KR102318983B1

KR102318983B1 - 신규한 1-octen-3-ol을 생산하는 형질전환 효모 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR102318983B1
Application number: KR1020190019496A
Authority: KR
Inventors: 천우재; 이광선; 김상웅; 김종국; 이난영; 정민지
Original assignee: 경상북도; 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-02-21
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2021-11-01
Also published as: KR102196834B1; US20210002674A1; US11371064B2; KR102196819B1; KR20190100889A; KR20190100871A; JP2021514630A; JP2022180459A; KR20190100890A

Abstract

본 출원은 1-octen-3-ol을 생산하는 형질전환 효모의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 효모에 관한 것으로 송이버섯 향을 이용한 향장산업 및 식품개발 산업상 유용한 발명이다.

Description

신규한 1-octen-3-ol을 생산하는 형질전환 효모 및 그 제조방법{Novel Transformed Yeast Producing 1-octen-3-ol and Methods For Producing The Same}

본 출원은 1-octen-3-ol을 생산하는 형질전환 효모 및 그 제조방법에 관한 것이다.

사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 1683년 Leeuwenhoek에 의해 발견되었으며 자낭균류에 속하는 대표적인 효모이다. 효모균은 효모 자체가 값싼 지방 및 단백질원으로 사료에 사용된다. 비타민 B군을 풍부하게 함유하고, 또 비타민 D를 함유하는 것도 있으며 의약품 공업에도 사용되고 있다. 효모를 처음으로 관찰한 것은 현미경의 발명자 레벤후크(Anton van Leeuwenhoek)이며 1680년에는 맥주 효모가 발견되었다. 그러나 효모 발효의 생물학적 의의가 알려진 것은 1861년이었으며 파스퇴르(Louis Pasteur)는 포도주 발효가 효모에 의해 일어난다는 사실을 최초로 규명하였다.

송이버섯의 주요 향기성분 중의 하나인 마츠다케올 (matsutakeol)로 알려진 옥텐올 (1-octen-3-ol)은 생합성 과정에서 리폭시게나아제(lipoxygenase)와 하이드로퍼옥사이드 리아제(hydroperoxide lyase) 효소가 관여하는 것으로 알려져 있다. 옥텐올(1-octen-3-ol)은 1-octen으로부터 유래되는 2차 알코올로, (R)-(-)-1-octen-3-ol과 (S)-(+)-1-octen3-ol의 두 가지 거울상 이성질체의 형태로 존재한다. (R)-(-)-1-octen-3-ol은 과일 향과 송이버섯 특유의 좋은 향이 나지만 (S)-(+)-1-octen-3-ol은 퀴퀴한 곰팡이 냄새, 잡초 냄새, 인위적인 냄새를 띤다. 따라서, (R)-(-)-1-octen-3-ol이 송이버섯의 주요 향기 성분으로 알려져 있다. 기질인 송이버섯의 리놀레산 (linoleic acid)은 자실체 내에서 (S)-1-hydroperoxy-(8E,12Z)-8,12-octadecadienoic acid (10-HPODE)로 산화되고 이 과정에서 리폭시게나아제가 관여한다. 그리고 10-HPODE는 다시 (R)-(-)-1-octen-3-ol과 10-Oxo-trans-8-decenoic acid(ODA)를 생합성하는데 사용되는데 이 과정에 관여하는 효소가 하이드로퍼옥사이드 리아제로 알려져 있다.

지금까지 화학합성 방법이 아닌 송이버섯의 리폭시게나아제와 하이드로퍼옥사이드 리아제의 유전자를 플라스미드 벡터를 이용하여 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에서 발현시킨 결과 옥텐올 (1-octen-3-ol)이 생합성되었음을 확인하는 옥텐올의 생합성 방법에 관한 연구는 미흡하다. 송이버섯은 특히 아시아에서 선호도가 매우 높은 식용버섯이므로, 옥텐올 (1-octen-3-ol)을 생합성하는 형질전환 효모는 송이향을 이용한 식품개발 등 관련 산업에 긍정적인 효과가 있을 것으로 예상된다.

종래 공지되거나 공용된 옥텐올(1-octen-3-ol)의 제조방법은 대한민국 공개특허 제 10-2013-0100141호에 개시되어 있다. 여기서는 옥텐올을 6-메틸-5-헵텐-2-온(MH)을 6-메틸-2-헵타논(MHA)으로 수소화하고, 이어서 이를 아세틸렌과 반응시켜 3,7-디메틸-1-옥틴-3-올(DMOI)을 형성한 다음 DMOI를 3,7-디메틸-1-옥텐-3-올(DMOE)로 수소화시켜 합성하는 화학적 제조방법을 개시하고 있을 뿐이다. 또, 대한민국 등록특허 제 10-1446315호 및 제 10-1455204호에는 송이버섯에서 유래한 옥텐올의 생합성에 관여하는 각 리폭시게나아제와 하이드로퍼옥사이드 리아제의 유전자를 개시하고 있을 뿐이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 효모를 이용한 옥텐올(1-octen-3-ol)의 제조 방법을 개발하기 위하여 예의 연구함으로써 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 목적은 Lipoxygenase를 코딩하는 염기서열과 Hydroperoxide lyase를 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모를 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 1-octen-3-ol의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 실시 양태의 설명 및 실시 형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 출원의 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 Lipoxygenase를 코딩하는 염기서열과 Hydroperoxide lyase를 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모를 제공한다.

본 출원의 일 양태에 따르면, 송이버섯의 Total RNA를 분리하고 cDNA 합성하는 단계와; 상기 합성된 cDNA로부터 Lipoxygenase 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자를 PCR 증폭하는 단계; 상기 증폭된 각 Lipoxygenase 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자를 벡터에 유전자 클로닝하는 단계;상기 클로닝 된 각 Lipoxygenase 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자를 각 Yeast expression vector에 유전자 클로닝하는 단계와; 상기 Yeast expression vector를 효모로 형질전환하고 배양하여 1-octen-3-ol의 생합성을 확인하는 단계를 포함하는 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모의 제조방법을 제공한다.

본 출원의 일 구현예로, 본 출원은 각 서열번호 9, 10, 11의 염기서열로 이루어진 리폭시게나아제(lipoxygenase)-1,2,3 유전자와 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 하이드로퍼옥사이드 리아제(hydroperoxide lyase)를 유전자 클로닝하여 포함하는 재조합 벡터를 효모에 형질전환시켜 배양하여 1-octen-3-ol의 생합성을 확인하는 단계를 포함하는 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모의 제조방법을 제공한다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 출원의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자 상동체는 본 출원 서열번호의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 출원의 일 양태에 따르면, 본 출원은 청구항 제1항의 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모를 배지에서 배양하여 1-octen-3-ol을 생합성하는 단계; 상기 생합성된 1-octen-3-ol 을 수득하는 단계를 포함하는 1-octen-3-ol 의 제조방법을 제공한다.

