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Die
vorliegende Erfindung betrifft Hydroperoxidlyasen (im Folgenden
auch als HPO-Lyaseproteine oder
Proteine mit HPO-Lyaseaktivität
bezeichnet), deren mikrobielle Herstellung über rekombinante DNS- oder
DNA-Technologie und deren Verwendung für die Herstellung von aliphatischen
Aldehyden und Alkoholen, Aroma- oder Geschmacksmolekülen, die
bekannt sind „als
Grünnoten".
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„Grünnoten" sind flüchtige Aroma-
und Duft- oder Geschmacksmoleküle,
die in einer großen
Vielzahl oder Verschiedenheit von Pflanzenblättern, Gemüsen und Früchten vorliegen, gekennzeichnet
durch organoleptische Begriffe oder Ausdrücke, wie frisches „Grün" und grasig. Diese
Verbindungen werden hergestellt durch die Pflanze bei dem Abbau
von ungesättigten
Fettsäuren
(Linol- und Linolensäure).
In 1 ist die Bildung einer Vielzahl von Abbauprodukten
von Linolensäure
zusammengefasst.
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Der
Abbau von mehrfach ungesättigten
Fettsäuren
beginnt mit der Oxidierung an cis-cis-Doppelbindungen von mehrfach
ungesättigten
Fettsäuren.
Diese Reaktion wird katalysiert durch Lipoxygenase (EC 1.13.11.12)-Enzymen,
die in Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen vorliegen. Die oxidierten
Produkte, Fettsäurehydroperoxide,
sind Vorläufer
für viele
wichtige Hormone (z. B. Prostaglandine, Lipoxine, Jasmonsäure, Traumatinsäure) und
Aroma/Duftmoleküle
(z. B. cis-3-Hexenol, 1-Octen-3-ol). Bei Pflanzen findet die Spaltung der
Hydroperoxide durch die Wirkung von speziellen Hydroperoxidlyasen
statt.
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Die
kommerzielle Herstellung von Verbindungen mit natürlicher „Grünnote" wird bislang erreicht
durch fraktionierte Destillation von essentiellen Ölen, wie
z. B. Minzöl,
oder durch die kombinierte Wirkung von Lipoxygenase und Hydroperoxidlyase
auf ungesättigte
Fettsäuren
unter Verwendung von Pflanzenmaterial aus verschiedenen Quellen
oder Ursprüngen.
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Die
WO 95 26 413 A offenbart ein Verfahren zur Bereitstellung von Verbindungen
mit Grünnote
unter Verwendung von Pflanzengewebe. Andere Dokumente beschreiben
den Grad der Expression von Lipoxygenase und Hydroperoxidlyase in
verschiedenen Sonnenblumenorganen oder -teilen [Vick, Plant Lipid
Metabolism, 280–282
(1995)] und bei Tomatenfrüchten
[Hatanaka et al., Biosciences 47, 369 bis 374 (1992)].
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Diese
Verfahren weisen jedoch die Nachteile auf, dass sie geringe Ausbeuten
bereitstellen und/oder abhängig
sind von speziellen Pflanzenmaterialien.
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Es
wurde nun gefunden, dass hoch reproduzierbare Ausbeuten von Verbindungen
mit „Grünnote" (z. B. cis-3-Hexenol)
erhalten werden können
unabhängig
vom Pflanzenmaterial und in Abwesenheit von unerwünschten
Nebenreaktionen (z. B. Isomeraseaktivität) durch die Übertragung
des Gens, das für
HPO-Lyase codiert von einer Pflanze in Wirtzellen, einer nachfolgenden
Expression des Gens, einer Zugabe von Linolensäurehydroperoxid als Substrat
und Reduktion des gespaltenen Substrats durch Aldehyddehydrogenase.
In 2 ist die Bildung von cis-3-Hexenol aus 13-(S)-Hydroperoxylinolensäure durch
rekombinante HPO-Lyase zusammengefasst.
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Daher
werden unter einem ersten Gesichtspunkt dieser Erfindung isolierte
DNS- oder DNA-Sequenzen
bereitgestellt, die Proteine codieren mit HPO-Lyaseaktivität, wobei
die DNS-Sequenzen dieser Erfindung so definiert sind, dass sie die
Nucleotidsequenz SEQ ID No: 1 oder ein Bruchstück davon oder irgendeine DNS-Sequenz
einschließen,
die im Wesentlichen zu der Nucleotidsequenz SEQ ID No: 1 oder einem
Bruchstück
davon homolog ist.
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Wie
zuvor verwendet, bedeutet der Begriff „im Wesentlichen homolog", dass eine bestimmte
in Rede stehende Sequenz, z. B. eine Mutantensequenz, verschieden
ist von einer Referenz- oder Vergleichssequenz durch eine oder mehrere
Substitutionen, Deletionen oder Additionen, von denen der Netzeffekt
nicht zu einer nachteiligen funktionellen Unähnlichkeit oder Dissimilation
zwischen den Referenz- und in Rede stehenden Sequenzen führt. Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung werden DNS-Sequenzen, die eine Homologie von mehr
als 95% aufweisen, die äquivalente
biologische Eigenschaften codieren und äquivalente Expressionseigenschaften
zeigen, als im Wesentlichen homolog betrachtet. Für die Zwecke
der Bestimmung der Homologie sollte eine Verkürzung der DNS-Sequenz nicht
berücksichtigt
werden. Sequenzen, die einen niedrigeren Grad an Homologie aufweisen,
die vergleichbare Bioaktivität
codieren und die äquivalente
Expressionscharakteristiken zeigen, z. B. Bruchstücke der
Nucleotidsequenz SEQ ID No: 1, werden als wesentliche Äquivalente
betrachtet. In der Regel können
homologe DNS-Sequenzen
identifiziert werden durch Kreuzhybridisierung unter Standardhybridisierungsbedingungen
von moderater oder gemäßigter Basenabfolge
oder Sequenz oder Strangbildung.
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Es
werden auch Vektoren und Expressionsvektoren bereitgestellt, die
die DNS-Sequenzen der vorliegenden Erfindung enthalten, Wirte, die
solche Vektoren für
die Herstellung von Proteinen mit HPO-Lyaseaktivität enthalten, und Verfahren
für die
Herstellung von solchen DNS-Sequenzen, rekombinanten Vektoren und Wirtzellen.
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Es
werden ferner rekombinante Proteine mit HPO-Lyaseaktivität bereitgestellt.
Speziell ein Protein mit HPO-Lyaseaktivität wird so definiert, dass es
die Aminosäuresequenz
SEQ ID No: 2 einschließt
oder irgendein Protein oder Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz
aufweist, die im Wesentlichen homolog ist zu der Aminosäuresequenz
SEQ ID No: 2 und ferner die folgende biologische Aktivität aufweist:
Wenn das Protein oder Polypeptid inkubiert wird unter geeigneten
Bedingungen und eine geeignete Menge an Substrat, wie z. B. 13-(S)-Linolensäurehydroperoxid,
zugegeben wird, wird die Bildung von cis-3-Hexenal beobachtet.
