JPH03504921A - 植物防御遺伝子調節要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に植物防御機構に関する。より詳細には、本発明は植物防御遺伝 子の選択的誘発を制御する調節要素に関する。さらに本発明は、ストレス調節さ れる植物防御遺伝子の転写を誘発するのに有用で、ちると思われる化合物を確認 するための新規な方法に関する３、 発明の背景 植物は環境ストレスに対し多数の適応および保護応答を示す。

この点において特に重要なもの１す、植物がアミノ酸フエニノしアラニンを多数 の保護用フェニルブロノ（メイド系産生物−−イソフラボノイドおよびツマ１ｊ ン系ファ・１′トアレキノ：／抗生物質、フラボン１′ド色素、ならびに細胞壁 ポリマーであるリグニンを含む−−−に曵換する能力である（〕〕＼−ルブロツ ク（Ｂａｈｌｂｒｏｃｋ）おヨヒクリセハッハ（１９７９）、ディクソン（Ｄｉ ｘＯｎ）ら（１９８３））。

中枢のツユ；４ルブＶ」バノイド経路から５〕岐し７た特定の支流経路によるこ れらの産生物の合成は、成長の過積で、および環境刺激により選択的に調節され る。たとえば１３．ｖ、および白色光は保護用１３．ｖ　　吸収性フうボッ・イ トの産生を刺激シ、（）＼−・ルブロソクらＣ１９”＋６））、一方感染はフ、 −イトアレキノン合成を誘発する（ホワイト’％、ツド（Ｔｈｉｔｅｈｅａｄ） ら（１９８２））。

最近の植物分子生物学的研究により、疾病抵抗性は植物宿主ＲＮ　Ａおよび蛋白 質合成に応じた能動的過積であることが示された。二わらの研究により、稟議の 病原体の攻盤９、または菌類細胞壁から得たグリカンニリシター調製物１−Ｊ、 るＩＩ攻撃・が植物宿↑Ｒ＼′Ａ合成のバクーシに実質的な変体を主（：るこ、 ジも一凧、］人オコだ。これらの変化にはだ解酵寡キ→″゛ナー吋゛ン）よびゲ ノ１、・カナ〜ｉ：“、細胞壁のヒトＤキ、・プロリンに富も、糖蛋白質、ｊ− ・みひにリグニンおより、不°フｒイト了レキ９．・二の合成（：開：ｇ　、（ ・こ）酵素を、、■−ドする植物防御遺１云子の転写活性化が今、まれる（りＬ ・−で−（Ｃｒａｍｅｒ）ら（１９８５ａ）：Ｘ３ム（Ｌａ１：ｌｂ）ら＜Ｎ’ ！８’７）：ｏ−・トシ（Ｌａｗ↑Ｏｎ）お、びラム（１９８７））□防御遺伝 ｆ転写体の蓄積は：Ｊ−ｌｊさｔする撰（ｊ質の自［〒９および対応イる防御（ ｊ毛この発」を潜Ｌ　＜勅へだイ）４、Ｆ、Ｉ　Ｑ’ｏ　！ｉプ；、　？ｉｉ　 機ｍ　（”）　ａに１３　＜＋：　”；　２、イーｊ−冊Ｆ’ｈ；”’Ｒを分＋ Ｅ　ｔ　６　．１　@＋”−：　ｉ：、、　ｊ、　−〇　、 植物学者は植物白身の防逗・、／スジ１ムをバ・イメテ”２・′ｔ・・、；ｊ　 、−（二、ｌ゛。

り匈強ず・；踵竺め（・：）ρ？理合ｔν゛Ｘ手Ｗ＝を一丁ザイン・１−ること がＣきろ。

、′とえば町在では、代ム・フッ゛−は環ｉ物によるシグナルに′応ンち、し７ て防御遺伝子を予備活性化Ｉうる遺伝子工学的に製造されり゛植物を考慮するこ とがＴき；）、これらの遺伝子の一？傳；７ｊ、性イ［１嘘イ・ｊ加面なエネル ギー負荷全植物１て与えるが、ニオ１らの遺６２子の発現が特定の器官もシ５＜ は組織、たとえば表皮においでｆｆ’、）み、または植物が特に疾弱にかかりや すい状況下にある特定の成長段階においてのみ発現ずべくＮ物を工学的に処理す ることにより、−の負（旬を最小限に抑えろことができる。

別法１大、防御遺伝子を予備活悸化し、これにより初期ストレスまたは感染の前 に植物〃免疫１１状態を／Ｊ誘発ｌ・するために使用１うる環境上安全な物質を 見出すことである。このような方法は改良植物に不都合なほど大きなエネルギー 負荷を与えないであろう。さらに環境に対し安全な物質を用いて植物自身の″免 疫！−機構を刺激しろるので、この方法（該我々が現在有害な殺虫薬に依存！７ ゛Ｃいるの２′：：排除するの１−ち役−ずγつ。