용어 "프라이머"는 분석을 통해 결정된 유전자의 서열 상동성 결과에서 70% 이상의 종간 서열 상동성을 가지는 핵산 부위에서 18 내지 35머 길이를 가지고, 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머가 서로 혼성화 되지 않으며, 상기 유전자와 프라이머가 엄격한 조건에서 혼성화되도록 프라이머 서열을 결정하는 알고리즘인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 "PCR(중합효소 연쇄반응)"이란 핵산 증폭 방법으로 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형에로의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis 등, 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al, 1985). PCR에 이용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 DNA의 반대쪽 가닥에 어닐링되도록 디자인되며, 프라이머의 DNA 중합효소 연장 생성물은 다른 프라이머를 위한 주형 가닥으로 작용한다. PCR 증폭 과정은 DNA 서열의 지수적 증가를 초래하며, 증폭된 DNA 서열의 길이는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'-말단에 의해 결정 된다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 상기 벡터는 클로닝 벡터로 사용될 수 있으며, 클로닝 벡터란, 숙주 내에서 안정적으로 유지되고 외부 DNA 조각을 삽입하려는 용도를 가지고 있다. 그러므로 벡터와 외부 DNA를 제한효소로 처리할 때 쉽게 삽입되거나 제거할 수 있는 특징을 가져야 한다. 사용되는 클로닝 벡터는 삽입하려는 유전자의 특징, 제한효소의 특징의 조건을 고려하여 적절하게 선정되나 본 출원에서 바람직하게는 pGEM easy vector 가 사용된다. 용어 "yeast expression vector(효모 발현 벡터)"는 프로모터 유전자, 해독개시 및 종결코돈이 제거된 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 터미네이터를 포함하며, 프로모터 유전자는 GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1 및 GAL10으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 yeast expression vector는 조합 효모 플라스미드(YIp : integrative yeast plasmid) 및 염색체 외 플라스미드 벡터 (extrachromosomal plasmid vector)가 모두 가능하다. 상기 염색체 외 플라스미드 벡터는 에피솜 효모 플라스미드(YEp : episomal yeast plasmid), 복제 효모 플라스미드(YRp : replicative yeast plasmid) 및 효모 중심체 플라스미드(YCp : yeast centromer plasmid)로 나뉘어진다. 더 나아가, 인위적 효모 염색체들(YACs : artificial yeast chromosomes)도 본 출원에 따른 발현 벡터로서 가능하다. 또한, 특히 바람직한 효모 벡터는 복제 원점 ori 및 항생물질 저항성 카세트(antibiotic resistance cassette)를 함유하여 대장균(E. coli)에서 증식되고 선택될 수 있는 효모 복제 플라스미드(yeast replication plasmid)이다. 더 나아가, 이들은 H. polymorpha로부터의 HARS1과 같이 효모 세포에서 염색체와 관계없이 독립적 복제를 할 수 있는 ARS 서열, 그리고 URA3 또는 HLEU2와 같은 대사성 효모 선택 마커(metabolic yeast selection marker)를 가진다. 본 출원에서도 yeast expression vector로서 다양한 vector가 사용될 수 있으나, 예컨대 pKLAC2 vector, Gateway pYES-DEST52 vector, pAO815 Pichia Expression vecotr, pYES2/3/CT vector 가 있지만, 가장 바람직하게는 실험결과 pYES3/CT vector 또는 pYES2/CT vector를 사용하는 것이다. 또, 각 유전자를 발현시키기 위하여 사용하는 vector의 조합은 발현시키고자 하는 유전자, 그 단백질 그리고 해당 단백질의 양에 따라 적절히 선택하되 그 비율을 조절하였다. 본 출원에서는 구체적으로, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2. 1:1비율이 사용될 수 있었지만, 가장 바람직하게는 pYES3/CT vector와 pYES2/CT vector를 1:1의 비율이었다.

본 출원의 용어 "유전자 클로닝"은 목적 유전자를 플라즈미드(plasmid), 파지(phage), 코스미드(cosmid) 등의 자기 복제능력을 갖는 벡터에 결합하여 대장균, 효모 등의 다양한 숙주에 도입하여 증식시킴으로써, 동일한 유전자 집단을 대량으로 만들어내는 기술을 말한다. 대장균에 있어서의 클로닝 및 서브 클로닝은 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 방법 등에 의해 증폭된 목적 유전자를 DNA 리가제(ligase)를 사용하여 복제 개시점과 항생제의 선택 표식을 갖는 벡터에 결합하여 대장균이나 효모 등 세포 안에 도입한 후, 항생제 내성을 조사함으로써 클로닝된 세포를 선별하는 방법으로 실시된다.

본 출원의 용어 "효모"는 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 스포로보 로마이세스(Sporobolomyces), 토루로프시스(Torulopsis), 트리코스포론(Trichosporon), 윅커하미아 (Wickerhamia), 아쉬바이아(Ashbya), 블라스토마이세스(Blastomyces), 캔디다(Candida), 사이테로마이세스 (Citeromyces), 크레브로테슘(Crebrothecium), 크립토코커스(Cryptococcus), 드바리오마이세스(Debaryomyces), 에노마이코프시스(Endomycopsis), 지오트리컴(Geotrichum), 한세눌라(Hansenula), 클로엑케라(Kloeckera), 리포마이세스(Lipomyces), 피키아(Pichia), 로도스포리듐(Rhodosporidium) 또는 로도토룰라(Rhodotorula) 속 (genus)에 속하는 효모일 수 있고, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 및 스키조사카로마이세스에 속하는 효모일 수 있고, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시에를 사용한다. 유전자의 발현율 및 최종 발현되는 산물의 양과 효율에 따라 적절한 종류의 효모를 선택하여 사용할 수 있다. 본 출원의 형질전환된 효모 사카로마이세스 세레비지에 KMG 1801, KMG 1802, KMG 1803은 은 2018년 2월 6일자 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 각각 기탁번호 제 KCTC13476BP호, KCTC13477BP호 및 KCTC13478BP호로 기탁되었다.

예를 들어, 숙주 세포가 효모인 경우, 상기 발현 컨스트럭트에서 이용 가능한 프로모터는 GAL10 프로모터, GAL1 프로모터, ADH1 프로모터, ADH2 프로모터, PHO5 프로모터, GAL1-10 프로모터, TDH3 프로모터, TDH2 프로모터, TDH1 프로모터, PGK 프로모터, PYK 프로모터, ENO 프로모터, T7 프로모터 및 TPI 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 프로모터는 유전자의 발현율 및 최종 발현되는 산물의 양과 발현 효율 등의 조건에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있다.

본 출원의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 방법은 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 효모의 "형질전환"은 핵산 분자 또는 벡터를 당업자에게 공지된 표준 방법, 바람직하게는 전기천공, 화학적 형질전환, 원형질 융합에 의한 형질전환, 또는 입자 밤바드먼트(bombardment)에 의해 세포 내로 도입되게 한다(참조: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Edited by: Fred M. Ausubel et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) , J. Sambrook and D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press). 본 출원의 바람직한 구현예에 따르면 본 출원의 형질전환 효모는 S.c. EasyComp Transformation kit를 이용하여 실시하였다.

본 출원의 일 구현예로, 청구항 제1항의 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모를 배지에서 배양하여 1-octen-3-ol을 생합성하는 단계; 상기 생합성된 1-octen-3-ol 을 수득하는 단계를 포함하는 1-octen-3-ol 의 제조방법에 제공된다.

본 출원의 효모의 배양은 1-octen-3-ol의 생합성을 확인하기 위해서 tryptophan과 uracil이 결실된 SC selectable medium에 형질전환 효모를 접종하여 overnight 전배양한 다음, 원심분리하여 효모를 모아 트립토판(tryptophan)과 유라실(uracil)이 결실된 SC induction medium에 접종하고, 2% Tween-20과 linoleic acid를 첨가하여 30℃에서 20시간 동안 배양할 수 있다. 본 출원에서 바람직하게는 기질인 linoleic acid의 농도는 0.01 내지 0.1M이 사용될 수 있고, 더 바람직하게는 0.5 내지 100mM의 농도가 사용되고 가장 바람직하게는 3mM의 농도를 사용하였다. 또한 본 출원에서 바람직한 배양 온도는 15℃ 내지 40℃, 더 바람직하게는 30℃이며, 배양 시간은 12 내지 48시간 동안의 배양시간이 사용되고, 구체적으로는 18 내지 36시간, 20 내지 26시간, 가장 바람직하게는 24시간이었다.

