る。陽イオン交換樹脂をマトリックス（matrix）として
使用する場合、ニトリロトリ酢酸誘導体のカップリング
はアミド結合の形成により直接行わせることができる。
本発明のキレート樹脂の製造には、市販のすでに機能
化したキャリアーマトリックスも使用することができ
る。本発明において、特に好ましい機能化したキャリア
ーマトリックスは、 を有するイミダゾールカルバメイト−アガロースで、こ
れは米国イリノイ，ロックフォード（Rockford），ピア
ーズ社（Pierce）の商品名リアクチゲルTM(Reactige
lTM)として販売されている。
化したキャリアーマトリックスも使用することができ
る。本発明において、特に好ましい機能化したキャリア
ーマトリックスは、 を有するイミダゾールカルバメイト−アガロースで、こ
れは米国イリノイ，ロックフォード（Rockford），ピア
ーズ社（Pierce）の商品名リアクチゲルTM(Reactige
lTM)として販売されている。
本発明のキレート樹脂は近接するヒスチジン残基を含
むペプチドと蛋白質に対する特に高い特異性によって区
別される。従って、近接するヒスチジン残基、とりわけ
２個の近接するヒスチジン残基を含有する蛋白質の精製
に特に適している。“近接するヒスチジン残基”の用語
は、特定のペプチドと蛋白質の三次元空間、即ち化合物
の表面上のヒスチジン残基の配列を意味している。ヒス
チジン残基の近接は一次構造に基づいてすでに定められ
るか、或いは二次及び／又は三次構造によってのみ実現
される。従って、本発明のキレート樹脂は数個、特に近
接する、好ましくはすぐ隣接するヒスチジン残基を有す
る自然及び変性蛋白質の精製に適している。
むペプチドと蛋白質に対する特に高い特異性によって区
別される。従って、近接するヒスチジン残基、とりわけ
２個の近接するヒスチジン残基を含有する蛋白質の精製
に特に適している。“近接するヒスチジン残基”の用語
は、特定のペプチドと蛋白質の三次元空間、即ち化合物
の表面上のヒスチジン残基の配列を意味している。ヒス
チジン残基の近接は一次構造に基づいてすでに定められ
るか、或いは二次及び／又は三次構造によってのみ実現
される。従って、本発明のキレート樹脂は数個、特に近
接する、好ましくはすぐ隣接するヒスチジン残基を有す
る自然及び変性蛋白質の精製に適している。
本発明のキレート樹脂はバッチ式あるいは連続的カラ
ム操作に使用することができる。蛋白質の導通に先きだ
ち、本発明のキレート樹脂をそれ自体はニッケルによっ
てキレート形成しない緩衝液、好ましくはpH8のリン酸
緩衝液で都合よく平衡化させる。平衡化緩衝液（並びに
溶出緩衝液）は変性因子或いはデタージェント、例えば
グアニジン塩酸、尿素或いはトリトン（triton）を含
む。このような変性因子又はデタージェントを加えて
も、例えば膜蛋白質の如く水に極めて難溶な蛋白質につ
いてすら操作になんら問題はない。蛋白質の溶離は一定
のpH値、或いは直線又は不連続的下降pH勾配で行うこと
ができる。至適溶出条件は存在する不純物の量と種類、
精製する物質の量、カラムの大きさ等に依存するので、
場合毎に適宜決めればよい。
ム操作に使用することができる。蛋白質の導通に先きだ
ち、本発明のキレート樹脂をそれ自体はニッケルによっ
てキレート形成しない緩衝液、好ましくはpH8のリン酸
緩衝液で都合よく平衡化させる。平衡化緩衝液（並びに
溶出緩衝液）は変性因子或いはデタージェント、例えば
グアニジン塩酸、尿素或いはトリトン（triton）を含
む。このような変性因子又はデタージェントを加えて
も、例えば膜蛋白質の如く水に極めて難溶な蛋白質につ
いてすら操作になんら問題はない。蛋白質の溶離は一定
のpH値、或いは直線又は不連続的下降pH勾配で行うこと
ができる。至適溶出条件は存在する不純物の量と種類、
精製する物質の量、カラムの大きさ等に依存するので、
場合毎に適宜決めればよい。
以下の実施例は本発明のニトリロトリ酢酸誘導体の製
造、本発明の金属キレート樹脂の製造並びに近接するヒ
スチジン残基を持つ蛋白質の精製におけるそれらの使用
を示すものである。
造、本発明の金属キレート樹脂の製造並びに近接するヒ
スチジン残基を持つ蛋白質の精製におけるそれらの使用
を示すものである。
実施例１ ブロム酢酸41.7gを150mlの2N水酸化ナトリウムに溶解
し、０℃に冷却した。これに、42gのＮε−Ｚ−Ｌ−リ
ジンを225mlの2N水酸化ナトリウムに溶解した溶液を攪
拌しながら０℃でゆっくり滴下した。２時間後冷却を止
め、この混合液を一夜攪拌した。この反応混合液は50℃
に２時間保ち、続いて、450mlの1N塩酸を加えた。混合
液を冷却した後、析出した結晶を濾別した。この生成物
を1N水酸化ナトリウム溶液に溶解し、同量の1N塩酸で再
沈澱させ、濾別した。白色結晶、m.p.172〜174℃（分
解）、〔α〕Ｄ＝＋9.9（ｃ＝1:0.1N NaOH）のＮ−〔５
−ベンジルオキシカルボニルアミノ−１−カルボキシペ
ンチル〕−イミノジ酢酸40gが得られた。
し、０℃に冷却した。これに、42gのＮε−Ｚ−Ｌ−リ
ジンを225mlの2N水酸化ナトリウムに溶解した溶液を攪
拌しながら０℃でゆっくり滴下した。２時間後冷却を止
め、この混合液を一夜攪拌した。この反応混合液は50℃
に２時間保ち、続いて、450mlの1N塩酸を加えた。混合
液を冷却した後、析出した結晶を濾別した。この生成物
を1N水酸化ナトリウム溶液に溶解し、同量の1N塩酸で再
沈澱させ、濾別した。白色結晶、m.p.172〜174℃（分
解）、〔α〕Ｄ＝＋9.9（ｃ＝1:0.1N NaOH）のＮ−〔５
−ベンジルオキシカルボニルアミノ−１−カルボキシペ
ンチル〕−イミノジ酢酸40gが得られた。