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Wie
zuvor verwendet, bedeutet der Begriff "im Wesentlichen homolog", dass eine besondere
in Rede stehende Sequenz, z. B. eine Mutantensequenz, verschieden
ist von einer Referenz- oder Vergleichssequenz durch eine oder mehrere
Substitutionen, Deletionen oder Additionen, wobei der Netzeffekt
davon keine nachteilige funktionelle Unähnlichkeit oder Dissimilation
zwischen den Referenz- und in Rede stehendenr Sequenzen zur Folge
hat. Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Sequenzen, die eine
Homologie von mehr als 95%, äquivalente
biologische Eigenschaften und äquivalente
Expressionseigenschaften aufweisen, als im Wesentlichen homolog
betrachtet. Für
die Zwecke der Bestimmung der Homologie sollte die Verkürzung oder
ein Abschneiden der Sequenz nicht berücksichtigt werden. Sequenzen,
die einen geringeren Grad an Homologie aufweisen, vergleichbare
Bioaktivität
und äquivalente
Expressionseigenschaften, z. B. Bruchstücke der Aminosäuresequenz
SEQ ID No: 2, werden als wesentliche Äquivalente bezeichnet.
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Wie
in dieser Beschreibung verwendet, schließt der Begriff rekombinante
Proteine mit HPO-Lyaseaktivität Proteine
ein, die geringfügig
modifiziert sind, wie z. B. durch Addition von speziellen Sequenzen,
die vorzugsweise an Affinitätsträgermaterial
binden. Beispiele solcher Sequenzen sind Sequenzen, die mindestens zwei
benachbarte Histitinreste enthalten (vgl. in diesem Hinblick das
europäische
Patent mit der Nr. 282 042). Solche Sequenzen binden selektiv an
Nitrilotriessigsäurenickelchelatharze
(Hochuli und Döbeli,
Biol. Chem. Hoope-Seyler 368, 748 (1987); Europäisches Patent mit der Nr. 253
303). Proteine mit HPO-Lyaseaktivität, die eine solche spezielle
Sequenz enthalten, können
daher selektiv separiert oder abgetrennt werden aus den verbleibenden
Polypeptiden. Die spezielle Sequenz kann verbunden sein entweder
an den C-Terminus oder das C-terminate Ende oder den N-Terminus
oder das N-terminale Ende der Proteine mit HPO-Lyaseaktivität.
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Verfahren
zur Expression, Isolierung und Reinigung der Proteine mit HPO-Lyaseaktivität werden
ebenso bereitgestellt.
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Die
folgenden Schritte verdeutlichen die Verfahren der rekombinanten
Expression der Proteine mit HPO-Lyaseaktivität.
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1) Klonen von DNS-Sequenzen,
die Proteine mit HPO-Lyaseaktivität codieren
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DNS-Sequenzen,
die Proteine mit HPO-Lyaseaktivität codieren, können geklont
werden unter Verwendung einer Vielzahl oder Verschiedenheit von
Techniken. Unter Verwendung der Verfahren, die in dieser Beschreibung
beschrieben sind, können
cDNSn oder cDNAs hergestellt werden, die Proteine mit HPO-Lyaseaktivität codieren
oder Fragmente davon. Diese cDNSn können isoliert und verstärkt werden
durch die PCR-Technik unter Verwendung von Oligodesoxynucleotid
DNS- oder DNA-Primer nach herkömmlichen
Techniken.
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Die
cDNS (SEQ ID No: 1), die die Aminosäuresequenz SEQ ID No: 2 codiert,
wird erhalten unter Verwendung der DNS-Primer, die in den Beispielen
beschrieben sind. Unter Verwendung herkömmlicher Technik wurde diese
cDNS isoliert aus einer Lambda-Phagen-cDNS-Bibliothek aus RNS abgeleitetet
von Bananen(Musa sp.)-blättern.
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Die
cDNS kann nicht nur aus cDNS-Bibliotheken erhalten werden, sondern
auch durch andere herkömmliche
Techniken, z. B. durch Klonen genomischer DNS oder Fragmenten davon,
in gereinigter Form aus den gewünschten
Zellen. Diese Verfahren sind beschrieben von Sambrook et al. in
DNA Cloning: A Practical Approach", Band I und II, D. N. Glover, Hrsg.,
1985, MRL Press, Ltd., Oxford, GB; Benton und Davis, Science 196,
180 bis 182 (1977); und Grunstein und Hogness, Proc. Nat. Acad.
Sci. 72, 3961 bis 3965 (1975).
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Um
die cDNS zu erhalten, die die Proteine mit HPO-Lyaseaktivität codiert,
werden cDNS-Bibliotheken getestet
oder gescreent nach herkömmlichen
DNS-Hybridisierungstechniken nach den Verfahren von Benton und Davis,
s. o., oder Grunstein und Hogness, s. o., unter Verwendung von radioaktiven
HPO-Lyasegenfragmenten. Klone, die zu den radioaktiven Genfragmenten
hybridisieren, werden analysiert, z. B. durch Restriktionsendonukleasenspaltung
oder Agarosegelelektrophorese. Nach einer Isolierung mehrerer positiver
Klone wird der positive Einschub oder Einbau oder Insert eines Klons
unterklont oder subkloniert, z. B. in Phagmiden, und sequenziert
nach herkömmlichen
Techniken.
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Aus
genomischer DNS abgeleitete Klone können Regulations- und Intron-DNS-Bereiche
aufwei sen zusätzlich
zu den codierenden Bereichen; von cDNS abgeleitete Klone werden
keine Intronsequenzen enthalten. Bei dem molekularen Klonen des
Gens aus genomischer DNS werden DNS-Fragmente oder -Bruchstücke erzeugt,
von denen einige das gewünschte
Gen codieren. Die DNS kann an speziellen Stellen gespalten werden
unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme. Bei einer anderen
Ausführungsform
kann man DNAse in Gegenwart von Mangan verwenden, um die DNS in
Bruchstücke
zu überführen, oder
die DNS kann physikalisch Scherkräften unterworfen werden, z.
B. durch Beschallung. Die linearen DNS-Fragmente können dann
nach Größe getrennt
werden durch Standardverfahren einschließlich, aber nicht beschränkt auf,
Agarose- und Polyacrylamidgelelektrophorese und Säulenchromatographie.