본 출원은 1-octen-3-ol을 생합성하는 형질전환 효모를 및 그 제조방법을 제공하여 친환경적이고 경제적인 옥텐올의 대량생산에 효과적이고, 송이향을 이용한 식품 및 향장 개발에 기여할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 출원의 송이로부터 추출된 total RNA를 나타내는 전기영동 사진도이다.
도 2는 본 출원의 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자 (각 Lane 1,2,3)와 Hydroperoxide lyase(Lane 4) 유전자의 증폭을 나타내는 전기영동 사진도이다.
도 3은 본 출원의 Lipoxygenase-1 유전자(A), Lipoxygenase-2 유전자(B), Lipoxygenase-3 유전자(C)와 Hydroperoxide lyase 유전자(D)가 pGEM™ easy T vector 플라스미드에 삽입된 결과를 나타내는 전기영동 사진도이다.
도 4는 pYES3/CT 및 pYES2/CT yeast expression vector의 맵을 나타내는 모식도이다.
도 5는 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자(A)와 Hydroperoxide lyase 유전자(B)가 플라스미드에 삽입된 결과를 나타내는 전기영동 사진도이다.
도 6(A)는 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자가 도입된 형질전환 효모를 배양한 플레이트의 사진도이다. 도 6(B)는 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자가 도입된 형질전환 효모의 colony PCR 결과를 나타내는 전기영동 사진도이다.
도 7은 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자의 조합이 형질전환된 각 효모의 생장곡선을 나타내는 그래프이다.
도 8은 (A) 기질을 첨가하지 않고 배양한 cell의 lysates, (B) 기질을 첨가하지 않고 배양한 medium, (C) 기질을 첨가하여 배양한 cell의 lysates, (D) 기질을 첨가하여 배양한 medium 에서의 1-octen-3-ol 생합성을 나타내는 그래프이다.
도 9는 형질전환체 효모에서 (A) Linoleic acid 첨가 농도에 따른 1-octen-3-ol 생합성량과 (B) 반응 온도 및 반응 시간에 따른 1-octen-3-ol의 생합성량을 나타내는 그래프이다.

이하, 본 출원에 따른 실시예를 통하여 본 출원을 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만 본 출원의 하기 실시예는 본 출원의 일 예시에 불과하다. 이들 실시예는 본 출원을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

실시예1 : 송이버섯의 Total RNA 분리

대구 인근 가창지역에서 채취한 송이 자실체로부터 Total RNA를 분리 하였다. 송이 자실체를 3 내지 5cm의 작은 조각으로 자른 뒤, 액체 질소를 사용하여 막자 사발로 곱게 마쇄하였다. 마쇄한 자실체를 TRIZol 1 mL 에 완전히 용해시킨 다음 클로로포름(chloroform)을 첨가하였고, 15분간 원심분리하여 RNA를 분리하였다. RNA가 포함된 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 동량의 이소프로필 알코올(Iso-propyl alcohol)을 첨가하여 상온에서 15분간 반응시키고 10분간 12,000rpm에서 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 다음, 상층액을 제거하고 75% 에틸알코올(ethyl alcohol)을 첨가하여 세척한 후 DEPC 처리수(DEPC(diethypyrocarbonate)-treated water)를 첨가하여 Total RNA를 용출, 분리하였고, 그 결과 Total RNA concentration은 992.8ng/㎕로 확인되었다(A260/A280=1.886)(도 1, 첫번째 레인은 DNA marker이며, 2~4레인은 Total RNA를 나타낸다).

실시예2 : 송이버섯의 cDNA 합성

상기 실시예1에서 수득한 Total RNA와 Accuscript High Fidelity 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Stratagene)을 사용하여 First strand cDNA를 다음의 방법으로 합성하였다. Total RNA 1 ㎕, RNase-free water 11.7 ㎕, AccuScript RT buffer 2 ㎕, Oligo dT primer 1 ㎕, dNTP mixture 0.8 ㎕를 혼합하여 65℃에서 5분, 다음 상온에서 5분간 반응시킨 후 DTT 100 mM, AccuScript RT 1 ㎕, RNase Block ribonuclease 0.5 ㎕를 더 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시킨 다음 70℃에서 15분 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

실시예3: Lipoxygenase-1,2,3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자의 PCR 산물 제작

상기 실시예2에서 합성, 수득한 cDNA를 주형으로 PrimeSTAR^TM HS Polymerase (TaKaRa)를 이용하고 하기의 프라이머(primer)(표 1) 및 PCR 조건(표 2)을 사용하여 유전자를 증폭시켰다. SC 선택적 배지(SC selectable medium)에서 해당 유전자 및 제한효소를 사용하여 PCR을 수행하였다.

Name	Sequences (5'-3')	Restriction enzyme
LOX1-F-HindIII (서열번호 1)	AAGCTT AACACAATGTCCTTAAGCAAGTTTCCG	HindIII
LOX1-R-KpnI (서열번호 2)	GGTACCACCTTCGTTACATCATACTGTAT	KpnI
LOX2-F-KpnI (서열번호 3)	GGTACC AACACAATGTTGACGCGGTTATTTAAG	KpnI
LOX2-R-NotI (서열번호 4)	GCGGCCGCATATCGAACTGCACAACGAGGG	NotI
LOX3-F-HindIII (서열번호 5)	AAGCTT AACACAATGTCGATTGATTCTGTTCCA	HindIII
LOX3-R-KpnI (서열번호 6)	GGTACCATGGCACAGTACTCCCGTTGCCA	KpnI
HPL-F-KpnI (서열번호 7)	GGTACC AACACAATGTCCCTCAAGCATTCTTCC	KpnI
HPL-R-EcoRI (서열번호 8)	GAATTCTGGATGTTGTGTCCGTGGCGATA	EcoRI

Target gene	Pre- denaturation	Denaturation	Anealing	Extension
Lipoxygenase-1 (서열번호 9)	98°C, 3min	98°C, 10sec	60°C, 15sec	72°C, 3min
Lipoxygenase-2 (서열번호 10)	98°C, 3min	98°C, 10sec	58°C, 15sec	72°C, 4min
Lipoxygenase-3 (서열번호 11)	98°C, 3min	98°C, 10sec	56°C, 15sec	72°C, 4min
Hydroperoxide lyase (서열번호 12)	98°C, 3min	98°C, 10sec	59°C, 5sec	72°C, 2min

실험결과, 전기영동 사진도를 통하여 각 Lipoxygenase-1 유전자(서열번호 9, 3158 bp), Lipoxygenase-2 유전자(서열번호 10, 3334 bp), Lipoxygenase-3 유전자(서열번호 11, 3854 bp)((도 2의 각 Lane 1,2,3)와 Hydroperoxide lyase(서열번호 12, 1,557 bp, 도 2의 Lane 4) 유전자의 증폭을 확인하였다. 도 2의 전기영동 사진도의 첫번째 레인은 DNA marker으로 Plus DNA Ladder Marker가 사용되었다.실시예4: pGEM™ easy T vector를 이용한 유전자 클로닝

상기 실시예3에서 수득한 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자의 PCR 산물을 각 pGEM™ easy T vector (Promega)로 클로닝하기 위해서 Mighty TA-cloning Reagent Set (TaKaRa)을 사용하여 A-tailing 과정을 수행 한 뒤, pGEM™ easy T vector와 4℃에서 overnight하여 ligation 시킨 후, ligation된 vector를 E.coli DH5α competent cells (TaKaRa)에 형질전환하였다. 다음, E.coli는 ampicillin (100 μl/ml), IPTG (0.1mM), X-gal(50 μg/ml)을 첨가한 Luria Broth (LB) medium plate에 도말하여 37℃에서 16 내지 18시간 동안 배양한 뒤, Higene™ Plasmid Mini Prep Kit (Biofact)를 사용하여 플라스미드를 추출하였다. 추출한 플라스미드에 유전자가 정확하게 삽입되었는지 확인하기 위하여 전기영동으로 유전자의 크기를 확인한 다음 해당 염기서열 시퀀싱을 수행하였다.

