PT1272642E - Mananase de café. - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MANANASE DE CAFÉ" A presente invenção refere-se à utilização de fragmentos de ADN de café codificando, pelo menos, uma enzima envolvida na hidrólise de polissacarídeos consistindo, pelo menos, em moléculas de mananas, simples ou ramificadas, ligadas entre si via uma ligação β (1—»4) .

Estado da técnica

Os polissacarídeos que contêm manose estão frequentemente presentes nas paredes celulares de plantas superiores, em particular em plantas leguminosas, e são considerados como uma reserva de hidratos de carbono nas sementes.

Demonstrou-se que a actividade de endo-p-mananase em diversas plantas é detectada, principalmente, no endosperma de sementes submetidas a germinação (Bewley, Trends Plant Sei 2, 464-469, 1997) .

No grão de café encontram-se, em particular, galactomananas. As últimas representam, aproximadamente, 24% do peso seco do grão (Bradbury e Halliday, J Agric Food Chem 38, 389-392, 1990). Estes polissacarídeos consistem numa cadeia linear de resíduos de manosilo que estão ligados entre si via ligações de tipo β-1->4 e aos quais estão unidos monómeros de resíduos de α-galactosilo. Sabe-se igualmente que a enzima 1 denominada endo-p-mananase (E. C 3.2.1.78) é uma hidrolase que degrada polímeros de (l->4)-β-mananas facilitando, deste modo, a saída da radícula durante a germinação e libertando pequenos oligossacarídeos que são depois utilizados como fonte de energia para o crescimento da planta jovem.

Nos processos industriais, durante o tratamento do café, as moléculas de mananas e seus derivados constituem uma parte considerável dos sedimentos insolúveis. Adicionalmente, a fracção destas moléculas que se dissolve durante a primeira extracção (aproximadamente 50%) é igualmente muito pobremente solúvel e, por conseguinte, é responsável pela maioria das precipitações secundárias que ocorrem durante as etapas subsequentes. Foi demonstrado, na patente EP 0676145A, que é possível hidrolisar as galactomananas do café utilizando uma mananase imobilizada extraída de Aspergillus niger. O próprio pedido EP N° 98203742.6 propõe a utilização de fragmentos de ADN de café codificando, pelo menos, uma endo-β-mananase envolvida na hidrólise de polissacarídeos consistindo, pelo menos, em moléculas de mananas, simples ou ramificadas, ligadas entre si via uma ligação β(1-»4). O documento WO 99/24588 relaciona-se com a preparação de um ADN de endo-p-mananase a partir de diferentes frutos incluindo tomates, melões, pêssegos, pepinos e nectarinas ou uma semente para o controlo do amadurecimento. O ADNc é utilizado para a preparação de uma sequência anti-sentido, útil no bloqueamento da expressão de endo-p-mananase na fruta para retardar o amadurecimento. 2

Giorgini et al. (Bras. Fisiol. Veg. 8(1) (1996), 43-49) referem que a actividade enzimática de endo-p-mananase se correlaciona com o crescimento dos cotilédones das sementes de café. A actividade enzimática pode ser modulada pela adição de diferentes promotores do crescimento. 0 documento EP 0676145 é dirigido a um processo para hidrolisar galactomananas presentes num extracto liquido por meio de β-mananase de Aspergíllus niger num suporte.

Contudo, pareceu vantajoso proporcionar meios para o tratamento de grãos de café.

Sumário da invenção A presente invenção refere-se a um processo para o tratamento de grãos de café, em que é utilizada a proteína de acordo com a SEQ ID N°: 2. A presente invenção refere-se, igualmente, ao processo de acordo com a reivindicação 1, compreendendo as etapas de - superexpressão de um ADN possuindo a SEQ ID N°: 1 num microrganismo, num fungo ou numa célula vegetal indiferenciada, - purificação da enzima, - tratamento dos sedimentos dos grãos de café com a enzima, para aumentar os rendimentos de extracção, ou tratamento do licor de café com a enzima, para diminuir a sedimentação causada por mananas que gelificam. 3

Outro aspecto da invenção refere-se a um fragmento de ADN derivado do café codificando, pelo menos, uma enzima envolvida na hidrólise de polissacarideos consistindo, pelo menos, em moléculas de mananas, puras ou ramificadas, ligadas entre si via uma ligação β(1->4), fragmento de ADN esse que possui a sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N°: 1 ou possui a sequência de ácidos nucleicos desde os nucleotideos 62 a 1312 da sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N°: 1. A presente invenção refere-se, adicionalmente, a um vector recombinante compreendendo um fragmento de ADN de acordo com 3.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a proteína derivada do grão de café, a qual é codificada por um gene do café e está envolvida na hidrólise de polissacarideos consistindo, pelo menos, em moléculas de mananas, puras ou ramificadas, ligadas entre si via uma ligação β (l->4), e que possui a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 2. A presente invenção refere-se, igualmente, a uma célula vegetal compreendendo, por meio de um vector recombinante, um fragmento de ADN de acordo com a presente invenção. A presente invenção refere-se, igualmente, a uma planta ou semente consistindo em células vegetais de acordo com a presente invenção. A presente invenção refere-se a um microrganismo compreendendo, integrado no seu genoma ou por meio de um plasmídeo que pode replicar, um fragmento de ADN de acordo com a presente invenção. 4

Descrição das figuras A Figura 1 representa um alinhamento de proteínas das endo-β-mananases de Aspergillus aculeatus, Trichoderma reesei e Lycopersicon esculentum (tomate) com mananase A (Marraccini e Rogers, documento EP N° 98203742.6) e a mananase de café de acordo com a presente invenção (mananase B). A Figura 2 representa um esquema que torna possível posicionar os oligonucleotídeos sintéticos utilizados para amplificar a proteína madura ManB, incluindo o grupo da cauda HIS na sua extremidade carboxi-terminal (C-ter.). A Figura 3 representa um mapa do plasmídeo pDP580. A Figura 4 representa um mapa do plasmídeo pDP588. A Figura 5 representa a análise por electroforese em gel de SDS-PAGE da expressão da proteína ManB em E. coli, após indução pela adição de IPTG. A Figura 6 representa um mapa do plasmídeo pNFF296. A Figura 7 representa um mapa do plasmídeo pCY316.

Descrição detalhada da invenção O termo "sequência homóloga" pretende significar qualquer sequência de ácidos nucleicos ou de aminoácidos possuindo uma função idêntica, o que difere das sequências de acordo com a invenção apenas pela substituição, deleção ou adição de um 5 pequeno número de bases de ácidos nucleicos ou de aminoácidos, por exemplo 1 a 500 pares de bases (pb) ou 1 a 150 aminoácidos.

Neste contexto, serão consideradas em particular como homólogas duas sequências de ADN que, em virtude da degenerescência do código genético, codifiquem o mesmo polipeptideo. Analogamente, serão consideradas com homólogas duas proteínas funcionais que sejam reconhecidas pelo mesmo anticorpo, a razão dos valores de intensidade de reconhecimento das duas proteínas pelo anticorpo não excedendo 100, por exemplo.

Será igualmente considerada como sequência homóloga aquela sequência que possui mais de 70% de homologia com as sequências de acordo com a invenção, em particular mais de 80% ou 90%. Neste último caso, a homologia é determinada pela razão entre o número de bases ou de aminoácidos de uma sequência homóloga que sejam idênticos àqueles de uma sequência de acordo com a invenção, e ao número total de bases ou de aminoácidos da referida sequência de acordo com a invenção. O termo "fragmento que hibridiza" pretende significar qualquer fragmento capaz de hibridizar em os fragmentos de acordo com a invenção pelo método de Transferência de Southern (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, EUA, 1989, capítulos 9.31 a 9.58). De um modo preferido, a hibridização é efectuada sob condições estringentes de forma a evitar hibridizações inespecíficas ou relativamente instáveis.

Finalmente, o termo "fragmento" ou "fragmento de ADN" deve ser compreendido como um ADN bicatenário de origem cromossómica 6 que pode ser sintetizado, reproduzido in vitro, por exemplo pelo conhecido método designado "Reacção de Polimerização em Cadeia", ou reproduzido in vivo numa bactéria do tipo Escherichia coli, por exemplo.

No restante da descrição, as sequências SEQ ID N°: referem-se às sequências dadas a seguir na listagem de sequências. Os oligonucleotideos sintéticos SEQ ID N°: 6 até SEQ ID N°: 25 mencionados na descrição e dados a seguir na listagem de sequências são proporcionados por Eurogentec (Pare Scientifique du Sart Tilman [Sart Tilman Scientific Park] - 4102 Seraing-Bélgica).

Foi possível demonstrar que a totalidade ou parte da sequência SEQ ID N°: 1 possibilita, a seguir a uma transformação, hidrolisar polissacarídeos consistindo, pelo menos, em moléculas de mananas, puras ou ramificadas, ligadas entre si via uma ligação β(1—»4) numa célula hospedeira, tal como uma célula vegetal ou um microrganismo. A presente invenção refere-se a qualquer fragmento de ADN possuindo a sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N°: 1. Esta sequência de ácidos nucleicos codificando, pelo menos, uma enzima envolvida na hidrólise de polissacarídeos consistindo, pelo menos, em moléculas de mananas, puras ou ramificadas, ligadas entre si via uma ligação β (l->4) . A enzima é, de um modo preferido, uma endo-p-mananase possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 2. 7 A invenção refere-se ao fragmento de ADN delimitado pelos nucleotideos 62 a 1312 da sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N°: 1. A presente invenção refere-se, igualmente, às novas enzimas codificadas pelos genes da sequência SEQ ID N°: 1, em particular às sequências que lhes são homólogas. É, deste modo, possível considerar a sua utilização para modificar ou degradar tais polissacarídeos in vitro, por exemplo. Para tal, é preferido purificar, pelo menos, uma destas enzimas, superexpressando convencionalmente o seu gene numa bactéria e isolá-lo convencionalmente por precipitação e/ou cromatografia do meio de cultura, por exemplo.

