DE60127950T2

DE60127950T2 - Mannanase aus kaffee

Info

Publication number: DE60127950T2
Application number: DE60127950T
Authority: DE
Inventors: Pierre o. 233 MARRACCINI; John Rogers; Raymond David Pridmore; Christof Gysler
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 2000-03-30
Filing date: 2001-02-13
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2021-02-14
Also published as: DK1272642T3; PT1272642E; ATE360078T1; EP1138771A1; WO2001075084A3; US7148399B2; ES2283412T3; EP1272642A2; DE60127950D1; US20030131380A1; EP1272642B1; US20070117196A1; US7700358B2; WO2001075084A2; JP2003529367A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Fragmenten von Kaffee-DNA, die mindestens ein Enzym kodiert, das an der Hydrolyse von Polysacchariden beteiligt ist, die mindestens aus einfachen oder verzweigten Mannan-Molekülen bestehen, die miteinander über eine β(1→4)-Bindung verknüpft sind.
Mannose umfassende Polysaccharide liegen häufig in den Zellwänden höherer Pflanzen, insbesondere bei Hülsenfrüchten, vor und werden als ein Kohlenhydratspeicher in den Samen betrachtet.
In verschiedenen Pflanzen wurde gezeigt, dass eine Endo-β-Mannanase-Aktivität hauptsächlich im Endosperm von keimenden Samen nachgewiesen wird (Bewley, 1997, Trends Plant Sci 2, 464-469).
In der Kaffeebohne werden insbesondere Galactomannane gefunden. Die letzteren stellen ungefähr 24% des Trockengewichts der Bohne dar (Bradbury und Halliday, 1990, J Agric Food Chem 38, 389-392). Diese Polysaccharide bestehen aus einer linearen Kette von Mannosylresten, die miteinander über Bindungen vom β-1→4-Typ verknüpft sind und an die α-Galactosyl-Rest-Monomere angefügt sind. Es ist ebenfalls bekannt, dass das als Endo-β-Mannanase (E.C. 3.2.1.78) bezeichnete Enzym eine Hydrolase ist, die (1-4)-β-Mannanpolymere abbaut, um somit den Austritt des Würzelchens während der Keimung zu erleichtern und um kleine Oligosaccharide freizusetzen, die dann als eine Energiequelle für das Wachstum der jungen Pflanze verwendet werden.
In industriellen Verfahren bilden die Mannan-Moleküle und ihre Derivate während der Behandlung von Kaffee einen beachtlichen Anteil der unlöslichen Sedimente. Zusätzlich ist die Fraktion dieser Moleküle, die sich während der ersten Extraktion lösen (ungefähr 50%) ebenfalls sehr gering löslich und ist deshalb für die Vielzahl der sekundären Niederschläge bzw. Ausfällungen verantwortlich, die während der nachfolgenden Schritte stattfinden. In dem EP-Patent 0676145A wurde gezeigt, dass es möglich ist, Galactomannane aus Kaffee unter Verwendung einer aus Aspergillus niger extrahierten, immobilisierten Mannanase zu hydrolysieren.
Die EP-Anmeldung Nr. 98203742.6 selbst schlägt die Verwendung von Fragmenten von Kaffee-DNA vor, die mindestens eine Endo-β-Mannanase kodieren, die an der Hydrolyse von Polysacchariden beteiligt ist, die mindestens aus einfachen oder verzweigten Mannan-Molekülen bestehen, die miteinander über eine β(1→4)-Bindung verknüpft sind.
Die WO 99/24588 betrifft die Präparation einer DNA von Endo-β-Mannanase aus verschiedenen Früchten, umfassend Tomaten, Melonen, Pfirsiche, Gurken und Nektarinen oder einem Samen, um einen Reifeprozess zu steuern. Die cDNA wird verwendet, um eine anti-sense Sequenz zu erzeugen, die zum Blockieren der Expression einer Endo-β-Mannanase in einer Frucht verwendet werden kann, um einen Reifeprozess zu verzögern.
Giorgini et al. (1996, Bras. Fisiol. Verg. 8(1), 43-49) berichten, dass die Enzymaktivität von Endo-β-Mannanase mit dem Wachstum der Keimblätter von Kaffeesamen korreliert. Die Enzymaktivität kann durch die Zugabe verschiedener Wachstumspromotoren moduliert werden.
Die EP 0676145 ist auf ein Verfahren zur Hydrolyse von in einem flüssigen Extrakt vorliegenden Galactomannanen mittels einer β-Mannanase von Aspergillus niger auf einem Träger gerichtet.
Jedoch erschien es vorteilhaft Mittel für die Behandlung von Kaffeebohnen bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Behandeln von Kaffeebohnen in dem das Protein gemäß SEQ ID Nr.2 verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls das Verfahren nach Anspruch 1, welches die Schritte umfasst von