실험 결과, lipoxygenase-1 유전자(도 3(A)), Lipoxygenase-2 유전자(도 3(B)), Lipoxygenase-3 유전자(도 3(C))와 Hydroperoxide lyase 유전자(도 3(D))가 pGEM™ easy T vector 플라스미드에 정확히 삽입된 것을 확인하였다.

실시예5: Yeast expression vector를 이용한 유전자 클로닝

Yeast에서의 유전자 발현을 위한 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자가 삽입된 pGEM vector를 각 제한효소 HindIII 와 KpnI으로 37℃에서 반응시켜 절단하였고, Hydroperoxide lyase 유전자가 삽입된 pGEM vector를 각 제한효소 KpnI 와 EcoRI으로 37℃에서 반응시켜 절단하였다. 절단된 유전자들은 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (TaKaRa)으로 정제한 후 정량하였다. 상기 유전자를 발현시키기 위한 미생물 모델로서 Saccharomyces cerevisiae 종을 선택한 후, 효율적인 단백질 발현을 위해 host cell에 적합한 yeast expression vector인 pYES3 벡터(Invitrogen사)를 선택하였다. 본 벡터는 pUc ori 서열이 포함되어 있어 박테리아에서 증폭이 쉽고, 2μ origin 서열이 포함되어 있어 효모에서도 증폭이 가능하다. 또한 이 벡터에는 목적 유전자를 절단하지 않는 제한효소 자리가 multiple cloning site에 있어 벡터에 유전자를 정확하게 삽입할 수 있었다. 강력한 프로모터인 GAL1 프로모터가 있고, T7 프로모터와 CYC1 서열이 있어 유전자의 삽입과 삽입된 서열을 유전자 염기서열 분석으로 정확하게 파악할 수 있다. 그리고 선택 표지 마커인 TRP1 유전자 서열이 존재하여 벡터가 삽입된 효모를 쉽게 선별할 수 있으며, V5 epitope와 6xHis tag 서열이 있어 발현된 타겟 단백질 검출에 용이하다. 종류가 다른 두 유전자를 함께 효모에 형질전환시키기 위하여 pYES3 벡터와 선택 표지 마커가 URA3로 다른 pYES2 벡터를 선택하였다. pYES2 벡터는 pYES3 벡터와 그 외의 특징은 같고 크기는 약 100bp정도 더 크다 (도 4). 선택 표지 마커를 이용하여 각 유전자가 모두 삽입된 효모를 효율적으로 선별할 수 있으므로, 다음의 방법을 이용하여 클로닝을 하였다. Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자는 pYES3/CT vector (Invitrogen)와, Hydroperoxide lyase 유전자는 pYES2/CT vector (Invitrogen)와 4℃에서 overnight ligation 반응을 시켜 E.coli DH5α competent cell(TaKaRa)에 형질전환하였고, ampicillin (100 μl/ml), IPTG (0.1mM), X-gal (50 μg/ml)을 첨가한 Luria Broth (LB) medium plate에 도말하여 37℃에서 16 내지 18시간 동안 배양하였다. 다음, 선별된 E.coli 로부터 Higene™ Plasmid Mini Prep Kit (Biofact)를 사용하여 플라스미드를 추출하였고, 추출한 플라스미드는 각 유전자가 정확하게 삽입되었는지 확인하기 위하여 전기영동으로 크기를 확인한 다음 염기서열 시퀀싱을 수행하였다. 실험 결과, Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자가 플라스미드에 정확히 삽입된 것을 확인하였다(도 5). 즉, 도 5(A)의 lane은 m: DNA ladder marker, 1: pYES3/CT, 2: pYES3/CT + Lipoxygenase-1 유전자, 3: pYES3/CT + Lipoxygenase-2 유전자, 4: pYES3/CT + Lipoxygenase-3 유전자이며, 도 5(B)의 lane은 m: DNA ladder marker, 1: pYES2/CT, 2: pYES2/CT + Hydroperoxide lyase 의 전기영동 결과이다.

실시예6: Yeast expression vectors의 INVSc1 효모로의 형질전환

S.C. EasyComp™ Transformation Kit (Invitrogen)를 사용하여 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) competent cell을 제조하였다. 그리고 상기 실시예5에서 수득한 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자가 도입된 pYES3/CT vector와 Hydroperoxide lyase가 도입된 pYES2 /CT vector를 각 1 : 1 의 비율로 혼합한 다음 이 벡터들을 S. cerevisiae competent cell(INVSc1)에 형질전환하였다. 그리고 트립토판(tryptophan)과 유라실(uracil)이 결실된 SC medium plate (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 2% glucose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements, 2% agar)에 상기 S. cerevisiae competent cell(INVSc1)을 도말하여 30℃에서 2 내지 3일간 배양하였다(도 6(A)). 상기 SC medium 배지는 tryptophan과 uracil이 결실된 최소배지로 TRP1 유전자가 있는 pYES3와 URA3 유전자가 있는 pYES2 벡터가 모두 삽입된 형질전환체 효모를 효율적으로 선별하고 타겟 단백질 발현에 적합하므로 사용되었고, 사용된 SC medium 배지의 조성은 다음 표 3과 같다.

조성비 (%, W/W)	조성 내역
0.67%	Yeast nitrogen base (without amino acids)
2%	Carbon source (형질전환체 선별 및 배양을 위한 raffinose 및 단백질 발현을 위한 galactose를 첨가)
0.01%	Adenine, arginine, cysteine, leucine, lysine, threonine
0.005%	Aspartic acid, histidine, isoleucine, methionine, phenylalanine, proline, serine, tyrosine, valine
2%	Agar(고체 배지인 경우)
Total 100%	H₂O로 100%를 구성한다.

다음, Colony PCR을 수행하여 두 종류의 유전자가 도입된 형질전환 효모를 선별한 결과, Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자가 Yeast expression vector를 통하여 INVSc1에 형질전환된 것을 확인하였다 (도 6(B)). 각 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자가 1:1의 비율로 형질전환된 각 효모 KMG 1801, KMG 1802, KMG 1803은 2018년 2월 6일자 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 각 기탁번호 제 KCTC13476BP호, KCTC13477BP호 및 KCTC13478BP호로 기탁되었다.또한, 각각의 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자의 조합이 형질전환된 효모의 생장을 확인하기 위하여, 해당 배양액의 5mL는 각 배양 후 0,4, 8,12,16,20,24,28,32,36시간마다 효모의 생장곡선 측정을 위한 시료로 사용되었다.측정 결과 KMG 1801(기탁번호 제 KCTC13476BP호, 도 7(A))와 KMG 1802(기탁번호 KCTC 13477BP호, 도 7(B))가 8 내지 12시간 구간에서 빠르게 성장하고, KMG 1803(기탁번호 제KCTC13478BP호, 도 7(C))은 28 내지 32시간 구간에서 빠르게 성장하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예7: Lipoxygenase과 Hydroperoxide lyase 유전자가 도입된 형질전환 효모에서 1-octen-3-ol 생합성의 확인