得られたリジン誘導体7.9gを49mlの1N水酸化ナトリウ
ムに溶解し、スパーテルの先一杯分の５％パラジウム／
炭素を添加後、室温、常圧下で水素添加させた。触媒を
濾別し、そして濾液を蒸発させた。かくして、6.2gのＮ
−〔５−アミノ−１−カルボキシペンチル〕−イミノジ
酢酸が得られた。その構造式 NH2−(CH2)4−CH（COOH）−Ｎ−(CH2COOH)2 をNMRスペクトルにより確認した。
ムに溶解し、スパーテルの先一杯分の５％パラジウム／
炭素を添加後、室温、常圧下で水素添加させた。触媒を
濾別し、そして濾液を蒸発させた。かくして、6.2gのＮ
−〔５−アミノ−１−カルボキシペンチル〕−イミノジ
酢酸が得られた。その構造式 NH2−(CH2)4−CH（COOH）−Ｎ−(CH2COOH)2 をNMRスペクトルにより確認した。
100mlのセファロース CL-6B（ファルマシア製）をガ
ラス吸引濾過器上で、約500mlの水で２回洗浄し、次い
で500ml丸フラスコ中16mlの4N水酸化ナトリウムと8.22m
lのエピブロムヒドリンと共に30℃で、４時間反応させ
た。反応混合液の全量は200mlであった。次いで、活性
化させたセファロースを濾別し、水で中性に洗浄して、
そして反応容器にもどした。6.5gのＮ−〔５−アミノ−
１−カルボキシペンチル〕−イミノジ酢酸を50mlの水に
溶解し、10.6gの固体炭酸ナトリウムと共に活性化させ
たセファロースに加えた。この混合物を60℃で一夜ゆっ
くりと攪拌した。得られた式 〔セファロース CL-6B〕−O-CH2‐CH（OH）‐CH2‐NH-
(CH2)4‐CH（COOH）−N(CH2COOH)2 （NTA樹脂）のキレート樹脂をクロマトグラフィーカラ
ム中で連続的に、500mlの水、100mlのNiSO4・6H2O（２
重量％）水溶液、200mlの水、200mlの0.2M酢酸（0.2M塩
化ナトリウムと0.1重量／容量％ツィーン20含有）及び2
00mlの水で洗浄した。得られた式 〔セファロース CL-6B〕−O-CH2‐CH（OH）‐CH2‐NH-
(CH2)4‐CH（COOH）−N(CH2COO-)2Ni2+ のキレート樹脂のニッケルイオン濃度は約7.1μM/mlに
なった。
ラス吸引濾過器上で、約500mlの水で２回洗浄し、次い
で500ml丸フラスコ中16mlの4N水酸化ナトリウムと8.22m
lのエピブロムヒドリンと共に30℃で、４時間反応させ
た。反応混合液の全量は200mlであった。次いで、活性
化させたセファロースを濾別し、水で中性に洗浄して、
そして反応容器にもどした。6.5gのＮ−〔５−アミノ−
１−カルボキシペンチル〕−イミノジ酢酸を50mlの水に
溶解し、10.6gの固体炭酸ナトリウムと共に活性化させ
たセファロースに加えた。この混合物を60℃で一夜ゆっ
くりと攪拌した。得られた式 〔セファロース CL-6B〕−O-CH2‐CH（OH）‐CH2‐NH-
(CH2)4‐CH（COOH）−N(CH2COOH)2 （NTA樹脂）のキレート樹脂をクロマトグラフィーカラ
ム中で連続的に、500mlの水、100mlのNiSO4・6H2O（２
重量％）水溶液、200mlの水、200mlの0.2M酢酸（0.2M塩
化ナトリウムと0.1重量／容量％ツィーン20含有）及び2
00mlの水で洗浄した。得られた式 〔セファロース CL-6B〕−O-CH2‐CH（OH）‐CH2‐NH-
(CH2)4‐CH（COOH）−N(CH2COO-)2Ni2+ のキレート樹脂のニッケルイオン濃度は約7.1μM/mlに
なった。
実施例２ 固定化したイミノジ酢酸（IMA）と固定化したニトリ
ロトリ酢酸（NTA）のニッケル錯体の安定性の定量的比
較のため、この２種のニッケルキレート樹脂をイミノジ
酢酸の水溶液で溶離し、ニッケルイオンの流失を追跡し
た。
ロトリ酢酸（NTA）のニッケル錯体の安定性の定量的比
較のため、この２種のニッケルキレート樹脂をイミノジ
酢酸の水溶液で溶離し、ニッケルイオンの流失を追跡し
た。
50mlの式 −O-CH2‐CH（CO）‐CH2‐N(CH2COOH)2 （調製方法：ヨッロッパ特許出願番号84101814.6,公開
番号118 808参照）のIMA樹脂をクロマトグラフィーカラ
ム（ｄ＝1.6cm）に入れ、水で十分に洗浄した。そし
て、10mlの0.012M NiSO4・5H2O水溶液を100ml/時間の流
速で導入し、続いて70mlの水で洗浄した。それを0.1Mイ
ミノジ酢酸水溶液、pH7.0で溶出した。10mlの分画を集
めた。ニッケルイオンは画分10〜19に検出（UV390nm）
された。
番号118 808参照）のIMA樹脂をクロマトグラフィーカラ
ム（ｄ＝1.6cm）に入れ、水で十分に洗浄した。そし
て、10mlの0.012M NiSO4・5H2O水溶液を100ml/時間の流
速で導入し、続いて70mlの水で洗浄した。それを0.1Mイ
ミノジ酢酸水溶液、pH7.0で溶出した。10mlの分画を集
めた。ニッケルイオンは画分10〜19に検出（UV390nm）
された。
同様の方法で、50mlの式 〔セファロース CL-6B〕−O-CH2‐CH（OH）‐CH2‐NH-
(CH2)4‐CH（COOH）−N(CH2COOH)2 のNTA樹脂をクロマトグラフィーカラム（ｄ＝1.6cm）に
入れ、洗浄して、その後、10mlの0.012M NiSO4・5H2O水
溶液を充填し、再び水洗し、そして0.1Mイミノジ酢酸水
溶液、pH7.0で溶出した。ニッケルイオンは画分30〜34
にのみ検出（UV390nm）され、このことから、ニッケル
イオンが既知IMA樹脂よりも新規なNTA樹脂中でより強く
結合していることは明らかである。