– Überexprimieren einer DNA mit der SEQ ID Nr. 1 in einem Mikroorganismus, einem Pilz oder einer undifferenzierten bzw. nicht differenzierten Pflanzenzellen,
– Reinigen des Enzyms,
– Behandeln der Sedimente von Kaffeebohnen mit dem Enzym, um die Extraktionsausbeuten zu erhöhen, oder Behandeln von Kaffee-Flüssigkeit mit dem Enzym, um die Sedimentation aufgrund von Mannanen, welche gelieren, zu verringern.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein von Kaffee abgeleitetes DNA-Fragment, welches mindestens ein Enzym kodiert, das an der Hydrolyse von Polysacchariden beteiligt ist, welche mindestens aus reinen oder verzweigten Mannan-Molekülen bestehen, die miteinander über eine β(1→4)-Bindung verknüpft sind, worin das DNA-Fragment die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID Nr.1 aufweist oder die Nukleinsäuresequenz von Nukleotid 62 bis 1312 der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen rekombinanten Vektor der ein DNA-Fragment nach Anspruch 3 umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Protein, das von der Kaffeebohne abgeleitet ist, welches von einem Kaffee-Gen kodiert wird und an der Hydrolyse von Polysacchariden beteiligt ist, welche mindestens aus reinen oder unverzweigten Mannan-Molekülen bestehen, die miteinander über eine β(1→4)-Bindung verknüpft sind, und welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine Pflanzenzelle, die mittels eines rekombinanten Vektors ein DNA-Fragment gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Pflanze oder einen Samen, die (aus) erfindungsgemäßen) Pflanzenzellen bestehen bzw. umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, der integriert in sein Genom oder mittels eines Plasmids, welches replizieren kann, ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment umfasst.
1 stellt eine Proteinausrichtung dar der Endo-β-Mannanasen von Aspergillus aculeatus, Trichoderma reesei und Lycopersicon esculentum (Tomate) mit einer Mannanase A (Marraccini und Rogers, EP-Nr. 98203742.6 ) und der erfindungsgemäßen Mannanase aus Kaffee (Mannanase B).
2 stellt ein Schema dar, welches es ermöglicht die synthetischen Oligonukleotide zu positionieren, die zum Amplifizieren des reifen ManB-Proteins umfassend der HIS-Markierungs-Gruppe an dessen carboxy-terminalen (C-ter.) Ende verwendet wurden.
3 stellt eine Karte des Plasmids pDP580 dar.
4 stellt eine Karte des Plasmids pDP588 dar.
5 stellt die Analyse durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese der Expression des ManB-Proteins in E. coli nach Induktion durch Zugabe von IPTG dar.
6 stellt eine Karte des Plasmids pNFF296 dar.
7 stellt eine Karte des Plasmids pCY316 dar.
Der Begriff "homologe Sequenz" soll eine beliebige Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz bedeuten, die eine identische Funktion aufweist, die sich von den erfindungsge mäßen Sequenzen lediglich durch die Substitution, Deletion oder Addition einer geringen Anzahl von Nukleinsäurebasen oder von Aminosäuren unterscheidet, beispielsweise 1 bis 500 Basenpaare (bp) oder 1 bis 150 Aminosäuren.
In diesem Zusammenhang werden insbesondere zwei DNA-Sequenzen, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes das gleiche Polypeptid kodieren, als homolog betrachtet. In ähnlicher Weise werden zwei funktionale Proteine, die durch den gleichen Antikörper erkannt werden, wobei die Intensitätswerte einer Erkennung der beiden Proteine durch den Antikörper beispielsweise 100 nicht übersteigen, als homolog betrachtet.
Ebenfalls wird eine Sequenz als eine homologe Sequenz betrachtet, wenn sie mehr als 70% Homologie mit den erfindungsgemäßen Sequenzen aufweist, insbesondere mehr als 80% oder 90% aufweist. In dem letzteren Fall wird die Homologie durch das Verhältnis zwischen der Anzahl an Basen oder an Aminosäuren einer homologen Sequenz, die identisch zu solchen einer erfindungsgemäßen Sequenz sind, und der Gesamtzahl an Basen oder an Aminosäuren der erfindungsgemäßen Sequenz bestimmt.
Der Begriff "Fragment welches hybridisiert" soll ein beliebiges Fragment bedeuten, das in der Lage ist an die erfindungsgemäßen Fragmente durch die Southern Blot-Methode (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, Kapitel 9.31 bis 9.58) zu hybridisieren. Vorzugsweise wird die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen durchgeführt, um so unspezifische oder relativ unstabile Hybridisierungen zu vermeiden.
Schließlich soll der Begriff "Fragment" oder "DNA-Fragment" als eine doppelsträngige DNA mit chromosomalem Ursprung verstanden werden, die synthetisiert werden kann, in vitro beispielsweise durch das bekannte, als "Polymerase-Kettenreaktion" bezeichnete Verfahren reproduziert werden kann, oder in vivo beispielsweise in einem Bakterium vom Typ Escherichia coli reproduziert werden kann.
In dem Rest der Beschreibung betreffen die SEQ ID Nrn. der Sequenzen die Sequenzen, die in der Sequenzauflistung nachstehend aufgeführt sind. Die synthetischen Oligonukleotide SEQ ID Nr.6 bis SEQ ID Nr. 25, die in der Beschreibung erwähnt und in der nachstehend aufgeführten Sequenzauflistung aufgeführt sind, werden durch Eurogentec (Parc Scientifique du Sart Tilman[Sart Tilman Scientific Parc]-4102 Seraing-Belgien) bereitgestellt.
Es konnte gezeigt werden, dass es die gesamte oder ein Teil der Sequenz SEQ ID Nr. 1 ermöglicht, nach einer Transformation, Polysaccharide in einer Wirtszelle, wie einer Pflanzenzelle oder einem Mikroorganismus, zu hydrolysieren, die zumindest aus reinen oder verzweigten Mannan-Molekülen bestehen, die miteinander über eine β(1→4)-Bindung verknüpft sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein beliebiges DNA-Fragment, das die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr.1 aufweist. Diese Nukleinsäuresequenz kodiert mindestens ein Enzym, das an der Hydrolyse von Polysacchariden beteiligt ist, die mindestens aus reinen oder verzweigten Mannan-Molekülen bestehen, die miteinander über eine β(1→4)-Bindung verknüpft sind.
Das Enzym ist vorzugsweise eine Endo-β-Mannanase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2.
Die Erfindung betrifft das DNA-Fragment, das durch die Nukleotide 62 bis 1312 der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1 begrenzt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die neuen Enzyme, die durch die Gene der SEQ ID Nr. 1 kodiert werden, insbesondere die Sequenzen, die homolog dazu sind. Damit ist es möglich sich vorzustellen sie beispielsweise zu verwenden, um derartige Polysaccharide in vitro zu modifizieren oder abzubauen. Dazu ist es bevorzugt mindestens eines dieser Enzyme durch herkömmliches Überexprimieren von dessen Gen in einem Bakterium und herkömmliches Isolieren von ihm, beispielsweise durch Fällen und/oder Chromatographie des Kulturmediums, zu reinigen.
Darüber hinaus ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ebenfalls ein Protein, das von der Kaffeebohne abgeleitet ist, das durch ein Kaffee-Gen kodiert wird und an der Hydrolyse von Polysacchariden beteiligt ist, die mindestens aus reinen oder verzweigten Mannan-Molekülen bestehen, die miteinander über eine β(1→4)-Bindung verknüpft sind, und das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hydrolyse von Polysacchariden, die mindestens aus reinen oder verzweigten Mannan-Molekülen bestehen, die miteinander über eine β(1→4)-Bindung verknüpft sind, bei dem (1) ein die erfindungsgemäßen Enzyme kodierendes DNA-Fragment in einen Vektor kloniert wird, wobei der Vektor ebenfalls eine Sequenz umfasst, die eine autonome Replikation oder Integration in eine Wirtszelle ermöglicht, (2) eine Wirtszelle mit dem Vektor transformiert wird und dann (3) die transformierte Wirtszelle unter für die Hydrolyse derartiger Polysaccharide geeigneter Bedingungen kultiviert wird.
Die vorliegende Erfindung eröffnet deshalb die Möglichkeit erfindungsgemäße DNA-Fragmente zu verwenden, um die Produktion von Polysacchariden, die mindestens aus reinen oder verzweigten Mannan-Molekülen bestehen, die miteinander über eine β(1→4) Bindung verknüpft sind, in einer Wirtszelle, insbesondere einer Kaffeebohnenzelle, zu modifizieren. Somit ist es möglich sich vorzustellen erfindungsgemäße DNAs in einer Kaffeebohnenzelle zu exprimieren oder überzuexprimieren, um derartige Polypeptide herzustellen, die beispielsweise das Aroma und die Struktur der Kaffeebohnen modifizieren sollen.
