WO2019164294A1 - 신규한 1-octen-3-ol을 생산하는 형질전환 효모 및 그 제조방법 - Google Patents

신규한 1-octen-3-ol을 생산하는 형질전환 효모 및 그 제조방법 Download PDF

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WO2019164294A1
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yeast
octen
lipoxygenase
vector
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천우재
이광선
김상웅
김종국
이난영
정민지
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경상북도
경북대학교 산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic

Definitions

  • the present application relates to a transformed yeast producing 1-octen-3-ol and a method for producing the same.
  • Saccharomyces cerevisiae was discovered by Leeuwenhoek in 1683 and is a representative yeast belonging to the aseptic fungus.
  • Yeast is a cheap source of fat and protein that yeast itself is used in feed. It contains abundant vitamin B group, and also contains vitamin D, and is also used in the pharmaceutical industry.
  • the first observation of yeast was the inventor of the microscope, Anton van Leeuwenhoek, and in 1680 a brewer's yeast was discovered. However, the biological significance of yeast fermentation was known in 1861, and Pasteur (Louis Pasteur) first identified that wine fermentation was caused by yeast.
  • Octenol (1-octen-3-ol) is one of the main flavor components of Matsutake mushrooms, which is involved in lipoxygenase and hydroperoxide lyase enzymes during biosynthesis. It is known.
  • Octenol (1-octen-3-ol) is a secondary alcohol derived from 1-octen, which is (R)-(-)-1-octen-3-ol and (S)-(+)-1-octen3 It exists in the form of two enantiomers of -ol.
  • (R)-(-)-1-octen-3-ol has a good aroma that is characteristic of fruit and pine mushrooms, but (S)-(+)-1-octen-3-ol has a smoky mold smell, weed odor, and artificial Smells. Therefore, (R)-(-)-1-octen-3-ol is known as the main fragrance component of Matsutake mushroom. Linoleic acid of the pine mushroom, substrate, is oxidized to (S) -1-hydroperoxy- (8E, 12Z) -8,12-octadecadienoic acid (10-HPODE) in the fruiting body and lipoxygenase is involved in this process. do. 10-HPODE is again used to biosynthesize (R)-(-)-1-octen-3-ol and 10-Oxo-trans-8-decenoic acid (ODA). Known as lyase.
  • Korean Patent Publication No. 10-2013-0100141 Conventionally known or commonly used method of preparing octenol (1-octen-3-ol) is disclosed in Korean Patent Publication No. 10-2013-0100141.
  • octenol is hydrogenated with 6-methyl-5-hepten-2-one (MH) to 6-methyl-2-heptanone (MHA), which is then reacted with acetylene to give 3,7-dimethyl-1-octin- It merely discloses a chemical preparation process that forms 3-ols (DMOIs) and then hydrogenates the DMOIs with 3,7-dimethyl-1-octen-3-ol (DMOE).
  • Korean Patent Nos. 10-1446315 and 10-1455204 disclose only the genes of lipoxygenase and hydroperoxide lyase involved in the biosynthesis of octenol derived from pine mushroom.
  • An object of the present application is to provide a transformed yeast for producing 1-octen-3-ol transformed with a recombinant vector comprising a nucleotide sequence encoding Lipoxygenase and a nucleotide sequence encoding Hydroperoxide.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing a transformed yeast for producing 1-octen-3-ol.
  • Another object of the present application is to provide a method for preparing 1-octen-3-ol.
  • the present application provides a transformation yeast for producing 1-octen-3-ol transformed with a recombinant vector comprising a nucleotide sequence encoding Lipoxygenase and a nucleotide sequence encoding Hydroperoxide.
  • the step of separating the total RNA of the pine mushroom and cDNA synthesis PCR amplifying Lipoxygenase gene and Hydroperoxide lyase gene from the synthesized cDNA; Gene cloning the amplified respective Lipoxygenase gene and Hydroperoxide lyase gene into a vector; gene cloning each of the cloned Lipoxygenase gene and Hydroperoxide lyase gene into each Yeast expression vector; It provides a method for producing 1-octen-3-ol production yeast comprising the step of transforming the yeast expression vector with yeast and confirming the biosynthesis of 1-octen-3-ol.
  • the present application is a hydroperoxide lyase consisting of a lipoxygenase-1,2,3 gene consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9, 10, and 11 and the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 12
  • Preparation of 1-octen-3-ol-producing transgenic yeast comprising the step of transforming and recombining a recombinant vector comprising a (hydroperoxide lyase) gene into yeast to confirm the biosynthesis of 1-octen-3-ol
  • homologues of the above nucleotide sequences are included within the scope of the present application.
  • the gene homologs each have at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% sequence homology with the nucleotide sequence of the present application SEQ ID NO. It may include a base sequence.
  • the "% sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).
  • the present application comprises the steps of culturing the 1-octen-3-ol production yeast of claim 1 in a medium for biosynthesis of 1-octen-3-ol; It provides a method for preparing 1-octen-3-ol comprising the step of obtaining the bio-synthesized 1-octen-3-ol.
  • primer has a length of 18 to 35mers at a nucleic acid site having at least 70% intersequence sequence homology in the sequence homology result of the gene determined by analysis, and the sense primer and the antisense primer do not hybridize with each other, It is preferred, but not limited to, an algorithm that determines the primer sequence such that the primer hybridizes under stringent conditions.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • Oligonucleotide primers used for PCR are designed to anneal to the opposite strand of DNA, and the DNA polymerase extension product of the primer serves as a template strand for other primers.
  • the PCR amplification process results in an exponential increase in the DNA sequence, and the length of the amplified DNA sequence is determined by the 5'-end of the oligonucleotide primer.
  • vector is used to refer to a DNA fragment (s), a nucleic acid molecule, that is delivered into a cell. Vectors can replicate DNA and be reproduced independently in host cells.
  • carrier is often used interchangeably with “vector”.
  • the vector can be used as a cloning vector, and the cloning vector is intended to be stably maintained in a host and to insert an external DNA fragment. Therefore, the vector and the foreign DNA should be easily inserted or removed when the restriction enzyme is processed.
  • Cloning vectors to be used are appropriately selected in consideration of the characteristics of the gene to be inserted, the characteristics of the restriction enzyme, but preferably pGEM easy vector is used in the present application.
  • yeast expression vector includes promoter genes, genes and terminators encoding target proteins from which translational initiation and termination codons have been removed, and promoter genes are referred to as GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1 and GAL10.
  • the gene is selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the yeast expression vector may be both an integrative yeast plasmid (YIp) and an extrachromosomal plasmid vector (extrachromosomal plasmid vector).
  • the extrachromosomal plasmid vector is divided into an episomal yeast plasmid (YEp), a replicative yeast plasmid (YRp) and a yeast centromeric plasmid (YCp).
  • yeast vectors are yeast replication plasmids that can be grown and selected in E. coli, containing the origin of replication ori and an antibiotic resistance cassette.
  • yeast vectors have ARS sequences capable of independent chromosome replication in yeast cells, such as HARS1 from H. polymorpha, and metabolic yeast selection markers such as URA3 or HLEU2.
  • various vectors may be used as the yeast expression vector, and specifically, pKLAC2 vector, Gateway pYES-DEST52 vector, pAO815 Pichia Expression vecotr, pYES2 / 3 / CT vector, preferably pYES3 / CT vector or pYES2 / CT.
  • Vector can be used.
  • the combination of vectors used to express each gene can be appropriately selected according to the gene to be expressed, the protein and the amount of the protein, and the ratio can be adjusted. Specifically in the present application, 1: 5, 1: 4, 1: 3, 1: 2. 1: 1 may be used, and preferably a pYES3 / CT vector and a pYES2 / CT vector are used at a ratio of 1: 1.