(CH2)4‐CH（COOH）−N(CH2COOH)2 のNTA樹脂をクロマトグラフィーカラム（ｄ＝1.6cm）に
入れ、洗浄して、その後、10mlの0.012M NiSO4・5H2O水
溶液を充填し、再び水洗し、そして0.1Mイミノジ酢酸水
溶液、pH7.0で溶出した。ニッケルイオンは画分30〜34
にのみ検出（UV390nm）され、このことから、ニッケル
イオンが既知IMA樹脂よりも新規なNTA樹脂中でより強く
結合していることは明らかである。
実施例３ 6.5gのブロム酢酸を8.1mlの4N水酸化ナトリウムに溶
解し、０℃に冷却した。それに、4.1gのＮγ−ベンジル
オキカルボニル−Ｌ−2,4−ジアミノ酪酸を24.4mlの2N
水酸化ナトリウム溶液に溶解した溶液を攪拌しながら滴
下した。２時間後、冷却を止め、混合物を一夜攪拌し
た。次に、この反応混合物を50℃２時間保持し、そして
12.2mlの4N塩酸を加えた。この混合物を冷却した後、分
離した結晶を濾別した。生成物は2N水酸化ナトリウム溶
液に溶解し、6.1mlの4N塩酸で再沈澱し、濾別した。白
色結晶、m.p.136〜138℃（分解）のＮ−〔３−ベンジル
オキシカルボニルアミノ−１−カルボキシプロピル〕−
イミノジ酢酸5gを得た。
解し、０℃に冷却した。それに、4.1gのＮγ−ベンジル
オキカルボニル−Ｌ−2,4−ジアミノ酪酸を24.4mlの2N
水酸化ナトリウム溶液に溶解した溶液を攪拌しながら滴
下した。２時間後、冷却を止め、混合物を一夜攪拌し
た。次に、この反応混合物を50℃２時間保持し、そして
12.2mlの4N塩酸を加えた。この混合物を冷却した後、分
離した結晶を濾別した。生成物は2N水酸化ナトリウム溶
液に溶解し、6.1mlの4N塩酸で再沈澱し、濾別した。白
色結晶、m.p.136〜138℃（分解）のＮ−〔３−ベンジル
オキシカルボニルアミノ−１−カルボキシプロピル〕−
イミノジ酢酸5gを得た。
得られた酪酸誘導体2.9gを16mlの1N水酸化ナトリウム
溶液に溶解し、スパーテルの先一杯分の５％パラジウム
／炭素を添加後、室温、常圧下で水素添加させた。触媒
を濾別し、濾液を蒸発させた。かくして、2.2gのＮ−
〔３−アミノ−１−カルボキシプロピル〕−イミノジ酪
酸が得られた。その構造 NH2−(CH2)2−CH（CCOH）−N(CH2COOH)2 をNMRスペクトルで確認した。
溶液に溶解し、スパーテルの先一杯分の５％パラジウム
／炭素を添加後、室温、常圧下で水素添加させた。触媒
を濾別し、濾液を蒸発させた。かくして、2.2gのＮ−
〔３−アミノ−１−カルボキシプロピル〕−イミノジ酪
酸が得られた。その構造 NH2−(CH2)2−CH（CCOH）−N(CH2COOH)2 をNMRスペクトルで確認した。
50mlの水で得られたＮ−〔３−アミノ−１−カルボキ
シプロピル〕−イミノジ酢酸1.9gを溶解した溶液2.6gの
固体炭酸ナトリウムで処理した。混合物を０℃に冷却
し、これにイミダゾールカルバメイト（ピアース社製の
リアクチーゲルTM）で活性化させたアガロース50mlを加
えた。０℃、15時間インキュベーション後、得られた、
式 アガロース−O-CO-NH-(CH2)2‐CH（COOH）−N(CH2COOH)
2 のキレート樹脂を濾別し、水洗して、実施例１で記載し
た如くNiIIイオンを導通した。得られた、式 アガロース−O-CO-NH-(CH2)2‐CH（COOH）−N(CH2COO-)
Ni2+ のキレート樹脂のニッケルイオン濃度は3.1μM/mlにな
った。
シプロピル〕−イミノジ酢酸1.9gを溶解した溶液2.6gの
固体炭酸ナトリウムで処理した。混合物を０℃に冷却
し、これにイミダゾールカルバメイト（ピアース社製の
リアクチーゲルTM）で活性化させたアガロース50mlを加
えた。０℃、15時間インキュベーション後、得られた、
式 アガロース−O-CO-NH-(CH2)2‐CH（COOH）−N(CH2COOH)
2 のキレート樹脂を濾別し、水洗して、実施例１で記載し
た如くNiIIイオンを導通した。得られた、式 アガロース−O-CO-NH-(CH2)2‐CH（COOH）−N(CH2COO-)
Ni2+ のキレート樹脂のニッケルイオン濃度は3.1μM/mlにな
った。
実施例４ カラム（直径＝1cm、長さ＝4.8cm）に式 〔セファロース CL-6B〕−O-CH2‐CH（OH）‐CH2‐NH-
(CH2)4‐CH（COOH）−N(CH2COOH)2 （NTA樹脂）の金属を含まないキレート樹脂を満たし、
カラム三倍容量の0.1M NiSO4・5H2Oで洗い、次いで、カ
ラム三倍容量の0.2M酢酸で洗浄することによりニッケル
型とした。次に0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）
と0.5M塩化ナトリウムの溶液で（それぞれの流速:13.2m
l/時間）で平衡化させた。
(CH2)4‐CH（COOH）−N(CH2COOH)2 （NTA樹脂）の金属を含まないキレート樹脂を満たし、
カラム三倍容量の0.1M NiSO4・5H2Oで洗い、次いで、カ
ラム三倍容量の0.2M酢酸で洗浄することによりニッケル
型とした。次に0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）
と0.5M塩化ナトリウムの溶液で（それぞれの流速:13.2m
l/時間）で平衡化させた。
1mgの式 His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Glu-Ala-Gly-Asp-Val のモデルペプチドを1mlの平衡緩衝液に溶解し、カラム
に付した。このモデルペプチドは0.2Mイミダゾール、0.