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Unabhängig von
der Quelle oder dem Ursprung, kann die DNS-Sequenz, die Proteine
mit HPO-Lyaseaktivität codiert,
molekular geklont werden in einem geeigneten Vektor zur Propagation
oder Fortpflanzung oder Vervielfältigung
der DNS durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren. Irgendein
kommerziell erhältlicher
oder verfügbarer
Vektor kann verwendet werden. Z. B. kann die DNS in einen pBluescript
SK-Vektor insertiert oder eingebaut werden. Geeignete Vektoren zur
Verwendung mit bakteriellen Wirten sind beschrieben von Pouwels
et al. in „Cloning
Vectors: A Laboratory Manual",
1985, Elsevier, N. Y. Als ein anschauliches oder repräsentatives,
aber nicht beschränkendes,
Beispiel können
brauchbare oder geeignete Klonierungsvektoren zur bakteriellen Verwendung
einen auswählbaren
Marker umfassen und einen bakteriellen Ursprung der Replikation,
abgeleitet aus kommerziell verfügbaren
oder erhältlichen
Plasmiden, die umgekehrt abgeleitet sind aus dem gut bekannten Klonierungsvektor
pBR322 (ATCC 37017). Solche kommerziellen Vektoren schließen z. B.
pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1
(Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein.
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Die
DNS-Sequenzen, die Proteine mit HPO-Aktivität codieren, die in diese kommerziell
erhältlichen Vektoren
insertiert oder eingebaut sind, können bestimmt oder herausgefunden
werden nach Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, z.
B. durch Standardnukleotidsequenzierungstechniken.
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DNS-Sequenzen,
die Proteine mit HPO-Aktivität
aus Pflanzen, die von der Banane verschieden sind, können hierbei
verwendet werden. Demzufolge kann irgendeine Pflanzenzelle wirkungsvoll
verwendet werden als Nukleinsäurequelle
oder -ursprung des Proteins mit HPO-Aktivität, während spezielle DNS geklont
wurde und in Bezug auf die DNS-Sequenz in Bananenblättern sequenziert
wurde.
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2) Herstellung von Proteinen
mit HPO-Lyaseaktivität
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Geklonte
DNS-Sequenzen, die für
Proteine mit HPO-Lyaseaktivität
codieren, können
in Wirten exprimiert oder hergestellt werden, um die Herstellung
dieser Proteine mit größerer Effizienz
oder Wirksamkeit auszustatten. Techniken für diese genetischen Manipulationen
sind spezifisch für
die verschiedenen zur Verfügung
stehenden Wirte, und sie sind im Stand der Technik bekannt.
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Zur
Expression von Proteinen mit HPO-Lyaseaktivität in Wirten sind im Allgemeinen
alle Vekto ren, die DNS-Sequenzen, die die Proteine mit HPO-Lyaseaktivität in dem
ausgewählten
Wirt codieren, replizieren und exprimieren, geeignet. Expressionsvektoren,
die geeignet sind zur Verwendung in prokaryotischen Wirtzellen sind
genannt z. B. in dem Lehrbuch „Molecular
Cloning – A
Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory (1982) von Maniatis et al. Beispiele
von anderen Vektoren sind Plasmide der pDS-Familie [Bujard et al.,
Methods in Enzymology, Hrsg. Wu und Grossmann, Academic Press, Inc.,
Band 155, 416 bis 433 (1987)).
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Solche
prokaryotischen Expressionsvektoren, die die DNS-Sequenzen enthalten,
die für
die verschiedenen Proteine mit HPO-Lyaseaktivität codieren, die wirksam oder
funktionsfähig
gebunden sind mit einer Expressionskontrollsequenz, können unter
Verwendung von herkömmlichen
Verfahren jeder geeigneten prokaryotischen Wirtszelle einverleibt
werden. Die Auswahl einer geeigneten prokaryotischen Wirtszelle
wird bestimmt durch verschiedene Faktoren, die alle im Stand der
Technik gut bekannt sind. Daher spielen z. B. die Kompatibilität oder gegenseitige
Verträglichkeit
mit dem gewählten
Vektor, die Toxizität
des Expressionsprodukts, die Expressionseigenschaften, notwendige
biologische Sicherheitsvorkehrungen und Kosten eine Rolle, und ein
Kompromiss zwischen allen diesen Faktoren muss gefunden werden.
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Geeignete
prokaryotische Wirtsorganismen schließen gramnegative und grampositive
Bakterien, z. B. E. coli und B. subtilis Stämme ein. Beispiele von prokaryotischen
Wirtsorganismen sind E. coli Stamm M15 (beschrieben als Stamm OZ
291 von Villarejo et al. in J. Bacteriol. 120, 466 bis 474 [1974]
und E. coli W3110 (ATCC Nr. 27325]). Zusätzlich zu den zuvor genannten
E. coli Stämmen
können
jedoch auch andere im Allgemeinen zugängliche E. coli Stämme, wie
z. B. E. coli 294 (ATCC Nr. 31446) und E. coli RR1 (ATCC Nr. 31343) ebenfalls
verwendet werden.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird Hefe als Wirtsorganismus verwendet. Expressionsvektoren,
die geeignet sind zur Verwendung in Hefezellen sind beschrieben
in „Guide
to yeast genetics and molecular biology", Guthrie und Fink, Hrsg., Methods in
Enzymology, Academic Press, Inc., Band 194 (1991), und „Gene expression
technology", Goeddel,
Hrsg., Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., Band 185 (1991).
Der bevorzugte Hefevektor der vorliegenden Erfindung ist das Plasmid
pYX233 (R&D Systems,
Abingdon, GB). Beispiele von geeigneten Hefezellen sind Saccharomyces
cerevisiae-, Pichia pastoris-, Hansenula polymorpha- und Schizosaccharomyces
pombe-Zellen. Ein Überblick über verschiedene
Hefenexpressionssysteme wird angegeben von Romanos et al., Yeast,
Band 8, 423 bis 488 (1992). Besonders bevorzugte Hefezellen der
vorliegenden Erfindung sind S. cerevisiae DBY746 [ATCC 44773].
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Die
Transformation mit diesen Expressionsvektoren wird durchgeführt wie
beschrieben von Klebe et al., Gene, Band 25, 333 bis 341 (1983).
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Die
Art und Weise, auf die die Expression der Proteine mit HPO-Lyaseaktivität durchgeführt wird, hängt ab von
dem gewählten
Expressionsvektor-Wirtszellen-System.
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In
der Regel werden die prokaryotischen Wirtszellen, die einen gewünschten
Expressionsvektor enthalten, unter Bedingungen gezüchtet, die
optimal für
das Wachstum der prokaryotischen Wirtszellen sind. Am Ende des exponentiellen
Wachstums, wenn die Zunahme in der Anzahl der Zellen pro Zeiteinheit
abnimmt, wird die Expression des gewünschten Proteins mit HPO-Lyaseaktivität induziert,
d. h. die DNS, die für
das gewünschte
Protein mit HPO-Lyaseaktivität
codiert, wird transkribiert oder umgeschrieben, und die transkribierte mRNA
wird übersetzt
oder umgesetzt. Die Induktion kann ausgeführt werden durch Zugabe eines
Induktors oder eines Derepressors zu dem Wachstumsmedium oder durch
Veränderung
eines physikalischen Parameters, z. B. einer Veränderung in der Temperatur.