″＄発発明１植植物市上遺伝子活性化に関ｊ、　゛（Ｅ得られた幾つかの知（１ １に基づく。、：わらの知見の第１１よ’！Ｊｉｍ型グルタチ／１′：、（らＳ Ｈ）、？ん、わぢ小型の水帛泳、づ・、１毒性の細ハ２：２代謝産物が、細胞壁 パフ）ピドｑキ・プロリンにＮｔ了糖蛋ｉ勺質゛ユらび１ごノ□−、−ルブロバ ーノ°４′１・゛生合成、酵素′Ｃある。７又ニルアラ−゛・ｙ′〕７モニ：、 　−／’　−Ｊ、ｌ　７　　ゼ（’ｐ　ＡＬ　）お、４、びカルニノノ、・／グ ・−七（ＣＨＳ　）をツー（Φ゛、−も）〕を含め六−特定の防御１遣二十ｌｖ ｖ転梅を促進゛Ｊ”るとＬ）うこと７’　Ｊ）　６゜−わらの遺（ξ子の転写π ３性化にＪ、）てけ粁］、フる転も仔、０）顕者−カ、′一時的蓄積がさζこｊ ）、＝ｔｑが蛋Ｆ−質含ＤｉＯ：：ｉ；体的・り・リーン・Ｑ実貫的変化（゛− 関与ｒ・丁とが見出された１１．−れはｎ類エリパ・り１こ対するＣた、花とし 、′：Ｗ・：）オＬる変化に近似１（る１、さらに、防ａ遺伝子コード１；ｈ城 のすぐ土？ぷにある特定のツク［・メ′子−ド配列が夕、・トタプ′寸、／相よ び６和工１）ジターなどの物質にコ、る調節２与え５ることが艶出された。菌類 二すシターおよびＧ　Ｓ　Ｈなどの簡単な化学物・質によりｌ・始動！・し）る こオｌらσ）特異（１’：）ブロモ・−ター領域は、病原体および環境ストレス に対する抵抗性が増強さｉｒ洲−ランスンエー　ツク植物を工業的に生産するの に極めＣ有用である。本発明の方法の部分に示されるように、これらのプロモー ター・領域は、植物自身の防御機構を予備活性化するために使用しつる、環境に 対し、安全な物質を確認するためにも有用である。

図面の簡単な説明 以下は図面の簡単な説明である。より詳細な説明は本明細書の実験の部２箇所に 示される。図面は下記の１１図からなる：実験の部Ｉの図面 東１図はＧＳＨに応答した植物防御遺伝子転写体の蓄積を表す写真である。

第２図（ＡおよびＢ）はＧＳＨに応答した（Ａ）ＰＡＬおよびＣＨＳ転写体なら びに（Ｂ）ＰＡＬ酵素活性の誘発の動力学を表す２種のグラフを示す。

第３図はＧＳＨによる植物防御遺伝子転写体の誘発についての用量応答を表す写 真である。

第４図は植物防御遺伝子の転写に対するＧＳＨの作用を表す写真である。

第５図（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）は植物における蛋白質合成パターンに対するＧＳ Ｈの作用を表す写真である。　第６図はＧ５５ＧによるＰＡＬ活性の誘発を示す グラフである。

実験の部■の図面 第７図（ＡおよびＢ）は２種類の図からなる：　　（Ａ）（：Ｈ８−ＣＡＴ−Ｎ Ｏ５構造体および欠失突然変異体の構造を示す。

（Ｂ）ＣＨＳ　　１５プロモーターおよびＣＡＴ融合ジャンクションのヌクレオ チド配列を示す。

第８図（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）はダイズの懸濁培養細胞から誘導されたプロトプ ラスト中へエレクトロボレートされたキメラＣＨ５−ＣＡＴ−ＮＯ５遺伝子の発 現を表す写真である。

第９図はエレクトロボレートされたＣＨＳ−Ｃ，ＡＴ−ＮＯＳ遺伝子を含むプロ トプラストにおけるＣＡＴ転写体の蓄積とＣＡＴ活性の相関関係を表す写真であ る。

第１０図は発現の基礎水準に対するＣＨＳ−ＣＡＴ−ＮＯ３のグルタチオン誘発 を、エレクトロボレートされたキメラ構造体の量の関数として表すグラフである 。

第１１図はダイズブロトブラスト中へエレクトロボレートされたＣＨＳ−ＣＡＴ −ＮＯ３遺伝子のグルタチオン調節に対する５′側欠失の影響を表す薄層クロマ トグラフィー分析および本明細書および請求の範囲においてはここで特に下記の とおり定義された句および技術用語を用いる：ここで用いるギリシャ文字ガンマ は／／　ｇ　／／と書かれる。