  • the term "gene cloning" of the present application binds a gene of interest to a vector having a self-replicating ability such as plasmid, phage, cosmid, etc., and introduces and propagates it into various hosts such as E. coli, yeast, etc. In other words, it refers to the technique of producing large quantities of the same gene population.
  • Cloning and subcloning in Escherichia coli is performed by binding a target gene amplified by a polymerase chain reaction (PCR) method to a vector having a replication initiation point and an antibiotic selection marker using a DNA ligase. After being introduced into the dorsal cells, cloning cells are selected by examining antibiotic resistance.
  • PCR polymerase chain reaction
  • yeast in the present application refers to Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sporobolomyces, Torulopsis, Trichosporon, Wickkerhamia (Wickerhamia), Ashbya, Blastomyces, Candida, Citeromyces, Crebrothecium, Cryptococcus, Debaryomyces ), Endomycopsis, Geotrichum, Hansenula, Kloeckera, Lipomyces, Pichia, Rhodosporidium or May be yeast belonging to the genus Rhodotorula, more preferably yeast belonging to Saccharomyces and Schizocarcinomyces, most preferably using Saccharomyces cerevisiae do.
  • the transformed yeast Saccharomyces cerevisiae of the present application KMG 1801, KMG 1802, KMG 1803 was assigned to the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resource Center (KCTC) dated February 6, 2018, respectively, KCTC13476BP and KCTC13477BP. And KCTC13478BP.
  • the promoters available in the expression construct may include GAL10 promoter, GAL1 promoter, ADH1 promoter, ADH2 promoter, PHO5 promoter, GAL1-10 promoter, TDH3 promoter, TDH2 promoter, TDH1 promoter, PGK promoter, PYK promoter, ENO promoter, T7 promoter and TPI promoter.
  • the promoter may be appropriately selected and used depending on conditions such as the expression rate of the gene, the amount of the final expressed product and the expression efficiency.
  • the method for culturing the transformed host cell may use a general method known in the art, but is not limited thereto.
  • “Transformation” of yeast is such that a nucleic acid molecule or vector is introduced into cells by standard methods known to those skilled in the art, preferably by electroporation, chemical transformation, transformation by plasma fusion, or particle bombardment. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Edited by: Fred M. Ausubel et al .; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), J. Sambrook and D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • the transgenic yeast of the present application is S.c. It was performed using the EasyComp Transformation kit.
  • the step of biosynthesizing 1-octen-3-ol by culturing the transformed yeast for producing 1-octen-3-ol of claim 1 in a medium Provided is a method for preparing 1-octen-3-ol comprising the step of obtaining the biosynthesized 1-octen-3-ol.
  • yeast culture of the present application was inoculated with transformed yeast in SC selectable medium lacking tryptophan and uracil, followed by overnight preculture, followed by centrifugation to collect yeast and tryptophan ( Tryptophan) and uracil (uracil) inoculated in the SC induction medium, can be incubated for 20 hours at 30 °C by adding 2% Tween-20 and linoleic acid.
  • the concentration of linoleic acid which is preferably a substrate, may be used in a range of 0.01 to 0.1 M, more preferably in a concentration of 0.5 to 100 mM and most preferably in a concentration of 3 mM.
  • the preferred culture temperature in the present application is 15 °C to 40 °C, more preferably 30 °C, the incubation time of 12 to 48 hours is used, specifically 18 to 36 hours, 20 to 26 hours, most Preferably 24 hours is used.
  • the present application provides a transformed yeast that biosynthesizes 1-octen-3-ol and a method for producing the same, which is effective for mass production of eco-friendly and economical octenol, and can contribute to the development of food and fragrance using pine flavour. It works.
  • Figure 1 is an electrophoretic picture showing the total RNA extracted from the cluster of the present application.
  • Figure 2 is an electrophoresis picture showing the amplification of Lipoxygenase-1 gene, Lipoxygenase-2 gene, Lipoxygenase-3 gene (Lane 1,2,3) and Hydroperoxide lyase (Lane 4) gene of the present application.
  • Figure 3 shows the results of inserting the Lipoxygenase-1 gene (A), Lipoxygenase-2 gene (B), Lipoxygenase-3 gene (C) and Hydroperoxide lyase gene (D) of the present application into the pGEM TM easy T vector plasmid Yeongdong picture.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a map of pYES3 / CT and pYES2 / CT yeast expression vectors.
  • Figure 5 shows the results of the insertion of the Lipoxygenase-1 gene, Lipoxygenase-2 gene, Lipoxygenase-3 gene (A) and Hydroperoxide lyase gene (B) into the plasmid It is a photograph of electrophoresis.
  • FIG. 6 (A) is a photograph of a plate cultured transgenic yeast in which the Lipoxygenase-1 gene, Lipoxygenase-2 gene, Lipoxygenase-3 gene and Hydroperoxide lyase gene were introduced.
  • FIG. 6 (B) is an electrophoretic photograph showing colony PCR results of transgenic yeast having Lipoxygenase-1 gene, Lipoxygenase-2 gene, Lipoxygenase-3 gene, and Hydroperoxide lyase gene.
  • FIG. 7 is a graph showing the growth curve of each yeast transformed with a combination of Lipoxygenase-1 gene, Lipoxygenase-2 gene, Lipoxygenase-3 gene and Hydroperoxide lyase gene.
  • Figure 8 (A) lysates of cells incubated without adding a substrate, (B) medium incubated without adding a substrate, (C) lysates in cells incubated with the addition of a substrate, and (D) cultured by adding a substrate This graph shows 1-octen-3-ol biosynthesis in a medium.
  • FIG. 9 is a graph showing the biosynthesis amount of 1-octen-3-ol according to (A) Linoleic acid addition concentration and (B) reaction temperature and reaction time in transformant yeast. to be.
  • Iso-propyl alcohol isopropyl alcohol
  • First strand cDNA was synthesized using Total RNA obtained in Example 1 and Accuscript High Fidelity 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Stratagene) by the following method. 1 ⁇ l of total RNA, 11.7 ⁇ l of RNase-free water, 2 ⁇ l of AccuScript RT buffer, 1 ⁇ l of Oligo dT primer, 0.8 ⁇ l of dNTP mixture, and reacted at 65 ° C. for 5 minutes and then at room temperature for 5 minutes, followed by DTT 100 mM, AccuScript. 1 ⁇ l of RT and 0.5 ⁇ l of RNase Block ribonuclease were further added and reacted at 42 ° C. for 1 hour, followed by 15 minutes at 70 ° C. to synthesize cDNA.
  • Example 3 PCR product preparation of Lipoxygenase-1,2,3 gene and Hydroperoxide lyase gene
  • Example 2 The cDNA synthesized and synthesized in Example 2 was used as PrimeSTAR TM HS Polymerase (TaKaRa) as a template, and the gene was amplified using the following primers (Table 1) and PCR conditions (Table 2). PCR was performed using the genes and restriction enzymes in SC selectable medium.
  • Lipoxygenase-1 (SEQ ID NO: 9) 98 ° C, 3min 98 ° C, 10sec 60 ° C, 15sec 72 ° C, 3min Lipoxygenase-2 (SEQ ID NO: 10) 98 ° C, 3min 98 ° C, 10sec 58 ° C, 15sec 72 ° C, 4min Lipoxygenase-3 (SEQ ID NO: 11) 98 ° C, 3min 98 ° C, 10sec 56 ° C, 15 sec 72 ° C, 4min Hydroperoxidelyase (SEQ ID NO: 12) 98 ° C, 3min 98 ° C, 10sec 59 ° C, 5sec 72 ° C, 2min
  • Lipoxygenase-1 gene (SEQ ID NO: 9, 3159 bp), Lipoxygenase-2 gene (SEQ ID NO: 10, 3333 bp), Lipoxygenase-3 gene (SEQ ID NO: 11, 3855 bp) (( Amplification of each lane 1,2,3) and Hydroperoxide lyase (SEQ ID NO: 12, 1,560 bp, Lane 4 of Figure 2) gene of Figure 2.