1Mリン酸ナトリウム、pH8.0と0.5M塩化ナトリウムの溶
液で溶離できた。溶離液の検出はムーレ．エス．及びス
テェイン．ダブリュ（Moore,S.and Stein.W.）〔J.Bio
l.Chem.176,367〜388（1948）〕に従いニンヒドリンで
行った。
に付した。このモデルペプチドは0.2Mイミダゾール、0.
1Mリン酸ナトリウム、pH8.0と0.5M塩化ナトリウムの溶
液で溶離できた。溶離液の検出はムーレ．エス．及びス
テェイン．ダブリュ（Moore,S.and Stein.W.）〔J.Bio
l.Chem.176,367〜388（1948）〕に従いニンヒドリンで
行った。
実施例５ 実施例４と同様の方法で、カラム（直径＝1cm,長さ4.
8cm）にNTA樹脂を満たし、ニッケル型とした。0.2M酢酸
で洗浄後、このカラムを7Mグアニジン塩酸、0.1Mリン酸
ナトリウム緩衝液の溶液（pH8.0）で平衡化させた。
8cm）にNTA樹脂を満たし、ニッケル型とした。0.2M酢酸
で洗浄後、このカラムを7Mグアニジン塩酸、0.1Mリン酸
ナトリウム緩衝液の溶液（pH8.0）で平衡化させた。
種々の量（12.7mgまで）の式 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-Hi
s-Ser のモデルペプチドを1mlの7Mグアニジン塩酸、0.1リン酸
ナトリウム（pH8.0）の溶液に溶解し、このカラムに付
した。このペプチドは7Mグアニジン塩酸に易溶である
が、0.1Mリン酸ナトリウムと0.5M塩化ナトリウムには難
溶である。溶出は段階的にpHを下げることによって行っ
た。ペプチドはλ＝280nmのUVスペクトロメトリーによ
り検出された。
s-Ser のモデルペプチドを1mlの7Mグアニジン塩酸、0.1リン酸
ナトリウム（pH8.0）の溶液に溶解し、このカラムに付
した。このペプチドは7Mグアニジン塩酸に易溶である
が、0.1Mリン酸ナトリウムと0.5M塩化ナトリウムには難
溶である。溶出は段階的にpHを下げることによって行っ
た。ペプチドはλ＝280nmのUVスペクトロメトリーによ
り検出された。
牛膵臓由来トリプシンと馬心臓由来チトクロームＣを
比較物質として使用した。２種の蛋白質ともNTA樹脂にp
H8で結合しない。明らかにヒスチジンの配列が決定的な
役割をはたしている。トリプシンの場合、３個のヒスチ
ジンは29,46及び79位に位置しているが、それは7Mグア
ニジンで構造をこわしても安定な錯体を形成する位置で
はない。チトクロームＣの場合では、２個のヒスチジン
が空間的に近接（18と26位）しているが、１個のヒスチ
ジンがヘム−鉄（haem-iron）に結合しているので、そ
れは２配位子を形成する位置ではない。
比較物質として使用した。２種の蛋白質ともNTA樹脂にp
H8で結合しない。明らかにヒスチジンの配列が決定的な
役割をはたしている。トリプシンの場合、３個のヒスチ
ジンは29,46及び79位に位置しているが、それは7Mグア
ニジンで構造をこわしても安定な錯体を形成する位置で
はない。チトクロームＣの場合では、２個のヒスチジン
が空間的に近接（18と26位）しているが、１個のヒスチ
ジンがヘム−鉄（haem-iron）に結合しているので、そ
れは２配位子を形成する位置ではない。
実施例６ 乳酸脱水素酵素イソ酵素は分子量140,000の４量体蛋
白質である。豚由来のこのイソ酵素はアミノ末端領域を
除いてほとんど相同である。これは、この蛋白質表面上
に位置している。心臓型イソ酵素はこの領域にヒスチジ
ンを持たないが、筋肉型は３個持ち、その中にはHis-Va
l-Pro-Hisの配列がある〔エル．リー（L.Li）ら、J.Bio
l.Chem.258,7029〜7032（1983）〕。
白質である。豚由来のこのイソ酵素はアミノ末端領域を
除いてほとんど相同である。これは、この蛋白質表面上
に位置している。心臓型イソ酵素はこの領域にヒスチジ
ンを持たないが、筋肉型は３個持ち、その中にはHis-Va
l-Pro-Hisの配列がある〔エル．リー（L.Li）ら、J.Bio
l.Chem.258,7029〜7032（1983）〕。
実施例４に記載した如く、カラム（直径＝1cm,長さ4.