Além disso, é igualmente um objecto da presente invenção uma proteína derivada do grão de café, a qual é codificada por um gene do café e está envolvida na hidrólise de polissacarídeos consistindo, pelo menos, em moléculas de mananas, puras ou ramificadas, ligadas entre si via uma ligação β (l-»4), e que possui a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 2.

Outro objecto da presente invenção refere-se a um processo para a hidrólise de polissacarídeos consistindo, pelo menos, em moléculas de mananas, puras ou ramificadas, ligadas entre si via uma ligação β (1—»4) , em que (1) um fragmento de ADN codificando as enzimas de acordo com a invenção é clonado num vector, o referido vector compreendendo igualmente uma sequência permitindo a replicação autónoma ou integração numa célula hospedeira, (2) uma célula hospedeira é transformada com o referido vector e, em seguida, (3) a célula hospedeira transformada é cultivada, sob condições adequadas, para a hidrólise de tais polissacarídeos.

Por conseguinte, a presente invenção deixa em aberto a possibilidade de utilização de fragmentos de ADN de acordo com a invenção para modificar a produção de polissacarídeos consistindo, pelo menos, em moléculas de mananas, puras ou ramificadas, ligadas entre si via uma ligação β(1->4), numa célula hospedeira, em particular uma célula de grão de café. É, deste modo, possivel considerar a expressão ou superexpressão de ADNs de acordo com a invenção, numa célula de grão de café, a fim de produzir tais polipeptideos destinados a modificar o aroma e a estrutura dos grãos de café, por exemplo.

Finalmente, a presente invenção proporciona igualmente novas enzimas envolvidas na hidrólise de tais polissacarídeos. Estas enzimas podem, assim, ser utilizadas, de um modo vantajoso, para sintetizar ou modificar tais polissacarídeos, in vitro. A presente invenção refere-se, igualmente, a uma célula vegetal compreendendo, por meio de um vector recombinante, um fragmento de ADN possuindo a sequência nucleotídica SEQ ID N°: 1 ou um fragmento de ADN compreendendo os nucleotídeos 62 a 1312 da sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N°: 1. A célula vegetal é, de um modo preferido, uma célula de café. A presente invenção refere-se igualmente a qualquer planta ou qualquer semente consistindo em células vegetais compreendendo, por meio de um vector recombinante, um fragmento de ADN possuindo a sequência nucleotidica SEQ ID N°: 1, ou um fragmento de ADN compreendendo os nucleotídeos 62 a 1312 da sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N°: 1. 9 É igualmente um objecto da presente invenção qualquer microrganismo compreendendo, integrado no seu genoma ou por meio de um plasmídeo que pode replicar-se, um fragmento de ADN de acordo com a invenção, de modo a que expresse, pelo menos, uma enzima envolvida na hidrólise de polissacarideos consistindo, pelo menos, em moléculas de mananas, puras ou ramificadas, ligadas entre si via uma ligação β (1—»4) .

Finalmente, a presente invenção refere-se a um processo para o tratamento de grãos de café, em que é utilizada a proteína de acordo com a invenção. É possível, em particular, utilizar a proteína de acordo com a invenção para aumentar a percentagem de sólidos extraídos, durante o tratamento dos grãos de café. Utilizando a proteína de acordo com a invenção é, deste modo, possível aumentar o rendimento de extracção diminuindo, em simultâneo, a quantidade de sedimento.

Após a superexpressão do fragmento de ADN de acordo com a invenção num microrganismo, num fungo ou numa célula vegetal indiferenciada, os sedimentos podem ser tratados com a enzima mais ou menos purificada, de forma a, deste modo, aumentar os rendimentos de extracção.

Após a superexpressão do fragmento de ADN de acordo com a invenção num microrganismo, num fungo ou numa célula vegetal indiferenciada, é igualmente possível tratar o licor de café, de forma a diminuir a sedimentação causada por mananas que gelificam. 10 A presente invenção é descrita a seguir em maior pormenor com o auxilio da descrição adicional que se seguirá e que se refere a exemplos de produção de fragmentos de ADN, ou plasmideos recombinantes e de bactérias transformadas de acordo com a invenção. Contudo, é evidente que estes exemplos são dados a titulo de ilustração do objecto da invenção pelo que não constituem de modo algum uma limitação. A manipulação do ADN, a clonagem e a transformação de células bacterianas são, na ausência de instruções em contrário, efectuados de acordo com os protocolos descritos no manual de Sambrook et al.r acima mencionado. As percentagens são dadas em peso, salvo indicação em contrário.

Exemplo 1

Medição do pico de actividade de endo-p-mananase durante a germinação

Grãos da variedade Coffea arabica var. caturra 2308 são colhidos no estádio de maturidade, despolpados e secos durante três dias à temperatura ambiente. Em seguida, a casca dos grãos é removida e estes são secos e depois esterilizados a fim de serem germinados em cultura in vítro. Para o efeito, são colocados em Rovral (0,12% v/v) durante 1 hora, enxaguados com água estéril, colocados numa solução de hipocloreto de cálcio (6% p/v) à qual são adicionadas algumas gotas de emulsionante Teepol, durante 1 hora e, em seguida, enxaguados 4 vezes com água estéril antes de serem cultivados em tubos de ensaio num meio de agar-água. A germinação ocorre a 25 °C na presença de luz. O momento em que os grãos são colocados sobre a camada de agar é considerado como dia zero após infiltração (DAS = 0). 11

Os lotes de grãos são, depois, colhidos em diversos estádios de germinação (DAS 7, 14, 21, 28), e são em seguida triturados em azoto liquido. Em seguida, o pó é homogeneizado numa proporção de 1 g por 5 mL, num tampão de extracção (fosfato-citrato a 200/100 mM, pH 5,0, meta-bissulfito a 10 mM, Na2S205, EDTA a 5 mM e uma pastilha/50 mL de inibidor de protease "Completo" [Cat. N° 1836145, Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse 116, Mannheim, GE] 1 pastilha/50 mL), durante 20 min a 4 °C. 0 homogeneizado é, depois, centrifugado a 12000 g durante 20 min a 4 °C, e o sobrenadante é recuperado e centrifugado uma segunda vez. 0 sobrenadante, correspondente ao extracto enzimático cru é, em seguida, dividido em aliquotas e congelado a -80 °C. A actividade enzimática da endo-p-mananase é ensaiada de acordo com o seguinte método. Um extracto enzimático cru de 400 pL é adicionado a 1,6 mL de tampão de reacção (NaCl a 100 mM, acetato de sódio a 200 mM, pH 5,0) contendo substrato insolúvel AZCL-Galactomanana (Cat. N° I-AZGMA, Megazyme International Ireland Ltd, Bray Business Park, Bray Co., Wicklow, Irlanda) numa quantidade final de 1% p/v. A reacção começa pela adição do extracto e realiza-se a 37 °C com agitação. A fim de calcular o declive inicial da reacção, uma alíquota de 400 pL de meio é removida a cada 15 min durante 1 h, aquecida a 100 °C durante 5 min e depois centrifugada a 12000 g durante 2 min. A densidade óptica do sobrenadante é medida a 590 nm e a actividade especifica é expressa em AU (unidades de absorção óptica) .min’1 .mg de proteina’1, após se ter ensaiado a concentração de proteína em cada extracto pelo método de Bradford (Bradford, Anal. Biochem. T2_, 248-254, 1976). Deste modo, verifica-se que a actividade é virtualmente zero durante os primeiros 14 dias após infiltração (DAS), e aumenta 12 subsequentemente de modo gradual até um pico máximo em torno de 28 DAS. Após 28 DAS, a actividade diminui lentamente.

Exeinplo 2

Etapas de purificação de endo-β-mananase

De acordo com os resultados acima descritos, a estratégia de purificação continua utilizando 16 mL de um extracto enzimático cru de 28-DAS possuindo uma actividade em torno de 0,2 AU.min"1.mg de proteína-1 x 10"2, um conteúdo de proteína total de, aproximadamente, 48 mg e uma actividade total de 9, 6 AU.min-1 x 10-2. 1. Precipitação de sulfato de amónio:

Inicialmente, o extracto enzimático cru é fraccionado por precipitação de sulfato de amónio a 4 °C. O sulfato de amónio é adicionado, lentamente, com agitação até ser obtido um nível de saturação de 35%, e a solução é em seguida centrifugada a 12000 g a 4 °C durante 20 min. O sedimento assim obtido é recolhido num mínimo (1 mL) de tampão de extracção (ver acima). Neste extracto, a concentração proteica é aproximadamente 10 mg.mL-1. A actividade específica de endo-p-mananase é 0,9 AU.min-1.mg-1 x 10-2, que corresponde a um enriquecimento de 4 vezes da enzima em relação ao extracto cru e uma recuperação de 10 AU.min"1 da actividade total, i. e., 100%. 13 2. Separação numa coluna de interacção hidrofóbica A amostra acima descrita é, em seguida, separada numa coluna de interacção hidrofóbica (Hiload HR 16/10 phenyl sepharose High performance, Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd, Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA, Inglaterra). A coluna é pré-equilibrada com um tampão de equilíbrio (fosfato de sódio a 50 mM, sulfato de amónio a 400 mM, pH 7,0). A amostra (1 mL) é depois injectada na coluna, que é, em seguida, lavada com 5 volumes de coluna do tampão de equilíbrio. É aplicado um gradiente de 0 a 99,5% de água em 0,5 volumes de coluna, seguido de outro de 99,5 a 100% em 5 volumes de coluna. A actividade concentra-se, principalmente, em três fracções, que são utilizadas para continuar a purificação. O rendimento de purificação desta etapa é em torno de 80% em relação à etapa anterior. A actividade específica é 27 AU.min” 1.mg“1, i. e., um enriquecimento de aproximadamente 137 vezes em relação ao extracto cru. A actividade total recuperada é aproximadamente 9 AU.min"1 x 10’2, i. e., 90% da actividade inicial. 3. Separação por cromatografia de permuta iónica