  • the amplification of the electrophoresis picture of Figure 2 is a DNA marker plus DNA Ladder Marker was used
  • Example 4 Gene Cloning with pGEM TM easy T Vector PCR products of Lipoxygenase-1 gene, Lipoxygenase-2 gene, Lipoxygenase-3 gene and Hydroperoxide lyase gene obtained in Example 3 were obtained.
  • pGEM TM easy T vector Promega
  • To clone into pGEM TM easy T vector (Promega), perform A-tailing process using Mighty TA-cloning Reagent Set (TaKaRa), then ligation with pGEM TM easy T vector at 4 °C overnight, ligation the vector was transformed into E.coli DH5 ⁇ competent cells (TaKaRa).
  • E.coli is ampicillin (100 ⁇ l / ml), IPTG (0.1mM), X-gal and plated on Luria Broth (LB) medium plate was added (50 ⁇ g / ml) for 16 to 18 hours at 37 °C After incubation, the plasmid was extracted using the Higene TM Plasmid Mini Prep Kit (Biofact), and the sequencing of the gene was performed by checking the size of the gene by electrophoresis to confirm that the gene was correctly inserted into the extracted plasmid.
  • the pGEM vector containing the Lipoxygenase-1 gene, Lipoxygenase-2 gene, and Lipoxygenase-3 gene for the expression of yeast was digested at 37 ° C with each restriction enzyme Hind III and Kpn I, and the hydroperoxide lyase gene was inserted.
  • the pGEM vector was digested by reacting each restriction enzyme Kpn I with EcoR I at 37 ° C.
  • the cleaved genes were quantified after purification with TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (TaKaRa).
  • pYES3 vector a yeast expression vector suitable for host cells.
  • the vector contains a pUc ori sequence for easy amplification in bacteria and a 2 ⁇ origin sequence for amplification in yeast.
  • the vector contains a restriction site that does not cleave the gene of interest, so that the gene can be correctly inserted into the vector.
  • the TRP1 gene sequence which is a selection marker marker
  • the V5 epitope and 6xHis tag sequence facilitate the detection of the expressed target protein.
  • PYES3 vector and selection marker markers were chosen as URA3 to other pYES2 vector types to transform a yeast two different genes together.
  • the pYES2 vector has the same characteristics as the pYES3 vector and is about 100bp larger in size (FIG. 4). Since the yeast into which each gene was inserted can be efficiently selected using the selection marker, cloning was performed using the following method.
  • Lipoxygenase-1 gene, Lipoxygenase-2 gene, Lipoxygenase-3 gene and pYES3 / CT vector (Invitrogen) and hydroperoxide lyase gene were reacted with pYES2 / CT vector (Invitrogen) overnight at 4 ° C for E.coli DH5 ⁇ competent cell.
  • TaKaRa was transformed, and plated on Luria Broth (LB) medium plate to which ampicillin (100 ⁇ l / ml), IPTG (0.1 mM) and X-gal (50 ⁇ g / ml) were added, and then 16 to 18 at 37 ° C. Incubated for hours. Next, plasmids were extracted from the selected E.
  • DNA ladder marker 1: pYES3 / CT
  • lane of Figure 5 (B) is the electrophoresis result of m: DNA ladder marker, 1: pYES2 / CT, 2: pYES2 / CT + Hydroperoxide lyase.
  • Saccharomyces cerevisiae competent cells were prepared using the SC EasyComp TM Transformation Kit (Invitrogen). Then, the pYES3 / CT vector into which the Lipoxygenase-1 gene, the Lipoxygenase-2 gene, and the Lipoxygenase-3 gene obtained in Example 5 were introduced and the pYES2 / CT vector into which the hydroperoxide lyase was introduced were mixed at a ratio of 1: 1. These vectors were transformed into S. cerevisiae competent cells (INVSc1). And tryptophan and uracil in the SC medium plate (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 2% glucose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements, 2% agar) .
  • the SC medium medium is effectively screened by the tryptophan and the uracil is a deletion minimal medium pYES3 with the TRP1 gene and the URA3 gene is pYES2 vector are all inserted in the transformant yeasts and were used so suitable for a target protein, the use
  • the composition of the SC medium medium is shown in Table 3 below.
  • Composition ratio (%, W / W) Composition breakdown 0.67% Yeast nitrogen base (without amino acids) 2% Carbon source (add raffinose for transformant selection and culture and galactose for protein expression) 0.01% Adenine, arginine, cysteine, leucine, lysine, threonine 0.005% Aspartic acid, histidine, isoleucine, methionine, phenylalanine, proline, serine, tyrosine, valine 2% Agar (for solid media) Total 100% 100% with H 2 O.
  • KCTC13476BP KCTC13477BP
  • KCTC13478BP KCTC13478BP
  • a combination of Lipoxygenase-1 gene, Lipoxygenase-2 gene, Lipoxygenase-3 gene, and Hydroperoxide lyase gene was transformed.
  • 5 mL of the culture was used as a sample for measuring the growth curve of yeast every 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36 hours after each culture.
  • each combination of genes obtained from Example 6 was selected from SC selectable medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base). , 2% raffinose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements), inoculated with transformed yeast overnight, followed by overnight incubation, followed by centrifugation to collect yeast, resulting in the induction of tryptophan and uracil. Inoculate with Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 1% raffinose, 2% galactose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements, and add 20% at 30 ° C by adding 2% Tween-20 and 1.5 mM linoleic acid.
  • SC induction medium Synthetic complete medium, 0.67 in which the pre-cultured yeasts were depleted of tryptophan and uracil to confirm 1-octen-3-ol biosynthesis in transgenic yeast according to reaction conditions.
  • Inoculated with% yeast nitrogen base, 1% raffinose, 2% galactose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements, and 2% Tween-20 and 3 mM linoleic acid were added at 12 and 24 ° C, respectively. Incubated for 36 and 48 hours.
  • the yeasts cultured by centrifugation were collected, sodium phosphate lysis buffer (50 mM sodium phosphate, 1 mM PMSF, 5% glycerol, 2% triton X-100; pH 6.5) and acid-washed glass beads (0.4 -0.6 mm size) was added for lysis with a bead beater, the cells were down by centrifugation, cell lysate supernatant was recovered, and 0.1 g of NaCl (for protein precipitation) was added to the same amount of diethyl ether (diethyl). ether was extracted and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (Aqilent 789OB GC & 5977B MSD).
  • DB-WAX 60m ⁇ 250 ⁇ m ⁇ 0.25 ⁇ m
  • helium carrier gas 60m ⁇ 250 ⁇ m ⁇ 0.25 ⁇ m
  • the column temperature was increased from 40 °C to 120 °C at 2 °C / min, and 240 °C at 120 °C.
  • the rate was raised to 20 ° C./min at a rate of 20 ° C./min.
  • the temperature of the injector was 250 ° C.
  • concentration of biosynthesized 1-octen-3-ol was compared with the 1-octen-3-ol standard (Sigma).
  • the present application relates to a transformed yeast producing 1-octen-3-ol and a method for producing the same, which is useful for the perfume industry and food development industry using pine mushroom flavor.