상기 실시예6으로부터 수득한 각 유전자의 조합이 형질전환된 효모에서의 1-octen-3-ol의 생합성을 확인하기 위해서 tryptophan과 uracil이 결실된 SC selectable medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 2% raffinose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 형질전환 효모를 접종하여 overnight 전배양한 다음, 원심분리하여 효모를 모아 트립토판(tryptophan)과 유라실(uracil)이 결실된 SC induction medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 1% raffinose, 2% galactose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 접종하고, 2% Tween-20과 1.5mM linoleic acid를 첨가하여 30℃에서 20시간 동안 배양하였다. 원심분리로 배양한 효모와 medium을 분리하고 효모에 인산나트륨 용해 완충액(sodium phosphate lysis buffer (50 mM sodium phosphate, 1 mM PMSF, 5% glycerol, 2% triton X-100; pH 6.5)과 acid-washed glass beads (0.4 - 0.6 mm size)를 첨가하여 bead beater로 lysis한 다음, 원심분리로 균체를 다운시키고 세포용해 상층액을 회수하였다. 다음, 생성된 1-octen-3-ol을 확인하기 위해서 lysates와 배양한 medium을 70℃에서 35분 동안 SPME (solid phase microextraction)에 휘발성 성분을 추출하여 기체 크로마토그래피-질량분석법 (Gas chromatography-mass spectrometry (Aqilent 789OB GC & 5977B MSD))로 분석하였다. 기체 크로마토그래피 질량 분석을 위하여 DB-WAX(60m × 250μm × 0.25μm)와 helium carrier gas를 사용하였으며, 컬럼(column)의 온도는 40℃에서 120℃까지 2℃/min의 속도로 높였으며, 120℃에서 240℃까지 20℃/min의 속도로 높였다. Injector의 온도는 250℃로 하였다.

실험 결과, 도 8과 같이 (A) 기질을 첨가하지 않고 배양한 cell의 lysates와 (B) 기질을 첨가하지 않고 배양한 medium에서는 peak가 관찰되지 않았으나, (C) 기질을 첨가하여 배양한 cell의 lysates와 (D) 기질을 첨가하여 배양한 medium 에서는 38.27 min에 1-octen-3-ol의 peak가 확인되었다.

한편, 각각의 Lipoxygenase 유전자와 Hydroperoxide lyase의 조합에 따른 1-octen-3-ol 생합성에 대한 결과는 표 4와 같다. 표 4에 따르면 송이버섯 자실체에서 발견된 유전자 Lipoxygenase-1, Lipoxygenase-2, Lipoxygenase-3와 Hydroperoxide lyase의 각 조합이 도입된 효모에서 모두 1-octen-3-ol의 생합성 효과가 있었으며, 조합의 종류에 따라 생합성의 정도는 다름을 확인하였다. 또한, 1-octen-3-ol 생합성율(Concentration)은 Lipoxygenase-1을 이용한 경우가 가장 높음이 확인되었다.

	Protein combination	Retention time (min)	Concentration(mg/L)
1	Lipoxygenase-1 + Hydroperoxide lyase	38.270	0.66
2	Lipoxygenase-2 + Hydroperoxide lyase	38.269	0.33
3	Lipoxygenase-3 + Hydroperoxide lyase	38.270	0.58
4	Lipoxygenase-1+2 + Hydroperoxide lyase	38.271	0.42
5	Lipoxygenase-1+3 + Hydroperoxide lyase	38.271	0.38
6	Lipoxygenase-2+3 + Hydroperoxide lyase	38.270	0.27
7	Lipoxygenase-1+2+3+ Hydroperoxide lyase	38.267	0.56

실험예1: 기질의 농도와 반응조건에 따른 1-octen-3-ol 생합성의 최적화기질의 농도와 반응조건에 따른 형질전환 효모의 1-octen-3-ol 생합성량을 확인하기 위해서 트립토판(tryptophan)과 유라실(uracil)이 결실된 SC selectable medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 2% raffinose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 Lipoxygenase-1 와 Hydroperoxide lyase가 형질전환된 효모를 접종하여 overnight 전배양한 다음, 원심분리로 효모를 모아 tryptophan과 uracil이 결실된 SC induction medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 1% raffinose, 2% galactose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 접종하고, 2% Tween-20과 적절한 농도의 linoleic acid (0 ~ 0.1 M) 첨가하여 30℃에서 20시간 동안 배양하였다. 또한, 반응조건에 따른 형질전환 효모에서 1-octen-3-ol 생합성량을 확인하기 위해서 전배양한 효모를 트립토판(tryptophan)과 유라실(uracil)이 결실된 SC induction medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 1% raffinose, 2% galactose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 접종하고, 2% Tween-20과 3mM linoleic acid를 첨가하여 15℃와 30℃에서 각 12, 24, 36, 48시간 동안 배양하였다. 원심분리로 배양한 효모를 모아 인산나트륨 용해 완충액(sodium phosphate lysis buffer (50 mM sodium phosphate, 1 mM PMSF, 5% glycerol, 2% triton X-100; pH 6.5))과 acid-washed glass beads (0.4 - 0.6 mm size)를 첨가하여 bead beater로 lysis한 다음, 원심분리로 균체를 다운시키고 세포용해 상층액을 회수하였고, 0.1g의 NaCl (단백질 침전을 위함)을 첨가하여 동량의 다이에틸 에테르(diethyl ether)로 향기물질을 추출하여 기체 크로마토그래피-질량분석법(Gas chromatography-mass spectrometry (Aqilent 789OB GC & 5977B MSD))으로 분석하였다. 기체 크로마토그래피 질량 분석을 위하여 DB-WAX(60m × 250μm × 0.25μm)와 helium carrier gas를 사용하였으며, column의 온도는 40℃에서 120℃까지 2℃/min의 속도로 높였으며, 120℃에서 240℃까지 20℃/min의 속도로 높였다. Injector의 온도는 250℃로 하였다. 생합성된 1-octen-3-ol의 농도는 1-octen-3-ol standard (Sigma)와 비교분석 하였다. 실험 결과, (A) Linoleic acid 첨가 농도가 3mM일 때 1-octen-3-ol 생합성량은 약 0.48mg/L로 가장 높았으며, (B) 24시간 동안 30℃ 에서의 1-octen-3-ol의 생합성량은 약 0.35mg/L으로 가장 높았다 (도 9).

본 출원은 1-octen-3-ol을 생산하는 형질전환 효모 및 그 제조방법에 관한 것으로 송이버섯 향을 이용한 향장산업 및 식품개발 산업상 유용한 발명인 것이다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC13476BP