As três fracções acima descritas são misturadas e concentradas e o tampão trocado utilizando tubos Ultrafree (Millipore, Bedford, MA, EUA, centrifugação a 4000 g no máximo). O volume recuperado é 1 mL. Esta amostra é injectada numa coluna de permuta iónica Resource Q (Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra) pré-equilibrada com um tampão Tris/HCl a 20 mM, pH 8,0. A eluição é efectuada com um gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl em 20 volumes de coluna. A actividade total recuperada 14 está presente exclusivamente em duas fracções. 0 rendimento de purificação desta etapa é 58% em relação à etapa anterior. A actividade especifica é 167 AU .min'1 .mg'1, i. e., um enriquecimento de aproximadamente 836 vezes em relação ao extracto cru. A actividade total recuperada é 0,9 AU.min'1, i. e., aproximadamente 9% da actividade inicial. 4. Separação por coluna de filtração em gel

As duas fracções recuperadas a partir da coluna de permuta aniónica são concentradas para 100 pL por centrifugação a 4000 g utilizando os tubos Ultrafree (Millipore Co, 80 Ashby Road, Bedford, MA, EUA). Esta amostra é injectada numa coluna Superdex 75 HR 10/30 (Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra) pré-equilibrada com um tampão de fosfato de sódio a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,0. As proteínas são eluidas com o mesmo tampão, com um caudal de 0,3 mL.min'1. Uma curva de calibração para a coluna é preparada nas mesmas condições utilizando padrões de peso molecular. A actividade de endo-p-mananase é distribuída em duas fracções, correspondente a um peso molecular de entre 40 e 55 KDa. 0 rendimento de purificação desta etapa final é 48%. A actividade especifica é, aproximadamente, 1400 AU .min'1 .mg'1, i. e., um enriquecimento de 7000 vezes em relação ao extracto cru. A actividade total é 0,45 AU.min'1, i. e., 4,5% da actividade inicial. 15 5. Análises por electroforese bidimensional e microsequenciação dos aminoácidos da enzima purificada

As fracções acima descritas com a actividade enzimática à saída da coluna são analisadas durante a purificação por electroforese bidimensional. Para o efeito, as fracções são misturadas e concentradas para 20 pL por centrifugação nos tubos Ultrafree (Millipore, EUA) como acima descrito. São adicionados 105 pL de tampão de re-hidratação (ureia a 8 M, 3% p/v de CHAPS, 0,8% v/v de anfolinas, 1% p/v de DTT) a este volume, e uma tira de gel não linear de 7 cm (pH 3,0 a 10,0) (Immobiline Dry Strip, Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra) é re-hidratada de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas são depois separadas em função do seu ponto isoeléctrico (pi) utilizando, por exemplo, o IPGphore system (Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra), empregando um número total de 14000 volt-horas.

No seguimento da separação das proteínas em função do seu pi, estas são depois separadas numa segunda dimensão de acordo com os seus pesos moleculares. Esta separação é efectuada de acordo com as recomendações de Hochstrasser et al. {Anal. Biochem, 173,412-423, 1989) e de Gorg et al. (Electrophoresis, 8_, 122-124, 1987) . Deste modo, a tira de gel da primeira dimensão é equilibrada numa primeira solução (ureia a 6 M, 30% v/v de glicerol, 2% p/v de SDS, 2% de DTT, Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0) durante 5 min e, em seguida, equilibrada numa segunda solução (ureia a 6 M, 30% v/v de glicerol, 2% p/v de SDS 2,5% p/v de iodoacetamida, Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0) durante 10 min. A tira de gel é em seguida carregada num gel de gradiente de concentração de acrilamida de 10-20% (dimensões 10 x 10 x 0,75 cm) com um único poço, e coberta com uma solução de agarose (1% p/v de agarose, 0,5% p/v de SDS, vestígios de 16 azul de bromofenol) pré-aquecida a 90 °C e mantida a 40 °C. O gel é montado num sistema de electroforese vertical e é

submetido a uma voltagem de 170 V durante 2 h. Após migração, as proteínas são coradas com prata de acordo com o método de Bjellqvist et al. (Electrophoresis, 14_, 1357-1365, 1993). O perfil da mistura das três fracções finais assim obtidas revela a presença de um único grupo de proteínas que consiste numa linha de 5 proteínas com o mesmo peso molecular aproximado de 42 KDa, mas com ligeiras diferenças no pi, entre pi 5,5 e 6. Este cálculo de pi é confirmado pelo facto de que a actividade de endo-p-mananase é eluída de uma coluna de cromatofocagem (mono P HR 5/5 - Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra) a um pH de 5,7 (resultados não apresentados) e igualmente pelo cálculo do pi teórico (5,8) da proteína madura (ver abaixo).

As proteínas assim purificadas são analisadas pela microsequenciação dos aminoácidos. Para o efeito, são transferidas para uma membrana PVDF ("Problot", Perkin Elmer Applied Biosystems Division, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404, EUA) utilizando, por exemplo, uma célula de

transferência Trans-Blot (Bio-Rad, 2000 Alfred Drive, Hercules, Califórnia 94547, EUA). Deste modo, no seguimento da separação da segunda dimensão, o gel é recuperado e agitado numa solução de transferência (10% v/v de metanol, NaOH-CAPS a 10 mM, pH 11,0) durante 10 min. Durante este período, dois suportes de espuma, duas folhas de papel Whatman e uma membrana PCDF-Problot (Perkin Elmer Applied Biosystem, EUA) são embebidas na mesma solução. O gel, a membrana e os suportes são montados no sistema Trans-Blot de acordo com as instruções do fabricante (Bio-Rad, EUA) , e a transferência é efectuada sob uma corrente de 100 V durante uma hora a uma temperatura de 4 °C. No final da transferência, as proteínas transferidas para a membrana são 17 reveladas com coloração ligeira de azul de Coomassie de acordo com as instruções do fabricante da membrana Problot. As diversas proteínas são excisadas da membrana, misturadas e sequenciadas conjuntamente. A sequenciação N-terminal das proteínas purificadas e dos peptídeos internos é efectuada com um sequenciador automático Beckmann (Beckmann Instruments Inc., 250 Harbor Boulevard Box 3100, Fullerton, Califórnia, 92634 EUA) de acordo com os métodos descritos em Teixeira et al. (Electrophoresis, 18_, 156- 162, 1997).

Por este método são obtidas três sequências; uma sequência N-terminal de 22 aminoácidos, denominada SEQ ID N°: 3, e duas outras respeitantes a peptídeos internos independentes, obtidos por digestão de tripsina, de 10 e 17 aminoácidos, respectivamente, descritos nas sequências SEQ ID N°: 4 e 5.

Nenhuma das sequências obtidas possui ambiguidades e mostra que as três proteínas, que compõem a linha acima descrita, são isozimas da endo-p-mananase que partilham uma sequência que é idêntica nas regiões analisadas. As sequências SEQ ID N°: 3, 4 e 5 correspondem, respectivamente aos resíduos 41 a 62, 99 a 108 e 265 a 281 da sequência SEQ ID N°: 2. 18

Exemplo 3

Isolamento do ADNc de comprimento completo codificando a endo-p-mananase do café purificada a partir de grãos submetidos a germinação 1. Isolamento dos ARNs totais e dos ARNs mensageiros poli A+ a partir do grão de café em germinação

Os grãos de café (Coffea arabica var. caturra 2308) são colhidos no estádio de maturidade e germinados in vitro, como acima descrito.

Os ARNs totais dos grãos são extraídos após 22 dias de germinação (DAS 22). Para o efeito, o grão é rapidamente triturado em azoto líquido e o pó obtido é ressuspendido em 8 mL de tampão a pH 8,0 contendo Tris HC1 a 100 mM, 0,1% p/v de SDS e 0,5% v/v de β-mercaptoetanol, é homogeneizado com um volume de fenol saturado com Tris HC1 a 100 mM, pH 8,0, e é em seguida centrifugado a 12000 g durante 10 min a 4 °C, de forma a extrair a fase aquosa, que é centrifugada (i) uma vez com um volume equivalente de fenol, (ii) duas vezes com um volume equivalente de fenol:clorofórmio (1:1) e (iii) duas vezes com um volume equivalente de clorofórmio (Rogers et al., Plant Physiol. Biochem. 3T_, 261-272, 1999) .

Os ácidos nucleicos totais são depois precipitados durante lha -20 °C pela adição à fase aquosa de 1/10 de um volume de acetato de sódio a 3 M, pH 5,2, e 2,5 volumes de etanol. A mistura resultante é, em seguida, centrifugada a 12000 g durante 30 min a 4 °C, e o sedimento é recolhido em 10 mL de H20, 19 antes de re-precipitar os ácidos nucleicos na presença de LiCl (2 M final) e de etanol (2,5 volumes).

Após a centrifugação, o sedimento dos ARNs totais é recolhido em 1 mL de H20 e é digerido durante 1 h a 37 °C com RQ1 DNAse (Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wisconsin 53711 EUA) a fim de eliminar qualquer vestígio de ADN e, em seguida, os ARNs totais são desproteinizados por tratamento com fenol e com clorofórmio, antes de os precipitar na presença de acetato de sódio, como acima descrito.

Os ARNs totais são depois recolhidos em 500 pL de H20, e são quantificados por ensaio espectrofotométrico a 260 nm. A sua qualidade é analisada por electroforese em gel de agarose na presença de formaldeído.