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Abstract

본 출원은 1-octen-3-ol을 생산하는 형질전환 효모의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 효모에 관한 것으로 송이버섯 향을 이용한 향장산업 및 식품개발 산업상 유용한 발명이다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 26.03.2019]　신규한 1-OCTEN-3-OL을 생산하는 형질전환 효모 및 그 제조방법
본 출원은 1-octen-3-ol을 생산하는 형질전환 효모 및 그 제조방법에 관한 것이다.
사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 1683년 Leeuwenhoek에 의해 발견되었으며 자낭균류에 속하는 대표적인 효모이다. 효모균은 효모 자체가 값싼 지방 및 단백질원으로 사료에 사용된다. 비타민 B군을 풍부하게 함유하고, 또 비타민 D를 함유하는 것도 있으며 의약품 공업에도 사용되고 있다. 효모를 처음으로 관찰한 것은 현미경의 발명자 레벤후크(Anton van Leeuwenhoek)이며 1680년에는 맥주 효모가 발견되었다. 그러나 효모 발효의 생물학적 의의가 알려진 것은 1861년이었으며 파스퇴르(Louis Pasteur)는 포도주 발효가 효모에 의해 일어난다는 사실을 최초로 규명하였다.
송이버섯의 주요 향기성분 중의 하나인 마츠다케올 (matsutakeol)로 알려진 옥텐올 (1-octen-3-ol)은 생합성 과정에서 리폭시게나아제(lipoxygenase)와 하이드로퍼옥사이드 리아제(hydroperoxide lyase) 효소가 관여하는 것으로 알려져 있다. 옥텐올(1-octen-3-ol)은 1-octen으로부터 유래되는 2차 알코올로, (R)-(-)-1-octen-3-ol과 (S)-(+)-1-octen3-ol의 두 가지 거울상 이성질체의 형태로 존재한다. (R)-(-)-1-octen-3-ol은 과일 향과 송이버섯 특유의 좋은 향이 나지만 (S)-(+)-1-octen-3-ol은 퀴퀴한 곰팡이 냄새, 잡초 냄새, 인위적인 냄새를 띤다. 따라서, (R)-(-)-1-octen-3-ol이 송이버섯의 주요 향기 성분으로 알려져 있다. 기질인 송이버섯의 리놀레산 (linoleic acid)은 자실체 내에서 (S)-1-hydroperoxy-(8E,12Z)-8,12-octadecadienoic acid (10-HPODE)로 산화되고 이 과정에서 리폭시게나아제가 관여한다. 그리고 10-HPODE는 다시 (R)-(-)-1-octen-3-ol과 10-Oxo-trans-8-decenoic acid(ODA)를 생합성하는데 사용되는데 이 과정에 관여하는 효소가 하이드로퍼옥사이드 리아제로 알려져 있다.
지금까지 화학합성 방법이 아닌 송이버섯의 리폭시게나아제와 하이드로퍼옥사이드 리아제의 유전자를 플라스미드 벡터를 이용하여 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에서 발현시킨 결과 옥텐올 (1-octen-3-ol)이 생합성되었음을 확인하는 옥텐올의 생합성 방법에 관한 연구는 미흡하다. 송이버섯은 특히 아시아에서 선호도가 매우 높은 식용버섯이므로, 옥텐올 (1-octen-3-ol)을 생합성하는 형질전환 효모는 송이향을 이용한 식품개발 등 관련 산업에 긍정적인 효과가 있을 것으로 예상된다.
종래 공지되거나 공용된 옥텐올(1-octen-3-ol)의 제조방법은 대한민국 공개특허 제 10-2013-0100141호에 개시되어 있다. 여기서는 옥텐올을 6-메틸-5-헵텐-2-온(MH)을 6-메틸-2-헵타논(MHA)으로 수소화하고, 이어서 이를 아세틸렌과 반응시켜 3,7-디메틸-1-옥틴-3-올(DMOI)을 형성한 다음 DMOI를 3,7-디메틸-1-옥텐-3-올(DMOE)로 수소화시켜 합성하는 화학적 제조방법을 개시하고 있을 뿐이다. 또, 대한민국 등록특허 제 10-1446315호 및 제 10-1455204호에는 송이버섯에서 유래한 옥텐올의 생합성에 관여하는 각 리폭시게나아제와 하이드로퍼옥사이드 리아제의 유전자를 개시하고 있을 뿐이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 효모를 이용한 옥텐올(1-octen-3-ol)의 제조 방법을 개발하기 위하여 예의 연구함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 목적은 Lipoxygenase를 코딩하는 염기서열과 Hydroperoxide를 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 1-octen-3-ol의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 실시 양태의 설명 및 실시 형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 Lipoxygenase를 코딩하는 염기서열과 Hydroperoxide를 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모를 제공한다.
본 출원의 일 양태에 따르면, 송이버섯의 Total RNA를 분리하고 cDNA 합성하는 단계와; 상기 합성된 cDNA로부터 Lipoxygenase 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자를 PCR 증폭하는 단계; 상기 증폭된 각 Lipoxygenase 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자를 벡터에 유전자 클로닝하는 단계;상기 클로닝 된 각 Lipoxygenase 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자를 각 Yeast expression vector에 유전자 클로닝하는 단계; 상기 Yeast expression vector를 효모로 형질전환하고 배양하여 1-octen-3-ol의 생합성을 확인하는 단계를 포함하는 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모의 제조방법을 제공한다.
본 출원의 일 구현예로, 본 출원은 각 서열번호 9, 10, 11의 염기서열로 이루어진 리폭시게나아제(lipoxygenase)-1,2,3 유전자와 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 하이드로퍼옥사이드 리아제(hydroperoxide lyase)를 유전자 클로닝하여 포함하는 재조합 벡터를 효모에 형질전환시켜 배양하여 1-octen-3-ol의 생합성을 확인하는 단계를 포함하는 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모의 제조방법을 제공한다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 출원의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자 상동체는 본 출원 서열번호의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 출원의 일 양태에 따르면, 본 출원은 청구항 제1항의 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모를 배지에서 배양하여 1-octen-3-ol을 생합성하는 단계; 상기 생합성된 1-octen-3-ol 을 수득하는 단계를 포함하는 1-octen-3-ol 의 제조방법을 제공한다.