수탁일자 : 20180206

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC13477BP

수탁일자 : 20180206

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC13478BP

수탁일자 : 20180206

<110> Kyongsangbuk-do Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Transformed Yeast Producing 1-octen-3-ol and Methods For Producing The Same <130> P6201 <140> 10-2019-0019496 <141> 2019-02-19 <150> KR 10-2018-0020608 <151> 2018-02-21 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOX1-F-HindIII <400> 1 aagcttaaca caatgtcctt aagcaagttt ccg 33 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOX1-R-KpnI <400> 2 ggtaccacct tcgttacatc atactgtat 29 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOX2-F-KpnI <400> 3 ggtaccaaca caatgttgac gcggttattt aag 33 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOX2-R-NotI <400> 4 gcggccgcat atcgaactgc acaacgaggg 30 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOX3-F-HindIII <400> 5 aagcttaaca caatgtcgat tgattctgtt cca 33 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOX3-R-KpnI <400> 6 ggtaccatgg cacagtactc ccgttgcca 29 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPL-F-KpnI <400> 7 ggtaccaaca caatgtccct caagcattct tcc 33 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPL-R-EcoRI <400> 8 gaattctgga tgttgtgtcc gtggcgata 29 <210> 9 <211> 3158 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipoxygenase-1 <400> 9 atgtccttaa gcaagtttcc gtccatcttt cgcaaatcca ccctgcccaa cggcacggtg 60 aatggtgatg cgacggccac atccacccaa gccatcaggg acgtccatgt taagaaaggt 120 tccccattta ctcaaatttt ggacccatct accatctcgt ctgtcgtgga tgccttcagg 180 cataaggagt ctctcgacga caggaaattc gctcttgagc atgctcttac cttcatttcc 240 cgcacggatg aaggtccact tcaaacagag ctacagaaca aaattgttga gctcttatac 300 aatgatttgg gtcacccgcc cgcgacgagc attggcaacc actacgcgtg gcgaacggct 360 gatggatctt ttaataacat cgatctcccg gaaataggca aggctggcac cccatatgct 420 cgctcagttc aacaatcgca tccccttccg aagaaccaat tgcctgatcc tggactcatc 480 ttcgatactc ttttgaagcg ggaaggtttc gaggaacatc ctgctgggct atcttctttg 540 atgttttcct ttgccgcttt agttatccac actgttttcc gtacatcaca cagaaatgtg 600 gacatcaatg aaacctcatc ctacgttgac ctttcgccgt tgtatggaca taaccaagag 660 gcacaggaca aagtccgcgt tcgagacggt cgaggcttgc ttctcccaga cgtttttgct 720 gaggataggt tacttcttct cccgcctgcc gtttgtgcgc tcctcgtctt gttcagtcgc 780 aaccataact acattgcaaa gaaactcttg gatataaatg agagaggcac ttacgttgac 840 ccgtccacgc tgcgctcgga taaaccagcc gaaaaagcca agctcctggc acaggaagag 900 gaactcttcc agatcgctcg tttaattaac tgtggctggt ttgcttctgt cgtgttttcg 960 gactacttct cgtgtatctt aggtctggtt agaactggaa gcagttggag cttggacccg 1020 ttccaggaaa tcaggaatca ggatcactct gttttcgagc gaggtaaagg gaatgcctgc 1080 agtgttgagt tcaactgcct gtatcgatgg cacgctacca ctagcgtaaa ggacgaagaa 1140 tgggtcgccc aagtttttga gaaggtcttc gatggtaaag atccggaagc agtcactcct 1200 gaggacttta aggctgctgg gcataggata gccgctacgc agcctgacat cacccattgg 1260 actttcgggg atttgcaacg ccaggcggat ggcactttca aggatgaaga tttggccagt 1320 cttatacaca atgcaacgga acatccggct ggagctttcc gtgcccgagg aacaccagct 1380 gtcatgcgcc ttcatgaaat aatggggatc gagcagaaca gaagatgggg agtctgctcg 1440 ctaaatgatt ttaggaagtt ccttggcttg aggccataca agtccttcaa ggagtggaac 1500 ccgaggcccg atattgctga agctgccgag aagctatatg gtgacatcga ccatctcgag 1560 ctatatgtcg gccttcaagc agaagatgcc aagcctgtca tggatggagc aggactttgt 1620 cctggatata caatcagccg agctattctt agcgacgcaa ttgctctcac tcgaggggac 1680 agattcttca ctcaagatta ttccccacac aatctgactg cttggggatt tgctgattgc 1740 cagagggatc ctaatgcgtt cggattcggc agcactcttg gccggctctt tttacgcaat 1800 cttcccaaca atttcacaga aaatagcgta tacactttct tccctttgat gactcccgac 1860 gccatgaaga cccatttgtc gaagctgaag ctgatcgatc agtatgattt cacacgtccc 1920 aaagatcaat cgggcgtgaa ggaggtcaat gattatgcgc aagtgactga gatacttagc 1980 aatcctgctg cctttgtatc atcttatgcc gaacaagctg ccagagttat caacggcaaa 2040 gggttttaca cggctcagca agacacggaa gaaaacaaaa ttgccaaagc attggcggac 2100 tcgccagagg ctcttgacaa gatcgggaaa tacttctatg atactacttc tcacttgatc 2160 aagtcaaatt cgttctcgct cgtcggtgat aaagtacgtg gtgttgacat agtgcgagat 2220 gtcttcaggg ttgttcctat attgtgggct gcagcggaca tcggtggcat cgagttgaag 2280 acaaaggacc atcctgatgg cgcatacacc ccttcagagc tgtacgatat tctgggtgat 2340 atctatacat tcgtcttcct tgagattgaa cctgctaatg tcatggtgct tggtgccaaa 2400 gtccgtcacg atactcgcga attgttgggc catatcaaga accatttgta tggtgcgggt 2460 ggtgtacgcg gttctttcac cggcttcgtt agctcgctct tcaccaggtc caggaaaccc 2520 gaacaccacg aacttgtcaa gcgtctttcc caacttgggc aatcgtcgga cgacctcgct 2580 acaaatattt tggctctttt ggtctcggcg acagttgaat tgtcccttgc tttgactaat 2640 atgataaatc tctatcttgg tagggaggag ggaactaaga tctcttcgtt gataaagagt 2700 gccgatggca atgccttgct tgatggttat gcgcgcgagg ctttgagact tgacccacca 2760 ttccagggtg tatatcgggt tgcgacgaag gatcaagaag tcggaggtgt tgctgtcaag 2820 aaaaatgacc gggtgttcct agacatcgct tccgccaacg tcaacgaatc agtcttcgag 2880 tcagcccact ctgtcaatcc ttctcgaggc accaaaggct atctttcggt tgatggactc 2940 tttgtccact taggagaaat gacgactaag attatgacgg aggtccttcg agccgtctat 3000 ggatttgaaa atgttcgtcg ggcgcccagg atttctgggg aactcaaaag gttcaaggac 3060 cattctcgac cacagctccg ctatgcgtat ttggatcaac accaacgtac ctctgcatgg 3120 cctacttcat tgactataca gtatgatgta acgaagat 3158 <210> 10 <211> 3334 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipoxygenase-2 <400> 10 atgttgacgc ggttatttaa gaaactcttt atttccccac tccttcatat catcctcttc 60 ttttctaccc cactctttag gttcatatct gtaatgaaca tccttaatca ctttacccag 120 gcagtcgact tcgttacaga atcacacgca ccattggaca ccgacgctgc gtgtcctgaa 180 tcagatgaat cattcaagaa agtttcagag acgcttgaat tatggtctca tcccgctgtc 240 aaaatctccg atctccctgc attttgggat gcggtgaagc acgggaatac cattggtctc 300 gatgatcgca agctgttgct ggagaaggtc ctcgtcctga tggcccgata taagaactct 360 gatcgctcca tgcaaattca gcgttatgtg atagatcttc tgtacaaaga cttgcctcat 420 cccccccgca gttatctgtg tccccccaca ggcggctctg cagtggtaac taattcactc 480 ggcaacataa aatacgcgtt tcgtaccgcc gacgggtcca attacaatcc cttattcccc 540 tctcttggca aagctgggtc tccatatgca cgctcagtcc ctggactccg tttcgtacca 600 aaacacgtac ttccagatcc tggtctcgtg ttcgacacgc tacttagacg agaggaattt 660 gttcctcatc ctggtgggat ctccagccta ttcttcgcat tcgcggactt ggtcatccat 720 agtattttca acacaaatca cacggattgg acaaagaacg atactagtag ctatctagat 780 ttaagtatcc tctacggaaa ctctgaaagt caggtgaatc aagtcagacg caaggacggg 840 acgggcaggc tttgggagga cgtattcgct gacagcagac tacttttcat gcctcctgct 900 agttgtgcac tattggtatt gttgagtcga aaccataatt acatcgctca gaagcttttg 960 aacatcaatg agaatggtac attcgttttt cctgttccgc aagacgaaca agcgcggctc 1020 gcccaagatg atgagatctt caatcgcgca cgaatggtta attgcggatt tttcctccag 1080 atcatcttag gagattatgt gggtgcaatt ttgggcctta ttcgtgacag gtccgattgg 1140 cgtctcgacc ctctcatgtc tatgcgagag tcagaccacg aggtttctcc gcaaggcaag 1200 ggaaacgtag tatctgtgga attcaatctt ctttaccggt ggcattctac attatcagcg 1260 caagatgctg aatggacaac aaacacgttc tcgaagctgt ttgagggcag agactcgagc 1320 cagatcaccg tccaagattt caagctggct gctcataagt acctgattcc gcacacggac 1380 gttaggacat gggagttcaa cggtctgaaa cgagaacctg atggacgctt caaagatgat 1440 gacttggcga gaactatcca agacgccact gaacatcgcg ctggagcctt taaagctaga 1500 ggaacacccg aagctcttcg tatcattgag atacttggaa ttgagcaagg cagagcctgg 1560 gggacatgtt cgctcaacga atttagaaaa tttttaggac tcaagcccta taaaacgttc 1620 aaggagtgga accccgacga aaagatacat actgctgcag cagctctata taaagatatc 1680 gagaatcttg aattacatgt cggccttcag gcagaagaaa caaaagtccc gggacctgga 1740 gcaggcttat gcccgggtta cactatctct agggccatct tggcagatgc tgtctctctg 1800 actcgggggg atccattctt taccactgaa tttactccgt tcaatttgac ctcgtggggg 1860 tacgaagact gtcaatacga tactaaggac ggttcctatg gtggaatcct cactaagcta 1920 ctcttccgaa cgttgcctga tcattacccg gctggatctg catatgctca cttccccttc 1980 cttgatccag tgtacatgag ggaaattctc accaaagatg tgaacctcgt caacaaatac 2040 acatggaccc gaccgcaact cccctctgtt accggcgtaa tcaacagttt taatggtgtc 2100 aagcaagtcc tgtccgaccc ttctttcgtg tctgcctaca acgaccgcat attcgacatc 2160 attacaactc ccccaacggc cgacaaggaa gaccataaat tgactatctt gcacaaaact 2220 cgcagcgact tcgttaaagg tcgcaaaaat