Z. B. kann die Expression gesteuert oder kontrolliert werden durch
den lac-Repressor.
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Durch
Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
(IPTG) wird die Blockierung der Expressionskontrollsequenz aufgehoben,
und die Synthese des gewünschten
Proteins wird dadurch induziert oder herbeigeführt.
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Die
Hefewirtszellen, die einen gewünschten
Expressionsvektor enthalten, werden unter Bedingungen gezüchtet, die
optimal sind für
das Wachstum der Hefewirtszellen. Ein typischer Expressionsvektor
enthält
das Promotorelement, das die Transkription von mRNA vermittelt,
die Proteincodierungssequenz, eine ribosomale Bindungsstelle zur
wirksamen Translation oder Übersetzung
der genetischen Information. Zusätzliche
Elemente können
Terminator-, Signal- und stromaufwärts aktivierende Sequenzen
einschließen.
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Die
Hefezellen werden gezüchtet,
wie beschrieben von Sherman in „Guide to yeast genetics and
molecular biology",
Guthrie und Fink, Hrsg., Methods in Enzymology, Academic Press,
Inc., Band 194, 3 bis 21 (1991).
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Das
Baculovirus-Insektenzellensystem kann auch verwendet werden für die Herstellung
von Proteinen mit HPO-Lyaseaktivität der vorliegenden Erfindung
(zum Überblick
s. Luclow und Summers, Bio Technology 6, 47 bis 55 [1988]). Die
Proteine mit HPO-Lyaseaktivität,
die hergestellt werden in Insektenzellen, die infiziert sind mit
rekombinantem Baculovirus, können
einer post-translationalen Verarbeitung unterliegen einschließlich einer
N-Glycosylierung (Smith et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 82, 8404
bis 8408) und O-Glycosylierung (Thomsen et al., 12. International
Herpesvirus Workshop, University of Philadephia, PA, USA).
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Pflanzen
können
auch als Wirte verwendet werden für die rekombinante Herstellung
von Proteinen mit HPO-Lyaseaktivität. Die Übertragung oder der Transfer
des Gens, das für
das Protein mit HPO-Lyaseaktivität codiert,
kann nach einer Vielzahl von Verfahren erhalten werden (zum Überblick
siehe Potrykus und Spangenberg, Hrsg., Gene transfer to plants;
A laboratory manual, Springer Verlag, Heidelberg, Deutschland (1995)), wobei
das HPO-Lyasegen integriert ist in das Chromosom der Wirtspflanze.
Homologe Expression – Überexpression – des Proteins
mit HPO-Lyaseaktivität
kann erhalten werden z. B. durch Transformierung einer Bananenpflanze
(Musa sp.) mit dem HPO-Lyasegen, das isoliert ist aus einer Bananen-Genbibliothek.
Ein Transformationsprotokoll von Bananenpflanzen kann gefunden werden
in Bio Technology 13 (5), 486 bis 492 (1995), oder Bio Technology
13 (5), 481 bis 485 (1995). Andere Beispiele für Pflanzenwirte für die Herstellung
von rekombinantem HPO-Lyaseprotein schließen Mais (Zea mays, Ishida
et al., Nature Biotechnology 14, 745 bis 750 (1996)), Flachs (Linum
usitatissimum, Dong und Mchughen, Plant Sci. 88 (1), 61 bis 71 (1993))
und Sojabohne (Glycine max, Christou et al., Tibtech 8, 145 bis
151 (1990)) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
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Für die Isolierung
kleiner Mengen an Proteinen mit HPO-Lyaseaktivität, die exprimiert oder synthetisiert
oder ausgeprägt
werden in Hefewirtszellen für
analytische Zwecke, z. B. für
die Polyacrylamidgelelektrophorese, können die Wirtzellen aufgebrochen
oder zerstört
werden durch Behandlung mit einem Detergens oder oberflächenaktiven
Stoff, z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS). Größere Mengen des HPO-Lyaseproteins können erhalten
werden durch mechanische [Charm et al., Meth. Enzymol. 22, 476 bis
556 (1971)], enzymatische (Lysozym-Behandlung) oder chemische (Detergentien-Behandlung,
Harnstoff- oder
Guanidinium-Hydrochlorid-Behandlung, etc.), Behandlungen, gefolgt
von der Verwendung von bekannten Verfahren, z. B. durch Zentrifugation
bei verschiedenen Gravitationen, Präzipitation oder Kristallisation
mit Ammoniumsulfat, Dialyse (bei Normaldruck oder bei verringertem
Druck), präparative
isoelektrische Fokusierung, präparative Gelelektrophorese
oder nach verschiedenen chromatographischen Methoden, wie z. B.
Gel-Filtration, Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC), Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie und
Affinitätschromatographie
(z. B. an Sepharose® Blue CL-6B).
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Für die Isolierung
kleiner Mengen an Proteinen mit HPO-Lyaseaktivität, die exprimiert oder synthetisiert
oder ausgeprägt
werden in Hefewirtszellen für
analytische Zwecke, z. B. für
die Polyacrylamidgelelektrophorese, können die Wirtzellen aufgebrochen
oder zerstört
werden durch die Verwendung von Glaskügelchen, wie es beschrieben
ist von Orlean et al. in „Guide
to yeast genetics and molecular biology", Guthrie und Fink, Hrsg., Methods in
Enzymology, Academic Press, Inc., Band 194, 682 bis 697 (1991).
Größere Mengen
des Proteins mit HPO-Lyaseaktivität können erhalten werden durch
ein Hindurchschicken oder Hineingeben von rekombinanten Hefezellen
durch oder in eine Dyno-Mill-Apparatur, die gefüllt ist mit Glaskügelchen
gemäß den Anleitungen
des Herstellers (Willy Bachofen, Maschinenfabrik AG, Basel, Schweiz).
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Die
Proteine mit HPO-Lyaseaktivität,
die exprimiert werden oder synthetisiert werden in dem Baculovirus-Insektenzellen-Vektorsystem
können
aus dem Wirtszellenmedium isoliert werden unter Verwendung von Standard-Proteinreinigungsverfahren.
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Die
Proteine mit HPO-Lyaseaktivität
können
verwendet werden bei der Herstellung von Verbindungen mit natürlicher „Grünnote" durch Katalyse der
Bildung von Aldehyden aus Fettsäurehydroperoxiden.