ここで用いるグルタチオンは、ｇ−Ｌ−グルタミル−し−システイニル−グリシ ンを意味する。

ここで用いるグルタチオンのペプチド同族体は、式ｇ−Ｌ−グルタミル−し一シ ステイニルーＸをもつ物質であり、ここでＸはグリシン以外のアミノ酸である。

ここで用いるホモグルタチオンは、ｇ−Ｌ−グルタミル−し−システイニル−β −アラニンを意味する。

ここで用いるＧＨＳは、還元型グルタチオンを意味する。

ここで用いるＧ５５Ｇは、酸化型グルタチオンを意味する。

ここで用いるＰＡＬは、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼを意味する。Ｐ ＡＬはアミノ酸であるＬ−フェニルアラニンをトランス−ケイ皮酸およびＮＨ， ”に変換するのを触媒する。

これはリグニン、フラボノイド、イソフラボノイド、クマリン類およびヒドロキ シケイ皮酸エステルを含めた、フェニルプロパン骨格を基礎とする広範な植物天 然産物の合成の最初の反応である。

ここで用いるＣＨＳは、カルコンシンターゼを意味する。ＣＨ３は４−フマロイ ル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡからの３個のアセテート単位との縮合を触媒して ナリンゲニンカルコンを与える。この反応はマメ科植物中のイソフラボノイド系 ファイトアレキシン抗生物質、および高等植物に遍在するフラボノイド系色素の 合成に特異的なフェニルプロパノイド代謝の１支流の最初の工程である（ディク ソン（Ｄｉｘｏｎ）ら（１９８３）　；バールブロック（Ｅａｈｌｂｒｏｃｋ） ら（１９７９））。

ここで用いる４ＣＬは、４−クマレート：ＣｏＡリガーゼを意味する。４ＣＬは 高等植物における多くのフェニルプロパノイド化合物の合成に際して中枢の中間 体であるチオールエステルを合成する（ダグラス（Ｄｏｕｇｌａｓ）ら（１９８ ７））。

ここで用いるＨＲＧＰは、ヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質を意味する。

ここで用いるエリジター物質は、ストレス制御されるプロモーターを／／始動／ ／１誘発その他の形で活性化しつる化合物であり、たとえばフェニルプロパノイ ド生合成酵素であるフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）　、カル コンシンターゼ（ＣＨ３）および４−フマレート：　ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ） をコードする植物遺伝子に対するプロモーター、ならびに細胞壁のヒドロキシプ ロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺伝子に対するプロモーターである。本 発明のエリジター物質には下記のものが含まれるが、これらに限定されない二速 元型グルタチオン；還元型ホモグルタチオンおよびグルタチオンの他のペプチド 同族体の還元型；グリカンエリジター、たとえばヘキサ（β−Ｄ−グルコピラノ シル）−Ｄ−グルシトール（シャープ（Ｓｈａｒｐ）ら（１９８４））　：脂質 エリジター、たとえばアラキドン酸およびエイコサベンクエン酸、糖蛋白質エリ ジター、菌類エリジター、ならびに非生物エリジター、たとえば塩化第二水銀Ｈ ｇｃ１．。

ここで用いる菌類エリジターは、マメ類の病原性菌類コレトトリクム・リンデム チアナム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ）の 菌糸体細胞壁から熱により遊離する高分子量物質を意味する（ロート：／　（Ｌ ａｗｔｏｎ）ら（１９８３））。

ここで用いるＣＡＴは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを意 味する。

ここで用いるＮＯＳは、ツバリンシンターゼを意味する。

ここで用いるＧＵＳは、ベーターグルクロニダーゼを意味する。

ここで用いるＣＧＣは、キメラ遺伝子カセットを意味する。／ｌプロモーター／ リポーター遺伝子／ターミネータ−〃、Ｉ／キメラ防御遺伝子プロモーター／リ ポータ−遺伝子／３−側ターミネーターｌ／、〃プロモーター／植物材料におい て発現可能な構造遺伝子／ターミネータ−／／などの句は本発明のキメラ遺伝子 カセットを意味し、〃キメラ遺伝子カセット〃という句と互換性をもって用いら れる。

ここで用いる転写は、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を意味する。

二こで用いるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始または調節 する他の因子の結合に関与するＤ　Ｎ　Ａ領域を意味する。

ここで用いる転写開始部位は、ＲＮＡに取り込まれた最初の塩基に対応するＤＮ Ａの位置を意味する。各図に示したＤＮＡ配列においては、転写開始部位を＋１ で表す。

ここで用いるＴ　、Ａ　Ｔ　、Ａボックスは、各真核細胞ＲＮＡポリメラーゼ１ １転写ユニツトの転写開始部位の約２５塩基対上流に見られるコンサーブドＡ− Ｔリツチーセブタマーを意味する。