용어 "프라이머"는 분석을 통해 결정된 유전자의 서열 상동성 결과에서 70% 이상의 종간 서열 상동성을 가지는 핵산 부위에서 18 내지 35머 길이를 가지고, 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머가 서로 혼성화 되지 않으며, 상기 유전자와 프라이머가 엄격한 조건에서 혼성화되도록 프라이머 서열을 결정하는 알고리즘인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "PCR(중합효소 연쇄반응)"이란 핵산 증폭 방법으로 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형에로의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis 등, 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al, 1985). PCR에 이용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 DNA의 반대쪽 가닥에 어닐링되도록 디자인되며, 프라이머의 DNA 중합효소 연장 생성물은 다른 프라이머를 위한 주형 가닥으로 작용한다. PCR 증폭 과정은 DNA 서열의 지수적 증가를 초래하며, 증폭된 DNA 서열의 길이는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'-말단에 의해 결정 된다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 상기 벡터는 클로닝 벡터로 사용될 수 있으며, 클로닝 벡터란, 숙주 내에서 안정적으로 유지되고 외부 DNA 조각을 삽입하려는 용도를 가지고 있다. 그러므로 벡터와 외부 DNA를 제한효소로 처리할 때 쉽게 삽입되거나 제거할 수 있는 특징을 가져야 한다. 사용되는 클로닝 벡터는 삽입하려는 유전자의 특징, 제한효소의 특징의 조건을 고려하여 적절하게 선정되나 본 출원에서 바람직하게는 pGEM easy vector 가 사용된다. 용어 "yeast expression vector(효모 발현 벡터)"는 프로모터 유전자, 해독개시 및 종결코돈이 제거된 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 터미네이터를 포함하며, 프로모터 유전자는 GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1 및 GAL10으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 yeast expression vector는 조합 효모 플라스미드(YIp : integrative yeast plasmid) 및 염색체 외 플라스미드 벡터 (extrachromosomal plasmid vector)가 모두 가능하다. 상기 염색체 외 플라스미드 벡터는 에피솜 효모 플라스미드(YEp : episomal yeast plasmid), 복제 효모 플라스미드(YRp : replicative yeast plasmid) 및 효모 중심체 플라스미드(YCp : yeast centromer plasmid)로 나뉘어진다. 더 나아가, 인위적 효모 염색체들(YACs : artificial yeast chromosomes)도 본 출원에 따른 발현 벡터로서 가능하다. 또한, 특히 바람직한 효모 벡터는 복제 원점 ori 및 항생물질 저항성 카세트(antibiotic resistance cassette)를 함유하여 대장균(E. coli)에서 증식되고 선택될 수 있는 효모 복제 플라스미드(yeast replication plasmid)이다. 더 나아가, 이들은 H. polymorpha로부터의 HARS1과 같이 효모 세포에서 염색체와 관계없이 독립적 복제를 할 수 있는 ARS 서열, 그리고 URA3 또는 HLEU2와 같은 대사성 효모 선택 마커(metabolic yeast selection marker)를 가진다. 본 출원에서는 yeast expression vector로서 다양한 vector가 사용될 수 있으며, 구체적으로 pKLAC2 vector, Gateway pYES-DEST52 vector, pAO815 Pichia Expression vecotr, pYES2/3/CT vector 가 있으며, 바람직하게는 pYES3/CT vector 또는 pYES2/CT vector가 사용될 수 있다. 각 유전자를 발현시키기 위하여 사용하는 vector의 조합은 발현시키고자 하는 유전자, 그 단백질 그리고 해당 단백질의 양에 따라 적절히 선택하여 그 비율을 조절할 수 있다. 본 출원에서는 구체적으로, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2. 1:1이 사용될 수 있고, 바람직하게는 pYES3/CT vector와 pYES2/CT vector를 1:1의 비율로 사용한다.
본 출원의 용어 "유전자 클로닝"은 목적 유전자를 플라즈미드(plasmid), 파지(phage), 코스미드(cosmid) 등의 자기 복제능력을 갖는 벡터에 결합하여 대장균, 효모 등의 다양한 숙주에 도입하여 증식시킴으로써, 동일한 유전자 집단을 대량으로 만들어내는 기술을 말한다. 대장균에 있어서의 클로닝 및 서브 클로닝은 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 방법 등에 의해 증폭된 목적 유전자를 DNA 리가제(ligase)를 사용하여 복제 개시점과 항생제의 선택 표식을 갖는 벡터에 결합하여 대장균이나 효모 등 세포 안에 도입한 후, 항생제 내성을 조사함으로써 클로닝된 세포를 선별하는 방법으로 실시된다.
본 출원의 용어 "효모"는 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 스포로보 로마이세스(Sporobolomyces), 토루로프시스(Torulopsis), 트리코스포론(Trichosporon), 윅커하미아 (Wickerhamia), 아쉬바이아(Ashbya), 블라스토마이세스(Blastomyces), 캔디다(Candida), 사이테로마이세스 (Citeromyces), 크레브로테슘(Crebrothecium), 크립토코커스(Cryptococcus), 드바리오마이세스(Debaryomyces), 에노마이코프시스(Endomycopsis), 지오트리컴(Geotrichum), 한세눌라(Hansenula), 클로엑케라(Kloeckera), 리포마이세스(Lipomyces), 피키아(Pichia), 로도스포리듐(Rhodosporidium) 또는 로도토룰라(Rhodotorula) 속 (genus)에 속하는 효모일 수 있고, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 및 스키조사카로마이세스에 속하는 효모일 수 있고, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시에를 사용한다. 유전자의 발현율 및 최종 발현되는 산물의 양과 효율에 따라 적절한 종류의 효모를 선택하여 사용할 수 있다. 본 출원의 형질전환된 효모 사카로마이세스 세레비지에 KMG 1801, KMG 1802, KMG 1803은 은 2018년 2월 6일자 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 각각 기탁번호 제 KCTC13476BP호, KCTC13477BP호 및 KCTC13478BP호로 기탁되었다.
예를 들어, 숙주 세포가 효모인 경우, 상기 발현 컨스트럭트에서 이용 가능한 프로모터는 GAL10 프로모터, GAL1 프로모터, ADH1 프로모터, ADH2 프로모터, PHO5 프로모터, GAL1-10 프로모터, TDH3 프로모터, TDH2 프로모터, TDH1 프로모터, PGK 프로모터, PYK 프로모터, ENO 프로모터, T7 프로모터 및 TPI 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 프로모터는 유전자의 발현율 및 최종 발현되는 산물의 양과 발현 효율 등의 조건에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
본 출원의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 방법은 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 효모의 "형질전환"은 핵산 분자 또는 벡터를 당업자에게 공지된 표준 방법, 바람직하게는 전기천공, 화학적 형질전환, 원형질 융합에 의한 형질전환, 또는 입자 밤바드먼트(bombardment)에 의해 세포 내로 도입되게 한다(참조: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Edited by: Fred M. Ausubel et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) , J. Sambrook and D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press). 본 출원의 바람직한 구현예에 따르면 본 출원의 형질전환 효모는 S.c. EasyComp Transformation kit를 이용하여 실시하였다.
본 출원의 일 구현예로, 청구항 제1항의 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모를 배지에서 배양하여 1-octen-3-ol을 생합성하는 단계; 상기 생합성된 1-octen-3-ol 을 수득하는 단계를 포함하는 1-octen-3-ol 의 제조방법에 제공된다.
본 출원의 효모의 배양은 1-octen-3-ol의 생합성을 확인하기 위해서 tryptophan과 uracil이 결실된 SC selectable medium에 형질전환 효모를 접종하여 overnight 전배양한 다음, 원심분리하여 효모를 모아 트립토판(tryptophan)과 유라실(uracil)이 결실된 SC induction medium에 접종하고, 2% Tween-20과 linoleic acid를 첨가하여 30℃에서 20시간 동안 배양할 수 있다. 본 출원에서 바람직하게는 기질인 linoleic acid의 농도는 0.01 내지 0.1M이 사용될 수 있고, 더 바람직하게는 0.5 내지 100mM의 농도가 사용되고 가장 바람직하게는 3mM의 농도가 사용된다. 또한 본 출원에서 바람직한 배양 온도는 15℃ 내지 40℃, 더 바람직하게는 30℃이며, 배양 시간은 12 내지 48시간 동안의 배양시간이 사용되고, 구체적으로는 18 내지 36시간, 20 내지 26시간, 가장 바람직하게는 24시간이 사용된다.
본 출원은 1-octen-3-ol을 생합성하는 형질전환 효모를 및 그 제조방법을 제공하여 친환경적이고 경제적인 옥텐올의 대량생산에 효과적이고, 송이향을 이용한 식품 및 향장 개발에 기여할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 본 출원의 송이로부터 추출된 total RNA를 나타내는 전기영동 사진도이다.
도 2는 본 출원의 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자 (각 Lane 1,2,3)와 Hydroperoxide lyase(Lane 4) 유전자의 증폭을 나타내는 전기영동 사진도이다.