Schließlich stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls neue Enzyme bereit, die an der Hydrolyse derartiger Polysaccharide beteiligt sind. Diese Enzyme können somit zweckmäßigerweise verwendet werden, um derartige Polysaccharide in vitro zu synthetisieren oder zu modifizieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine Pflanzenzelle, die mittels eines rekombinanten Vektors ein DNA-Fragment umfasst, das die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr.1 oder ein DNA-Fragment aufweist, das die Nukleotide 62 bis 1312 der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst.
Vorzugsweise ist die Pflanzenzelle eine Kaffeezelle.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine beliebige Pflanze oder einen beliebigen Samen, die Pflanzenzellen umfassen, die mittels eines rekombinanten Vektors ein DNA-Fragment umfassen, das die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 oder ein DNA-Fragment aufweist, das die Nukleotide 62 bis 1312 der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr.1 umfasst.
Ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein beliebiger Mikroorganismus, der integriert in dessen Genom oder mittels eines Plasmids, das replizieren kann, ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment umfasst, so dass es mindestens ein Enzym exprimiert, das an der Hydrolyse von Polysacchariden beteiligt ist, die mindestens aus reinen oder verzweigten Mannan-Molekülen bestehen, die miteinander über eine β(1→4) Bindung verknüpft sind.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Behandeln von Kaffeebohnen bei dem das erfindungsgemäße Protein verwendet wird. Insbesondere kann das erfindungsgemäße Protein verwendet werden, um den Prozentsatz an extrahierten Feststoffen während der Behandlung von Kaffeebohnen zu erhöhen. Durch Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins ist es somit möglich die Extraktionsausbeute zu erhöhen, während gleichzeitig die Menge an Sediment verringert wird.
Nach Überexprimieren des erfindungsgemäßen DNA-Fragments in einem Mikroorganismus, einem Pilz oder einer undifferenzierten Pflanzenzelle können die Sedimente mit dem mehr oder weniger gereinigten Enzym behandelt werden, um so die Extraktionsausbeuten zu erhöhen.
Nach Überexprimieren des erfindungsgemäßen DNA-Fragments in einem Mikroorganismus, einem Pilz oder einer undifferenzierten Pflanzenzelle ist es ebenfalls möglich Kaffee-Flüssigkeit zu behandeln, um so die Sedimentation aufgrund der Mannane, die gelieren, zu verringern.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlicher beschrieben unter Zuhilfenahme der weiteren Beschreibung, die folgt und sich auf Beispiele einer Herstellung von erfindungsgemäßen DNA-Fragmenten, rekombinanten Plasmiden und transformierten Bakterien bezieht. Dabei ist jedoch klar, dass diese Beispiel lediglich zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Gegenstands dienen, für den sie in keiner Weise eine Begrenzung darstellen. Die Handhabung der DNA, das Klonieren und die Transformation von Bakterienzellen werden in der Abwesenheit von gegenteiligen Anleitungen gemäß den in dem Handbuch von Sambrook et al., vorstehend aufgeführt, beschriebenen Protokollen durchgeführt. Die Prozentsätze werden, sofern nicht anders angezeigt, als Gewichtsprozente angegeben.
Beispiel 1
Erfassung der Spitze der Aktivität von Endo-β-Mannanase während der Keimung
Bohnen der Coffea arabica var. caturra 2308-Varietät werden im reifen Zustand geerntet, das Fruchtfleisch entfernt (depulped) und für 3 Tage bei Raumtemperatur getrocknet. Als nächstes wird die Pergamenthaut (parchment skin) der Bohnen entfernt und sie werden getrocknet und dann sterilisiert, um in Kultur in vitro zur Keimung gebracht zu werden. Dazu werden sie für 1 Stunde in Rovral (0,12% Vol./Vol.) platziert, mit sterilem Wasser gespült, für 1 Stunde in eine Lösung aus Calciumhypochlorit (6% Gew./Vol.) zu der wenige Tropfen von Teepol-Emulgator zugesetzt wird platziert und dann viermal mit sterilem Wasser gespült bevor sie in Teströhren auf einem Agar-Wasser-Medium kultiviert werden. Die Keimung erfolgt bei 25°C in der Gegenwart von Licht. Der Moment an dem die Bohnen auf das Agar-Bett platziert werden wird als der Tag nach Quellen (day alter soaking) 0 betrachtet (DAS = 0).
Die Chargen der Bohnen werden dann in verschiedenen Stadien der Keimung geerntet (DAS 7, 14, 21, 28) und dann in flüssigem Stickstoff gemahlen. Das Pulver wird dann in einem Verhältnis von 1 g pro 5 ml für 20 Minuten bei 4°C in einem Extraktionspuffer homogenisiert (200/100 mM Phosphat-Citrat, pH-Wert 5,0, 10 mM meta-Bisulphit, Na₂S₂O₅, 5 mM EDTA und eine Tablette pro 50 ml von "Complete"-Protease-Inhibitor [Kat.-Nr. 1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse 116, Mannheim, Deutschland] eine Tablette pro 50 ml). Das Homogenat wird dann bei 12.000 g für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert, wobei der Überstand gewonnen und ein zweites Mal zentrifugiert wird. Der Überstand, der dem Enzymrohextrakt entspricht, wird dann aliquotiert und bei -80°C gefroren.
Die Enzymaktivität der Endo-β-Mannanase wird gemäß der/des folgenden Methode bzw. Verfahrens getestet. Zu 1,6 ml Reaktionspuffer (100 mM NaCl, 200 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,0), der AZCL-Galactomannan unlösliches Substrat (Kat.-Nr. I-AZGMA, Megazyme International Ireland Ltd, Bray Business Park, Bray Co., Wicklow, Irland) in einer Endquantität von 1% Gew./Vol. umfasst, wird 400 μl Enzymrohextrakt zugesetzt. Die Reaktion startet durch Zugabe des Extrakts und findet bei 37°C unter Rühren statt. Um die anfängliche Steigung der Reaktion zu berechnen wird für 1 Stunde alle 15 Minuten eine Teilmenge bzw. ein Aliquot von 400 μl des Mediums entfernt, für 5 Minuten bei 100°C erhitzt und dann bei 12.000 g für 2 Minuten zentrifugiert. Die optische Dichte des Überstand wird bei 590 nm erfasst und die spezifische Aktivität wird in AU (optische Absorptionseinheiten)·min^-1·mg Protein^-1 ausgedrückt, nachdem die Proteinkonzentration in jedem Extrakt durch das Verfahren nach Bradford getestet wurde (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72, 248-254). Somit wird festgestellt, dass die Aktivität während der ersten 14 Tage nach Quellen (DAS) nahezu 0 ist und nachfolgend schrittweise auf eine maximale Spitze um 28 DAS ansteigt. Nach 28 DAS nimmt die Aktivität langsam ab.
Beispiel 2
Reinigungsschritte einer Endo-β-Mannanase
Gemäß den vorstehend beschriebenen Ergebnissen wird die Reinigungsstrategie unter Verwendung von 16 ml eines 28-DAS Enzymrohextrakts fortgesetzt, der eine Aktivität um 0,2 AU·min^-1·mg Protein^-1 × 10^-2, einen Gesamtproteingehalt von ungefähr 48 mg und eine Gesamtaktivität von 9,6 AU·min^-1 × 10^-2 aufweist.
1. Ammoniumsulfatfällung
Zunächst wird der Enzymrohextrakt durch Ammoniumsulfatfällung bei 4°C fraktioniert. Das Ammoniumsulfat wird langsam unter Rühren zugesetzt bis ein Sättigungsspiegel von 35% erhalten wird, wobei die Lösung dann bei 12.000 g für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert wird. Das so erhaltene Pellet wird in einem Minimum (1 ml) von Extraktionspuffer (siehe vorstehend aufgeführt) aufgenommen. In diesem Extrakt beträgt die Proteinkonzentration ungefähr 10 mg·ml^-1. Die spezifische Endo-β-Mannanase-Aktivität beträgt 0,9 AU·min^-1·mg^-1 × 10^-2, was einer 4-fachen Anreicherung des Enzyms in Bezug auf den Rohextrakt und einer Rückgewinnung von 10 AU·min^-1 der Gesamtaktivität, d. h. 100% entspricht.
2. Trennung auf einer Säule mit hydrophober Wechselwirkung
Die vorstehend beschriebene Probe wird dann auf einer Säule mit hydrophober Wechselwirkung getrennt (Hiload HR 16/10 Phenylsepharose High performance, Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd, Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA, England). Die Säule wird mit einem Äquilibrierungspuffer voräquilibriert (50 mM Natriumphosphat, 400 mM Ammoniumsulfat, pH-Wert 7,0). Die Probe (1 ml) wird dann auf die Säule injiziert, die dann mit 5 Säulenvolumen des Äquilibrierungspuffers gespült wird. Es wird ein Wassergradient von 0 bis 99,5% in 0,5 Säulenvolumen angelegt, gefolgt von einem anderen von 99,5 bis 100% in 5 Säulenvolumen. Die Aktivität ist hauptsächlich in drei Fraktionen konzentriert, die verwendet werden, um die Reinigung fortzusetzen. Die Reinigungsausbeute dieses Schritts in Bezug auf den vorherigen Schritt liegt um 80%. Die spezifische Aktivität beträgt 27 AU·min^-1·mg^-1, d. h. eine ungefähr 137-fache Anreicherung in Bezug auf den Rohextrakt. Die rückgewonnene bzw. gewonnene Gesamtaktivität beträgt ungefähr 9 AU·min^-1 × 10^-2, d. h. 90% der anfänglichen Aktivität.
3. Trennung durch Ionenaustauschchromatografie