ＴＡＴＡボックスは適正な転写開始のためにＲＮＡポリメラーゼ酵素を位置定め するのに関与すると考えられている。

ここで用いるターミネータ−または３゛側ターミネータ−は、遺伝子または転写 体の３゛末端にあり、ＲＮＡポリメラーゼに転写を停止すべく指示するＤＮＡ配 列を意味する。ターミネータ−の例にはツバリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子の ３′側フランキング領域、およびオクトビンシンターゼ（ＯＣ５）遺伝子の３− 側フランキング領域が含まれる。

ここで用いるＩＩｍｈＯｌ／は、導電率の標準単位を意味する。

ここで用いる適切な植物材料は、特に植物プロトプラスト、植物細胞、植物カル ス、植物組織、成育中の若生植物、未成熟の、および成熟した全植物を含めたも のを意味する。

ここで用いる植物プロトプラストは、植物細胞壁をもたない単一の植物細胞を意 味する。

ここで用いる植物カルスは、未分化の植物細胞塊を意味する。

本明細書および請求の範囲で用いる／／実質的な配列相同！・は、ユニに開示お よび特許請求される実際の配列とわずかなかつ重要でない配列変異をもつＤＮＡ ５ＲＮＡまたはアミノ酸配列が本発明の配列と均等であり、従って請求の範囲に 含まれることを意味する。これに関して／／わずかなかつ重要でない配列変異／ ／　（すなわちここに開示されるＤＮＡ、ＲＮＡまたは蛋白質と実質的な配列相 同をもつ配列）は本発明に開示および特許請求される配列と機能的に均等である 。機能的に均等な配列は、ここに開示および特許請求される核酸およびアミノ酸 組成と実質的に同じ組成のものを産生すべく実質的に同じ様式で機能するであろ う。

本明細書および請求の範囲で用いる、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白 質の修飾語としてＩ〆実質的に純粋な／／は、このように表示されたＤＮＡ、Ｒ ＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白質がそれらのインビボ細胞環境内から人間の努力 により分離され、この分離の結果これらの実質的に純粋なりＮＡ、、ＲＮＡ。

ポリペプチドまたは蛋白質が、分離されていない不純なりＮＡ。

ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白質とは異なる様式で用いられることを意味する 。

ここで用いる作動性結合したとは、各ＤＮＡ配列（プロモーター、およびリポー タ−遺伝子または構造遺伝子、およびターミネータ−）が作動性または機能性で あること、すなわちそれらの意図する目的に有効であることを意味する。言い換 えると、作動性結合したまたは機能性結合したとは、個々のＤＮＡセグメントが 結合したのち、プロモーターにより適宜活性化されるとリポータ−または構造遺 伝子が発現することを意味する。

ここで用いる人間の努力により工学的に形成された植物材料は、新規な系統を形 成するために伝統的な植物育種法ではなく近代的な遺伝子工学的方法を用いる科 学者により作り出された植物材料を意味する。工学的に形成された植物材料はＩ ・自然界には・ｌ存在せず、従って天然物ではない。

ここで用いるエリジター調節されるアクチベータードメインは、ストレス調節さ れる植物遺伝子、たとえばＰＡＬ、ＣＨ８゜４ＣＬ、および細胞壁のヒドロキン プロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺伝子からのプロモーター上の第１の ヌクレオチド配列領域を意味する。機能により定義すると、これらのニリンター 調節されるアクチベータードメインまたは領域は、プロモーターを保有するプロ トプラスト、植物細胞、または植物をエリジター、たとえば還元型グルタチオン 、還元型ホモグルタチオン、グルタチオンのペプチド同族体の還元型、菌類エリ ジター調製物などで処理した際に活性化される性質をプロモーターに付与する。

ＣＨＳプロモーターの場合、アクチベーター領域はヌクレオチド−２９から−１ ７３に及び；この領域は同調調節される遺伝子、たとえばＰＡＬおよび４ＣＬの プロモーター中の類似アクチベーター領域と実質的な配列相同性をもつ。

ここで用いる上流サイレンサードメインは、ストレス調節される植物遺伝子、た とえばＰＡＬ、ＣＨ８，４ＣＬ、および細胞壁のヒドロキンプロリンに冨む糖蛋 白質をコードする植物遺伝子からのプロモーター上の第２のヌクレオチド配列領 域を意味する。機能により定義すると、これらのサイレンサードメインは、この ドメインを除去して機能アッセイにより活性を分析した場合、エリジター誘発さ れた発現（プロモーターの残りの部分により仲介される）が数倍増強されるほど これらプロモーターの活性を抑制する。サイレンサードメインはリプμ・ソサー 因子の結合部位を含むことが知られている。ＣＨＳプロモーターの場合、サイレ ンサードメインまたは領域はヌクレオチド−１７３から−３２６に及び：この領 域は同調調節される遺伝子、たとえばＰ　Ａ　Ｌおよび４ＣＬのプロモーター中 の類似サイレンサー領域と実質的な配列相同性をもつ。