Para o efeito, os ARNs mensageiros poli A+ (ARNm) são depois purificados a partir de 500 pg de ARNs totais utilizando o sistema de purificação Oligotex-dT (Qiagen INC., 9600 De Soto Avenue, Chatsworth, Califórnia, 91311 EUA) e, em seguida, a quantidade de ARNs mensageiros é avaliada utilizando o kit de ADN Dipstick (InVitrogen BC, De Schelp 12, 9351 NV Leek, Países Baixos) . 2. Construção e selecção do banco de ADNc A síntese de ADN complementar (ADNc), requerida para a construção dos bancos, é efectuada de acordo com as recomendações fornecidas no kit "Riboclone cDNA synthesis system M-MLV (H-)" (Promega, EUA), à excepção da etapa de ligação do adaptador EcoRI. Isto torna possível clonar estes ADNc 20 directamente no sítio SrfI único do vector pPCR-Script Amp SK( + ) (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, Califórnia 92037, EUA). A eficiência desta reacção de síntese de ADNc é monitorizada pela adição de alfa-(32P)-dCTP durante a síntese das duas cadeias de ADN.

Após migração no gel de agarose alcalino (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, EUA, 1989), o comprimento dos ADNc neosintetizados é estimado como variando entre 0,2 a mais de 4,3 Kb. As quantificações, utilizando o kit de ADN Dipstick (InVitrogen, Países Baixos), revelam que aproximadamente 100 ng de ADNc são sintetizados a partir de 1 yg de ARNm.

Os ADNc ligados ao vector pPCR-Script Amp SK(+) (Stratagene, EUA) foram utilizados para transformar a estirpe de Escherichia coli (E. coli) XL2-Blue MRF' (Stratagene, EUA). As bactérias que contêm vectores recombinantes são seleccionadas em placas de meio LB (Luria-Bertani) contendo 100 yg.mL"1 de ampicilina, e na presença de IPTG e de X-Gal (Sambrook et al., 1989) . Os plasmídeos deste banco de ADNc são, em seguida, extraídos de uma cultura de um dia para o outro, correspondentes a uma mistura de transformantes, na presença de 25 mL de meio LB contendo 100 yg.mL-1 de ampicilina, e utilizando o "QiaFilter Plasmid MidiKit" (Qiagen INC., EUA). 3. Isolamento do ADNc codificando a endo-p-mananase do café

Este banco de ADNc de grãos em germinação foi testado por PCR utilizando oligonucleotídeos sintéticos deduzidos a partir 21 do resultado da sequenciação N-terminal e interna da mananase purificada. São utilizados os oligonucleotideos sintéticos degenerados MAN 202, possuindo a sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N°: 6, e MAN 203, possuindo a sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N°: 7. O oligonucleotideo sintético MAN 202 corresponde aos aminoácidos 9 a 14 (GTEFVM) da sequência N-terminal (SEQ ID N°: 3) da mananase purificada. O oligonucleotideo sintético MAN 203 corresponde à sequência complementar codificando os aminoácidos WAFSDG localizados na posição 2 a 7 do peptideo interno da mananase purificada, correspondente à sequência SEQ ID N°: 4. A reacção de PCR é efectuada na presença de 10 ng de plasmideo do banco de ADNc, num volume final de 50 yL contendo KC1 a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM, pH 8,8, MgCl2 a 1,5 mM, 0,1 mg.mL’1 de gelatina, 0,2 mM de cada dNTP, 0,25 μΜ de cada oligonucleotideo (MAN 202 e 203) e 3 unidades de Taq ADN polimerase (Stratagene, EUA). É utilizada a máquina de PCR Robocycler 96 (Stratagene, EUA) equipada com uma tampa de aquecimento e as reacções são incubadas durante 35 ciclos (94 °C - 1 min, 45 °C - 1 min 30 s, 72 °C - 2 min) seguidas de uma extensão final a 72 °C durante 7 min. No final desta reacção, é obtido um produto de PCR único de aproximadamente 170 pb de comprimento, o qual foi directamente ligado ao vector pGEMT-easy, de acordo com as recomendações do fornecedor (Promega, EUA) . A ligação é utilizada em seguida para transformar a estirpe de E. coli XL2-Blue MRF' (Stratagene, EUA). As bactérias que contêm vectores recombinantes são seleccionadas em placas de meio LB contendo 100 yg.mL-1 de ampicilina, e na presença de IPTG e de X-Gal (Sambrook et al., 1989). 22

No final da transformação, foi isolado um clone que contém o fragmento de 170 pb de ADNc clonado no sitio SfrI do vector pPCR-Script Amp SK(+) (Stratagene, EUA). Este produto de PCR foi em seguida sequenciado de acordo com o protocolo "T7 sequencing kit" (Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra), na presença de alfa- (35S) -dATP. A análise da sua sequência mostra que está localizado entre os nucleotideos 206 e 375 da sequência SEQ ID N°: 1 e é flanqueado, nas suas extremidades 5' e 3', pelas sequências correspondentes aos oligonucleotideos MAN 202 e 203. A partir desta análise, deduz-se que este produto de PCR corresponde a um fragmento do ADNc codificando efectivamente a endo-p-mananase do café que foi purificada e sequenciada como acima definido. Regista-se igualmente que este ADNc é diferente daquele que foi clonado no laboratório (documento EP N° 98203742.6), o que sugere a existência de uma família multigénica codificando a endo-p-mananase do café. A fim de isolar o ADNc de comprimento completo da endo-β-mananase do café, são efectuadas uma série de reacções de PCR, utilizando, desta vez, oligonucleotideos sintéticos que são específicos e deduzidos a partir da sequência do produto de PCR de 170 pb anteriormente clonado. Para tal, são utilizados os oligonucleotideos MAN 214, possuindo a sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N°: 8, e MAN 215, possuindo a sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N°: 9. Os oligonucleotideos sintéticos MAN 214 e 215 correspondem, respectivamente, aos nucleotideos 307 a 325 e 307 a 290 da sequência SEQ ID N°: 1 e estão posicionados cabeça-com-cauda nesta mesma sequência.

Estas reacções de PCR utilizam 10 ng do banco de ADNc anteriormente pesquisado, os oligonucleotideos MAN 214 e 215, e 23 os oligonucleotídeos universais T3 e T7 específicos do vector de clonagem pPCR-Script Amp SK(+) (Stratagene, EUA), que correspondem às sequências SEQ ID N°: 10 e 11, respectivamente. Estes iniciadores localizam-se, cada um deles, a aproximadamente 100 pb, em ambos os lados, do sítio de clonagem SfrI do vector pPCR-Script Amp SK(+). As reacções de PCR são incubadas de acordo com as condições acima descritas e com os seguintes parâmetros: 40 ciclos de amplificação (94 °C - 1 min, 50 °C -1 min 30 s, 72 °C - 3 min) seguidos de uma extensão final a 72 °C durante 7 min.

Após migração dos produtos de PCR no gel de agarose, observa-se a presença de um fragmento de ADN de, aproximadamente, 400 pb amplificado durante a reacção MAN 215-T3 e de um fragmento de ADN de, aproximadamente, 1,2 Kb amplificado durante a reacção MAN 214-T7. Estes fragmentos foram clonados independentemente no vector pGEMT-easy (Promega, EUA) e, em seguida, sequenciados em ambas as cadeias (Eurogentec Bei s. a. - Pare Scientifique du Sart Tilman [Sart Tilman Scientific Park] - 4102 Seraing - Bélgica). A análise das sequências de ácidos nucleicos mostra que o produto de PCR amplificado pelos oligonucleotídeos MAN 215-T3 compreende os primeiros 307 nucleotídeos da sequência SEQ ID N°: 1, enquanto o produto de PCR amplificado pelos oligonucleotídeos MAN 214-T7 compreende as últimas 1180 bases da sequência SEQ ID N°: 1 e também uma cauda poli A+ de 26 resíduos que não é mostrado na sequência SEQ ID N°: 1. A fim de isolar o ADNc de comprimento completo da mananase do café correspondente à sequência SEQ ID N°: 1, foi efectuada uma última reacção de PCR utilizando 20 ng do banco de ADN plasmídico e os oligonucleotídeos sintéticos MAN 300 e 301. 24

Estes iniciadores correspondem, respectivamente, às sequências SEQ ID N°: 12 e 13 e estão localizados nas extremidades 5' e 3', respectivamente, da sequência SEQ ID N°: 1. 0 iniciador MAN 301 foi escolhido de forma a ficar localizado imediatamente a montante da cauda poliA+ presente no fragmento de PCR amplificado com os oligonucleotideos MAN 214-T7. Esta reacção de PCR foi efectuada num volume final de 50 pL contendo 10 ng de plasmideo do banco de ADNc (DAS = 22), KC1 a 10 mM, (NH4)2S04 a 6 mM, Tris-HCl a 20 mM, pH 8, 0,1% de Triton X-100, MgCl2 a 2 mM, 0,2 mM de cada dNTP, BSA a 10 pg/mL, 0,25 pM de cada oligonucleotideo e 3 unidades de Pfu ADN polimerase (Stratagene, EUA) . A reacção é incubada durante 45 ciclos (94 °C - 1 min, 45 °C - 1 min 30 s, 72 °C - 3 min) e seguida de uma extensão final a 72 °C durante 7 min.