8cm）にNTA樹脂を満たし、ニッケル型とし、そして0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）と0.5M塩化ナトリウ
ム溶液で平衡化させた。2mgの豚心臓（H4‐LOH）又は豚
筋肉（M4‐LOH）由来の乳酸脱水素酵素を1.5mlの平衡緩
衝液に溶解し、上記カラムに付した。H4‐LOHはその28
個のヒスチジン残基にもかかわらず吸着しないが、M4‐
LOHはpH7.5で吸着し、pH6に下げることで溶離させた。
8cm）にNTA樹脂を満たし、ニッケル型とし、そして0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）と0.5M塩化ナトリウ
ム溶液で平衡化させた。2mgの豚心臓（H4‐LOH）又は豚
筋肉（M4‐LOH）由来の乳酸脱水素酵素を1.5mlの平衡緩
衝液に溶解し、上記カラムに付した。H4‐LOHはその28
個のヒスチジン残基にもかかわらず吸着しないが、M4‐
LOHはpH7.5で吸着し、pH6に下げることで溶離させた。
本実験はNTA樹脂が構造要素として蛋白質表面上に隣
接するヒスチジン残基を持つ蛋白質にきわめて選択的で
あることを示している。
接するヒスチジン残基を持つ蛋白質にきわめて選択的で
あることを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｚ Ｎ Ｒ // Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｆ
Claims (14)
- 【請求項１】式 キャリアーマトリックス−スペーサー−NH−(CH2)x−CH
（COOH）−N(CH2COO-)2Ni2+ （Ｉ） （式中、ｘは、2,3又は４を示す） で表される金属キレート樹脂。 - 【請求項２】キャリアーマトリックスがアガロースであ
る特許請求の範囲第１項に記載の金属キレート樹脂。 - 【請求項３】キャリアーマトリックスが、架橋アガロー
スを約６％含む、直径45〜165μｍのビーズ状ゲルであ
る特許請求の範囲第１項に記載の金属キレート樹脂。 - 【請求項４】スペーサーが−O-CO−又は−O-CH2‐CH（O
H）‐CH2−である特許請求の範囲第１項〜第３項のいず
れかに記載の金属キレート樹脂。 - 【請求項５】式 H2N−(CH2)x−CH（COOH）−N(CH2COOH)2 （式中、ｘは2,3又は４を示す） で表される化合物又はその塩を、スペーサー基を付して
機能化したキャリアーマトリックスと反応させ、次い
で、ニッケル塩溶液で洗浄して式 キャリアーマトリックス−スペーサー−NH−(CH2)x−CH
（COOH）−N(CH2COO-)2Ni2+ （Ｉ） （式中、ｘは、2,3又は４を示す） で表される金属キレート樹脂を製造する方法。 - 【請求項６】式（Ｉ）中のキャリアーマトリックスがア
ガロースである特許請求の範囲第５項に記載の方法。 - 【請求項７】式（Ｉ）中のキャリアーマトリックスが、
架橋アガロースを約６％含む、直径45〜165μｍのビー
ズ状ゲルである特許請求の範囲第５項に記載の方法。 - 【請求項８】スペーサーが−O-CO−又は−O-CH2‐CH（O
H）‐CH2−である特許請求の範囲第５項〜第７項のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項９】機能化したキャリアーマトリックスが、 を含むオキシラン−アガロースである特許請求の範囲第
５項に記載の方法。 - 【請求項１０】機能化したキャリアーマトリックスが、 を含むイミダゾールカルバメイト−アガロースである特
許請求の範囲第５項に記載の方法。 - 【請求項１１】蛋白質を式 キャリアーマトリックス−スペーサー−NH−(CH2)x−CH
（COOH）−N(CH2COO-)2Ni2+ （Ｉ） （式中、ｘは、2,3又は４を示す） で表される金属キレート樹脂上でアフィニティークロマ
トグラフィーに付することを特徴とする数個の近接する
ヒスチジン残基を含む蛋白質の精製方法。 - 【請求項１２】キャリアーマトリックスがアガロースで
ある特許請求の範囲第11項に記載の方法。 - 【請求項１３】キャリアーマトリックスが、架橋アガロ
ースを約６％含む、直径45〜165μｍのビーズ状ゲルで
ある特許請求の範囲第11項に記載の方法。 - 【請求項１４】スペーサーが−O-CO−又は−O-CH2‐CH
（OH）‐CH2−である特許請求の範囲第11項〜第13項の
いずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH278286 | 1986-07-10 | ||
| CH20782/86-3 | 1986-07-10 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7157981A Division JP2562571B2 (ja) | 1986-07-10 | 1995-06-23 | 新規ニトリロトリ酢酸誘導体及びその塩、並びにそれらの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6344947A JPS6344947A (ja) | 1988-02-25 |
| JPH0822382B2 true JPH0822382B2 (ja) | 1996-03-06 |
Family
ID=4241469
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62169950A Expired - Lifetime JPH0822382B2 (ja) | 1986-07-10 | 1987-07-09 | 金属キレ−ト樹脂 |
| JP7157981A Expired - Lifetime JP2562571B2 (ja) | 1986-07-10 | 1995-06-23 | 新規ニトリロトリ酢酸誘導体及びその塩、並びにそれらの製造方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7157981A Expired - Lifetime JP2562571B2 (ja) | 1986-07-10 | 1995-06-23 | 新規ニトリロトリ酢酸誘導体及びその塩、並びにそれらの製造方法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4877830A (ja) |
| EP (1) | EP0253303B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0822382B2 (ja) |
| AT (1) | ATE76866T1 (ja) |
| AU (1) | AU596674B2 (ja) |
| CA (1) | CA1304886C (ja) |
| DE (1) | DE3779501D1 (ja) |
| DK (2) | DK172602B1 (ja) |
| IE (1) | IE60468B1 (ja) |
| IL (1) | IL83079A (ja) |
| NZ (1) | NZ220948A (ja) |
| PH (1) | PH23746A (ja) |
| ZA (1) | ZA874860B (ja) |
Families Citing this family (75)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1304886C (en) * | 1986-07-10 | 1992-07-07 | Heinz Dobeli | Metal chelate resins |
| US5057302A (en) * | 1987-02-13 | 1991-10-15 | Abbott Laboratories | Bifunctional chelating agents |
| CA1340522C (en) * | 1987-03-10 | 1999-05-04 | Heinz Dobeli | Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification |
| US5225534A (en) * | 1987-09-08 | 1993-07-06 | Hoffmann-La Roche Inc. | Recombinant malarial polypeptides |
| EP0309746A1 (de) * | 1987-09-08 | 1989-04-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antimalaria-Vakzine |
| US4952321A (en) * | 1988-10-07 | 1990-08-28 | Brigham Young University | Process of removing and concentrating desired ions from solutions |
| US5169936A (en) * | 1989-04-14 | 1992-12-08 | Biogen, Inc. | Protein purification on immobilized metal affinity resins effected by elution using a weak ligand |
| DE59010560D1 (de) * | 1989-08-19 | 1996-12-12 | Qiagen Gmbh | Verfahren und vorrichtung zur trennung und detektion von komponenten eines stoffgemisches durch temperaturgradienten-gelelektrophorese |