도 3은 본 출원의 Lipoxygenase-1 유전자(A), Lipoxygenase-2 유전자(B), Lipoxygenase-3 유전자(C)와 Hydroperoxide lyase 유전자(D)가 pGEM™ easy T vector 플라스미드에 삽입된 결과를 나타내는 전기영동 사진도이다.
도 4는 pYES3/CT 및 pYES2/CT yeast expression vector의 맵을 나타내는 모식도이다.
도 5는 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자(A)와 Hydroperoxide lyase 유전자(B)가 플라스미드에 삽입된 결과를 나타내는 전기영동 사진도이다.
도 6(A)는 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자가 도입된 형질전환 효모를 배양한 플레이트의 사진도이다. 도 6(B)는 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자가 도입된 형질전환 효모의 colony PCR 결과를 나타내는 전기영동 사진도이다.
도 7은 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자의 조합이 형질전환된 각 효모의 생장곡선을 나타내는 그래프이다.
도 8은 (A) 기질을 첨가하지 않고 배양한 cell의 lysates, (B) 기질을 첨가하지 않고 배양한 medium, (C) 기질을 첨가하여 배양한 cell의 lysates, (D) 기질을 첨가하여 배양한 medium 에서의 1-octen-3-ol 생합성을 나타내는 그래프이다.
도 9는 형질전환체 효모에서 (A) Linoleic acid 첨가 농도에 따른 1-octen-3-ol 생합성량과 (B) 반응 온도 및 반응 시간에 따른 1-octen-3-ol의 생합성량을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 출원에 따른 실시예를 통하여 본 출원을 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만 본 출원의 하기 실시예는 본 출원의 일 예시에 불과하다. 이들 실시예는 본 출원을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예1 : 송이버섯의 Total RNA 분리
대구 인근 가창지역에서 채취한 송이 자실체로부터 Total RNA를 분리 하였다. 송이 자실체를 3 내지 5cm의 작은 조각으로 자른 뒤, 액체 질소를 사용하여 막자 사발로 곱게 마쇄하였다. 마쇄한 자실체를 TRIZol 1 mL 에 완전히 용해시킨 다음 클로로포름(chloroform)을 첨가하였고, 15분간 원심분리하여 RNA를 분리하였다. RNA가 포함된 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 동량의 이소프로필 알코올(Iso-propyl alcohol)을 첨가하여 상온에서 15분간 반응시키고 10분간 12,000rpm에서 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 다음, 상층액을 제거하고 75% 에틸알코올(ethyl alcohol)을 첨가하여 세척한 후 DEPC 처리수(DEPC(diethypyrocarbonate)-treated water)를 첨가하여 Total RNA를 용출, 분리하였고, 그 결과 Total RNA concentration은 992.8ng/㎕로 확인되었다(A260/A280=1.886)(도 1, 첫번째 레인은 DNA marker이며, 2~4레인은 Total RNA를 나타낸다).
*실시예2 : 송이버섯의 cDNA 합성
상기 실시예1에서 수득한 Total RNA와 Accuscript High Fidelity 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Stratagene)을 사용하여 First strand cDNA를 다음의 방법으로 합성하였다. Total RNA 1 ㎕, RNase-free water 11.7 ㎕, AccuScript RT buffer 2 ㎕, Oligo dT primer 1 ㎕, dNTP mixture 0.8 ㎕를 혼합하여 65℃에서 5분, 다음 상온에서 5분간 반응시킨 후 DTT 100 mM, AccuScript RT 1 ㎕, RNase Block ribonuclease 0.5 ㎕를 더 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시킨 다음 70℃에서 15분 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
실시예3: Lipoxygenase-1,2,3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자의 PCR 산물 제작
상기 실시예2에서 합성, 수득한 cDNA를 주형으로 PrimeSTARTM HS Polymerase (TaKaRa)를 이용하고 하기의 프라이머(primer)(표 1) 및 PCR 조건(표 2)을 사용하여 유전자를 증폭시켰다. SC 선택적 배지(SC selectable medium)에서 해당 유전자 및 제한효소를 사용하여 PCR을 수행하였다.
Name Sequences (5'-3') Restriction enzyme
LOX1-F-HindIII(서열번호 1) AAGCTT AACACAATGTCCTTAAGCAAGTTTCCG HindIII
LOX1-R-KpnI(서열번호 2) GGTACCACCTTCGTTACATCATACTGTAT KpnI
LOX2-F-KpnI(서열번호 3) GGTACC AACACAATGTTGACGCGGTTATTTAAG KpnI
LOX2-R-NotI(서열번호 4) GCGGCCGCATATCGAACTGCACAACGAGGG NotI
LOX3-F-HindIII(서열번호 5) AAGCTT AACACAATGTCGATTGATTCTGTTCCA HindIII
LOX3-R-KpnI(서열번호 6) GGTACCATGGCACAGTACTCCCGTTGCCA KpnI
HPL-F-KpnI(서열번호 7) GGTACC AACACAATGTCCCTCAAGCATTCTTCC KpnI
HPL-R-EcoRI(서열번호 8) GAATTCTGGATGTTGTGTCCGTGGCGATA EcoRI
Target gene Pre-denaturation Denaturation Anealing Extension
Lipoxygenase-1(서열번호 9) 98°C, 3min 98°C, 10sec 60°C, 15sec 72°C, 3min
Lipoxygenase-2(서열번호 10) 98°C, 3min 98°C, 10sec 58°C, 15sec 72°C, 4min
Lipoxygenase-3(서열번호 11) 98°C, 3min 98°C, 10sec 56°C, 15sec 72°C, 4min
Hydroperoxidelyase(서열번호 12) 98°C, 3min 98°C, 10sec 59°C, 5sec 72°C, 2min
실험결과, 전기영동 사진도를 통하여 각 Lipoxygenase-1 유전자(서열번호 9, 3159 bp), Lipoxygenase-2 유전자(서열번호 10, 3333 bp), Lipoxygenase-3 유전자(서열번호 11, 3855 bp)((도 2의 각 Lane 1,2,3)와 Hydroperoxide lyase(서열번호 12, 1,560 bp, 도 2의 Lane 4) 유전자의 증폭을 확인하였다. 도 2의 전기영동 사진도의 첫번째 레인은 DNA marker으로 Plus DNA Ladder Marker가 사용되었다.실시예4: pGEM™ easy T vector를 이용한 유전자 클로닝상기 실시예3에서 수득한 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자의 PCR 산물을 각 pGEM™ easy T vector (Promega)로 클로닝하기 위해서 Mighty TA-cloning Reagent Set (TaKaRa)을 사용하여 A-tailing 과정을 수행 한 뒤, pGEM™ easy T vector와 4℃에서 overnight하여 ligation 시킨 후, ligation된 vector를 E.coli DH5α competent cells (TaKaRa)에 형질전환하였다. 다음, E.coli는 ampicillin (100 μl/ml), IPTG (0.1mM), X-gal(50 μg/ml)을 첨가한 Luria Broth (LB) medium plate에 도말하여 37℃에서 16 내지 18시간 동안 배양한 뒤, Higene™ Plasmid Mini Prep Kit (Biofact)를 사용하여 플라스미드를 추출하였다. 추출한 플라스미드에 유전자가 정확하게 삽입되었는지 확인하기 위하여 전기영동으로 유전자의 크기를 확인한 다음 해당 염기서열 시퀀싱을 수행하였다.
실험 결과, lipoxygenase-1 유전자(도 3(A)), Lipoxygenase-2 유전자(도 3(B)), Lipoxygenase-3 유전자(도 3(C))와 Hydroperoxide lyase 유전자(도 3(D))가 pGEM™ easy T vector 플라스미드에 정확히 삽입된 것을 확인하였다.