Die drei vorstehend beschriebenen Fraktionen werden gemischt und konzentriert und der Puffer wird unter Verwendung von Ultrafree-Röhren gewechselt (Millipore, Redford, MA, USA, Zentrifugation bei maximal 4000 g). Das rückgewonnene Volumen beträgt 1 ml. Diese Probe wird auf eine Resource Q-Anionenaustauschsäule (Amersham Pharmacia Biotech, England) injiziert, die mit einem 20 mM Tris/HCl-Puffer, pH-Wert 8,0, voräquilibriert wird. Die Flution erfolgt mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl in 20 Säulenvolumen. Die gewonnene Gesamtaktivität liegt ausschließlich in zwei Fraktionen vor. Die Reinigungsausbeute dieses Schritts beträgt in Bezug auf den vorherigen Schritt 58%. Die spezifische Aktivität beträgt 167 AU·min^-1·mg^-1, d. h. eine ungefähr 836-fache Anreicherung in Bezug auf den Rohextrakt. Die gewonnene Gesamtaktivität beträgt 0,9 AU·min^-1, d. h. ungefähr 9% der anfänglichen Aktivität.
4. Trennung durch eine Gelfiltrationssäule
Die beiden gewonnenen Fraktionen der Anionenaustauschsäule werden durch eine Zentrifugation bei 4000 g unter Verwendung der Ultrafree-Röhrchen (Millipore Co, 80 Ashby Road, Redford, MA, USA) auf 100 μl konzentriert. Diese Probe wird auf eine Superdex 75 HR 10/30 Säule (Amersham Pharmacia Biotech, England) injiziert, die mit einem 50 mM Natriumphosphat-, 150 mM NaCl-Puffer, pH-Wert 7,0, voräquilibriert wurde. Die Proteine werden mit dem gleichen Puffer bei einer Flussrate von 0,3 ml·min^-1 eluiert. Unter den gleichen Bedingungen wird eine Eichkurve für die Säule erzeugt, wobei Molekulargewichtsstandards verwendet werden. Die Endo-β-Mannanase-Aktivität ist in zwei Fraktionen verteilt, die einem Molekulargewicht zwischen 40 und 55 kDa entsprechen. Die Reinigungsausbeute dieses letzten Schritts beträgt 48%. Die spezifische Aktivität beträgt ungefähr 1400 AU·min^-1·mg^-1, d. h. eine 7000-fache Anreicherung in Bezug auf den Rohextrakt. Die Gesamtaktivität beträgt 0,45 AU·min^-1, d. h. 4,5% der anfänglichen Aktivität.
5. Analyse durch zweidimensionale Elektrophorese und Mikrosequenzierung der Aminosäuren des gereinigten Enzyms
Die vorstehend beschriebenen Fraktionen mit der Enzymaktivität bei Austritt aus der Säule werden während der Reinigung durch zweidimensionale Elektrophorese analysiert. Dazu werden die Fraktionen gemischt und durch Zentrifugation in den Ultrafree-Röhrchen (Millipore, USA), wie vorstehend beschreiben, auf 20 μl konzentriert. Zu diesem Volumen werden 105 μl eines Rehydrations-Puffers (8 M Harnstoff, 3% Gew./Vol. CHAPS, 0,8% Vol./Vol. Ampholine, 1% Gew./Vol. DTT) zugesetzt, und ein nichtlinearer (pH-Wert 3,0 bis 10,0) 7 cm Gelstreifen (Immobiline Dry Strip, Amersham Pharmacia Biotech, England) wird gemäß den Angaben des Herstellers rehydriert. Die Proteine werden dann als eine Funktion ihrer isoelektrischen Punkte (pI) getrennt, wobei beispielsweise das IPGphore-System (Amersham Pharmacia Biotech, England) verwendet wird, wobei eine Gesamtzahl von 14.000 Voltstunden eingesetzt wird.
Nach der Trennung der Proteine als eine Funktion ihrer pI-Werte werden sie dann in einer zweiten Dimension gemäß ihrer Molekulargewichte getrennt. Diese Trennung wird gemäß den Empfehlungen von Hochstrasser et al. (Anal. Biochem, 173, 412-423, 1989) und von Gorg et al. (Electrophoresis 8, 122-124, 1987) durchgeführt. Somit wird der Gelstreifen der ersten Dimension in einer ersten Lösung (6 M Harnstoff, 30% Vol./Vol. Glycerin, 2% Gew./Vol SDS., 2% DTT, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0) für 5 Minuten äquilibriert und dann für 10 Minuten in einer zweiten Lösung (6 M Harnstoff, 30% Vol./Vol. Glycerin, 2% Gew./Vol SDS., 2,5% Gew./Vol. Iodacetamid, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0) äquilibriert. Der Gelstreifen wird dann auf ein Gradientengel mit einer 10-20%igen Acrylamidkonzentration (Abmessungen 10 × 10 × 0,75 cm) und mit einer einzigen Vertiefung gelegt und mit einer Agaroselösung bedeckt (1% Gew./Vol Agarose, 0,5% Gew./Vol. SDS, Spuren von Bromphenolblau), die auf 90°C vorgewärmt und bei 40°C gehalten wurde. Das Gel wird in einem vertikalen Elektrophoresesystem angebracht und für 2 Stunden einer Spannung von 170 V unterzogen. Nach Wanderung werden die Proteine gemäß der Methode von Bjellquist et al. (Elektrophoresis, 1993, 14, 1357-1365) mit Silber gefärbt. Das so erhaltene Profil des Gemisches der letzten drei Fraktionen zeigt das Vorliegen einer einzigen Gruppe von Proteinen, die aus einer Linie von 5 Proteinen mit dem gleichen ungefähren Molekulargewicht von 42 kDa besteht, jedoch mit geringen Unterschieden im pI-Wert, zwischen pI-Werten von 5,5 und 6. Diese Schätzung des pI-Werts wird durch die Tatsache bestätigt, dass die Endo-β-Mannanase-Aktivität von einer chromatofokussierenden Säule (mono P HR 5/5 - Amersham Pharmacia Biotech, England) bei einem pH-Wert von 5,7 eluiert (Ergebnisse nicht gezeigt) und ebenfalls durch die Schätzung des theoretischen pI-Werts (5,8) des reifen Proteins (siehe nachstehend).
Die so gereinigten Proteine werden durch Mikrosequenzieren der Aminosäuren analysiert. Dazu werden sie auf eine PVDF-Membran übertragen ("Problot", Perkin Elmer Applied Biosystems Division, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404, USA) beispielsweise unter Verwendung einer Trans-Blot-Transfer- bzw. Übertragungs-Zelle (Bio-Rad, 2000 Alfred Drive, Hercules, California 94547, USA). Somit wird nach der Trennung in der zweiten Dimension das Gel rückgewonnen und in einer Übertragungslösung (10% Vol./Vol. Methanol, 10 mM NaOH-CAPS, pH-Wert 11,0) für 10 Minuten geschüttelt. Während dieser Zeit werden zwei Schaumträger (foam supports), zwei Stücke Whatman-Papier und eine PCDF-Problot-Membran (Perkin Elmer Applied Biosystems, USA) in der gleichen Lösung angefeuchtet. Das Gel, die Membran und die Träger werden in dem Trans-Blot-System gemäß den Herstelleranweisungen (Bio-Rad, USA) angebracht und die Übertragung erfolgt bei einem Strom von 100 V für eine Stunde bei einer Temperatur von 4°C. Am Ende der Übertragung werden die auf die Membran übertragenen Proteine mit einer leichten Coomassie-Blau-Färbung gemäß den Anleitungen des Problot-Membran-Herstellers deutlich gemacht. Die verschiedenen Proteine werden aus der Membran ausgeschnitten, gemischt und zusammen sequenziert. Das N-terminale Sequenzieren der gereinigten Proteine und der internen Peptide wird mit einem automatischen Sequenzer von Beckmann (Beckmann Instruments Inc., 250 Harbor Boulevard Box 3100, Fullerton, California, 92634 USA) gemäß des in Teixeira et al. (Elektrophoresis 18, 156-162, 1997) beschriebenen Verfahrens durchgeführt.
Durch dieses Verfahren werden drei Sequenzen erhalten; eine N-terminale Sequenz mit 22 Aminosäuren, die als SEQ ID Nr. 3 bezeichnet wird, und zwei weitere, die unabhängige interne Peptide betreffen, die durch Trypsinverdau erhalten werden, mit 10 bzw. 17 Aminosäuren, die in den Sequenzen SEQ ID Nr. 4 und 5 beschrieben sind.
Keine der so erhaltenen Sequenzen weist Zweideutigkeiten bzw. Mehrdeutigkeiten auf und sie zeigen, dass die drei Proteine, die die vorstehend beschriebene Linie ausmachen, Isoenzyme der Endo-β-Mannanase sind, die eine Sequenz teilen, die in den analysierten Bereichen identisch ist. Die Sequenzen SEQ ID Nr. 3, 4 und 5 entsprechen jeweils den Resten 41 bis 62, 99 bis 108 und 265 bis 281 von SEQ ID Nr. 2.
Beispiel 3
Isolierung der Volllängen-cDNA, die die Endo-β-Mannanase aus Kaffee kodiert und aus keimenden Bohnen gereinigt wird
1. Isolierung der Gesamt-RNAs und der Poly A+ Messenger-RNAs aus den keimenden Kaffeebohnen
Die Kaffeebohnen (Coffea arabica var. caturra 2308) werden im reifen Stadium geerntet und in vitro, wie vorstehend beschrieben, zur Keimung gebracht.
Die Gesamt-RNAs der Bohnen werden nach 22 Tagen der Keimung (DAS 22) extrahiert. Dazu wird die Bohne schnell in flüssigem Stickstoff gemahlen und das so erhaltene Pulver wird in 8 ml Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 resuspendiert, der 100 mM Tris HCl, 0,1% Gew./Vol. SDS und 0,5% Vol./Vol. β-Mercaptoethanol umfasst, es wird mit einem Volumen mit 100 mM Tris HCl, pH-Wert 8,0 gesättigtem Phenol homogenisiert und dann bei 12.000 g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um so die wässrige Phase zu extrahieren, die (i) einmal mit einem äquivalenten Volumen an Phenol, (ii) zweimal mit einem äquivalenten Volumen an Phenol:Chloroform (1:1) und (iii) zweimal mit einem äquivalenten Volumen an Chloroform zentrifugiert wird (Rogers et al., 1999, Plant Physiol. Biochem., 37, 261-272).
Die Gesamtnukleinsäuren werden dann für eine Stunde bei -20°C durch Zugabe von 1/10 eines Volumens von 3 M Natriumacetat, pH-Wert 5,2, und 2,5 Volumen Ethanol zu der wässrigen Phase gefällt.
Das so erhaltene Gemisch wird dann bei 12.000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert und das Pellet wird in 10 ml H₂O aufgenommen, bevor die Nukleinsäuren in der Gegenwart von LiCl (2 M Endkonzentration) und Ethanol (2,5 Volumen) wieder gefallt werden.