gtcgagagcc tgcttccata ttcagagcct 2280 cctcatgaaa cttgggcagg atattttacg aaggaagtca aagctctgat tacagagaaa 2340 gcagtccacc atgttggaga taattcaaaa tacgttgaca tagttggaga cgtgatcaat 2400 ctggtgccag ttcgttgggt ttccgagaag attcttggac ttccgctcaa aactatctcc 2460 aacccctccg gtacttttta cgaacaagaa atgtataaga tgttcgcgaa tacggctcga 2520 tatgtcttct tgaacatcga tcccgcccat gattggcatt tacgggagag ctctgttgaa 2580 gcgtttagaa agatcttgaa cgtcacggag gctcatttag gctgggtgac accgacggaa 2640 attctcgacc atatagccat caaaaactat gatagtcacc ggtttttgaa gcgagtccgc 2700 gaggctggaa cagattatac caccaaagag ttggccgcac aagtattttc cgccgtggtt 2760 cctactgccg ccctcttctc acaagtcatt gcgcatgtgg tcgatttcta ccttgacgac 2820 gacaagcgaa atgaacgaga ggagattgtc aagttggttt ccgcgtgtca tgacaaagaa 2880 acggtcgcga aaattatggt ttatgttcaa gaagctctac gccttaatcc aactgtctcg 2940 ggtgtatacc gcacggcggg caaagatgtt tccatcgaac attctagagt tcaagctggt 3000 cagagaatct ttgccagcat tgtcaatgcc aatgttgata cttacagatt tggagcaact 3060 cctaccacag caacctacga caagcctgat aatgcggctg gaatctttgg gtttggagag 3120 tatggacttc tctctgctca gtttttcgaa tccaccgctc cgactattct aggaacagtg 3180 cttggactga aaaatctcaa acgtgcccca ggacagtctg gaaaatttgc taggttcacg 3240 gaagaattgc atggtagccc gcagcagtgg tacatcaata tgcaagggaa gactacccct 3300 ttcccggatt ccctcgttgt gcagttcgat atgc 3334 <210> 11 <211> 3854 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipoxygenase-3 <400> 11 atgtcgattg attctgttcc agatattgcc tatgacggtg aagcgaaggt ggaaactgat 60 cctgatgttg ctgttcttac gacttccccg gcgtctcagt ctctatactc tcccgcaata 120 ctggcattcg ttcccaacca tgataaatct ttgctgcaac gattgtggtt gaatggagat 180 ggcatcaaat caacgtcaac tagagctctt gattacaaag tggccaaaaa ggttgctatg 240 accttgttgc acaatgacaa gcaacgttct ccattagtcg atcttcataa ccctgctgct 300 caattatcgt ccacacagta tcccttcaca cgaaaggtcg aaacaccact cgcctccacg 360 caaacaccag accctcaact tgtattccag cgtttgatgc aggagaacca tgtcgtcgag 420 catccgaatg gaatttcggg tctagctttt gttctcgcta ctgttatttc gctttctctc 480 atccgtatca acgaaaagaa accagaatgc aacgaaacgt ctccttatct tgatctatct 540 cccctctatg gtgtgaatga tgcagagacg gatatggttc gtgctaagga cgggcgcgga 600 atgctctctc cggattgttt ctacgaggac cgtgtcatgt tactcccacc cgcagtgtcc 660 gcatttttga ttctttggaa cagaaatcac aatttcatcg cacgacttct tttgctgaat 720 aacgaaggaa acaaatgggt caaaccctct gacgatgcct tctcacctga tggtaacctc 780 gccgcgaacc tccaagcaca agacgacgag atcttcacca ttgcacgtct gataaactgt 840 gttcagttca agaacgttgt tgcagtggac ttcctaaaag tattgatggg gcttccacac 900 gacggaaaga gcgcagattt ggacatctca attgatcatg aacaattgga gaggggtaga 960 ggtcatgact ctagcatgga atctgctctt ctttataact ggacgtcaat gatagctaca 1020 gaagatgtca ggaaaatcga agaaacggtt gacgacgaat ttcacactac actcgatcag 1080 ctgtctgctg acgacgtgca gaacatgatg atgaatggta caaggaatcc ggatagacga 1140 taccgagaca gcgcaggcct caaacgcggg agagatggtc gcttccagga taatgatctt 1200 gctcgtgtcc tgcaagatgc gacaggatat catgcaggcg cgcccggcgc tcgtcgcatc 1260 ccctcatgct tccgcacctc tgaaatcatg attattgaac gagcgagacg gtggggcgta 1320 tgctctttca acgacttcag gaaattttta ggtctcaaag ttctaaagag cttccaagag 1380 tggaactcga accctgatgt tttcagggca gccgaggagc tctatggaag cattgacaac 1440 ttggaacttt atcctggcct ccaagctgag gacacatctg ggtccggtct tgggtttggt 1500 tgcacgatga cgtacggcct ctttgccgat attgtggcta taatgcgcag tgaccaccgt 1560 tttacgaccg aatttaccgc tggtaaatta actcaatggg gttacaatga ctgtactcgc 1620 cgtttgaata atggtgcctt cacctccacg ttgcctagat tattgcagcg aaattttcct 1680 cggaactatc catacgacaa cacctacagt ctgttcccct tgacctgtcc tgccacgacg 1740 aagacagcct tagccgattc gcgcaatcaa tacgatttcg agaggcccga agttcacaat 1800 gtcaaagtca tagagacgaa gagagcaata agttatgtct tcaacaaacc ctctgtatac 1860 caaacaatct atggcaagaa tctcgagaaa ttgacggacg gttatggcta tttcctgggt 1920 ttcgataacg aattgcttca tgatcgagat caaatgatga cactgtttgc actaattccg 1980 gacaaagggt ctttgtctcg acacgcatcc tatttcagta ctactgcggc tgcccttata 2040 agagacaaat cgatccaaaa caatgggcac aggtccgttg atatcgtacg agatgttatc 2100 aacacgacat gcactcgttg ggtatgcgag acactctgtg gacgctctct gtcagacggt 2160 gaggcgacaa aaaagcatga agaattcgca gctatttatg catatatttt tcgaactatc 2220 gatcccgaga ctgggtgggc ggtccgtgaa gctgccatgg atgccagttc aagactcgga 2280 aaagatatcg aacgtcatct gcccatcccc tccgacatcg gaggcacaaa ctggatcaac 2340 gatttcagaa gctgtctcat agatctatat tcatggttca ctcgaatctg tcaagagatg 2400 ggacccggga aggaattaac acaccgcgtg gccttgacct ttcttgacag gatggtcaag 2460 tcgaacagac agttccgcct tggcgagctc accaaccacg gccatctccg agacatcatt 2520 gatgattcca atgtccagag ccgagaagaa gcacttgaga agcgtcggat agtggcgaac 2580 gttttgggat tggctgtcgt tacggctgtc aactacgcac aaacatgtac acatgctgtt 2640 gatttttatc tcggcgatga acacgaagaa gaaaggaaag aaattgtacg actatcaatg 2700 ttgtcgccaa gagattcgcg gagccaaggc gcgaacaaga agatcatggg ttatattcgg 2760 gaagcacaaa gacttagcca gccattagga ctttggcgtg acgtcgtcga gaaggacttc 2820 atcccacaag gaaacggtgt agaagtccgc aaaggggatc gtatctttgc tgacttcaat 2880 aaggctcata aaaatgccat ggacttctgt catcctaaca agatagaccc agatcggaaa 2940 actccttcca tacagggtat gggacttcac aaatgtcctg gtataggctt tgtagacgag 3000 actatgccag agctctttaa atctatcttt cgcttgaaga atcttcgacg tgacagtggc 3060 aaggccggcc gcttggagat gtttgtttgc caccctgcgc ctgcccagtc agatccaaag 3120 gtatatttag atcccactgg cgagatctct catttccctc gatctctttc tttgttgtat 3180 gacgatgatg gctctgcgga ggggtccccc tcaaagctga aaaagcggaa atggagagtc 3240 cttcctggga agaagactga gaaattacgg cgtaacatgg atcaagccat tgcgagcttg 3300 gtagtggcga tctccctgct attcatcctg ctccaaatgt ttcatgttta ttcccaccat 3360 atgccctcat tccgatttcc tttctcttcg acacctaaac gccgagaccc accgccatcg 3420 atgggtgata tcaaagtaga tgtcgtagaa tgtccgacgc caacggaagt cttccaacca 3480 tatgagatcc atacgatgct cccaggttcc gacgggcatc cgattccact tgaatacacc 3540 atagaccacc ctaagccgca caagctgagt gtggtagaca tcgatgagcg ggacatgcag 3600 atggctgttt atgtagatga tgacctgaga ggactcacgc gggatttcga actgaaccaa 3660 acgatgaact gcggggagga tgtggcaaca tgtttgacga gtggattcag cgctggtgtt 3720 gttgtcgtac gacctggtaa acatacggtt aggatccagt gggtggggaa agactatata 3780 cctggtactc acgacatcga ctggggtaag gagcgaagcc ggcgtctgaa gtggcaacgg 3840 gagtactgtg ccat 3854 <210> 12 <211> 1557 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydroperoxide lyase <400> 12 atgtccctca agcattcttc cctctccgcc ttcatcccat cctccacttc acatcccccg 60 ctctacaatt ttccagtccc gtcttttctc aatatcaccg ggaaatcctt cacttggtta 120 tacaccaccc ttgcaatcgt ctttgctctt ctcgttctag agcagtcagt atatagatac 180 aagaaacgtc atttacctgg tgctaaatgg actattccta taatcggtaa attcgccgat 240 tccttgtcgc ctacccttga agggtacaag aaacagtggg attcgggtcc tttgagcgct 300 gtcagtgtgt tcaacatttt cattgtcatg gcctcttcaa atgactatgc ccgcaaaatt 360 ctcaactctc ccggctttgc cgaaccatgt attgtacatg ccgccaagtc aatcctcctt 420 tctgacaatt gggtcttcct gaacggaaaa gctcatactt catatcgccg tgttcttaac 480 agtctcttca cccgccgtgc actcagcatt tatattccaa tcgaagaaaa cattacgcgt 540 aaacatttcg ccaaatggct cgcgactgct tccaaggaat ccgcgcctca gaccatcatg 600 atgactgtac gtcacttgaa tatggataca tcattgaacg tcttctgcgg taaacatatc 660 tcagaagagg ccgctctgga gatcaacgaa aagtactggg ccatcacgaa ggctcttgaa 720 cttgtaaact tcccgctcgc tctccctggc acgaaagttt ataatgccat ccaagcccgt 780 aaatctgccc tccattggtt ggagcttgca gccaacagaa gcaagaaggc tatggccaat 840 ggtgcagagc cccagtgcat gttagacgag tgggttcaga tactcaacga cccctcatat 900 aacggcaggc gggatttcag tgatctggaa atggccatgg tcctcttctc gttcctgttc 960 gcatcgcagg acgctctgag cagtgccgtg atttatgggt tccagcactt ggcagaccat 1020 cctgaagttc ttgccaaaat acgagaggag caagagaaag tccgccaggg cgattaccag 1080 aagcctctga cgctcgaaat gatcgatcaa atgacttacc tcaacgcagt tgttaaggag 1140 agcttgagaa tcaagccacc cgtcaccatg atcccgtaca aggccttgaa agctttccca 1200 atctctgacg actacgttgt accccctggc agcatggtca tcccttcgtt ctttaactct 1260 ttgcacgatc cctccgtcta ccccgaaccc gaaacgttta atcccgaccg ctggcttgat 1320 cctgaaagtt ctgcaaacca gaatcccaag aacttcattg gttttggcag tggcccacac 1380 cgctgtatcg gatttgagta tactttcata aacattgcta tcgtgcttgc gaccgccgct 1440 gtcacgatga acattgagca tgatgttacc cccctcagcg acaaagtcga gattatcgcg 1500 acactgtttc ccaaagacgg atgtcgtctc agattatcgc cacggacaca acatcca 1557