| US5266686A (en) * | 1992-09-25 | 1993-11-30 | Pierce Chemical Company | Method for isolation and purification of enzyme-antibody conjugates |
| CA2125467C (en) * | 1993-07-06 | 2001-02-06 | Heinz Dobeli | Process for producing hydrophobic polypeptides, proteins or peptides |
| SE9303822D0 (sv) * | 1993-11-18 | 1993-11-18 | Kabi Pharmacia Ab | Method for purification |
| DE4433980C2 (de) * | 1994-09-23 | 1996-08-22 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren und Biosensorhit zur Untersuchung der Wechselwirkung von Biomolekülen mittels Oberflächen-Plasma-Resonanz |
| US6472148B1 (en) | 1994-09-26 | 2002-10-29 | President And Fellows Of Harvard College | Molecular recognition at surfaces derivatized with self-assembled monolayers |
| US5620850A (en) * | 1994-09-26 | 1997-04-15 | President And Fellows Of Harvard College | Molecular recognition at surfaces derivatized with self-assembled monolayers |
| TW442492B (en) * | 1995-07-26 | 2001-06-23 | Novartis Ag | Process for the enrichment of interferon |
| DE19531173A1 (de) * | 1995-08-24 | 1997-02-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum Stabilisieren des Gehalts glykierten Proteins einer Probe auf einem Matrixmaterial |
| DE69730551T2 (de) | 1996-04-15 | 2005-09-01 | Givaudan S.A. | Hydroxyperoxide Lyasen |
| US5858724A (en) * | 1996-07-16 | 1999-01-12 | Pel-Freez | Recombinant rabbit tissue factor |
| US5962641A (en) * | 1996-08-16 | 1999-10-05 | Clontech Laboratories, Inc. | Method for purification of recombinant proteins |
| US7014992B1 (en) | 1996-11-05 | 2006-03-21 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Conductive oligomers attached to electrodes and nucleoside analogs |
| DE19645729C1 (de) * | 1996-11-06 | 1998-06-04 | Brahms Diagnostica Gmbh | Rezeptorbindungsassay, für den Rezeptorbindungsassay geeigneter rekombinanter Fusionsrezeptor, Vektor zu dessen Herstellung sowie Reagenziensatz für die Durchführung des Rezeptorbindungsassays |
| NZ501832A (en) * | 1997-06-24 | 2002-12-20 | Proteus Molecular Design | Angiotensin-peptide carrier conjugates for treating diseases associated with the renin-angiotensin system |
| US6068993A (en) * | 1997-07-02 | 2000-05-30 | Biobras Sa | Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin |
| US7087148B1 (en) | 1998-06-23 | 2006-08-08 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Binding acceleration techniques for the detection of analytes |
| CA2277372C (en) | 1998-07-13 | 2011-03-15 | Tran Quang Minh | Affinity immobilised metal resins |
| ES2248936T3 (es) | 1999-03-04 | 2006-03-16 | F. KURT RETSCH GMBH & CO. KG | Procedimiento y dispositivo para descomponer material biologico. |
| US6479300B1 (en) | 1999-03-15 | 2002-11-12 | Millipore Corporation | Metal loaded ligand bound membranes for metal ion affinity chromatography |
| US7312087B2 (en) * | 2000-01-11 | 2007-12-25 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Devices and methods for biochip multiplexing |
| US20020177135A1 (en) * | 1999-07-27 | 2002-11-28 | Doung Hau H. | Devices and methods for biochip multiplexing |
| JP2001029783A (ja) * | 1999-07-13 | 2001-02-06 | Tran Quang Minh | 親和性固定化金属樹脂 |
| EP1069131B1 (en) * | 1999-07-15 | 2006-03-15 | Qiagen GmbH | Methods for separating particulate substrates from solution while minimizing particle loss |
| US6379708B1 (en) * | 1999-11-20 | 2002-04-30 | Cytologic, Llc | Method for enhancing immune responses in mammals |
| US6623655B1 (en) † | 2000-04-24 | 2003-09-23 | Sigma-Aldrich Co. | Metal chelating compositions |
| GB0028879D0 (en) * | 2000-11-27 | 2001-01-10 | Prometic Biosciences Ltd | Adsorbents and their use |
| WO2003050540A2 (en) * | 2001-12-05 | 2003-06-19 | Large Scale Biology Corporation | Flexible method and apparatus for high throughput production and purification of multiple proteins |
| US7122640B2 (en) * | 2002-06-10 | 2006-10-17 | Phynexus, Inc. | Open channel solid phase extraction systems and methods |
| US20040224329A1 (en) * | 2003-05-08 | 2004-11-11 | Gjerde Douglas T. | Three-dimensional solid phase extraction surfaces |
| JP2005529335A (ja) * | 2002-06-10 | 2005-09-29 | フィネクサス， インク． | 開放チャンネルを使って生体分子を固体相として抽出するシステムと方法 |
| US7879621B2 (en) * | 2003-05-08 | 2011-02-01 | Phynexus, Inc. | Open channel solid phase extraction systems and methods |
| US7151167B2 (en) * | 2002-06-10 | 2006-12-19 | Phynexus, Inc. | Open channel solid phase extraction systems and methods |