Nach Zentrifugation wird das Pellet der Gesamt-RNAs in 1 ml H₂O aufgenommen und für eine Stunde bei 37°C mit RQ1-DNAse (Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wisconsin 53711, USA) verdaut, um jegliche Spur an DNA zu beseitigen, wobei dann die Gesamt-RNAs durch Behandlung mit Phenol und mit Chloroform deproteiniert werden, bevor sie in der Gegenwart von Natriumacetat, wie vorstehend beschrieben, gefällt werden.
Die Gesamt-RNAs werden dann in 500 μl H₂O aufgenommen und durch einen spektrophotometrischen Test bzw. Assay bei 260 nm quantifiziert. Ihre Qualität wird durch Agarosegel-Elektrophorese in der Gegenwart von Formaldehyd analysiert.
Dazu werden die Poly A+-Messenger-RNAs (mRNAs) dann von 500 μg der Gesamt-RNAs unter Verwendung des Oligotex-dT-Reinigungssystems (Qiagen INC., 9600 De Soto Avenue, Chatsworth, California, 91311, USA) gereinigt, wobei dann die Quantität der Messenger-RNAs unter Verwendung des DNA Dipstick-Kits berechnet bzw. bewertet wird (InVitrogen BC, De Schelp 12, 9351 NV Leek, Niederlande).
2. Konstruktion und Durchmustern der cDNA-Bank
Die Synthese komplementärer DNA (cDNA), die zur Konstruktion der Banken benötigt wird, wird gemäß den Empfehlungen, die in dem "Riboclone cDNA-Synthesesystem M-MLV(H-)"-Kit (Promega, USA) mitgeliefert werden, durchgeführt, mit der Ausnahme des Ligationsschritts der EcoRI-Linker. Dies ermöglicht es, diese cDNAs direkt in die einzige SrfI-Stelle des Vektors pPCR-Script Amp SK(+) (Stratagene, 11011 North Torreg Pines Road, La Jolla, California, 92037, USA) zu klonieren. Die Wirksamkeit dieser cDNA-Synthesereaktion wird durch Zugabe von alpha-(³²P)-dCTP während der Synthese der beiden DNA-Stränge beobachtet.
Nach Wanderung in einem basischen Agarosegel (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, USA), wird abgeschätzt, dass sich die Länge der neu synthetisierten cDNAs von 0,2 bis mehr als 4,3 kb erstreckt. Die Quantifizierungen unter Verwendung des DNA Dipstick-Kits (InVitrogen, Niederlande) zeigen, dass von 1 μg mRNA ungefähr 100 ng cDNA synthetisiert werden.
Die in den Vektor pPCR-Script Amp SK(+) (Stratagene, USA) ligierten cDNAs wurden verwendet, um den Escherichia coli (E. coli) Stamm XL2-Blue MRF' (Stratagene, USA) zu transformieren. Die die rekombinanten Vektoren umfassenden Bakterien werden auf LB(Luria-Bertani)-Medium-Platten, die 100 ug·ml^-1 Ampicillin umfassen, und in der Gegenwart von IPTG und X-Gal selektioniert (Sambrook et al., 1989). Die Plasmide dieser cDNA-Bank werden dann in der Gegenwart von 25 ml LB-Medium, das 100 μg·ml^-1 Ampicillin umfasst, von einer Übernachtkultur, die einem Gemisch von Transformanten entspricht, extrahiert, und wobei der "QiaFilter Plasmid MidiKit" (Qiagen INC., USA) verwendet wird.
3. Isolation der cDNA, die die Endo-β-Mannanase aus Kaffee kodiert
Die cDNA-Bank aus keimenden Bohnen wurden mittels PCR untersucht bzw. getestet, wobei synthetische Oligonukleotide verwendet wurden, die von dem Ergebnis des N-terminalen und internen Sequenzierens der gereinigten Mannanase abgeleitet wurden.
Es werden die degenerierten, synthetischen Oligonukleotide MAN 202 mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 6 und MAN 203 mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 7 verwendet. Das synthetische Oligonukleotid MAN 202 entspricht den Aminosäuren 9 bis 14 (GTEFVM) der N-terminalen Sequenz (SEQ ID Nr. 3) der gereinigten Mannanase. Das synthetische Oligonukleotid MAN 203 entspricht der komplementären Sequenz, die die Aminosäuren WAFSDG kodiert, die an Position 2 bis 7 des internen Peptids der gereinigten Mannanase lokalisiert sind und der Sequenz SEQ ID Nr. 4 entsprechen.
Die PCR-Reaktion wird in der Gegenwart von 10 ng Plasmid aus der cDNA-Bank in einem Endvolumen von 50 μl durchgeführt, umfassend 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,8, 1,5 mM MgCl₂, 0,1 mg·ml^-1 Gelatine, 0,2 mM je dNTP, 0,25 μM je Oligonukleotid (MAN 202 und 203) und 3 Einheiten der Taq DNA-Polymerase (Stratagene, USA). Es wird die Robocycler 96 PCR-Maschine (Stratagene, USA) verwendet, die mit einem Heizdeckel ausgestattet ist, wobei die Reaktionen für 35 Zyklen inkubiert werden (94°C - 1 Minute, 45°C - 1 Minute 30 Sekunden, 72°C - 2 Minuten) gefolgt von einer letzten Verlängerung (extension) bei 72°C für 7 Minuten. Am Ende dieser Reaktion wird ein einziges PCR-Produkt mit einer Länge von ungefähr 170 bp erhalten, welches direkt in den Vektor pGEMT-easy, gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Promega, USA), ligiert wird. Die Ligation wird dann verwendet, um den E. coli-Stamm XL2-Blue MRF' (Stratagene, USA) zu transformieren. Die Bakterien, die rekombinante Vektoren umfassen, werden auf LB-Medium-Platten, die 100 μg·ml^-1 Ampicillin umfassen, und in der Gegenwart von IPTG und X-Gal selektioniert (Sambrook et al., 1989).
Am Ende der Transformation wurde ein Klon isoliert, der das 170 bp cDNA-Fragment umfasste, das in die SfrI-Stelle des Vektors pPCR-Script Amp SK (+) (Stratagene, USA) kloniert wurde. Dieses PCR-Produkt wurde dann gemäß des "T7-Sequenzier-Kit"-Protokolls (Amersham Pharmacia Biotech, England) in der Gegenwart von alpha (³⁵S)-dATP sequenziert. Die Analyse von dessen Sequenz zeigt, dass es zwischen den Nukleotiden 206 und 375 der Sequenz SEQ ID Nr. 1 lokalisiert ist und an dessen 5'- und 3'- Enden durch die Sequenzen begrenzt ist, die den Oligonukleotiden MAN 202 und 203 entsprechen. Von dieser Analyse wird abgeleitet, dass dieses PCR-Produkt einem Fragment der cDNA entspricht, die wirksam die Endo-β-Mannanase aus Kaffee kodiert, die wie vorstehend erläutert gereinigt und sequenziert wurde. Es wird ebenfalls bemerkt, dass diese cDNA unterschiedlich zu der ist, die im Labor kloniert wurde ( EP-Nr. 98203742.6 ), was das Vorliegen einer Multigen-Familie, die Endo-β-Mannanase aus Kaffee kodiert, vorschlägt.
Um die Volllängen-cDNA der Endo-β-Mannanase aus Kaffee zu isolieren werden eine Reihe von PCR-Reaktionen durchgeführt, wobei diesmal synthetische Oligonukleotide verwendet werden, die spezifisch sind und von der Sequenz des vorher klonierten 170 bp PCR-Produkts abgeleitet sind. Dazu werden die Oligonukleotide MAN 214 mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 8 und MAN 215 mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 9 verwendet. Die synthetischen Oligonukleotide MAN 214 und 215 entsprechen den Nukleotiden 307 bis 325 bzw. 307-290 der Sequenz SEQ ID Nr. 1 und sind Kopf an Schwanz an dieser gleichen Sequenz positioniert.
In diesen PCR-Reaktionen werden 10 ng der vorher durchmusterten cDNA-Bank, die Oligonukleotide MAN 214 und 215, und die universellen Oligonukleotide T3 und T7 verwendet, die für den Klonierungsvektor pPCR-Script Amp SK (+) (Stratagene, USA), spezifisch sind und die den Sequenzen SEQ ID Nr. 10 bzw. 11 entsprechen. Diese Primer sind jeweils auf einer der beiden Seiten ungefähr 100 bp von der SfrI-Klonierungsstelle des Vektors pPCR-Script Amp SK (+) lokalisiert. Die PCR-Reaktionen werden gemäß der vorstehend beschriebenen Bedingungen inkubiert und mit den folgenden Parameter: 40 Amplifikationszyklen (94°C-1 Minute, 50°C-1 Minute 30 Sekunden, 72°C-3 Minuten) gefolgt von einer letzten Verlängerung bei 72°C für 7 Minuten.
Nach Wanderung der PCR-Produkte auf einem Agarosegel wird das Vorliegen eines DNA-Fragments von ungefähr 400 bp beobachtet, das während der MAN 215-T3 Reaktion amplifiziert wurde, und eines DNA-Fragments von ungefähr 1,2 Kb, das während der MAN 214-T7-Reaktion amplifiziert wurde. Diese Fragmente werden unabhängig in den Vektor pGEMT-easy (Promega, USA) kloniert und dann auf beiden Strängen sequenziert (Eurogenetec Bel, s.a. - Parc Scientifique du Sart Tilman [Sart Tilman Scientific Park] - 4102 Seraing - Belgien). Die Analyse der Nukleinsäuresequenzen zeigt, dass das durch die Oligonukleotide MAN 215-T3 amplifizierte PCR-Produkt die ersten 307 Nukleotide der Sequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst, wohingegen das durch die Oligonukleotide MAN 214-T7 amplifizierte PCR-Produkt die letzten 1180 Basen der Sequenz SEQ ID Nr. 1 und ebenfalls einen Poly A+-Schwanz mit 26 Resten umfasst, der in der Sequenz SEQ ID Nr. 1 nicht gezeigt ist.