ここに示される各種アミノ酸配列を構成するアミノ酸は下記の３文字または１文 字略号に従って識別される：３文字　　　１文字 アミノ酸　　　　　　　　　略号　　　　略号し一アスパラギン酸　　　　　　 Ａｓｐ　　　　　　ＤＬ−グルタミン酸　　　　　　　Ｇｌｕ　　　　　　ＥＬ −ヒスチジン　　　　　　　Ｈｉｓ　　　　　　Ｅし一フェニルアラニン　　　 　Ｐｈｅ　　　　　　Ｆここに示される各種ヌクレオチド配列を構成するヌクレ オチドは、当技術分野でルーティンに用いられるそれらの通常の１文字表示（Ａ ＳＧ、ＴＳＣまたはＵ）をもつ。

発明の要約 本発明は、外的エリジターにより／／始動／／、誘発その他の形で活性化されう る植物防御遺伝子プロモーターを開示する。本発明は、ストレス調節される植物 防御遺伝子プロモーターを外的に活性化し、これによりそれらに作動性結合した 天然またはキメラ遺伝子を発現させるために使用しつる物質の確認に有用なスク リーニングアッセイ法を開示する。

発明の説明 一観点においては本発明は、キメラ遺伝子融合体が植物細胞に導入された場合ス トレス調節されたターゲット遺伝子発現を指令する、実質的に純粋な植物防御遺 伝子プロモーターからなる。これらのプロモーターには下記のものが含まれるが 、これらに限定されない：フェニルプロパノイド生合成酵素であるフェニルアラ ニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）　、カルコンシンターゼ（Ｃ）（Ｓ）およ び４−フマレート：　ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）をコードする植物遺伝子のプロ モーター、ならびに細胞壁のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質をコードする植 物遺伝子のプロモーター。

他の観点においては、本発明はストレス調節される植物プロモーターの実質的に 純粋な機能性ドメインからなる。これらのドメインには下記のものが含まれるが 、これらに限定されない；フェニルプロパノイド生合成酵素であるフェニルアラ ニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）　、カルコンシンターゼ（ＣＨ３）および ４−クマレート：ＣＯＡリガーゼ（４ＣＬ）をコードする植物遺伝子のプロモー ターならびに細胞壁のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺伝 子のプロモーターからの機能性ドメイン。これらの実質的に純粋な機能性ドメイ ンには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：　（１）ＣＨＳプロモ ーター中のＴＡＴＡボックスとヌクレオチド−１７３位の間に位置するエリジタ ー調節されるアクチベータ一二および（２）ＣＨＳプロモーター中の一１７３位 と一３２６位のヌクレオチド間に位置する上流サイレンサー。（ヌクレオチドの 位置は第７図に示すものを意味する。’）ＣＨＳプロモーターと同調調節される 遺伝子ＰＡＬおよび４ＣＬのプロモーターとの間にはこれら機能性ドメイン内の 要素間に実質的な配列相同性があり；さらに、ＰＡＬおよび４ＣＬプロモーター 中の実質的に相同なドメインはＣＢＳプロモーターの場合と同様な相対位置に配 置されている。たとえばＰＡＬおよびＣＨＳプロモーターはサイレンサー領域に 約７０％の相同性をもち、一方ＣＨ５および４ＣＬプロモーターはＴＡＴＡボッ クスのすぐ上流の６８塩基対（アクチベータードメイン）上に７０％の相同性を もち、ＰＡＬおよび４ＣＬはこの同じ領域に６０％以上の相同性をもつ。エドワ ーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら（１９８５）およびクレイ７−（Ｃｒａｒａｅｒ）ら （１９８９、印刷中）参照。

他の観点においては、本発明は第７図にＣＨＳプロモーターの５゛側フランキン グ領域中のヌクレオチド配列（−２４２から−１９４）および（−７４から−５ ２）として示す２種類の実質的に純粋な配列からなる。１：れら２種類の配列要 素は下記のものである： （１）： （−２４２）ＡＣＣＡＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＡＣＡＧＴＧ ＡＡＴ’ＧＡＡＴＧＡＡ　ＴＧＡＧＴＴＡＴＡ　（−（２）： （−７４）ＣＡＣＧＴＧＡ丁ＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＣＴＡＣ（−５２）他の観 点においては、本発明はｐＣＨＣｌおよびｐＣＨＣ２よりなる群から選ばれるキ メラプラスミドからなる。

他の観点においては、本発明は下記よりなるキメラ遺伝子カセット（ＣＧＣ）か らなる：　（ａ）フェニルプロパノイド生合成酵素であるフェニルアラニンアン モニア−リアーゼ（ＰＡＬ）、カルコンシンターゼ（ＣＨ３）および４−フマレ ート二ｃ。

Ａリガーゼ（４ＣＬ）をコードする植物遺伝子のプロモーター、ならびに細胞壁 のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質をニードする植物遺伝子のプロモーターよ りなる群から選ばれる少なくとも１種類のプロモーター、ここでプロモーターは 下記のものに作動性結合している：　（ｂ）少なくとも１種類のリポータ−遺伝 子、および（ｃ）少なくとも１種類のターミネータ−配列。