Claims

삭제
송이버섯의 Total RNA를 분리하고 cDNA 를 합성하는 단계와;
상기 합성된 cDNA로부터 Lipoxygenase 유전자와 서열목록 12의 Hydroperoxi de lyase 유전자를 PCR 증폭하는 단계와;
상기 증폭된 각 Lipoxygenase 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자를 벡터에 유전자 클로닝하는 단계와;
상기 클로닝 된 각 Lipoxygenase 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자를 각 효모 발현 벡터에 유전자 클로닝하는 단계와;
상기 효모 발현 벡터를 효모로 형질전환하고 배양하여 1-octen-3-ol의 생합성을 확인하는 단계를 포함하는 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모의 제조방법에 있어서;
PCR 증폭하는 단계는 Lipoxygenase -1, -2 및 -3 중에서 선택되는 어느 하나의 유전자를 코딩하는 서열목록 9, 10 및 11의 염기서열과 Hydroperoxide lyase 유전자를 코딩하는 서열목록 12의 염기서열을 갖는 유전자를 증폭하고, 상기 발현벡터에 유전자 클로닝하는 단계는 pYES3/CT vector와 pYES2/CT vector를 1 : 1 비율로 사용하며, 상기 효모 배양하여 1-octen-3-ol의 생합성을 확인하는 단계는 SC medium 배지에서 3mM의 linoleic acid를 첨가하여 30℃에서 24시간 배양하는 것을 특징으로 하는 형질전환 효모의 제조방법.
제2항의 방법으로 제조된 1-octen-3-ol 생합성 형질전환 효모 KCTC13476BP.
삭제
삭제
삭제
삭제