No final desta reacção, é amplificado um único fragmento de aproximadamente 1500 pb, o qual foi clonado no vector pPCR Script Amp SK(+) e, em seguida, sequenciado em ambas as cadeias. A sua sequência corresponde à sequência SEQ ID N°: 1. Por comparação nos bancos de dados, deduz-se que este ADNc é de comprimento completo e codifica efectivamente uma endo-p-mananase que compreende as sequências proteicas SEQ ID N°: 3 a 5 obtidas anteriormente a partir da purificação da endo-p-mananase. Regista-se igualmente que este ADNc é diferente do ADNc clonado anteriormente no laboratório (documento EP N° 98203742.6). Constitui, por conseguinte, um novo ADNc codificando a endo-p-mananase do café que foi purificada como acima descrito. Regista-se igualmente que esta sequência SEQ ID N°: 1 contém, sem qualquer diferença nucleotidica, todas as sequências dos intermediários de clonagem anteriormente isolados durante as amplificações de PCR do banco de ADNc em germinação. 25 4. Análise do ADNc de comprimento completo codificando a endo-p-mananase do café A análise da sequência de ácidos nucleicos mostra que este ADNc de comprimento completo contém uma sequência transcrita não traduzida de 61 pb na sua extremidade 5' e uma sequência em 3' transcrita não traduzida de 174 pb. Não possui nenhuma cauda poli A+ na sua extremidade 3' visto que o oligonucleotideo sintético MAN 301 acima utilizado foi precisamente escolhido a montante desta sequência. No interior desta sequência em 3' transcrita não traduzida, observa-se a presença de motivos ricos em AT que se presume estarem envolvidos em mecanismos de poliadenilação. Regista-se igualmente a presença de diversas sequências repetidas invertidas e directas que poderão estar envolvidas em mecanismos de estabilidade de ARN mensageiro ou de eficiência de tradução, por exemplo (Gallie, Plant Mol Biol, 32, 145-158,1996). A sequência SEQ ID N°: 1 contém uma fase de leitura aberta de 417 codões (1251 bases), que começa com o codão ATG na posição 62 e termina com um codão TAA (A na posição 1312) . Regista-se igualmente a presença de um segundo codão de tradução-iniciação na posição 65 da sequência SEQ ID N°: 1. A proteina deduzida a partir deste ADN complementar possui um peso molecular teórico de 46794 Da e um pi teórico de 7,8. Possui, igualmente, um segmento proteico muito hidrofóbico que corresponde aproximadamente aos primeiros 30 aminoácidos da sequência SEQ ID N°: 2. Esta sequência proteica poderá corresponder a um peptideo sinal contendo os 40 aminoácidos da sequência SEQ ID N°: la montante da sequência SEQ ID N°: 3 que 26 corresponde à sequenciação N-terminal da enzima purificada. Neste caso, espera-se que o peso molecular da proteína seja de 42616 Da na sua forma madura, i. e., correspondendo aos últimos 376 aminoácidos da sequência SEQ ID N°: 2. Neste caso, calcula-se que o seu pi esteja próximo de 5,8. Estes dados em concordância com aqueles observados durante a purificação da proteína (ver Exemplo: 2, * 5).

Regista-se igualmente a existência de diversos sítios potenciais de glicosilação (Asn / X / Ser ou Thr) . 0 primeiro, localiza-se no peptídeo sinal potencial, na posição 35 a 37 da sequência SEQ ID N°: 2 e, por conseguinte, presume-se que esteja ausente na forma madura da mananase. 0 segundo localiza-se na posição C-terminal, na posição 398 e 400 da sequência SEQ ID N°: 2.

Regista-se que as sequências SEQ ID N°: 3 a 5, que correspondem à sequenciação proteica efectuada utilizando a proteína purificada, se verificam, sem qualquer ambiguidade, no interior da proteína (SEQ ID N°: 2) deduzida a partir da sequência SEQ ID N°: 1. Por exemplo, a sequência SEQ ID N°: 3 corresponde aos aminoácidos 41 a 62 da SEQ ID N°: 2. Analogamente, verificam-se as sequências SEQ ID N°: 4 e 5 que correspondem, respectivamente, aos aminoácidos 99 a 108 e 265 a 281 da SEQ ID N°: 2. As sequências SEQ ID N°: 4 e 5 são, além disso, precedidas, respectivamente, pelos aminoácidos R (posição 98 da SEQ ID N° : 2) e K (posição 264 da SEQ ID N° : 2) reconhecidos pela tripsina que foi utilizada para efectuar a proteólise de mananase purificada e em seguida a sequenciação de determinados peptídeos internos (ver Exemplo: 2, * 5). 27 5. Comparação das sequências proteicas das mananases do cafeeiro. 0 alinhamento (Feng e Doolittle, J. Mol. Evol. 2_5, 351-360, 1987) da sequência proteica SEQ ID N°: 2, designada mananase B, com a sequência proteica da endo-p-mananase designada mananase A, cujo ADN complementar foi previamente clonado no laboratório (Marraccini e Rogers, documento EP N° 98203742.6), demonstra que existe menos de 56% de identidade entre estas duas proteínas do cafeeiro (Figura 1). Por outro lado, existem diversos segmentos proteicos extremamente conservados entre estas duas proteínas e aquela do tomate (Bewley et al., Planta 203, 454-459,1997) ou de outras mananases eucarióticas, tais como aquelas do Aspergillus aculeatus (Numero de registo da base de dados: L35487) e Trichoderma reesei (L25310). Além disso, algumas destas conservações referem-se a aminoácidos que se presume serem essenciais na actividade da proteína, em particular os resíduos de glutamato (E) na posição 212, 216, 253 e 333 da sequência SEQ ID N°: 2, os quais podem ser resíduos catalíticos (Bewley et al., 1997). Outros resíduos de aminoácidos, tais como a histidina (H) 291, a asparagina (N) 215, a tirosina (Y) 293 e o triptofano (W) 377, da sequência SEQ ID N°: 2 são igualmente conservados e podem ser essenciais para a ligação e a degradação do substrato. 28

Exemplo 4

Expressão da mananase do café ManB em E. coli 1. Construção de plasmídeos de expressão A sequência de ADNc de manB correspondente à sequência SEQ ID N° : 1 foi utilizada como molde para a amplificação da sequência da proteina madura (sem sequência sinal) e sem o codão de terminação da tradução. 0 iniciador de PCR B262, correspondente à sequência SEQ ID N°: 14, inicia na extremidade 5' do ADNc de manB madura e introduz um sitio de restrição único Nco I abrangendo um novo codão de iniciação ATG directamente antes da proteina madura ManB, e iniciador B260, correspondente à sequência SEQ ID N°: 15, inicia na extremidade 3', introduzindo um sitio de restrição Sall eliminando simultaneamente o codão de terminação e produzindo uma fusão em fase em relação às sequências da cauda HIS proporcionadas no plasmideo pET24-d (Novagen Inc., 601 Science Drive, Madison WI, EUA) (Figura 2) . A amplificação foi com a polimerase de alta-fidelidade termoestável Pwo (Roche Diagnostics GmbH, GE) . Um pL de ADN molde foi misturado com três pL de cada oligonucleotideo a 100 pmol.pL-1 de tampão de PCR de Pwo 10X, 6 pL de 2 mM de dNTP e 0,5 pL de Pwo polimerase. A amplificação foi realizada numa máquina de PCR Perkin-Elmer 9700 (Applied Biosystem Division, EUA) em tubos de 0,2 mL com uma espera de 5 min a 95 °C, seguida de 30 ciclos de 95 °C durante 30 sec, 50 °C durante 30 sec e 68 °C durante 2 min e, finalmente, mantido a 4 °C.

Após o PCR, uma amostra foi visualizada num gel de agarose a 1% para confirmar a amplificação. O fragmento de PCR foi purificado utilizando o kit de limpeza de PCR da Qiagen (Cat. N° 29 28104, Qiagen INC., EUA) e eluido num volume de 50 yL. Um volume de 25 yL do fragmento de PCR purificado foi digerido com as enzimas de restrição Ncol e Sall a 37 °C, o produto foi resolvido num gel de agarose a 1% e os fragmentos de ADN apropriados foram cortados e eluidos utilizando o kit de extracção de gel da Qiagen (Cat. N° 28704) . Este fragmento de ADN foi ligado ao vector pET24-d previamente preparado digerido com Sall mais Ncol (desfosforiladas) e transformado em células XLl-blue (Stratagene, EUA). Os transformantes foram seleccionados em placas de LB suplementadas com 50 yL.mL-1 de canamicina, analisados por mini preparações plasmidicas mais digestões de enzimas de restrição e, finalmente, por análise de sequência de ADN utilizando os iniciadores 'pET-For', correspondente à sequência SEQ ID N°: 16 e 'pET-Rev', correspondente à sequência SEQ ID N°: 17. O plasmideo resultante foi denominado pDP580, cujo mapa é apresentado na Figura 3. O plasmideo pDP580 foi transformado no hospedeiro de expressão T7 BL21 (DE3) CodonPlus™ RIL (Stratagene, EUA) para análise de expressão. 2. Indução de expressão proteica A estirpe transportando o plasmideo de expressão foi crescida em meio LB suplementado com os antibióticos apropriados a 37 °C com agitação durante 16 h, para proporcionar uma inicial fresca. Um mL da cultura inicial foi inoculado em 60 mL de meio LB suplementado com os antibióticos apropriados e incubado a 37 °C com agitação até que a cultura atingiu uma densidade óptica (O.D.60o) de aproximadamente 0,6. Foi adicionado IPTG até uma concentração final de 1 mM e a incubação continuou durante 30 mais 4 h a 37 °C com agitação. Foi removida uma amostra de 40 mL e foi centrifugada a 10000 rpm e foi recolhido o sedimento celular (sedimento A) . O sedimento bacteriano foi suspendido em um mL de KPO4 a 50 mM pH 7,0, tampão imidazole a 10 mM, arrefecido sobre gelo e sonicado durante 30 s seguido de 20 s a 0 °C. Os resíduos celulares foram sedimentados por centrifugação a 12000 rpm durante 30 min (sedimento B), o sobrenadante removido (sobrenadante B) e, tanto o sedimento como o sobrenadante, foram armazenados a -20 °C. A fim de analisar as proteínas por SDS-PAGE, o sedimento B foi solubilizado em KPO4 a 50 mM pH 7,0, imidazole a 10 mM e ureia a 8 M. As amostras foram então resolvidas em Ready Gels (Bio-Rad Lab., 200 Alfred Nobel Drive, 94547 Hercules CA. EUA, Cat. N° 161-1101) com 10% de Tris-HCl utilizando as condições recomendadas. 3. Superexpressão do operão groESL de E. coli

Publicações recentes demonstraram que algumas proteínas superexpressas que são precipitadas como corpos de inclusão podem ser recuperadas na fracção proteica solúvel pela co-expressão do operão groESL do hospedeiro ou factor desencadeador (Vonrhein et al., FEBS Letters 443, 167-169, 1999; Nishihara et al., Appl. Environ Microbiol _33, 884-889, 2000). Para testar se a superexpressão simultânea do operão groESL de E. coli poderia auxiliar a solubilização da enzima endo-p-mananase do café superexpressa, o operão groESL foi clonado e expresso no plasmídeo de expressão pKK223-3 (Brosius e Holy, Proc Natl Acad Sei ^1, 6929-6933, 1984) . O plasmídeo pKK223-3 (Amersham

Pharmacia Biotech, Inglaterra, Cat. N° 27-4935-01) foi escolhido porque utiliza o gene de resistência à ampicilina para selecção (nenhum conflito com os outros plasmídeos) e porque a expressão 31 dos genes inseridos é igualmente induzida por IPTG, como para pET24-d (Novagen Inc., EUA). 0 ADN cromossómico total de E. coli foi amplificado por PCR utilizando a Pwo polimerase e os iniciadores B452, correspondente à sequência SEQ ID N°: 18, e B543, correspondente à sequência SEQ ID N°: 19, como acima descrito.