本発明のこの観点において有用なリポータ−遺伝子にはクロラムフェニコールア セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）およびベーターグルクロニダーゼ（ＧＵＳ ）が含まれるが、これらに限定されない；有用なターミネータ−配列にはＮＯ５ 遺伝子の３′側フランキング領域およびｏｃｓ遺伝子の３′側フランキング領域 が含まれるが、これらに限定されない。

新規な遺伝材料を植物に挿入するための幾つかの直接的方法がこうして得られる 。その結果本発明のキメラ遺伝子カセットは、防御能の向上したトランスジェニ ック植物系統を得たい者にとって極めて有用となろう。たとえばアグロバクテリ ウム・チュメファシエンス（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅ ｎｓ）の天然遺伝子ベクター系の変形を用いて、タバコ、バレイショ、ニンジン 、アマ、ナス、トマト、トウガラシ、ヒマワリおよびアブラナ類（キャベツ）を 含めた多数の工学処理による双子葉植物が効果的に作り出された。植物遺伝子工 学の技術分野の専門家は過度の経験なしにこれらの方法を用いて、遺伝子構成の 一部として本発明のキメラ遺伝子カセットを含む新規な植物系統を作り出すこと ができる。あるいは当業者はトランスジェニック植物を作り出すためのホーシュ （Ｉｌｏｒｓｃｈ）ら（１９８５）に記載のリーフディスク形質転換法などの方 法、または単子葉植物、トウモロコシを形質転換するために近年用いられている ロデスらの方法（Ｒｈ。

ｄｅｓら（１９８８））を用いることができる。（リーフディスク形質転換法は 本発明のキメラ遺伝子カセットを含むダイズブロトプラストおよびトランスジェ ニックタバコ植物を工学的に形成するために効果的に用いられた。） 他の観点においては、本発明は外的エリジター物質を用いて植物防御遺伝子を活 性化することよりなる。この目的に有用な外的エリジター物質には下記のものが 含まれるが、これらに限定されない；還元型グルタチオン；還元型ホモグルタチ オン、およびグルタチオンの他のペプチド同族体の還元型ニゲリカンエリジター 、たとえばヘキサ（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｄ−グルシトール、脂質エリ ジター、たとえばアラキドン酸、糖蛋白質エリジター、菌類エリジター、および 非生物エリシター、たとえば塩化第二水銀ＨｇＣ１□。外的物質により誘発され つる植物防御遺伝子には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：フェ ニルプロパノイド生合成酵素であるフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（Ｐ ＡＬ）　、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）および４−り７Ｌ／−ト：ＣＯＡ’Ｊ ガーゼ（４ＣＬ）をコードする植物防御遺伝子、ならびに細胞壁のヒドロキンプ ロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺伝子。

本発明の他の種々の観点は後記２種類の実験の部にさらに説明および例示される 。実験の部Ｉは下記の所見に関連する：還元型グルタチオン（ＧＳＨ）をマメ（ Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｌ、　）の懸濁培養細胞に０．０１− １．０ｍＭの濃度で施すと、フェニルプロパノイド生合成酵素であるフェニルア ラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）　、カルコンシンターゼ（ＣＨ３）−− ２ノグニン産生（ＰＡＬ）およびファイドアレキノン産生（ＰＡＬ、ＣＨＳ）に 関与−一をコードするもの、ならびに細胞壁のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白 質をコードするものを含めた防御遺伝子の転写を刺激する。これらの遺伝子の転 写が活性化されると対応する転写体が顕著に蓄積し、これによって蛋白質合成の 全般的パターンが実質的に変化する。この変化は菌類ニリンターに応答する先の 所見に近似する。ＧＳＨは抽出性ＰＡＬ活性を顕著に増大させるのに対し、酸化 型グルタチオン、グルタチオンの個々のアミノ酸成分（グルタメート、システィ ンおよびグリシン）、ならびに強いＳＨ還元剤、たとえばシスティン、アスコル ビン酸およびメルカプトエタノールは不活性である。

外的ＧＳＨが防御遺伝子の活性化および対応する転写体の蓄積に与える影響は先 に菌類エリ／ターによる処理後に観察されたものと質的に類似するが、本発明の 特に予想外の特色はＧＳＨの実質的なＩ的効果である。たとえばＰＡＬおよびＣ Ｈ３転写体の誘発は最適濃度の菌類エリジターの場合より数倍増大し、かつより 持続的である。さらにＧＳＨ処理後に得られた約２００μｋａｔ／ｋｇ（蛋白質 ）というＰＡＬ酵素活性は、細胞懸濁培養物または他の誘発系において観察され たもののうち最高である（ロートン（Ｌａｖｔｏｎ）ら、１９８３）。