Um die Volllängen-cDNA der Mannanase aus Kaffee zu isolieren, die der Sequenz SEQ ID Nr. 1 entspricht, wurde eine letzte PCR-Reaktion durchgeführt, wobei 20 ng des Plasmids der DNA-Bank und die synthetischen Oligonukleotide MAN 300 und 301 verwendet wurden. Diese Primer entsprechen den Sequenzen SEQ ID Nr. 12 bzw. 13 und sind an den 5'- bzw. 3'-Enden der Sequenz SEQ ID Nr. 1 lokalisiert. Der Primer MAN 301 wurde so ausgewählt, dass er gerade stromaufwärts von dem in dem mit den Oligonukleotiden MAN 214-T7 amplifizierten PCR-Fragment vorliegenden Poly A+-Schwanz lokalisiert ist. Diese PCR-Reaktion wurde in einem Endvolumen von 50 μl durchgeführt, umfassend 10 ng Plasmid der cDNA-Bank (DAS = 22), 10 mM KCl, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 0,1% Triton X-100, 2 mM MgCl₂, 0,2 mM je dNTP, 10 μg/ml BSA, 0,25 μM je Oligonukleotid und 3 Einheiten der Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, USA). Die Reaktion wird für 45 Zyklen inkubiert (94°C - 1 Minute, 45°C - 1 Minute 30 Sekunden, 72°C - 3 Minuten) und von einer letzten Verlängerung bei 72°C für 7 Minuten gefolgt.
Am Ende dieser Reaktion ist ein einziges Fragment von ungefähr 1500 bp amplifiziert worden, das in den Vektor pPCR Script Amp SK (+) kloniert und dann auf beiden Strängen sequenziert wurde. Dessen Sequenzen entspricht der Sequenz SEQ ID Nr. 1. Durch Vergleich in den Datenbanken wird abgeleitet, dass diese cDNA eine Volllängen-cDNA ist und wirksam eine Endo-β-Mannanase kodiert, die die Protein Sequenzen SEQ ID Nr. 3 bis 5 umfasst, die vorher durch die Reinigung der Endo-β-Mannanase erhalten wurden. Es wird ebenfalls erwähnt, dass diese cDNA von der cDNA verschieden ist, die vorher im Labor kloniert wurde ( EP-Nr. 98203742.6 ). Sie stellt deshalb eine neue cDNA dar, die die Endo-β-Mannanase aus Kaffee kodiert, die wie vorstehend beschrieben gereinigt wurde. Es wird ebenfalls erwähnt, dass diese Sequenz SEQ ID Nr. 1 ohne irgendeinen Nukleotidunterschied all die Sequenzen der Klonierungszwischenschritte umfasst, die vorher durch die PCR-Amplifikationen der cDNA-Bank aus keimenden Bohnen isoliert wurden.
4. Analyse der Volllängen-cDNA, die Endo-β-Mannanase aus Kaffee kodiert
Die Analyse der Nukleinsäuresequenz zeigt, dass diese Volllängen-cDNA eine 61 bp transkribierte, untranslatierte Sequenz an ihrem 5'-Ende und eine 174 bp 3'-transkribierte, untranslatierte Sequenz umfasst. Sie weist an ihrem 3'-Ende keinen Poly A+-Schwanz auf, da das synthetische Oligonukleotide MAN 301, das vorstehend verwendet wurde, genau stromaufwärts von dieser Sequenz gewählt wurde. In dieser 3'-transkribierten, untranslatierten Sequenz wird das Vorliegen von AT-reichen Motiven beobachtet, von denen angenommen wird, dass sie an Polyadenylierungsmechanismen beteiligt sind. Das Vorliegen mehrerer umgekehrter und direkt wiederholter Sequenzen, die beispielsweise an Mechanismen von Messenger-RNA-Stabilität oder einer Translationswirksamkeit beteiligt sein können (Galllie, 1996, Plant Mol Biol 32, 145-158) wird ebenfalls erwähnt.
Die SEQ ID Nr. 1 umfasst einen offenen Leserahmen von 417 Codons (1251 Basen), der mit dem ATG-Codon an Position 62 beginnt und mit einem TAA-Codon endet (A an Position 1312). Das Vorliegen eines zweiten Translations-Startcodons an Position 65 der Sequenz SEQ ID Nr. 1 wird ebenfalls erwähnt. Das von dieser komplementären DNA abgeleitete Protein weist ein theoretisches Molekulargewicht von 46794 Da und einen theoretischen pI-Wert von 7,8 auf. Es weist ebenfalls ein sehr hydrophobes Proteinsegment auf, das ungefähr den ersten 30 Aminosäureresten der Sequenz SEQ ID Nr. 2 entspricht. Diese Proteinsequenz kann einem Signalpeptid entsprechen, das die 40 Aminosäuren der Sequenz SEQ ID Nr. 1 stromaufwärts von der Sequenz SEQ ID Nr. 3 umfasst, die der N-terminalen Sequenzierung des gereinigten Enzyms entspricht. In diesem Fall wird erwartet, das das Molekulargewicht des Proteins in dessen reifer Form 42616 Da beträgt, d. h. den letzten 376 Aminosäuren der Sequenzen SEQ ID Nr. 2 entspricht. In diesem Fall wird dessen pI-Wert nahe an 5,8 geschätzt. Diese Daten stimmen mit denen überein, die während der Reinigung des Proteins beobachtet wurde (siehe Beispiele 2, ♣ 5).
Das Vorliegen mehrerer potenzieller Glycosylierungsstellen (Asn/X/Ser oder Thr) wird ebenfalls erwähnt. Die Erste ist in dem potentiellen Signalpeptid an Position 35 bis 37 der Sequenz SEQ ID Nr. 2 lokalisiert und es wird deshalb angenommen, dass sie in der reifen Form der Mannanase abwesend ist. Die Zweite ist an der C-terminalen Position an Position 398 und 400 der Sequenz SEQ ID Nr. 2 lokalisiert.
Es wird erwähnt, dass die Sequenzen SEQ ID Nr. 3 bis 5, die der unter Verwendung des gereinigten Proteins durchgeführten Proteinsequenzierung entsprechen, ohne irgendeine Mehrdeutigkeit in dem von der Sequenz SEQ ID Nr. 1 abgeleiteten Protein (SEQ ID Nr. 2) gefunden werden. So entspricht beispielsweise die Sequenz SEQ ID Nr. 3 den Aminosäuren 41 bis 62 von SEQ ID Nr. 2. In gleichartiger Weise werden die Sequenzen SEQ ID Nr. 4 und 5, die den Aminosäuren 99 bis 108 bzw. 265 bis 281 von SEQ ID Nr. 2 entsprechen, gefunden. Darüber hinaus gehen den Sequenzen SEQ ID Nr. 4 und 5 jeweils die Aminosäuren R (Position 98 von SEQ ID Nr. 2) und K (Position 264 von SEQ ID Nr. 2) voraus, die durch Trypsin erkannt werden, welches verwendet wurde, um die Proteolyse der gereinigten Mannanase und dann das Sequenzieren von bestimmten internen Peptiden durchzuführen (siehe Beispiele 2, ♣ 5).
5. Vergleich der Proteinsequenzen von Mannanasen des Kaffeebaums.
Die Ausrichtung (Feng und Doolittle, 1987, J. Mol. Evol., 25, 351-360) der als Mannanase B bezeichneten Proteinsequenz SEQ ID Nr. 2, mit der Proteinsequenz der als Mannanase A bezeichneten Endo-β-Mannanase, wobei die komplementäre DNA von dieser kürzlich im Labor kloniert wurde (Marraccini und Rogers, EP-Nr. 98203742.6 ), zeigt, dass zwischen diesen beiden Proteinen aus dem Kaffeebaum eine Identität von weniger als 56% existiert (1). Andererseits gibt es mehrere Proteinsegmente, die zwischen diesen beiden Proteinen und dem der Tomate (Bewley et al., 1997, Planta 203, 454-459) oder anderer eukaryotischer Mannanasen, wie solchen von Aspergillus aculeatus (Datenbank-Eintrittsnummer: L35487) und Trichoderma reesei (L255310) überaus konserviert sind. Einige dieser Konservierungen betreffen darüber hinaus Aminosäuren von denen angenommen wird, dass sie für die Aktivität des Proteins wesentlich sind, insbesondere die Glutamat(E)-Reste an Position 212, 216, 253 und 333 der Sequenz SEQ ID Nr. 2, die katalytische Reste sein können (Bewley et al., 1997). Andere Aminosäurereste, wie das Histidine (H) 291, das Asparagin (N) 215, das Tyrosin (Y) 293 und das Tryptophan (W) 377 der Sequenz SEQ ID Nr. 2 sind ebenfalls konserviert und können für das Anfügen an und den Abbau des Substrats wesentlich sein.
Beispiel 4
Expression der ManB-Mannanase aus Kaffee in E. coli
1. Konstruktion von Expressionsplasmiden
Die der SEQ ID Nr. 1 entsprechende manB cDNA-Sequenz wurde als Vorlage für Amplifikation der reifen Proteinsequenz (ohne Signalsequenz) und ohne das Translations-Stopp-Codon verwendet. Der PCR-Primer B262, der der Sequenz SEQ ID Nr. 14 entspricht, bindet (primes) an dem 5'-Ende der reifen manB-cDNA und führt eine einzige NcoI-Restriktionsschnittstelle ein, die ein neues ATG-Startcodon direkt vor dem reifen ManB-Protein umfasst, und Primer B260, der der Sequenz SEQ ID Nr. 15 entspricht, bindet an das 3'-Ende, wobei er eine SalI-Restriktionsschnittstelle einführt, während das Terminationskodon beseitigt und eine Fusion im Leserahmen an die HIS-Tag-Sequenzen erzeugt wird, die in dem Plasmid pET24-d (Novagen Inc., 601 Science Drive, Madison WI, USA) bereitgestellt wird (2). Eine Amplifikation erfolgte mit der hochgenauen, hitzestabilen Pwo-Polymerase (Roche Diagnostics GmbH, Deutschland). Ein μl an DNA-Vorlage wurde mit drei μl jedes Oligonukleotids mit 100 pmol·μl^-1, 10 μl 10X Pwo PCR-Puffer, 6 μl 2 mM dNTP und 0,5 μl Pwo-Polymerase gemischt. Eine Amplifikation wurde in einer Perkin-Elmer 9700 PCR-Maschine (Applied Biosystem Division, USA) in 0,2 ml Röhrchen durchgeführt, wobei bei 95°C für 5 Minuten gehalten wurde, gefolgt von 30 Zyklen bei 95°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 68°C für 2 Minuten und ein letztliches Halten bei 4°C.
Nach der PCR wurde eine Probe auf einem 1%igen Agarosegel sichtbar gemacht, um eine Amplifikation zu bestätigen. Das Amplikon wurde unter Verwendung des PCR-Reinigungs-Kits von Qiagen (Kat.-Nr. 28104, Qiagen Inc., USA) gereinigt und in einem Volumen von 50 μl eluiert. Ein Volumen von 25 μl des gereinigten Amplikons wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und SalI bei 37°C verdaut, das Produkt wurde auf einem 1%igen Agarosegel aufgelöst, und wobei die geeigneten DNA-Fragmente ausgeschnitten und unter Verwendung des Gel-Extraktionskits von Qiagen (Kat.-Nr. 28704) eluiert wurden. Dieses DNA-Fragment wurde in den vorher hergestellten pET24-d-Vektor ligiert, der mit SalI und NcoI, (dephosphoryliert) verdaut wurde, und in XL1-blue-Zellen (Stratagene, USA) transformiert. Die Transformanten wurden auf LB-Platten, die mit 50 μg·ml^-1 Kanamycin ergänzt wurden, selektioniert, durch Miniplasmid-Präparationen und Restriktionverdaue und schließlich durch eine DNA-Sequenzanalyse analysiert, wobei die Primer 'pET-For', der der Sequenz SEQ ID Nr. 16 entspricht, und 'pET-Rev', der der Sequenz SEQ ID Nr. 17 entspricht, verwendet wurden.