Após o PCR, uma amostra foi visualizada num gel de agarose a 1% para confirmar a amplificação. 0 fragmento de PCR foi purificado utilizando o kit de limpeza de PCR da Qiagen e eluido num volume de 50 yL. Um volume de 25 pL do fragmento de PCR purificado foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e Sall a 37 °C, o produto foi resolvido num gel de agarose a 1% e o fragmento de ADN apropriado foi cortado e eluido utilizando o kit de extracção de gel da Qiagen. O fragmento de ADN foi ligado ao vector pKK223-3 previamente preparado (Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra), digerido com Sall mais EcoRl (desfosforiladas) e transformado em células XLl-blue. As construções foram seleccionadas em placas de LB suplementadas com 100 pg.mL’1 de ampicilina, analisadas por minipreparações plasmidicas, mais digestões de enzimas de restrição e um clone positivo foi denominado pDP588 (Figura 4) . O plasmideo pDP588 foi transformado no hospedeiro de expressão de E. coli BL21 (DE3) CodonPlus™ RIL (Stratagene, EUA) contendo o plasmideo de expressão de endo-p-mananase do café pDP580 e seleccionado em placas de LB suplementadas com ampicilina, cloranfenicol e canamicina. A expressão proteica foi como acima descrito, com a excepção de que a cultura foi crescida em meio LB suplementado com ampicilina, cloranfenicol e canamicina a 37 °C. 32 4. Ensaio de endo-p-mananase A actividade de endo-p-mananase foi ensaiada em culturas de E. coli preparadas e submetidas a expressão induzida por IPTG, exactamente como acima descrito. As culturas (100 mL) foram divididas em duas quando a densidade óptica (O.D. 600 ) tinha atingido 0,6. A expressão proteica recombinante foi induzida com IPTG numa cultura (dando actividade induzida por IPTG), ao passo que a outra cultura foi mantida em paralelo sem indução (controlo) . Estas culturas de 50 mL foram, em seguida, conduzidas até aos estádios sedimento B e sobrenadante B, como acima descrito. A actividade foi ensaiada em amostras dos estádios sobrenadante B e sedimento B. A amostra a ensaiar (200 pL de sobrenadante ou sedimento B suspendido em 200 pL de tampão de reacção de ensaio) foi adicionada no tempo zero a 800 pL de tampão de reacção (acetato de sódio/ácido acético a 200 mM, NaCl a 100 mM, pH 5,0) contendo uma suspensão de 1% (p/v) de substrato insolúvel AZCL-galactomanana (Megazyme, Irlanda). As reacções foram agitadas continuamente a 37 °C. Foram retiradas aliquotas (200 pL) ao longo do tempo, aquecidas a 100 °C durante 5 min e centrifugadas a 12000 g durante 5 min, e o sobrenadante dividido em aliquota para uma microplaca de 96 poços. A seguir ao aquecimento a cor era estável. A absorção do sobrenadante foi lida a 595 nm e a actividade é expressa como Δ595 nm.min_1.pL de amostra"1. Visto que as comparações são feitas entre sobrenadantes ou entre material sedimentado, não foi feita nenhuma tentativa para expressar a actividade especifica. 33

5. Expressão do gene da endo-p-mananase do café de ManB

Culturas do hospedeiro de expressão de E. coli BL21 (DE3) contendo os plasmídeos CodonPlus RIL (Stratagene, EUA) e pDP580, com e sem plasmídeo pDP588, foram introduzidas com IPTG durante 4 h, as células rebentadas por sonicação e as proteínas solúveis (sobrenadante B) e proteínas no sedimento celular (sedimento B) resolvidas por SDS-PAGE. 0 SDS-PAGE das proteínas solúveis (sobrenadante B) (Figura 5) revelou que não estavam presentes fortes bandas proteicas correspondentes ao tamanho previsto da construção da endo-p-mananase do café. Por outro lado, o SDS-PAGE do sedimento celular dissolvido (sedimento B), revelou a presença de uma nova forte banda proteica para a expressão a partir do plasmídeo pDP580. Estes resultados permaneceram inalterados quando foi incluído o plasmídeo de expressão groESL. Registou-se igualmente que uma construção expressando o gene de comprimento completo da endo-p-mananase não produziu quaisquer novas bandas proteicas, possivelmente devido à sequência sinal de secreção associada. 6. Análise de actividade de endo-p-mananases de ManB expressas em E. coli

Foi analisada a actividade do produto recombinante do gene de manB (endo-p-mananases de ManB) (Tabela 1). Pode constatar-se que a expressão de endo-p-mananase a partir de pDP580 é detectável apenas após a indução por IPTG e apenas a um nível baixo. Este resultado confirma que a designação do gene corresponde à actividade enzimática. Quando é incluído o plasmídeo de expressão groESL de E. coli pDP588, a expressão de endo-p-mananase aumenta mais de 50 vezes, confirmando que a co- 34 expressão deste chaperone melhorou a eficiência do enrolamento da proteína endo-p-mananase. Contudo, apenas quantidades muito pequenas da proteína permanecem na forma solúvel para conferir actividade enzimática detectável, permanecendo simultaneamente indetectável acima do conteúdo proteico de fundo por SDS-PAGE.

Estirpe de E. coli pDP580 pDP580 + pDP588 Sedimento B controlo 1,6 6,6 + IPTG 2,6 142 Sobrenadante B controlo 1,0 2,8 + IPTG 1,0 74

Tabela 1. Actividade de endo-p-mananase induzida por IPTG detectada em todas as E. coli expressando o plasmídeo de expressão de ManB pDP580, mais o plasmídeo de expressão groESL de E. coli pDP588. ND = não detectado A actividade é expressa como A595nm.min-1.yL de amostra-1 x 10"5

Os resultados representam a média de, pelo menos, 3 experiências. 35 EXEMPLO 5

Expressão da mananase do café ManB em Yarrowia lipolytica 1. Construção do plasmideo de expressão/secreção A sequência de ADNc de manB correspondente à sequência SEQ ID N° : 1 foi utilizada como molde para a amplificação da sequência codificando a proteína madura (sem sequência sinal) e sem o codão de terminação da tradução. 0 iniciador de PCR B281, correspondente à sequência SEQ ID N°: 20, inicia na extremidade 5' do ADNc de manB madura e introduz um sítio Sfil permitindo a clonagem direccional em fase relativamente a uma sequência sinal híbrida de lipase XPR2 presente no plasmideo de

expressão/secreção de Yarrowia lipolytica pNFF296 (Figura 6) . O iniciador de PCR B282, correspondente à sequência SEQ ID N°: 21, inicia na extremidade 3' do ADNc de manB madura e introduz em fase uma sequência 3xHIS imediatamente antes do codão de terminação e do sítio de clonagem Sfil em frente do terminador de lipase de pNFF296. A expressão do gene inserido está sob o controlo de um promotor sintético derivado de XPR2 (Mazdak et al., J Mol Microbiol Biotechnol 2, 207-216, 2000). A amplificação foi com a Pfu polimerase nativa de alta-fidelidade termoestável (Stratagene, EUA). Um microlitro de ADN molde foi incubado com KC1 a 10 mM, (NH4)2S04 a 6 mM, Tris-HCl a 20 mM, pH 8,0, 0,1% de Triton X-100, MgCl2 a 2 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 10 yg.mlf1 de BSA, 0,25 μΜ de cada iniciador e 3 unidades de Pfu ADN polimerase (Stratagene, EUA) num RoboCycler da Stratagene (Stratagene, EUA) . O PCR foi realizado como se segue: 1 ciclo (95 °C - 1 min, 50 °C - 1 min, 72 °C - 3 min) , 30 ciclos (95 °C - 1 min, 50 °C - 1 min, 72 °C - 3 min) e um ciclo final (95 °C -1 min, 50 °C - 1 min, 72 °C - 10 min) . O produto de PCR foi 36 visualizado num gel de agarose a 1% para confirmar a amplificação, purificado utilizando o kit de purificação de PCR Qiaquick (Cat. N° 28704, Qiagen INC., EUA), digerido com Sfil e subsequentemente ligado ao vector pNFF296 (Figura 6) previamente digerido com Sfil. Esta ligação foi utilizada para transformar BZ234 de E. coli (Biozentrum, University of Basel, Klingelbergstr. 50-70CH, 4056 Basel, Suiça). As construções foram seleccionadas em placas de LB suplementadas com 50 yg.mL"1 de canamicina, analisadas por mini preparações plasmidicas mais digestão de enzima de restrição e, finalmente, por análise de sequência de ADN com os iniciadores internos de manB B360 e B361 correspondentes, respectivamente, às sequências SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 23, e também com os iniciadores externos B358 e B359 correspondentes, respectivamente, a SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 25. O plasmídeo resultante foi denominado pCY316 (Figura 7). 2. Transformação de YLP3 de Yarrowia lipolytica A estirpe hospedeira YLP3 de Yarrowia lipolytica foi derivada da estirpe polf (MatA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp-2 SUC2) (Mazdak et ai., 2000) pela transformação da referida estirpe em prototrofia de Leucina com um fragmento de 5,1 Kb de Sal I transportando o gene LEU2 de tipo selvagem de Yarrowia lipolytica e seleccionando para convertidos de LEU2. A estirpe hospedeira Yarrowia lipolytica foi riscada sobre uma placa de agar YPD (1% de Bacto Extracto de Levedura da Difco, 2% de Bacto Peptona da Difco, 2% de Glucose, 2% de Bacto Agar da Difco; Difco-Lee lab., 1475 Athens Hwy, Grayson 30017, GA, EUA) e crescida de um dia para o outro a 28 °C. 4 mL de YPD liquido, pH 4,0 (1% de Bacto Extracto de Levedura da Difco, 1% de Bacto 37