実験の部工に示されるように、ＧＳＨの効果は遺伝子活性化に対する選択的効果 、転写体の蓄積および蛋白質合成のいずれ合物グルタメート、グリシンおよびシ スティン（グルタチオンを構成する成分アミノ酸モノマー）、または他のＳＨ試 薬（たとえばアスコルベート、システィンまたはジチオトレイトール）が効果を もたないことは注目すべきである。インビボでＧＳＨは０．０５−１．５ｍＭの 濃度において見出される（ビーロースキー（Ｂｉｅｌａｗｓｋｉ）ら、１９８６ ；レネンバーグ（Ｒｅｎｎｅｎｂｅｒｇ）、１９８２ニスミス（Ｓｍｉｔｈ）、 １９７５；およびスミスら、１９８５）。従って防御遺伝子に対する作用はＧＳ Ｈの生理的濃度において起こる。

本発明の有用性に関しては、外的エリジターによる植物防御遺伝子の選択的誘発 は防御遺伝子活性化の基礎となる分子機構を分析するための卓越した実験系を提 供する。さらに、小型の水溶性、無毒性の細胞代謝産物が特定の植物遺伝子セッ トを強力に活性化するのであるから、ＧＳＨおよび関連ニリンターによる処理は 応答性プロモーターにより駆動されるキメラトランスジエンを工学的に調節する ために有用であろう。

実験の部■は、微生物の攻撃に対する植物防御の活性化の基礎となる機構を解明 する試みに関する。その試みの一部として細菌のクロラムフェニコールアセチル トランスフェラーゼ遺伝子に融合した、ファイトアレキシン生合成酵素カルコン シンターゼをコードする防御遺伝子の５′側フランキング領域を含むキメラ遺伝 子のエリジター調節について研究を行った。グルタチオンまたは菌類エリジター は、ダイスのプロトプラスト中へエレクトロポレートされたこのキメラ遺伝子の 迅速かつ著しい、ただし一過性の発現を引き起こした。この応答は懸濁培養細胞 における内在カルコンシンターゼ遺伝子のものと近似していた。

さらに実験の部■に提示したデータは、ＣＨＳコード領域のすぐ上流の４２９ｂ ｐヌクレオチド配列がエリジター物質、たとえばグルタチオンまたは菌類エリジ ターによる調節を与えるのに十分であることを示す。さらに５′側欠失の機能分 析によれば、プロモーター活性は下記により決定されることが示唆された＋　　 （１）ＴＡＴＡボックスとヌクレオチド−１７３位との間に位置するエリジター 調節されるアクチベーター、および（２）−１７３と−３２６の間の上流サイレ ンサー。これらのシス作用性要素は、エリシテーションシグナルの形質導入に際 して誘発性防御応答の形成を開始すべく機能する。

プロトプラスト中へエレクトロボレートされたキメラＣＨ８−ＣＡＴ−ＮＯ３遺 伝子の応答は、エリジター処理細胞の懸濁培養物における内在染色体ＣＨ８遺伝 子のものと、誘発の動力学ならびにインデューサーとしてのグルタチオンおよび 菌類ニリンターの相対力らに関して近似する。従ってここに記載する好ましいプ ロトプラスト系は、植物防御遺伝子の発現を誘発しまたは植物自身の防御機構を 予備活性化するために使用しつる外的物質を確認するだめの簡便な機能アッセイ 法を提供する。

さらにこの系は防御遺伝子のニリンター調節に関与するシス作用性ヌクレオチド 配列を分析するために有用である。

当業者は以上の記載および以下の実験の部により、これ以上の詳述なしに本発明 を最大限に利用しつると思われる。実験の部に示した材料は特に指示し７ない限 り説明のために示したものであり、従って請求の範囲による本発明の範囲を限定 するものと解すべきでない。

グルタチオン（ｇ　＝　Ｌ−グルタミル−し−システイニル−グリシン）は広範 な代謝過程に関与する低分子量チオールである（マイスター（ｌｉｅｉｓｔｅｒ ）ら（１９８３））。高等植物においてグルタチオンにつき提示された機能には 下記のものが含まれる二還元型イオウの貯蔵および輸送；蛋白質還元体：クロロ プラストにおけるＨ２Ｏ２の分解ならびに特定の除草剤および殺虫剤を含めた外 因生物（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ）の解毒（エドヮーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら（ １９８６）およびレネンハーグ（Ｒｅｎｎｅｎｂｅｒｇ）（１９ε２））。全般 的にグルタチオンは多くのストレス、たとえば照射（マイスターら（１９８３） ）、熱（二一トーソテｏ　（Ｎｉｅｔｏ−Ｓｏｔｅｌｏ）ら（１９８６））およ び重金属への暴露（グリル（Ｇｒｉｌｌ）ら（１９８５））により起こる酸化的 損傷に対する保護に際して重要な役割を果たすと思われる。