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Daher
stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren bereit zur Herstellung
von Verbindungen mit natürlicher „Grünnote", wobei das Verfahren
umfasst die Schritte von:
- a) Umsetzen eines
Fettsäurehydroperoxids
mit rekombinanten Proteinen mit HPO-Lyaseaktivität; und
- b) Umsetzen des erhaltenen aliphatischen Aldehyds mit Isomerase
und/oder Alkoholdehydrogenase.
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Der
Begriff Verbindungen mit „Grünnote" betrifft aliphatische
Aldehyde aus Blättern
und aliphatische Alkohole aus Blättern,
z. B. cis-3-Hexenol und trans-2-Hexenal. Beispiele von Fettsäurehydroperoxiden
sind in 1 angegeben.
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Bei
dem Verfahren zur Herstellung von Verbindungen mit natürlicher „Grünnote" können die
Proteine mit HPO-Lyaseaktivität
in isolierter Form verwendet werden, oder bei einer weiteren Ausführungsform
in Form von zellfreien Extrakten, die erhalten werden aus Wirtszellen,
die Vektoren für
die Herstellung von Protein mit HPO-Lyaseaktivität enthalten.
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Bei
einer bevorzugten speziellen Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung wird das Verfahren zur Herstellung von Verbindungen mit
natürlicher „Grünnote" eingesetzt, um cis-3-Hexenol
zu synthetisieren oder herzustellen. Dieses spezielle Verfahren
zur Herstellung von cis-3-Hexenol umfasst die Schritte von:
- a) Umsetzen von 13-(S)-Hydroperoxidlinolensäure mit
rekombinanten Proteinen mit HPO-Lyaseaktivität; und
- b) Reduzieren des erhaltenen cis-3-Hexanals mit Alkoholdehydrogenase.
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Bei
der Ausführung
des speziellen Verfahrens zur Herstellung von cis-3-Hexenol werden
vorzugsweise die Proteine mit HPO-Lyaseaktivität erhalten aus Saccharomyces
cerevisiae-Zellen, die Vektoren enthalten für die Herstellung von den Proteinen,
und die Reduktion von cis-3-Hexenal zu cis-3-Hexenol wird katalysiert durch endogene
Aldehyddehydrogenase. Die 2 fasst
schematisch dieses spezielle Verfahren zusammen.
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Die
Verbindungen mit Grünnote,
z. B. cis-3-Hexenol, hergestellt nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung
kann verwendet werden als Duft- und/oder Geschmacks- oder Aromamittel
und verarbeitet werden in eine Geruchs- und/oder Aromazusammensetzung
auf eine an sich bekannte Art und Weise.
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Nachdem
diese Erfindung nun allgemein beschrieben ist, wird dieselbe besser
verstanden durch Bezugnahme auf die speziellen Beispiele, die hierin
eingeschlossen sind nur zum Zweck der Veranschaulichung und die
nicht so verstanden werden sollen, dass sie beschränkend wirken,
sofern es nicht anders angegeben ist in Verbindung mit den folgenden
Figuren:
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1 fasst
schematisch den Abbau von Linolensäure durch den Lipoxygenaseabbauweg
oder -pfad in Pflanzen zusammen.
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2 fasst
schematisch die Bildung von cis-3-Hexenol aus 13-(S)-Hydroperoxylinolensäure durch
rekombinantes HPO-Lyaseprotein und Alkoholdehydrogenase zusammen.
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Linolensäure-(13S)-hydroperoxid
wurde hergestellt, wie beschrieben von lacazio et al. (J. Org. Chem. 55,
1690 bis 1691 [1990]) unter Verwendung von Lipoxygenase-1 von Fluka
(62340; Fluka, Buchs, Schweiz). Linolensäure (62159; Fluka, Buchs, Schweiz)
wurde als Vorläufer
verwendet. Typischerweise wurde eine 60 bis 70 mM wässerige
Lösung
von Linolensäurehydroperoxid
erhalten unter diesen Bedingungen. Dieser Vorläufer kann über mehrere Monate in 0,5 ml
aliquoten Anteilen bei –80°C gelagert
werden.
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Die
Enzymaktivität
von Bananen HPO-Lyaseprotein wurde wie folgt gemessen:
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Das
Reaktionsvolumen betrug 500 μl,
das 20 mM Natriumphosphatpuffer enthielt mit einem pH von 6,8, 0,8
mM Linolensäurehydroperoxid
und 50 μl
Bananen HPO-Lyaseprotein in wässerigem
Puffer. Die Reaktion oder Umsetzung wurde 10 min lang bei Raumtemperatur
inkubiert und nachfolgend gestoppt durch die Zugabe von 200 μl Methyl-t-butylether,
der einen internen Standard, wie z. B. cis-3-Hexenol, enthielt. Die Aktivität der Lyase
wurde bestimmt als Funktion der Menge an cis-3-Hexenal, das hergestellt
wurde während
dieser Standardreaktion. Cis-3-Hexenal wurde quantifiziert durch
Kapillargaschromatographie, wie beschrieben von Olias et al., J.
Agric. Food Chem, Band 41, 2368 bis 2373 (1993).
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Beispiel 1
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Reinigung von Bananen
HPO-Lyaseprotein
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Etwa
5 kg Bananengewebe (Musa sp.; gekauft von einem örtlichen Geschäft) wurde
verwendet für
die Isolierung des HPO-Lyaseproteins. Die Arbeitsschritte wurden
bei 4°C
durchgeführt.
Aliquote Anteile von 560 g Bananengewebe wurden homogenisiert in
1,1 l eiskaltem Puffer A (50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, 2
mM Dithiothreitol, 7 mM EDTA, 0,25 mM PMSF) und 36 g von PVP K30
von Fluka unter Verwendung eines Warring-Mischers. Das Homogenat
wurde zentrifugiert bei 10.000 × g über einen
Zeitraum von 20 min, und der Überstand
(Rohextrakt) wurde durch 3 Schichten von Miracloth (Calbiochem)
filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde bei 100.000 × g 50 min
lang zentrifugiert, und das Pellet oder kompakte Agglomerat wurde
homogenisiert und solubilisiert in 150 ml Puffer B (20 mM Tris,
pH 7,0, 0,1% Triton X114) und nachfolgend geklärt durch Zentrifugation bei
100.000 × g über einen
Zeitraum von 30 min. Die solubilisierte HPO-Lyaseproteinfraktion
wurde aufgetragen auf eine Säule
von DEAE-CL6B (2,6 cm i. d. × 20
cm; Pharmacia), die mit Puffer A äquilibriert war. Ein HPO-Lyaseprotein
wurde eluiert mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M Ammoniumacetat
in Puffer B bei 2 ml/min. Die Fraktionen wurden gesammelt und getestet
oder gescreent nach ihrer Aktivität von HPO-Lyase. Aktive Fraktionen
wurden zusammengefügt
und konzentriert durch Ultrafiltration mit einer Amicon Ultrafiltrationseinheit,
die eine PM30-Membran (Amicon) enthielt. Das Konzentrat, etwa 8
ml, wurden in 2 ml aliquote Anteile pro Chromatographielauf angewendet
oder aufgetragen auf eine Gelfiltrationssäule (Superose 6, 23 mm i. d. × 50 cm,
befestigt an einen FPLC-Apparat, Pharmacia). Die Flussrate betrug
1,5 ml/min an Puffer B, und Fraktionen wurden gesammelt und getestet
nach ihrer Aktivität
gegenüber
HPO-Lyase. Aktive Fraktionen wurden zusammengefügt und aufgebracht auf eine
Anionenaustauschchromatographie (Poros 20 HQ, 4,6 mm i. d. × 100 mm,
Perceptive Biosystems). Die Chromatographie wurde durchgeführt auf
einer Bio-CAD-Sprint-Workstation
(Perceptive Biosystems) mit einer Flussgeschwindigkeit von 5 ml/min.