실시예5: Yeast expression vector를 이용한 유전자 클로닝
Yeast에서의 유전자 발현을 위한 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자가 삽입된 pGEM vector를 각 제한효소 HindIII 와 KpnI으로 37℃에서 반응시켜 절단하였고, Hydroperoxide lyase 유전자가 삽입된 pGEM vector를 각 제한효소 KpnI 와 EcoRI으로 37℃에서 반응시켜 절단하였다. 절단된 유전자들은 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (TaKaRa)으로 정제한 후 정량하였다. 상기 유전자를 발현시키기 위한 미생물 모델로서 Saccharomyces cerevisiae 종을 선택한 후, 효율적인 단백질 발현을 위해 host cell에 적합한 yeast expression vector인 pYES3 벡터(Invitrogen사)를 선택하였다. 본 벡터는 pUc ori 서열이 포함되어 있어 박테리아에서 증폭이 쉽고, 2μ origin 서열이 포함되어 있어 효모에서도 증폭이 가능하다. 또한 이 벡터에는 목적 유전자를 절단하지 않는 제한효소 자리가 multiple cloning site에 있어 벡터에 유전자를 정확하게 삽입할 수 있었다. 강력한 프로모터인 GAL1 프로모터가 있고, T7 프로모터와 CYC1 서열이 있어 유전자의 삽입과 삽입된 서열을 유전자 염기서열 분석으로 정확하게 파악할 수 있다. 그리고 선택 표지 마커인 TRP1 유전자 서열이 존재하여 벡터가 삽입된 효모를 쉽게 선별할 수 있으며, V5 epitope와 6xHis tag 서열이 있어 발현된 타겟 단백질 검출에 용이하다. 종류가 다른 두 유전자를 함께 효모에 형질전환시키기 위하여 pYES3 벡터와 선택 표지 마커가 URA3로 다른 pYES2 벡터를 선택하였다. pYES2 벡터는 pYES3 벡터와 그 외의 특징은 같고 크기는 약 100bp정도 더 크다 (도 4). 선택 표지 마커를 이용하여 각 유전자가 모두 삽입된 효모를 효율적으로 선별할 수 있으므로, 다음의 방법을 이용하여 클로닝을 하였다. Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자는 pYES3/CT vector (Invitrogen)와, Hydroperoxide lyase 유전자는 pYES2/CT vector (Invitrogen)와 4℃에서 overnight ligation 반응을 시켜 E.coli DH5α competent cell(TaKaRa)에 형질전환하였고, ampicillin (100 μl/ml), IPTG (0.1mM), X-gal (50 μg/ml)을 첨가한 Luria Broth (LB) medium plate에 도말하여 37℃에서 16 내지 18시간 동안 배양하였다. 다음, 선별된 E.coli 로부터 Higene™ Plasmid Mini Prep Kit (Biofact)를 사용하여 플라스미드를 추출하였고, 추출한 플라스미드는 각 유전자가 정확하게 삽입되었는지 확인하기 위하여 전기영동으로 크기를 확인한 다음 염기서열 시퀀싱을 수행하였다. 실험 결과, Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자가 플라스미드에 정확히 삽입된 것을 확인하였다(도 5). 즉, 도 5(A)의 lane은 m: DNA ladder marker, 1: pYES3/CT, 2: pYES3/CT + Lipoxygenase-1 유전자, 3: pYES3/CT + Lipoxygenase-2 유전자, 4: pYES3/CT + Lipoxygenase-3 유전자이며, 도 5(B)의 lane은 m: DNA ladder marker, 1: pYES2/CT, 2: pYES2/CT + Hydroperoxide lyase 의 전기영동 결과이다.
실시예6: Yeast expression vectors의 INVSc1 효모로의 형질전환
S.C. EasyComp™ Transformation Kit (Invitrogen)를 사용하여 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) competent cell을 제조하였다. 그리고 상기 실시예5에서 수득한 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자가 도입된 pYES3/CT vector와 Hydroperoxide lyase가 도입된 pYES2 /CT vector를 각 1 : 1 의 비율로 혼합한 다음 이 벡터들을 S. cerevisiae competent cell(INVSc1)에 형질전환하였다. 그리고 트립토판(tryptophan)과 유라실(uracil)이 결실된 SC medium plate (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 2% glucose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements, 2% agar)에 상기 S. cerevisiae competent cell(INVSc1)을 도말하여 30℃에서 2 내지 3일간 배양하였다(도 6(A)). 상기 SC medium 배지는 tryptophan과 uracil이 결실된 최소배지로 TRP1 유전자가 있는 pYES3와 URA3 유전자가 있는 pYES2 벡터가 모두 삽입된 형질전환체 효모를 효율적으로 선별하고 타겟 단백질 발현에 적합하므로 사용되었고, 사용된 SC medium 배지의 조성은 다음 표 3과 같다.
조성비 (%, W/W) 조성 내역
0.67% Yeast nitrogen base (without amino acids)
2% Carbon source (형질전환체 선별 및 배양을 위한 raffinose 및 단백질 발현을 위한 galactose를 첨가)
0.01% Adenine, arginine, cysteine, leucine, lysine, threonine
0.005% Aspartic acid, histidine, isoleucine, methionine, phenylalanine, proline, serine, tyrosine, valine
2% Agar(고체 배지인 경우)
Total 100% H2O로 100%를 구성한다.
다음, Colony PCR을 수행하여 두 종류의 유전자가 도입된 형질전환 효모를 선별한 결과, Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자가 Yeast expression vector를 통하여 INVSc1에 형질전환된 것을 확인하였다 (도 6(B)). 각 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자가 1:1의 비율로 형질전환된 각 효모 KMG 1801, KMG 1802, KMG 1803은 2018년 2월 6일자 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 각 기탁번호 제 KCTC13476BP호, KCTC13477BP호 및 KCTC13478BP호로 기탁되었다.또한, 각각의 Lipoxygenase-1 유전자, Lipoxygenase-2 유전자, Lipoxygenase-3 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자의 조합이 형질전환된 효모의 생장을 확인하기 위하여, 해당 배양액의 5mL는 각 배양 후 0,4, 8,12,16,20,24,28,32,36시간마다 효모의 생장곡선 측정을 위한 시료로 사용되었다.측정 결과 KMG 1801(기탁번호 제 KCTC13476BP호, 도 7(A))와 KMG 1802(기탁번호 KCTC 13477BP호, 도 7(B))가 8 내지 12시간 구간에서 빠르게 성장하고, KMG 1803(기탁번호 제KCTC13478BP호, 도 7(C))은 28 내지 32시간 구간에서 빠르게 성장하는 것을 확인할 수 있었다.실시예7: Lipoxygenase과 Hydroperoxide lyase 유전자가 도입된 형질전환 효모에서 1-octen-3-ol 생합성의 확인
상기 실시예6으로부터 수득한 각 유전자의 조합이 형질전환된 효모에서의 1-octen-3-ol의 생합성을 확인하기 위해서 tryptophan과 uracil이 결실된 SC selectable medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 2% raffinose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 형질전환 효모를 접종하여 overnight 전배양한 다음, 원심분리하여 효모를 모아 트립토판(tryptophan)과 유라실(uracil)이 결실된 SC induction medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 1% raffinose, 2% galactose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 접종하고, 2% Tween-20과 1.5mM linoleic acid를 첨가하여 30℃에서 20시간 동안 배양하였다. 원심분리로 배양한 효모와 medium을 분리하고 효모에 인산나트륨 용해 완충액(sodium phosphate lysis buffer (50 mM sodium phosphate, 1 mM PMSF, 5% glycerol, 2% triton X-100; pH 6.5)과 acid-washed glass beads (0.4 - 0.6 mm size)를 첨가하여 bead beater로 lysis한 다음, 원심분리로 균체를 다운시키고 세포용해 상층액을 회수하였다. 다음, 생성된 1-octen-3-ol을 확인하기 위해서 lysates와 배양한 medium을 70℃에서 35분 동안 SPME (solid phase microextraction)에 휘발성 성분을 추출하여 기체 크로마토그래피-질량분석법 (Gas chromatography-mass spectrometry (Aqilent 789OB GC & 5977B MSD))로 분석하였다. 기체 크로마토그래피 질량 분석을 위하여 DB-WAX(60m × 250μm × 0.25μm)와 helium carrier gas를 사용하였으며, 컬럼(column)의 온도는 40℃에서 120℃까지 2℃/min의 속도로 높였으며, 120℃에서 240℃까지 20℃/min의 속도로 높였다. Injector의 온도는 250℃로 하였다.