| US8029803B2 (en) | 2002-06-20 | 2011-10-04 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
| US8025873B2 (en) | 2002-06-20 | 2011-09-27 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
| US7354750B2 (en) * | 2002-10-18 | 2008-04-08 | Promega Corporation | Methods for separating molecules |
| US7799526B2 (en) * | 2002-11-21 | 2010-09-21 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Phosphoprotein detection reagent and methods of making and using the same |
| SE526214C2 (sv) * | 2003-02-28 | 2005-07-26 | Amersham Biosciences Ab | Ett sätt att generera metallkelaterande affinitetsligander |
| SE0301011D0 (sv) * | 2003-04-04 | 2003-04-04 | Amersham Biosciences Ab | Preparation of a metal chelating separation medium |
| US20040241721A1 (en) * | 2003-05-08 | 2004-12-02 | Gjerde Douglas T. | Open channel solid phase extraction systems and methods |
| ES2287728T3 (es) * | 2003-05-23 | 2007-12-16 | Aplagen Gmbh | Complejos de quelatos metalicos inmovilizados sobre soportes solidos para la preparacion de peptidos. |
| US8007805B2 (en) * | 2003-08-08 | 2011-08-30 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens |
| US20050123932A1 (en) * | 2003-12-09 | 2005-06-09 | Mekbib Astatke | Nucleic acid-chelating agent conjugates |
| US7276362B2 (en) * | 2004-01-30 | 2007-10-02 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Recombinant histidine-tagged inosine monophosphate dehydrogenase polypeptides |
| DE102004038134B4 (de) | 2004-08-05 | 2013-07-25 | Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main | Multivalente Chelatoren zum Modifizieren und Organisieren von Zielmolekülen, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung |
| JP2008520616A (ja) * | 2004-11-24 | 2008-06-19 | アプラーゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 固相ペプチド合成および精製方法 |
| EP1848529A1 (en) * | 2005-02-14 | 2007-10-31 | GE Healthcare Bio-Sciences AB | Liquid chromatography method |
| US7229769B2 (en) * | 2005-03-25 | 2007-06-12 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for detecting protease activity |
| US20070196833A1 (en) * | 2005-04-21 | 2007-08-23 | Gjerde Douglas T | Open channel solid phase extraction systems and methods |
| EA200800109A1 (ru) * | 2005-06-23 | 2008-06-30 | Аплаген Гмбх | Суправалентные соединения |
| US20070065514A1 (en) * | 2005-09-22 | 2007-03-22 | Howell Mark D | Method for enhancing immune responses in mammals |
| WO2007041861A1 (en) * | 2005-10-13 | 2007-04-19 | Virexx Medical Corp. | Chimeric antigen containing hepatitis c virus polypeptide and fc fragment for eliciting an immune response |
| US20070254378A1 (en) * | 2006-03-06 | 2007-11-01 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Chelating monomers and polymers |
| GB0610479D0 (en) * | 2006-05-26 | 2006-07-05 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | A method for generating metal chelating affinity ligands |
| US8999157B2 (en) * | 2007-07-09 | 2015-04-07 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method for preparation of a biomolecule adsorbent |
| US20090162845A1 (en) | 2007-12-20 | 2009-06-25 | Elazar Rabbani | Affinity tag nucleic acid and protein compositions, and processes for using same |
| KR20160110544A (ko) * | 2008-06-04 | 2016-09-21 | 그리폴스 테라퓨틱스 인코포레이티드 | 플라스민의 제조를 위한 조성물, 방법 및 키트 |
| EP2192410B1 (en) | 2008-11-26 | 2012-07-11 | Corning Incorporated | Nanoparticulate affininty capture for label independent detections system |
| PT2403865E (pt) | 2009-03-03 | 2015-11-18 | Grifols Therapeutics Inc | Métodos de preparação de plasminogénio |
| CN102686606A (zh) * | 2009-10-09 | 2012-09-19 | 阿纳福公司 | 结合il-23r的多肽 |
| EP2362220A1 (en) | 2010-02-25 | 2011-08-31 | Corning Incorporated | Affinity hydrogel and label independent detection methods thereof |
| HU230585B1 (hu) | 2012-05-30 | 2017-01-30 | Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem | Fehérjék megkötésére és elválasztására alkalmas lantanida fémionokkal komplexált hordozók |
| JP2014113108A (ja) * | 2012-12-11 | 2014-06-26 | Tokyo Medical Univ | タンパク質の可溶化活性を有する多量体タンパク質およびその用途 |
| EP3887033A1 (en) | 2018-11-28 | 2021-10-06 | Cube Biotech GmbH | Solid-phase chelator material, method for producing thereof and use thereof for the purification of proteins |
| CN109535274B (zh) * | 2018-11-30 | 2021-02-19 | 淮阴工学院 | 一种蒲菜多糖脱蛋白脱色的方法 |
| WO2022167246A1 (en) | 2021-02-02 | 2022-08-11 | Cube Biotech Gmbh | Soluble chelator for targeting recombinant proteins |