Das so erhaltene Plasmid wurde als pDP580 bezeichnet, wobei die dessen Karte in 3 gezeigt ist. Das Plasmid pDP580 wurde für eine Expressionsanalyse in dem T7-Expressionswirt BL21 (DE3) CodonPlus^TM RIL (Stratagene, USA) exprimiert.
2. Induktion der Proteinexpression
Der das Expressionsplasmid tragende Stamm wurde in LB-Medium, das mit den geeigneten Antibiotika ergänzt wurde, bei 37°C unter Schütteln für 16 Stunden wachsen gelassen, um eine frische Starter-Kultur bereitzustellen. Mit 1 ml der Starter-Kultur wurden 60 ml LB-Medium, das mit den geeigneten Antibiotika ergänzt wurde, angeimpft und bei 37°C unter Schütteln inkubiert bis die Kultur eine optische Dichte (O.D.₆₀₀) von ungefähr 0,6 erreicht hat. IPTG wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugesetzt und die Inkubation wurde für weitere 4 Stunden bei 37°C unter Schütteln fortgesetzt. Eine Probe von 40 ml wurde entfernt und bei 10.000 rpm zentrifugiert, wobei das Zellpellet (Pellet A) gesammelt wurde. Das bakterielle Pellet wurde in einem ml von 50 mM KPO₄, pH-Wert 7,0, 10 mM Imidazol-Puffer suspendiert, auf Eis gekühlt und für 30 Sekunden durch Beschallung zerstört, gefolgt von 20 Sekunden bei 0°C. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 12.000 rpm für 30 Minuten pelletiert (Pellet B), der Überstand wurde entfernt (Überstand B) und beide Pellets und Überstände bei -20°C gelagert. Um die Proteine mittels SDS-PAGE zu analysieren, wurde Pellet B in 50 mM KPO₄, pH-Wert 7,0, 10 mM Imidazol und 8 M Harnstoff solubilisiert. Die Proben wurden dann auf 10%igen Tris-HCl-Ready-Gelen (Bio-Rad Lab., 200 Alfred Nobel Drive, 94547 Hercules CA, USA, Kat.-Nr. 161-1101) aufgelöst, wobei die empfohlenen Bedingungen verwendet wurden.
3. Überexpression des groESL-Operons von E. coli
Neue Publikationen haben gezeigt, dass einige überexprimierte Proteine, die als Einschlusskörper ausfallen, durch die Co-Expression von entweder dem groESL-Operon des Wirts oder eines Trigger-Faktors (trigger factor) in die lösliche Proteinfraktion rückgewonnen werden können (Vonrhein et al., 1999, FERS Letters 443, 167-169; Nishihara et al., 2000, Appl. Environ Microbiol 33, 884-889). Um zu untersuchen, ob die gleichzeitige Überexpression des groESL-Operons von E. coli die Solubilisierung des überexprimierten Endo-β-Mannanase-Enzyms aus Kaffee unterstützen kann, wurde das groESL-Operon kloniert und in dem Expressionsplasmid pKK223-3 (Brosius und Holy, 1984, Proc Natl Acad Sci 81, 6929-6933) exprimiert. Das Plasmid pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech, England, Kat.-Nr. 27-4935-01) wurde ausgewählt, da es zur Selektion das Ampicillin-Resistenzgen verwendet (kein Konflikt mit anderen Plasmiden) und weil die Expression der eingeführten Gene ebenfalls durch IPTG induziert wird, wie für pET24-d (Novagen Inc., USA).
Chromosomale Gesamt-DNA von E. coli wurde unter Verwendung von Pwo-Polymerase und der Primer B452, der der Sequenz SEQ ID Nr. 18 entspricht, und B543, der der Sequenz SEQ ID Nr. 19 entspricht, wie vorstehend beschrieben mittels PCR amplifiziert.
Nach der PCR wurde eine Probe auf einem 1%igen Agarosegel sichtbar gemacht, um eine Amplifikation zu bestätigen. Das Amplikon wurde unter Verwendung des PCR-Reinigungs-Kits von Qiagen gereinigt und in einem Volumen von 50 μl eluiert. Ein Volumen von 25 μl des gereinigten Amplikons wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SalI bei 37°C verdaut, das Produkt wurde auf einem 1%igen Agarosegel aufgelöst und das geeignete DNA-Fragment wurde ausgeschnitten und unter Verwendung des Gelextraktions-Kits von Qiagen eluiert. Das DNA-Fragment wurde in den vorher hergestellten pKK223-3-Vektor (Amersham Pharmacia Biotech, England) ligiert, der mit SalI und EcoRI (dephosphoryliert) verdaut wurde, und in XL1-blue Zellen transformiert. Die Konstrukte wurden auf LB-Platten, die mit 100 μg·ml^-1 Ampicillin ergänzt wurden, selektioniert, durch Miniplasmid-Präparationen und Restriktionsenzymverdaue analysiert, und wobei ein positiver Klon mit pDP588 bezeichnet wurde (4). Das Plasmid pDP588 wurde in den E. coli-Expressionswirt BL21 (DE3) CodonPlus^TM RIL (Stratagene, USA) transformiert, der das Expressionsplasmid pDP580 der Endo-β-Mannanase aus Kaffee umfasste und auf LB-Platten selektioniert, die mit Ampicillin, Chloramphenicol und Kanamycin ergänzt wurden. Die Proteinexpression erfolgt wie vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Kultur in LB-Medium, das mit Ampicillin, Chloramphenicol und Kanamycin ergänzt wurde, bei 37°C wachsen gelassen wurde.
4. Endo-β-Mannanase-Test bzw. Assay
Eine Endo-β-Mannanase-Aktivität wurde in E. coli-Kulturen getestet, die genau wie vorstehend beschrieben hergestellt und einer IPTG induzierten Expression unterzogen wurden. Die Kulturen (100 ml) wurden bei Erreichen der optischen Dichte (O.D.₆₀₀) von 0,6 in zwei aufgeteilt. In einer Kultur wurde eine rekombinante Proteinexpression mit IPTG induziert (ergibt eine IPTG-induzierte Aktivität), während die andere Kultur als Parallele ohne Induktion (Kontrolle) gehalten wurde. Diese 50 ml Kulturen wurden dann zu den Stadien Pellet B und Überstand B, wie vorstehend beschrieben, geerntet.
In Proben der Stadien Überstand B und Pellet B wurde nach Aktivität getestet. Die zu testende Probe (200 μl des Überstands oder des Pellets B suspendiert in 200 μl Assay- bzw. Testreaktionspuffer) wurde zum Zeitpunkt null zu 800 μl Reaktionspuffer (200 mM Natriumacetat/Essigsäure, 100 mM NaCl, pH-Wert 5,0), der eine Suspension von 1% (Gew./Vol.) unlöslichem Substrat AZCL-Galactomannan (Megazyme, Irland) umfasst, zugesetzt. Die Reaktionen wurden bei 37°C kontinuierlich gerührt. Mit der Zeit wurden Teilmengen (200 μl) entnommen, für 5 Minuten auf 100°C erhitzt und bei 12.000 g für 5 Minuten zentrifugiert, und wobei der Überstand in eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen aliquotiert wurde. Die Farbe war nach Erhitzen stabil. Die Absorption des Überstands wurde bei 595 nm ausgelesen und die Aktivität als Δ595 nm·min^-1·μl Probe^-1 ausgedrückt. Da Vergleiche entweder zwischen Überständen oder zwischen pelletiertem Material durchgeführt wurden, wurde kein Versuch unternommen eine spezifische Aktivität auszudrücken.
5. Expression des ManB-Endo-β-Mannanase-Gens aus Kaffee
Die die Plasmide CodonPlus RIL (Stratagene, USA) und pDP580 mit und ohne Plasmid pDP588 umfassenden Kulturen des E. coli-Expressionswirts BL21 (DE3) wurden mit IPTG für 4 Stunden herangeführt, die Zellen durch Beschallung zerstört und die löslichen Proteine (Überstand B) und Proteine in dem Zellpellet (Pellet B) wurden durch SDS-PAGE aufgelöst. Die SDS-PAGE der löslichen Proteine (Überstand B) (5) zeigte, dass keine starken Proteinbanden vorliegen, die der vorhergesagten Größe des Endo-β-Mannanase Konstrukts aus Kaffee entsprechen. Die SDS-PAGE des gelösten Zellpellets (Pellet B) zeigte andererseits das Vorliegen einer starken, neuen Proteinbande für die Expression von Plasmid pDP580. Diese Ergebnisse blieben unverändert, wenn das groESL-Expressionsplasmid eingeschlossen wurde. Es wird ebenfalls erwähnt, dass ein Konstrukt, das das Volllängen-Endo-β-Mannanase-Gen exprimiert keine neuen Proteinbanden erzeugt, was möglicherweise durch die assoziierte Sekretionssignalsequenz bedingt ist.
6. Analyse der Aktivität der in E. coli exprimierten ManB-Endo-β-Mannanasen
Die Aktivität des rekombinanten manB-Genprodukts (ManB-Endo-β-Mannanasen) wurde analysiert (Tabelle 1). Es zeigt sich, dass die Expression von Endo-β-Mannanase von pDP580 lediglich nach Induktion durch IPTG und lediglich mit einem niedrigen Spiegel nachweisbar ist. Dieses Ergebnis bestätigt, dass sich die Bezeichnung des Gens und der Enzymaktivität entsprechen. Wird das E.coli groESL-Expressionsplasmid pDP588 eingeschlossen, erhöht sich die Expression der Endo-β-Mannanase um mehr als das 50-Fache, was bestätigt das die Co-Expression dieses Chaperons die Wirksamkeit der Faltung des Endo-β-Mannanase-Proteins verbessert hat. Jedoch verbleiben lediglich sehr geringe Mengen des Proteins in löslicher Form, um eine nachweisbare Enzymaktivität zu ergeben, während sie mittels SDS-PAGE über den Proteinhintergrund nicht nachweisbar bleiben.