Die HPO-Lyase wurde
eluiert mit einem linearen Gradienten eines Puffers C (20 mM Tris,
pH, 7,0, 0,2% Triton X100 reduziert) bis zu einem Puffer C, der
0,5 M Ammoniumacetat enthielt. Fraktionen wurden gesammelt und getestet
nach HPO-Lyaseaktivität.
Aktive Fraktionen wurden zusammengefügt, der pH wurde auf etwa 7,5 durch
Verdünnung
mit Puffer D (20 mM Tris, pH 8,0, 0,2% Triton X100 reduziert) eingestellt
und nochmals angewendet auf die Poros-Anionenaustauschsäule, die
equilibriert war mit Puffer D. Die HPO-Lyaseaktivität wurde
eluiert mit einem Gradienten an 0 bis 0,4 M Ammoniumacetat in Puffer
D. Es wurden Fraktionen gesammelt, nach HPO-Lyaseaktivität getestet
und aliquote Anteile von jeder Fraktion wurden analysiert durch
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE). Die SDS-PAGE wurde
durchgeführt,
wie beschrieben von Ausubel et al., Hrsg., „Current Portocols in Molecular
Biology", (1995),
herausgegeben von Current Protocols, USA, unter Verwendung eines
Minigelapparats (Hoeffer SE280). Das Gel wurde gefärbt unter
Verwendung eines Silberfärb-Plus-Kits
(silver stain Plus kit) (Bio-Rad) gemäß den Anleitungen des Herstellers.
Die HPO-Lyase wurde detektiert oder bestimmt als Proteinbande von
etwa 55 kDA Größe. Die
spezielle Aktivität
betrug 6.000 μmol cis-3-Hexenal
hergestellt/h/mg des Proteins. Die Proteinaktivität wurde
auf mehr als das 9.000-fache gereinigt.
-
Fraktionen,
die die maximale Aktivität
enthielten von allen Wiederholungsreinigungsläufen wurden zusammengegeben
und konzentriert durch Kristallisation oder Präzipitation. Dafür wurden
die zusammengegebenen Fraktionen gemischt mit 2 Volumen an Ethanol
und gekühlt
auf –20°C über einen
Zeitraum von 5 h. Die Mischung wurde bei 20.000 × g 30 min lang zentrifugiert,
und das erhaltene Pellet oder das kompakte Agglomerat wurde mit
70% Ethanol gewaschen und über
einen Zeitraum von 15 min luftgetrocknet. Das Pellet wurde in 160 μl Tricinprobenpuffer
(Novex, San Diego, USA) resuspendiert, und die Probe wurde einer
SDS-Tricin-PAGE (10 bis 20%) (Novex, San Diego, USA) unterworfen.
Die Proteinbanden wurden auf eine PVDF-Membran (Immobilon PSQ, Millipore)
mit einem Transferpuffer (10 mM 3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure, 10%
Methanol, pH 11,0) 60 min lang bei 400 mA in einer Trans-Blot-Zelle
(BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA) geblottet und angefärbt mit
Ponceau S (0,1% Ponceau S in 10% Essigsäure). Die angefärbten Banden
wurden aus dem Gel geschnitten und in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend
1% reduziertes Triton X-100 (RTX), 10% Acetonitril und 1 μg Lys-C über Nacht
bei 37°C
verdaut. Die Proben wurden auf eine Vydac C8 (250 × 1 mm)
Umkehrphasensäule
geladen oder aufgetragen. Eine Sequenzanalyse der eluierten Peptide
wurde durchgeführt
auf einem ABI Procise Protein Sequencer.
-
Aminosäuresequenzen
wurden erhalten aus 4 einzelnen Peptiden, wie unten gezeigt:
PEP1:
WLALQLLPTVK
PEP2: SIIGADPSVSPDVGENGFVMLD
PEP3: NILIGDYMPSLSFTGDTRVVVYLDP
PEP4:
(D)GLDRF(N)FQGPETFFRSRMAT(H)
(Aminosäurereste in Klammern sind nur
versuchsweise oder vorläufig
zugeordnet)
-
Beispiel 2
-
Klonen
oder Klonierung von DNS, die HPO-Lyaseprotein codiert
-
A. Isolierung von RNS
aus Bananenblättern
-
Bananenblätter (Musa
sp.), die eine hohe Hydroperoxidlyaseaktivität enthielten, wurden eingefroren
in flüssigem
Stickstoff, und das Gewebe wurde pulverisiert unter Verwendung von
Reibschale und Pistill. Die gesamte RNS oder RNA wurde isoliert
aus dem Blattpulver unter Verwendung des RNeasy Total RNA Purification Systems
von Qiagen gemäß der Anleitung,
die mit dem Reinigungssystem von dem Hersteller geliefert wird. Poly
A+mRNS wurde erhalten aus der gesamten RNS
unter Verwendung eines Oligotex mRNA Kits, gekauft von Qiagen (Qiagen
AG, 4052 Basel, Schweiz).
-
B. Erzeugung einer HPO-Lyasesonde
-
Eine
Anzahl von degenerierten PCR-Primern wurde entworfen oder hergestellt,
basierend auf den Aminosäuresequenzen,
die erhalten wurden aus den HPO-Lyasepeptiden. Verschiedene Primerpaare
wurden verwendet zur Vervielfältigung
oder Amplifizierung eines Teils des Bananen-HPO-Lyasegens. Ein spezielles Amplifikationsprodukt
wurde erhalten unter Verwendung des folgenden Sense- und Antisense-Primerpaars:
(mehrere
Nucleotide an einer einzelnen Position zeigen die Degeneration,
gleiche Mengen von jedem Nucleotid wurden in dieser Position eingebaut,
I gibt Inosin an)
-
Eine
cDNA-Synthese des ersten Strangs wurde ausgeführt an etwa 100 ng der gesamten
RNS unter Verwendung von SuperScript RNase H- Reverse Transkriptase
(Gibco BRL). PCR mit AmpliTaq (Perkin-Elmer) an der cDNS wurde durchgeführt für 40 Umläufe (Erwärmen am
Anfang 94°C,
3 min, Annealing oder Tempern 50°C,
1 min, Extension 72°C,
1,5 min, Denaturierung 94° 0,5
min; GeneAmp PCR System 2000, Perkin-Elmer). Das schätzungsweise
oder etwa 200 bp oder Basenpaare PCR-Produkt wurde isoliert aus
einem Agarosegel und kloniert in den pCR-Script SD(+) Vektor (Stratagene).