| CN113150194A (zh) * | 2021-02-24 | 2021-07-23 | 广东昊邦医药健康有限责任公司 | 金属螯合树脂及其制备方法、应用 |
| CN117339580B (zh) * | 2023-12-05 | 2024-04-02 | 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 | 螯合载体、其制备方法及应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU426693B2 (en) * | 1968-07-18 | 1972-07-31 | Mobil Oil Corporation | Fuel additive |
| US4530963A (en) * | 1982-08-20 | 1985-07-23 | Devoe-Holbein International, N.V. | Insoluble chelating compositions |
| CA1304886C (en) * | 1986-07-10 | 1992-07-07 | Heinz Dobeli | Metal chelate resins |
-
1987
- 1987-06-02 CA CA000538559A patent/CA1304886C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-03 DK DK198702851A patent/DK172602B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-07-03 IL IL83079A patent/IL83079A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-07-03 ZA ZA874860A patent/ZA874860B/xx unknown
- 1987-07-03 NZ NZ220948A patent/NZ220948A/xx unknown
- 1987-07-06 AU AU75245/87A patent/AU596674B2/en not_active Expired
- 1987-07-07 PH PH35505A patent/PH23746A/en unknown
- 1987-07-08 EP EP87109892A patent/EP0253303B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-08 AT AT87109892T patent/ATE76866T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-07-08 DE DE8787109892T patent/DE3779501D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-09 IE IE184287A patent/IE60468B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-07-09 JP JP62169950A patent/JPH0822382B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-13 US US07/072,452 patent/US4877830A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-23 JP JP7157981A patent/JP2562571B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-12-19 DK DK199701493A patent/DK172891B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4877830A (en) | 1989-10-31 |
| DK149397A (da) | 1997-12-19 |
| PH23746A (en) | 1989-11-03 |
| CA1304886C (en) | 1992-07-07 |
| EP0253303A3 (en) | 1989-05-24 |
| AU7524587A (en) | 1988-01-14 |
| JPS6344947A (ja) | 1988-02-25 |
| DK172602B1 (da) | 1999-02-22 |
| DK285187D0 (da) | 1987-06-03 |
| EP0253303A2 (de) | 1988-01-20 |
| EP0253303B1 (de) | 1992-06-03 |
| DK172891B1 (da) | 1999-09-13 |
| ZA874860B (en) | 1988-01-11 |
| IE60468B1 (en) | 1994-07-13 |
| AU596674B2 (en) | 1990-05-10 |
| IE871842L (en) | 1988-01-10 |
| DE3779501D1 (de) | 1992-07-09 |
| IL83079A (en) | 1991-11-21 |
| NZ220948A (en) | 1990-07-26 |
| JPH0899944A (ja) | 1996-04-16 |
| JP2562571B2 (ja) | 1996-12-11 |
| IL83079A0 (en) | 1987-12-31 |
| DK285187A (da) | 1988-01-11 |
| ATE76866T1 (de) | 1992-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0822382B2 (ja) | 金属キレ−ト樹脂 | |
| US5047513A (en) | Metal chelate resins | |
| JP3946772B2 (ja) | 組み換えタンパク質の精製法 | |
| Hochuli et al. | New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues | |
| AU2002340787B2 (en) | Peptide purification by means of metal ion affinity chromatography | |
| Lilius et al. | Metal affinity precipitation of proteins carrying genetically attached polyhistidine affinity tails | |
| JPH04506030A (ja) | 化学生成物 | |
| CN113164915A (zh) | 固相螯合剂材料，其制备方法及其用于纯化蛋白质的用途 | |
| JPS6356501A (ja) | アフイニテイークロマトグラフイー用カラム充填剤及びその製造方法 | |
| SE406913B (sv) | Forfarande for rening eller lagning av ett enzym genom kontakt med affinitelsmatrismaterial | |
| Schmidt et al. | A Zn (II)-binding site engineered into retinol-binding protein exhibits metal-ion specificity and allows highly efficient affinity purification with a newly designed metal ligand | |
| US20080293925A1 (en) | Affinity Adsorbents for Plasminogen | |
| US3847745A (en) | Preparation of water-insoluble biologically active materials | |
| Plapp | Mechanisms of carboxymethylation of bovine pancreatic nucleases by haloacetates and tosylglycolate | |
| Wuenschell et al. | Chiral copper—chelate complexes alter selectivities in metal affinity protein partitioning | |
| CA1328537C (en) | Metal chelate resins | |
| JPS61236726A (ja) | 組織プラスミノーゲン・アクチベータの精製方法 | |
| JPH0260316B2 (ja) | ||
| JPS585191A (ja) | カリクレインの精製法 | |
| JPS58176547A (ja) | イムノアフイニテイ−クロマトグラフイ−用担体 | |
| JPS5837832B2 (ja) | 酵素吸着体及び酵素の精製方法 | |
| JP2001029783A (ja) | 親和性固定化金属樹脂 | |
| CN102453076A (zh) | 一种金属螯合介质辅助peg修饰蛋白质药物的方法 | |
| JPS63145297A (ja) | タンパク質の精製方法 | |
| JPS5824176B2 (ja) | 酵素吸着体及び酵素の精製方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080306 Year of fee payment: 12 |