E. coli-Stamm pDP580 pDP580 + pDP588

Pellet B

Kontrolle 1,6 6,6

+ IPTG 2,6 142

Überstand B

Kontrolle 1,0 2,8

+ IPTG 1,0 74

Tabelle 1: IPTG-induzierte Endo-β-Mannanase-Aktivität nachgewiesen in allen E. coli, die das ManB-Expressionsplasmid pDP580 exprimieren und mit dem E. coli groESL-Expressionsplasmid pDP588.

ND = nicht nachgewiesen bzw. detektiert

Die Aktivität ist als Δ595 nm·min^-1·μl Probe^-1 × 10^-5 ausgedrückt. Die Ergebnisse stellen das Mittel von mindestens 3 Experimenten dar.
Beispiel 5
Expression der ManB-Endo-β-Mannanase aus Kaffee in Yarrowia lipolytica
1. Konstruktion des Expression/Sekretionsplasmids
Die der Sequenz SEQ ID Nr. 1 entsprechenden manB cDNA-Sequenz wurde als Vorlage für die Amplifikation der Sequenz verwendet, die das reife Protein (ohne Signalsequenz) und ohne das Translations-Stopp-Codon kodiert. Der PCR-Primer B281, der SEQ ID Nr. 20 entspricht, bindet an das 5'-Ende der reifen manB-cDNA und führt eine SfiI-Stelle ein, die ein direktionales Klonieren im Leserahmen in eine Hybrid XPR2-Lipase-Signalsequenz ermöglicht, die auf dem Expression/Sekrektionsplasmid pNFF296 für Yarrowia lipolytica vorliegt (6). Der PCR-Primer B282, der der SEQ ID Nr. 21 entspricht, bindet an das 3'-Ende der reifen manB-cDNA und führt im Leserahmen eine 3xHIS-Sequenz gerade vor dem Stopp-Codon und der Sfil-Klonierungsstelle vor dem Lipase-Terminator von pNFF296 ein. Eine Expression des eingeführten Gens steht unter der Kontrolle eines synthetischen XPR2-abgeleiteten Promotors (Mazdak et al., 2000, J Mol Microbiol Biotechnol 2, 207-216). Eine Amplifikation erfolgte mit der hochgenauen, hitzestabilen nativen Pfu-Polymerase (Stratagene, USA). Ein Mikroliter an DNA-Vorlage wurde mit 10 mM KCl, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 0,1% Triton X-100, 2 mM MgCl₂, 0,2 mM je dNTP, 10 μg·ml^-1 BSA, 0,25 μM je Primer und 3 Einheiten der Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, USA) in einem Stratagene RoboCycler (Stratagene, USA) inkubiert. Die PCR wurde wie folgt durchgeführt: 1 Zyklus (95°C - 1 Minute, 50°C - 1 Minute, 72°C - 3 Minuten), 30 Zyklen (95°C - 1 Minute, 50°C - 1 Minute, 72°C - 3 Minute) und ein letzter Zyklus (95°C - 1 Minute, 50°C - 1 Minute, 72°C - 10 Minuten). Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%igen Agarosegel sichtbar gemacht, um eine Amplifikation zu bestätigen, unter Verwendung des Qiaquick-PCR-Reinigungskits (Kat.-Nr. 28704, Qiagen INC., USA) gereinigt, mit SfiI verdaut und anschließend in den Vektor pNFF296 (6) ligiert, der vorher mit SfiI verdaut wurde. Diese Ligation wurde zum Transformieren von E. coli BZ234 (Biozentrum, Universität Basel, Klingelbergstr. 50-70 CH, 4056 Basel, Schweiz) verwendet. Konstrukte wurden auf LB-Platten, die mit 50 μg·ml^-1 Kanamycin ergänzt wurden, selektioniert, durch Miniplasmid-Präparationen und Restriktionsenzymverdau und schließlich durch eine DNA-Sequenzanalyse mit den internen manB-Primern B360 und B361, die den Sequenzen SEQ ID Nr. 22 bzw. SEQ ID Nr. 23 entsprechen, und ebenfalls mit den äußeren Primern B358 und B359, die SEQ ID Nr. 24 bzw. SEQ ID Nr. 25 entsprechen, analysiert. Das so erhaltene Plasmid wurde als pCY316 (7) bezeichnet.
2. Transformation von Yarrowia lipolytica YLP3
Der Wirtsstamm von Yarrowia lipolytica YLP3 wurde von den Stamm polf (MatA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp-2 SUC2) (Mazdak et al., 2000) durch Transformation des Stamms auf Leucin-Prototrophie mit einem 5,1 kb SalI-Fragment, das das LEU2-Gen des Wildtyps von Yarrowia lipolytica trägt, und Selektionieren nach LEU2-Konvertanten abgeleitet. Der Wirtsstamm von Yarrowia lipolytica wurde auf einer YPD-Agarplatte ausgestreift (1% Difco Bacto Hefeextrakt, 2% Difco Bacto Pepton, 2% Glucose, 2% Difco Bacto Agar; Difco-Lee lab., 1475 Athens Hwy, Grayson 30017, GA, USA) und über Nacht bei 28°C wachsen gelassen. Mit frisch gewachsenen Zellen von der YPD-Platte wurden 4 ml flüssiges YPD, pH-Wert 4,0 (1% Difco Bacto Hefeextrakt, 1% Difco Bacto Pepton, 1% Glucose, 50 mM Citratpuffer mit einem pH-Wert von 4,0) angeimpft und in einem Röhrchen auf einer Rotations-Schüttelvorrichtung (200 rpm, 28°C, 8-9 Stunden) wachsen gelassen. Von dieser Vorkultur wurde eine geeignete Menge verwendet, um 20 ml YPD, pH-Wert 4,0, in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben ohne Schikanen anzuimpfen. Diese Kultur wurde in einer Rotations-Schüttelvorrichtung bei 200 rpm bei 28°C (über Nacht) geschüttelt bis ein Zelltiter von 10⁸ pro ml erreicht wurde. Die Zellen wurden bei 3000 g für 5 Minuten zentrifugiert, mit 10 ml sterilem Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 40 ml 0,1 M Lithiumacetat, pH-Wert 6,0 (eingestellt mit 10% Essigsäure) suspendiert und in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben bei 140 rpm bei 28°C für 60 Minuten geschüttelt. Die Zellen wurden wiederum für 5 Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 2 ml Lithiumacetat, pH-Wert 6,0 suspendiert und die kompetenten Zellen wurden bis zur Transformation auf Eis gelagert.
Einhundert Microliter kompetenter Zellen wurden mit 5-20 μl Plasmid, das mit NotI linearisiert wurde und 50 μg Träger-DNA (Heringssperma-DNA, die durch Beschallung auf 100 bis 600 bp zerstört wurde, Promega, USA) in einem 2 ml Röhrchen gemischt und für 15 Minuten bei 28°C inkubiert. Es wurden 700 μl 40% PEG 4000, 0,1 M Lithiumacetat, pH- Wert 6,0, zugesetzt und die Röhrchen heftig bei 240 rpm auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28°C für 60 Minuten geschüttelt. Es wurde ein Volumen von 1,2 ml von 0,1 M Lithiumacetat, pH-Wert 6,0, zugesetzt und gemischt und es wurden bis zu 250 μl auf selektiven Agar-Platten ausplattiert (0,17% Difco Bacto-Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 1% Glucose, 0,006% L-Leucin, 0,1% Natriumglutamat, 0,1% Difco Bacto Casaminosäuren, 2% Agar). Das Expressionsplasmid pNFF296 trägt ein defektes URA3-Allel, was die Selektion mehrerer Integrationen der Expressions-Sekretions-Kassette in dem Wirtsstamm YLP3 ermöglicht (Le Dall et al., 1994, Current Genetic, 26, 38-44).
3. Kultivierung von Yarrowia lipolytica-Transformanten in Schüttelkolben
Transformanten (Ura⁺) wurden erneut auf selektivem Medium isoliert (0,17% Difco Bacto-Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren und Amoniumsulfat, 1% Glucose, 0,006% L-Leucin, 0,1% Natriumglutamat, 0,1% Difco Bacto-Casaminosäuren, 2% Agar). Eine Reihe von Klonen wurde in Schüttelkolben wachsen gelassen um eine Expression und Sekretion von ManB-Endo-β-Mannanase aus Kaffee in das Kulturmedium zu überprüfen:
Kleine Flecken bzw. Patches von Zellen wurden auf YPD-Agar-Platten ausgestreift und über Nacht bei 28°C wachsen gelassen. Die gewachsenen dünnen Zellschichten wurden verwendet, um 50 ml DMI-Medium in 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 4 seitlichen Schikanen anzuimpfen. Das DMI-Medium umfasst pro Liter: 10 g KH₂PO₄; 2,5 g MgSO₄·7H₂O; 20 g Glucose; 5,1 ml Spurenelementlösung; 17 ml Vitaminlösung; 3 g Harnstoff. Der Harnstoff wurde in 15 ml Wasser gelöst und sterilfiltriert. Die Spurenelementlösung umfasst pro Liter: 12,5 g EDTA; 4 g ZnSO₄·7H₂O; 6,5 g MnSO₄·H₂O; 5 g CaCl₂·2H₂O; 30 g NaH₂PO₄·H₂O; 2,5 g FeSO₄·7H₂O; 0,008 g H₃BO₃; 0,0009 g KI; 0,1 g CuSO₄·5H₂O; 0,004 g Na₂MoO₄·2H₂O; 0,007 g CoCl₂·6H₂O; 0,0008 g NiSO₄·7H₂O; 0,04 g EDTA und wurde durch autoklavieren bei 121°C für 20 Minuten sterilisiert. Die Vitaminlösung wurde wie kürzlich beschrieben hergestellt (Verduyn et al., 1992, Yeast, 8, 501). Der anfängliche pH-Wert des Mediums wurde auf 5,0 eingestellt. Die Kulturen wurden bei 140 rpm in einer Rotations-Schüttelvorrichtung für 3 Tage bei 28°C geschüttelt. Teilmengen der Kulturen wurden bei maximaler Geschwindigkeit (3000 g) für 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde verwendet, um die Endo-β-Mannanase-Aktivität zu bestimmen.
4. Endo-β-Mannanase-Assay
Der Kulturüberstand (250 μl) wurde zu 750 μl Reaktionspuffer zugesetzt (200 mM Natriumacetat Essigsäure, pH-Wert 5,0) umfassend AZCL-Galactomannan (Megazym, Irland), um eine Endkonzentration von 0,5% Gew./Vol. zu ergeben. Die Proben wurden für 60 Minuten bei 40°C mit gelegentlichem Rühren inkubiert. Die Reaktionen wurde durch Fällung mit 2,5 ml 95%igem Ethanol abgestoppt.

Nach Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit (3000 g) wurde die Adsorption des Überstands bei 590 nm ausgelesen. Eine Endo-β-Mannanase-Aktivität wird als Δ595 nm·Stunden^-1·ml Überstand^-1 ausgedrückt. Ein Leerwert (250 μl Reaktionspuffer) und ein Kulturüberstand eines ein leeres Plasmid (pNFF296) tragenden YLP3-Transformanten wurden parallel als Kontrollen eingeschlossen. Insgesamt wurden 21 Transformanten hinsichtlich Endo-β-Mannanase-Aktivität durchmustert. Alle Transformanten, die mit dem Plasmid pCY316 transformiert wurden, zeigten verschiedene Spiegel an Enzymaktivität, während in der das leere Plasmid pNFF296 tragenden Kontrolltransformante keine Aktivität nachgewiesen werden konnte. Für sechs unabhängige pCY316-Transformanten wurde das Experiment zweimal wiederholt, wobei die Ergebnisse der Aktivitäts-Tests in Tabelle 2 zeigt sind.

Transformanten	Aktivität(*)
YLP3 (pCY316) # 1	0,268
YLP3 (pCY316) # 4	0,328
YLP3 (pCY316) # 11	0,246
YLP3 (pCY316) # 13	0,288
YLP3 (pCY316) # 16	0,320
YLP3 (pCY316) # 21	0,271
YLP3 (pNFF296) # 1 (leeres Plasmid)	0

Tabelle 2: Endo-β-Mannanase-Aktivität nachgewiesen in Kulturüberständen verschiedener unabhängiger Klone von Yarrowia lipolytica, die mit dem Vektor pCY316 transformiert wurden.

(*) Die Aktivität ist als Δ590 nm·Stunden^-1·250 μl Überstand^-1 ausgedrückt. Hintergrundwerte des Leerwertes [Puffer] sind bereits von den vorstehend aufgeführten Endwerten abgezogen.
(#): Zeigt die Anzahl der transformierten Klone an.

Die Ergebnisse stellen das Mittel von 3 Experimenten dar. SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verfahren zur Behandlung von Kaffeebohnen, wobei das Protein gemäß SEQ ID NR: 2 eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, welches die Schritte umfasst, – Überexprimieren einer DNA mit der SEQ ID NR:1 in einem Mikroorganismus, einem Pilz oder einer nicht-differenzierten Pflanzenzelle, – Reinigen des Enzyms, – Behandeln der Sedimente von Kaffeebohnen mit dem Enzym um die Extraktionsausbeuten zu erhöhen, oder Behandeln von Kaffee-Flüssigkeit mit den Enzymen, um die Sedimentation aufgrund von Mannanen, welche gelieren, zu verringern.
DNA-Fragment, abgeleitet von Kaffee, welches mindestens ein Enzym kodiert, das an der Hydrolyse von Polysacchariden beteiligt ist, welche mindestens aus reinen oder verzweigten Mannan-Molekülen bestehen, welche miteinander über eine β(1→4) Bindung verknüpft sind, worin das DNA-Fragment die Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID NR: 1 aufweist oder die Nukleinsäure-Sequenz von Nukleotid 62-1312 der Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID NR: 1.
Rekombinanter Vektor, welcher ein DNA-Fragment nach Anspruch 3 umfasst.
Protein, das von der Kaffeebohne abgeleitet ist, welches von einem Kaffee-Gen kodiert ist und an der Hydrolyse von Polysacchariden involviert ist, welche aus mindestens reinen oder verzweigten Mannan-Molekülen bestehen, die miteinander über eine β(1→4) Bindung verknüpft sind, und welches die Aminosäure-Sequenz SEQ ID NR: 2 aufweist.
Pflanzenzelle, welche mittels eines rekombinanten Vektors ein DNA-Fragment nach Anspruch 3 enthält.
Pflanzenzelle nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Kaffeezelle ist.
Pflanze oder Samen, welche aus Pflanzenzellen nach den Ansprüchen 6 oder 7 bestehen.
Mikroorganismus, welcher integriert in sein Genom oder mittels eines Plasmids, welches replizieren kann, ein DNA-Fragment nach Anspruch 3 enthält, so dass es mindestens ein Enzym exprimiert, das an der Hydrolyse von Polysacchariden beteiligt ist, welches aus mindestens reinen oder verzweigten Mannan-Molekülen bestehen, die miteinander über eine β(1→4) Bindung verknüpft sind.