Peptona da Difco, 1% de Glucose, tampão de Citrato a 50 mM a pH 4,0) foram inoculados com células crescidas de fresco da placa de YPD e foram crescidos num tubo num agitador rotativo (200 rpm, 28 °C, 8-9 h) . Uma quantidade adequada desta pré-cultura foi utilizada para inocular 20 mL de YPD, pH 4,0, num frasco Erlenmeyer de 250 mL sem quebra-ondas. Esta cultura foi agitada num agitador rotativo a 200 rpm a 28 °C (de um dia para o outro) até ter sido atingido um titulo celular de 108.mL_1. As células foram centrifugadas durante 5 min a 3000 g, lavadas com 10 mL de água estéril e re-centrifugadas. O sedimento celular foi suspendido em 40 mL de acetato de litio a 0,1 M pH 6,0 (ajustado com 10% de ácido acético) e agitado num Erlenmeyer de 250 mL Erlenmeyer a 140 rpm a 28 °C durante 60 minutos. As células foram novamente centrifugadas durante 5 min a 3000 g. O sedimento celular foi suspendido em 2 mL de acetato de litio, pH 6,0 e as células competentes foram mantidas em gelo até à transformação.

Cem microlitros de células competentes foram misturados com 5-20 pL de plasmideo linearizado com Notl e 50 pg de ADN transportador (ADN de esperma de arenque sonicado até 100-600 pb, Promega, EUA) num tubo de 2 mL e incubados durante 15 minutos a 28 °C. Foram adicionados 700 pL de 40% de PEG 4000, acetato de litio a 0,1 M, pH 6,0 e os tubos foram vigorosamente agitados a 240 rpm num agitador rotativo a 28 °C durante 60 minutos. Foi adicionado e misturado um volume de 1,2 mL de acetato de litio a 0,1 M, pH 6,0, e até 250 pL foram plaqueados em placas de agar selectivas (0,17% de Bacto Base Azotada de Levedura da Difco sem aminoácidos e sulfato de amónio, 1% de glucose, 0,006% de L-leucina, 0,1% de glutamato de sódio, 0,1% de Bacto Casaminoácidos da Difco, 2% de agar). O plasmideo de expressão pNFF296 transporta um alelo defeituoso URA3 que 38 permite a selecção de integração múltipla da cassete de expressão de secreção na estirpe hospedeira YLP3 (Le Dali et al., Current Genetics, 26, 38-44, 1994). 3. Cultura em frasco agitado de transformantes de Yarrowia lipolytica

Os transformantes (Ura+) foram re-isolados em meio selectivo (0,17% de Bacto Base Azotada de Levedura da Difco sem aminoácidos e sulfato de amónio, 1% de glucose, 0,006% de L-leucina, 0,1% de glutamato de sódio, 0,1% de Bacto Casaminoácidos da Difco, 2% de agar). Uma série de clones foi crescida em frascos de agitação para verificação de expressão e secreção de mananase de café ManB no interior do meio de cultura:

Pequenos excertos de células foram riscados em placas de agar YPD e crescidos de um dia para o outro a 28 °C. As finas camadas de células que cresceram foram utilizadas para inocular 50 mL de meio DMI em Erlenmeyers de 500 mL com quatro quebra-ondas laterais. O meio DMI contém, por litro: 10 g de KH2PO4; 2.5 g de MgS04.7H20; 20 g de glucose; 5,1 mL de solução de oligoelementos; 17 mL de solução de vitaminas; 3 g de ureia. A ureia foi dissolvida em 15 mL de água e esterilizada por filtração. A solução de oligoelementos continha, por litro; 12.5 g de EDTA; 4 g de ZnS04.7H20; 6,5 g de MnS04.H20; 5 g de

CaCl2.2H20; 30 g de NaH2P04 .H20; 2,5 g de FeS04.7H20; 0,008 g de H3BO3; 0, 0009 g de Kl; 0,1 g de CuS04.5H20; 0,004 g de

Na2MoC>4.2H20; 0, 007 g de CoCl2.6H20; 0,0008 g de NiS04.7H20; 0,04 g de EDTA, e foi esterilizada em autoclave durante 20 min a 121 °C. A solução vitamínica foi preparada como anteriormente 39 descrito (Verduyn et al., Yeast, 8_, 501, 1992). O pH inicial do meio foi ajustado para 5,0. As culturas foram agitadas a 140 rpm num agitador rotativo a 28 °C durante três dias. As aliquotas das culturas foram centrifugadas à velocidade máxima (3000 g) durante 15 min e o sobrenadante foi utilizado para a determinação da actividade de endo-p-mananase. 4. Ensaio de endo-p-mananase O sobrenadante da cultura (250 pL) foi adicionado a 750 pL de tampão de reacção (acetato de sódio/ácido acético a 200 mM, pH 5,0) contendo AZCL-galactomanana (Megazyme, Irlanda) para produzir uma concentração final de 0,5% p/v. As amostras foram incubadas a 40 °C com agitação ocasional, durante 60 minutos. As reacções foram paradas por precipitação com 2,5 mL de etanol a 95%.

Após centrifugação à velocidade máxima (3000 g), a adsorção do sobrenadante foi lida a 590 nm. A actividade de endo-β-mananase é expressa como A595nm.h“1.mL de sobrenadante’1. Foram incluidos em paralelo, como controlos, um branco (250 pL de tampão de reacção) e um sobrenadante de cultura de um transformante YLP3 transportando um plasmideo vazio (pNFF296) . Foi pesquisado um total de 21 transformantes para actividade de endo-p-mananase. Todos os transformantes transformados com o plasmideo pCY316 revelaram diversos níveis de actividade enzimática, ao passo que não pôde ser detectada nenhuma actividade no transformante de controlo transportando o plasmideo vazio pNFF296. A experiência foi repetida duas vezes para seis transformantes pCY316 independentes e os resultados dos ensaios de actividade são apresentados na Tabela 2. 40

Transformantes Actividade(*’ YLP3 (pCY316) # 1 0,268 YLP3 (pCY316) # 4 0,328 YLP3 (pCY316) #11 0,246 YLP3 (pCY316) # 13 0,288 (pCY316) # 16 0,320 YLP3 (pCY316) #21 0,271 YLP3 (pNFF296) # 1 0 (plasmídeo vazio)

Tabela 2: Actividade de endo-p-mananase detectada em sobrenadantes de cultura de diferentes clones independentes de Yarrowia lipolytica transformados com o vector pCY316. (*) A actividade é expressa como A590nm.h"1.250 pL de sobrenadante-1. Os valores de fundo do branco [tampão] foram já subtraídos dos valores finais dados acima. (#): indica a numeração dos clones transformados.

Os resultados representam a média de 3 experiências.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110? SOCIETE DES PRODUITS NESTLE S.A. <120> MANANASE DE CAFÉ <130> mananase II <140> <141 > <160> 25 <170> Patent In Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1486 41

<212> ADN <213> Coffea arabica <400> 1 gtgaccagac tctagttcga aatgatgtcc agagaaaaga cattcttctc ggtgttggag cagcttcagc tttgtcaaaa cctcaacggc ttcaatgcat gaaggtatca accaccttcc ggctttcagc gacggtggct catgttcaaa ggtttggatt actcactttg gtcaacaact gagagatcaa ggacactact aggctacttc aaaaaccaca tgcatacaaa gacgatccga aagtgaccta tctggaaaag gtccatcgat agcgatcacc gccccaaaag aaggaatata tcgcatagta caagtggatt ttcgaatgat gagactcaag ttccaaatat ttgctcgaga acctgggtac caagtcgcca cgcttgtgca gcaactcgtg ggctccaggg atggaaagtt cactgtagga gtaattgctc ggcaccaaat ctcaatgatg taaaacagtt tttctaggtc agcaacaaat taatagctat gtctcttgtt aaggtgctgt agggacatgg tgaaattgcg ctaggggaac tgagtttgtg attggttaat gtacatggca aacaagcttc caagtatgga atagggcttt gcaacaatct tcgtagtttc agaagcaaag gggaaggtta cgggggaaag tgaacaatga tgatgacttt tcaagactgt tctcacaaga ccatatttgc atgggagcta ctattcagga ttggatctca tcctagacat tggtcttgaa atcctggtta ccaagttggg ttgccaccat tcatttgtat cacaatttgt ggatagatgg agccacttct gttgaccgaa aaagggatgc gtatttatca gcggcggcgt atgtggtggt ggggcgatgg atatgagatt aacaatccaa caggctatca ttaagagcct actaagaatt ttatgtgaca ttattgtatc atcaatcact caatataatc 60 tctctttcct tggctctttt 120 agtaatagta ccagcagcag 180 atgaatggga ggccattata 240 tctgatccat ctacgaggac 300 atgaatgcag ccagaacttg 360 cctggttcct acaacgagga 420 aagtacggga tccatctcat 480 aaacaatatg tccagtgggc 540 tttaccgatc caattgtcag 600 atcaactcca taacgggact 660 atgaatgaac ctcgttgcca 720 gaaatggcaa ctcatgtcaa 780 ggattttatg gagagtctgt 840 actgacttta tttccaataa 900 cctgaccaat gggtacccaa 960 atcaaagagc acatagatga 1020 ttcggcaagt cttcaagatc 1080 catatatacg ataccatcta 1140 aacctctttt ggcaagtcat 1200 gtcttggaag agaacccttc 1260 tctcttacct aaatatggtt 1320 catactacaa attctgaaaa 1380 aattattaat ttgatactta 1440 aagtatcaat tcataacgag ttattacccg tgtatttgca cattca 1486 <210> 2 <211> 416