Die DNS-Sequenz
des Genfragments wurde bestimmt (kommerzieller Service: Microsynth
GmbH, Balgach, Schweiz). Die Aminosäuresequenz, die durch das Genfragment
codiert wird, ist wie folgt:
-
-
Dieses
Genfragment wurde verwendet, um eine radioaktive Probe zu erzeugen.
Dafür wurden
50 ng eines gelgereinigten Fragments markiert unter Verwendung des
BioPrime DNA Labeling Systems (Gibco BRL), im Wesentlichen so wie
es vom Hersteller beschrieben ist. Anstelle biotinylierte Nucleotide
zu verwenden, wurde [α32P]
dCTP (50 μCi,
6.000 Ci/mmol; Amersham) verwendet. Nicht einverleibte Nucleotide
wurden entfernt unter Verwendung des QIAquick Spin PCR Purification
Kits (Qiagen).
-
C. Aufbau einer Bananenblatt
cDNS-Bibliothek
-
3
bis 5 μg
einer Bananenpflanzen-mRNS wurden verwendet, um cDNS herzustellen,
die dann legiert wurde in einen λZAP
ExpressTM-Vektor unter Verwendung des ZAP
ExpressTM cDNA Gigapack II Gold Cloning Kits
(Stratagene GmbH, Heidelberg, Deutschland). Die erhaltenen Phagen
wurden dann vervielfältigt
oder amplifiziert vor einem ersten oder anfänglichen Testen oder Screening
der Genbank.
-
D. Screening oder Testen
der Bananenblatt cDNS-Bibliothek
-
Etwa
6 × 105 Plaques wurden gescreent oder getestet
unter Verwendung des radioaktiven HPO-Lyase-Genfragments (siehe oben). Hybridisierung
wurde erreicht unter Verwendung der Quickhybe-Lösung
von Stratagene und 100 μg/ml
Lachssperma DNS über
einen Zeitraum von 3 h bei 68°C.
2 Runden des Screenings oder Testens wurden durchgeführt. Insgesamt
18 positive Klone wurden erhalten. Der Lambda-Vektor, der die positiven
Einschübe
oder Inserts, enthielt, wurde überführt in Phagemiden
unter Verwendung von ExAssist Helper Phages, wie beschrieben (ZAP-cDNA® II
Gold Cloning Kit, Stratagene), und Plasmid-DNS wurde isoliert aus
allen Klonen unter Verwendung des Plasmid Midi Kit (Qiagen) gemäß der Beschreibung
der Hersteller.
-
E. Eine DNS Sequenzbestimmung
des HPO-Lyasegens aus Banane
-
Die
DNS-Sequenz des Phagemidseinschubs wurde bestimmt bei einem kommerziellen
Sequenzierungscenter (MediGene GmbH, Martinsried, Deutschland) und
wird als SEQ ID No: 1 angegeben.
-
Beispiel 3
-
Expression des HPO-Lyaseproteins
in Hefe
-
A. Subklonierung der cDNS
in den Hefeexpressionsvektor pYX233
-
Der
cDNS-Einschub des Phagemids, erhalten wie oben beschrieben, wurde
subkloniert in den Hefeexpressionsvektor pYX233 (R&D Systems, Abingdon,
UK). Zu diesem Zweck wurden Oligonucleotide mit einem Teil der der
C- bzw. der N-terminalen Sequenz der cDNS entsprach und der zweite
Teil, der eine geeignete Restriktionsstellenerkennungssequenz beinhaltetet,
verwendet. Die zwei folgenden Oligonucleotide wurden synthetisiert
(Microsynth GmbH, Balgach, Schweiz):
Sense: 5' CATGCCATGGCTATGATGTGGTCG
3'
Antisense:
5' GAGAAGCTTGAGCTCTAGCCTCCTGCAACGTC
3'
-
Unter
Verwendung dieser 2 Primer wurde eine PCR-Reaktion durchgeführt an 10
ng Phagemid unter Verwendung von AmpliTAQ (Perkin-Elmer) über 25 Cyclen
mit Bedingungen, wie sie in Beispiel 2 angegeben sind. Das 1,6 kb
PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und SacI (New
England Biolabs Inc.) verdaut. Das doppelt verdaute PCR-Produkt
wurde dann gereinigt und isoliert aus Agarosegelen unter Verwendung
des QiaEx Kit (Qiagen). Parallel dazu wurde der Hefeexpressionsvektor
pYX233 linearisiert durch Verdauung mit NcoI und SacI. Der offene
Vektor und das gereinigte PCR-Produkt
wurden legiert in einer 1 : 1 molaren Menge gemäß dem Standardprotokoll, wie
es angegeben wird von Sambrook et al., wie oben angegeben. Das Plasmid,
das nun die cDNS enthielt, wurde transformiert in E. coli DH5α (GibcoBRL),
aus dem die Plasmid-DNS isoliert wurde unter Verwendung von Qiagen
Plasmid Midi Kit (Qiagen, Deutschland).
-
B. Transformation eines
Hefestamms
-
5 μg des Plsamids
wurden transformiert in S. cerevisiae DBY746 (ATCC 44773), wie beschrieben
von Klebe et al., siehe oben. Die transformierten Hefezellen wurden
auf geeignete selektive Medien gelegt (SD Medium ergänzt mit
den Aminosäuren
Histidin, Leucin, Uracil; siehe Sherman in „Guide to yeast genetics and
molecular biology",
Guthrie und Fink, Hrsg., Methods in Enzymology, Academic Press,
Inc., Band 194, 3 bis 21 (1991), zur Beschreibung des Mediums) und
4 Tage lang bei 30°C
gezüchtet
oder wachsen gelassen. Diese Zellen waren die Quelle oder der Vorrat
für das
heterologe Lyaseprotein. Kolonien, die auf den selektiven Agarmedien
wuchsen, ließ man
wachsen auf oder in flüssi gem
SD-Medium, das ergänzt
war mit den obigen Aminosäuren.