실험 결과, 도 8과 같이 (A) 기질을 첨가하지 않고 배양한 cell의 lysates와 (B) 기질을 첨가하지 않고 배양한 medium에서는 peak가 관찰되지 않았으나, (C) 기질을 첨가하여 배양한 cell의 lysates와 (D) 기질을 첨가하여 배양한 medium 에서는 38.27 min에 1-octen-3-ol의 peak가 확인되었다.
한편, 각각의 Lipoxygenase 유전자와 Hydroperoxide lyase의 조합에 따른 1-octen-3-ol 생합성에 대한 결과는 표 4와 같다. 표 4에 따르면 송이버섯 자실체에서 발견된 유전자 Lipoxygenase-1, Lipoxygenase-2, Lipoxygenase-3와 Hydroperoxide lyase의 각 조합이 도입된 효모에서 모두 1-octen-3-ol의 생합성 효과가 있었으며, 조합의 종류에 따라 생합성의 정도는 다름을 확인하였다. 또한, 1-octen-3-ol 생합성율(Concentration)은 Lipoxygenase-1을 이용한 경우가 가장 높음이 확인되었다.
Protein combination Retention time (min) Concentration(mg/L)
1 Lipoxygenase-1 + Hydroperoxide lyase 38.270 0.66
2 Lipoxygenase-2 + Hydroperoxide lyase 38.269 0.33
3 Lipoxygenase-3 + Hydroperoxide lyase 38.270 0.58
4 Lipoxygenase-1+2 + Hydroperoxide lyase 38.271 0.42
5 Lipoxygenase-1+3 + Hydroperoxide lyase 38.271 0.38
6 Lipoxygenase-2+3 + Hydroperoxide lyase 38.270 0.27
7 Lipoxygenase-1+2+3+ Hydroperoxide lyase 38.267 0.56
실험예1: 기질의 농도와 반응조건에 따른 1-octen-3-ol 생합성의 최적화기질의 농도와 반응조건에 따른 형질전환 효모의 1-octen-3-ol 생합성량을 확인하기 위해서 트립토판(tryptophan)과 유라실(uracil)이 결실된 SC selectable medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 2% raffinose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 Lipoxygenase-1 와 Hydroperoxide lyase가 형질전환된 효모를 접종하여 overnight 전배양한 다음, 원심분리로 효모를 모아 tryptophan과 uracil이 결실된 SC induction medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 1% raffinose, 2% galactose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 접종하고, 2% Tween-20과 적절한 농도의 linoleic acid (0 ~ 0.1 M) 첨가하여 30℃에서 20시간 동안 배양하였다. 또한, 반응조건에 따른 형질전환 효모에서 1-octen-3-ol 생합성량을 확인하기 위해서 전배양한 효모를 트립토판(tryptophan)과 유라실(uracil)이 결실된 SC induction medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 1% raffinose, 2% galactose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)에 접종하고, 2% Tween-20과 3mM linoleic acid를 첨가하여 15℃와 30℃에서 각 12, 24, 36, 48시간 동안 배양하였다. 원심분리로 배양한 효모를 모아 인산나트륨 용해 완충액(sodium phosphate lysis buffer (50 mM sodium phosphate, 1 mM PMSF, 5% glycerol, 2% triton X-100; pH 6.5))과 acid-washed glass beads (0.4 - 0.6 mm size)를 첨가하여 bead beater로 lysis한 다음, 원심분리로 균체를 다운시키고 세포용해 상층액을 회수하였고, 0.1g의 NaCl (단백질 침전을 위함)을 첨가하여 동량의 다이에틸 에테르(diethyl ether)로 향기물질을 추출하여 기체 크로마토그래피-질량분석법(Gas chromatography-mass spectrometry (Aqilent 789OB GC & 5977B MSD))으로 분석하였다. 기체 크로마토그래피 질량 분석을 위하여 DB-WAX(60m × 250μm × 0.25μm)와 helium carrier gas를 사용하였으며, column의 온도는 40℃에서 120℃까지 2℃/min의 속도로 높였으며, 120℃에서 240℃까지 20℃/min의 속도로 높였다. Injector의 온도는 250℃로 하였다. 생합성된 1-octen-3-ol의 농도는 1-octen-3-ol standard (Sigma)와 비교분석 하였다. 실험 결과, (A) Linoleic acid 첨가 농도가 3mM일 때 1-octen-3-ol 생합성량은 약 0.48mg/L로 가장 높았으며, (B) 24시간 동안 30℃ 에서의 1-octen-3-ol의 생합성량은 약 0.35mg/L으로 가장 높았다 (도 9).
본 출원은 1-octen-3-ol을 생산하는 형질전환 효모 및 그 제조방법에 관한 것으로 송이버섯 향을 이용한 향장산업 및 식품개발 산업상 유용한 발명인 것이다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
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수탁일자 : 20180206
[규칙 제26조에 의한 보정 26.03.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-69
[규칙 제26조에 의한 보정 26.03.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-70
[규칙 제26조에 의한 보정 26.03.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-71

Claims (7)

  1. Lipoxygenase를 코딩하는 서열목록 9,10,11 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열과 Hydroperoxide lyase를 코딩하는 서열목록 12의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모.
  2. 송이버섯의 Total RNA를 분리하고 cDNA 합성하는 단계;
    상기 합성된 cDNA로부터 Lipoxygenase 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자를 PCR 증폭하는 단계;
    상기 증폭된 각 Lipoxygenase 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자를
    벡터에 유전자 클로닝하는 단계;
    상기 클로닝 된 각 Lipoxygenase 유전자와 Hydroperoxide lyase 유전자를 각 Yeast expression vector에 유전자 클로닝하는 단계;
    상기 Yeast expression vector를 효모로 형질전환하고 배양하여 1-octen-3-ol의 생합성을 확인하는 단계를 포함하는 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 Yeast expression vector는 pYES3/CT vector 또는 pYES2/CT vector 중 선택되는 vector인 것이 특징인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 pYES3/CT vector 와 pYES2/CT vector를 1:1의 비율로 사용하는 것이 특징인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 효모의 배양은 SC medium 배지에서 0.01 내지 100mM의 linoleic acid를 이용하여 15 내지 45℃에서, 12 내지 48시간 동안 배양하는 것이 특징인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)인 것이 특징인 방법.
  7. 청구항 제1항의 1-octen-3-ol 생산용 형질전환 효모를 배지에서 배양하여 1-octen-3-ol을 생합성하는 단계;
    상기 생합성된 1-octen-3-ol 을 수득하는 단계를 포함하는 1-octen-3-ol 의 제조방법.
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