<212> PRT <213> Coffea arabica <400>2 42

Met Met Ser Arg Glu Lys Ser Leu Leu Leu Arg Cys Cys Ser Leu Ser 15 10 15

Leu Ala Leu Phe Ile Leu Leu Gly Vai Gly Glu Gly His Gly Glu Ile 20 25 30

Ala Ser Asn Ser Thr Ser Ser Ser Ser Phe Ser Phe Vai Lys Thr Arg 35 40 45

Gly Thr Glu Phe Vai Met Asn Gly Arg Pro Leu Tyr Leu Asn Gly Phe 50 55 60

Asn Ala Tyr Trp Leu Met Tyr Met Ala Ser Asp Pro Ser Thr Arg Thr 65 70 75 80

Lys Vai Ser Thr Thr Phe Gin Gin Ala Ser Lys Tyr Gly Met Asn Ala 85 90 95

Ala Arg Thr Trp Ala Phe Ser Asp Gly Gly Tyr Arg Ala Leu Gin Gin 100 105 110

Ser Pro Gly Ser Tyr Asn Glu Asp Met Phe Lys Gly Leu Asp Phe Vai 115 120 125

Vai Ser Glu Ala Lys Lys Tyr Gly Ile His Leu Ile Leu Thr Leu Vai 130 135 140

Asn Asn Trp Glu Gly Tyr Gly Gly Lys Lys Gin Tyr Vai Gin Trp Ala 145 150 155 160

Arg Asp Gin Gly His Tyr Leu Asn Asn Asp Asp Asp Phe Phe Thr Asp 165 170 175

Pro Ile Vai Arg Gly Tyr Phe Lys Asn His Ile Lys Thr Vai Leu Thr 180 185 190

Arg Ile Asn Ser Ile Thr Gly Leu Ala Tyr Lys Asp Asp Pro Thr Ile 195 200 205

Phe Ala Trp Glu Leu Met Asn Glu Pro Arg Cys Gin Ser Asp Leu Ser 210 215 220

Gly Lys Ala Ile Gin Asp Trp Ile Ser Glu Met Ala Thr His Vai Lys 225 230 235 240

Ser Ile Asp Ser Asp His Leu Leu Asp Ile Gly Leu Glu Gly Phe Tyr 43 245 250 255

Gly Glu Ser Vai Pro Gin Lys Lys Glu Tyr Asn Pro Gly Tyr Gin Vai 260 265 270 Gly Thr Asp Phe Ile Ser Asn Asn Arg Ile Vai Gin Vai Asp Phe Ala 275 280 285 Thr Ile His Leu Tyr Pro Asp Gin Trp Vai Pro Asn Ser Asn Asp Glu 290 295 300 Thr Gin Ala Gin Phe Vai Asp Arg Trp Ile Lys Glu His Ile Asp Asp 305 310 315 320 Ser Lys Tyr Leu Leu Glu Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Phe Gly Lys 325 330 335 Ser Ser Arg Ser Pro Gly Tyr Gin Vai Ala Lys Arg Asp Ala Tyr Leu 340 345 350 Ser His Ile Tyr Asp Thr Ile Tyr Ala Cys Ala Ala Thr Arg Gly Gly 355 360 365 Gly Vai Cys Gly Gly Asn Leu Phe Trp Gin Vai Met Ala Pro Gly Met 370 375 380 Glu Ser Trp Gly Asp Gly Tyr Glu Ile Vai Leu Glu Glu Asn Pro Ser 385 390 395 400 Thr Vai Gly Vai Ile Ala Gin Gin Ser Asn Arg Leu Ser Ser Leu Thr 405 410 415 <210> 3 <211 >22

<212> PRT <213> Coffea arabica <400>3

Ser Phe Ser Phe Vai Lys Thr Arg Gly Thr Glu Phe Vai Met Asn Gly 1 5 10 15

Arg Pro Leu Tyr Leu Asn 20 <210> 4 <211 > 10

<212> PRT <213> Coffea arabica <400>4 44

Thr Trp Ala Phe Ser Asp Gly Gly Tyr Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 17

<212> PRT <213> Coffea arabica <400>5

Glu Tyr Asn Pro Gly Tyr Gin Vai Gly Thr Asp Phe lie Ser Asn Asn 15 10 15

Arg <210> 6 <211 > 18

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotideo sintético Man 202 <400>6 ggnacngart tygtnatg 18 <210> 7 <211> 17

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotideo sintético Man 203 <400>7 ccrtcrctra angccca 17 <210> 8 <211> 19

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotideo sintético Man 214 <400>8 atcaaccacc ttccaacaa 19 <210> 9 45

<211 > 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotideo sintético Man 215 <400>9 taccttcgtc ctcgtaga 18

<210> 10 <211 >20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotideo sintético T3 <400> 10 aattaaccct cactaaaggg 20

<210> 11 <211 >22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotideo sintético T7 <400> 11 gtaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 12 <211 >21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotideo sintético Man 300 <400> 12 gtgaccagac tctagttcga a 21 <210> 13 <211> 22

<212> ADN <213>Sequência Artificial <220> <223>Descrição de Sequência Artificial: oligonucleotideo sintético Man 301 <400> 13 tgaatgtgca aatacacggg ta 22 4 6

<210> 14 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador B262 <400>14 atatatccat ggtgagcttc agctttgtca aaactagggg 40

<210> 15 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador B260 <400> 15 atatatgtcg acggtaagag atgatagcct gttgg 35

<210> 16 <211> 20 <212> ADN <213>Sequência Artificial <220> <223>Descrição de Sequência Artificial: iniciador "pET-For" <400> 16 tagttattgc tcagcggtgg 20 <210> 17 <211> 20

<212> ADN <213>Sequência Artificial <220> <223>Descrição de Sequência Artificial: iniciador "pET-Rev" <400> 17 agcggataac aattcccctc 20

<210> 18 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador B452 <400> 18 47 36 tcaaaggaat tctatcaatg aatattcgtc cattgc

<210> 19 <211 >30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador B453 <400> 19 gggtttgtcg acttctgcga ggtgcagggc 30

<210> 20 <211 >49 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador B281 <400> 20 ccggcctctt cggccgccaa gcgaagcttc agctttgtca aaactaggg 49

<210> 21 <211 >47 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador B282 <400> 21 ggcccacgtg gccttagtgg tggtgggtaa gagatgatag cctgttg 47

<210> 22 <211 >26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador B360 <400> 22 gaacctcgtt gccaaagtga cctatc 26

<210> 23 <211 >26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador B361 48 <400> 23 caatgtctag gaggtgatcg ctatcg 26 <210> 24 <211 >24

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador B358 <400> 24 gccagccaca gattttcact ccac 24

<210> 25 <211 >26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador B359 <400> 25 gaggaacgca tatacagtaa tcatag 26

Lisboa, 8 de Maio de 2007 49

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para o tratamento de grãos de café, em que é utilizada a proteína de acordo com a SEQ ID N°: 2.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, compreendendo as etapas de - superexpressâo de um ADN possuindo a SEQ ID N°: 1 num microrganismo, num fungo ou numa célula vegetal indiferenciada, - purificação da enzima, - tratamento dos sedimentos dos grãos de café com a enzima, para aumentar os rendimentos de extracção ou tratamento do licor de café com a enzima, para diminuir a sedimentação causada por mananas que gelificam.
3. 3. Fragmento de ADN derivado do café codificando, pelo menos, uma enzima envolvida na hidrólise de polissacarídeos consistindo, pelo menos, em moléculas de mananas, puras ou ramificadas, ligadas entre si via uma ligação β(1—»4), fragmento de ADN que possui a sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N°: 1 ou que possui a sequência de ácidos nucleicos desde os nucleotídeos 62 a 1312 da sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N°: 1.
4. 4. Vector recombinante compreendendo um fragmento de ADN de acordo com 3. 1
5. 5. Proteína derivada do grão de café, a qual é codificada por um gene do café e está envolvida na hidrólise de polissacarídeos consistindo, pelo menos, em moléculas de mananas, puras ou ramificadas, ligadas entre si via uma ligação β(1->4), e que possui a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 2.
6. 6. Célula vegetal compreendendo, por meio de um vector recombinante, um fragmento de ADN de acordo com a reivindicação 3.
7. 7. Célula vegetal de acordo com a Reivindicação 6, caracterizada por ser uma célula de café.
8. 8. Planta ou semente consistindo em células vegetais de acordo com uma das reivindicações 6 e 7.
9. 9. Microrganismo compreendendo, integrado no seu genoma ou por meio de um plasmídeo que pode replicar-se, um fragmento de ADN de acordo com a reivindicação 3, de modo a que expresse, pelo menos, uma enzima envolvida na hidrólise de polissacarídeos consistindo, pelo menos, em moléculas de mananas, puras ou ramificadas, ligadas entre si via uma ligação β (1—»4) . Lisboa, 8 de Maio de 2007 2