Induktion der Expression des Gens, das das Lyaseprotein codiert,
wurde erreicht durch Zugabe von 2% (Endkonzentration) an Galactose
zu dem Wachstumsmedium, wenn Kulturdichten erreicht wurden mit einer
Absorption von 0,4, gemessen bei 600 nm. Das Induktionsprotokoll
wurde im Wesentlichen durchgeführt wie
beschrieben von Mylin et al. in "Gene
expression technology",
Goeddel, Hrsg., Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., Band
185, 297 bis 308 (1991). Kulturproben wurden 4 h nach Zugabe von
Galactose entfernt, und die Aktivittät des Lyaseproteins wurde gemessen
aus den gebrochenen Zellen, wie oben beschrieben.
-
Beispiel 4
-
Herstellung von cis-3-Hexenol
-
S.
cerevisiae-Zellen, die das rekombinante Plasmid, Vektor pYX233,
enthaltend das HPO-Lyasegen, wie
in Beispiel 3 beschrieben, enthielten, wurden in 100 ml SD-Medium
ergänzt
mit den Aminosäuren
Histidin, Leucin, Uracil (siehe Sherman, siehe oben, zur Beschreibung
des Mediums) bei 30°C
kultiviert. Die Induktionsbedingungen waren so wie in Beispiel 3
beschrieben. Die Zellen wurden geerntet durch Zentrifugation (8.000 × g über einen
Zeitraum von 10 min), und das Zellpellet wurde resuspendiert in
10 ml eines 10 mM Phosphatpuffers, pH 6,8, 0,05% Triton-X100, 0,25
mM PMSF, 1 mM Linolensäurehydroperoxid.
Zu der Zellsuspension wurden 10 g Glaskügelchen (0,2 bis 0,4 mm im
Durchmesser; Sigma) gegeben, und die Mischung wurde dreimal 1 min
lang heftig durchgewirbelt. Die Reaktionsmischuing wurde 30 min
lang bei Raumtemperatur inkubiert, woraufhin 0,2 g Bäckerhefezellen
(Hefe Schweiz AG) zugegeben wurden. Die Inkubation wurde für weitere
30 min durchgeführt.
-
Die
Reaktionsmischung wurde mit 10 ml Methyl-t-butylether extrahiert,
und die organische Phase wurde durch Zentrifugation (8.000 × g 10 min
lang) getrennt. Der Überstand,
der das Produkt cis-3-Hexenol
enthielt, wurde aufgehoben. Die cis-3-Hexenolkonzentration wurde
bestimmt durch Kapillargaschromatographie, wie beschrieben von Olias
et al. (1993), J. Agric. Food Chem. 41, 2368 bis 2373.
-
Beispiel 5
-
Herstellung von cis-3-Hexenol
und cis-3-Hexenal unter Verwendung ganzer Hefezellen
-
Das
Lyasegen wurde in den Hefeexpressionsvektor pYX212 (R&D Systems) kloniert.
Dafür wurde
das doppelt verdaute und gereinigte PCR-Produkt (wie in Beispiel
3 beschrieben) legiert in den Vektor pYX212, der linearisiert war
mit den Restriktionsenzymen NcoI und SacI. Das Plasmid, das das
PCR-Produkt enthielt,
wurde transformiert in E. coli DH5α (Gibco BRL; Sambrook et al.,
siehe oben), von dem die Plasmid-DNS isoliert wurde unter Verwendung
des Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen, Deutschland). 5 μg des Plasmids
wurden transformiert in S. cerevisiae DBY746 (ATCC 44773), wie beschrieben
von Klebe et al., siehe oben. Die transformierten Hefezellen wurden
auf ein geeignetes selektives Medium (SD-Medium ergänzt mit den Aminosäuren Histidin,
Leucin, Tryptophan; siehe Sherman, siehe oben, zur Beschreibung
des Mediums) gegeben, und man ließ sie 4 Tage lang bei 30°C wachsen.
Die Kolonien, die auf dem selektiven Agarmedium wuchsen, ließ man nochmals
wachsen auf einem flüssigen
SD-Medium, das mit den obigen Aminosäuren ergänzt war.
-
Herstellung von cis-3-Hexenal
-
S.
cerevisiae Zellen, die das rekombinante Plasmid, Vektor pYX212 enthaltend
das HPO-Lyasegen, wie
oben beschrieben, enthielten, wurden in 100 ml SD-Medium, das mit
den obigen Aminosäuren
ergänzt
war, bei 30°C
kultiviert, bis die Kulturdichten eine Absorption von etwa 10 erreichten,
gemessen bei 600 nm. Die HPO-Lyase wurde kontinuierlich exprimiert
oder synthetisiert aus dem konsti tutiven Triosephosphatisomerasepromoter
aus dem Vektor pYX212. Die Zellen wurden geerntet durch Zentrifugation
(8.000 × g
während
eines Zeitraums von 10 min), und sie wurden in 20 ml 10 mM Phosphatpuffer,
pH 6,8, 10 mM Linolensäurehydroperoxid
resuspendiert. Die Reaktionsmischung wurde 30 min lang bei Raumtemperatur
inkubiert und nachfolgend extrahiert mit 10 ml Methyl-t-butylether.
Die organische Phase wurde getrennt durch Zentrifugation (8.000 × g für einen
Zeitraum von 10 min) und der Überstand,
der das erzeugte cis-3-Hexenal enthielt, wurde aufbewahrt.
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Herstellung von cis-3-Hexenol
-
S.
cerevisiae Zellen, die das rekombinante Plasmid, Vektor pYX212 enthaltend
das HPO-Lyasegen, wie
oben beschrieben, enthielten, wurden in 100 ml SD-Medium, das mit
den obigen Aminosäuren
ergänzt
war, bei 30°C
kultiviert, bis die Kulturdichten eine Absorption von etwa 10 erreichten,
gemessen bei 600 nm. Die HPO-Lyase wurde kontinuierlich exprimiert
durch den konstitutiven Triosephosphatisomerasepromoter aus dem
Vektor pYX212. Die Zellen wurden geerntet durch Zentrifugation (8.000 × g während einem
Zeitraum von 10 min) und in 20 ml 10 mM Phosphatpuffer, pH 6,8,
10 mM Linolensäurehydroperoxid
resuspendiert. 2 ml Ethanol und 10 g kommerziell erhältliche
Bäckerhefezellen
(Hefe Schweiz AG) wurden zu den resuspendierten rekombinanten Hefezellen
gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 30 min lang bei Raumtemperatur
inkubiert und nachfolgend extrahiert mit 10 ml Methyl-t-butylether. Die
organische Phase wurde getrennt durch Zentrifugation (8.000 × g für einen
Zeitraum von 10 min), und der Überstand,
der das erzeugte cis-3-Hexenol enthielt, wurde aufbewahrt. Die cis-3-Hexenal- und cis-3-Hexenolkonzentrationen
wurden bestimmt, wie in Beispiel 4 beschrieben.
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