スーパーオキシドアニオンの生成および脂質過酸化を含めたレドックスの混乱は 、機械的損傷および微生物感染に対する特徴的な応答であると思われる（カイ（ Ｃｈａｉ）ら（１９８７））。さらに特定のスルフヒドリル試薬はファイトアレ キシンの産生、および疾病抵抗の発現に伴う他の防御応答の活性化を刺激する（ ゲスティン（Ｇｕｓｔｉｎｅ）（１９８７）およびストッセル（Ｓｔｏｓｓｅｌ ）（１９８４））。

これらの所見を合わせると、グルタチオンは生物学的および物理的ストレスに対 する植物細胞の応答を仲介する際に役割を果たすことが示唆される。

この例は、マメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｌ、　）の懸濁培養 細胞をＧ　Ｓ　Ｈで処理すると、ファイトアレキシンおよびリグニンの生合成酵 素をコードする防御遺伝子の転写が実質的かつ選択的に誘発され、細胞壁ＨＲＧ Ｐをコードする遺伝子も刺激されることを示す。遺伝子発現および蛋白質合成の パターンに対するＧＳＨの作用は、菌類エリジターに対する応答に近似する。

実験の部Ｉ　材料および方法 菌類の培養およびエリジターの調製 コレトトリクム・リンデムチアナム（ＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｒＡｌｉｎｄ ｅｎｕｔｈｉａｎｕｍ）の培養物の供給源、維持および増殖は報告に従った（ベ イリー（Ｂａｉｌｅｙ）ら（１９７１））。エリジター（最終濃度６０μｇグル コース当量／ｍ１）は分離された菌糸体細胞壁の熱処理により遊離する高分子量 画分であった（ロートン（Ｌａｗｔｏｎ）ら（１９８３））。

植物材料 マメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｌ、　ｃｖ　Ｃａｎａｄｉａｎ 　ｆｏｎｄｅｒ）細胞培養物を前記に従って増殖させ、ただし培養物を全暗所に 保持した（ロートン（Ｌａｗｔｏｎ）ら（１９８３））。実験は７−１０日令の 細胞培養物を用いて行われ、その際増殖培地は導電率２．５−２．８ｍｈｏを示 した。これは細胞培養サイクル中のニリンターに対する最大応答期間を表す（エ ドワーズ（Ｅｄｖａｒｄｓ）ら（１９８５））。

酵素の抽出およびアッセイ ＰＡＬの抽出およびアッセイは先の報告に従った（ロートン（Ｌａｖｔｏｎ）ら （１９８３））。１単位の酵素活性（ｌｋａｔ）はアッセイ条件下で１ｍｏ　１ の産生物を１秒以内に産生ずるのに必要な酵素の量であると定義される。

ＲＮＡの抽出 全細胞ＲＮＡはフェノール１０．１Ｍトリス−ＨＣｌエマルジョン（ｐＨ９，０ ）中で直接ホモジナイズした試料から分離され、先の報告に従って精製された（ ロートン（Ｌａｗｔｏｎ）ら（１９８３））。ＲＮＡは２６０ｎｍで分光測光法 によりアッセイされた。

ＲＮＡの収量は１５０　２５０μｇ／ｇ（新鮮な組織の重量）であり、Ａ　ｚｏ ｏ／　Ａ、ｚａｏ比は１．８−２．１であった。

インビトロ翻訳および二次元電気泳動 全ＲＮＡを、インビトロで［３Ｂ　３　］メチオニン（エーメルシャム）の存在 下にメツセンジャー依存性家兎網状赤血球溶解物を用いて翻訳した（ロートン（ Ｌａｗｔｏｎ）ら（１９８３））。翻訳産生物は、二次元ゲル電気泳動により（ ガレルス（Ｇａｒｒｅｌｓ）（１９７９））第１次元の等電点集束法については ｐＨ範囲３．５−１０を用い、次いで１０％ゲル５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によ り分画された。

放射性標識ポリペプチドをフルオログラフィーにより視覚化した（ボンナー（Ｂ ｏｎｎｅｒ）ら（１９７４））。

ＲＮＡプロットハイブリダイゼーション全ＲＮＡをグリオキサールで変性し、１ ９ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中の１．２％アガロースゲル中における電気 泳動により分画した（マツクマスター（ＭｃＭａｓｔｅｒ）ら（１９７７））。

ニトロセルロースプロット（トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）（１９８０））を、挿入 配列ｐＰＡＬ５（ｊ−ドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら（１９８５））、ｐＣＨ８ ５（ライダー（Ｒｙｄｅｒ）ら（１９８４））、ｐＨｙｐ２．１３およびｐＨｙ ｐ４゜１（コルビン（Ｃｏｒｂｉｎ）ら（１９８７））のニックトランスレーシ ョンにより調製された［＄２ｐ］標識ｃＤＮＡ配列とハイブリダイズさせた。オ ートラジオグラフィー後に特異的転写体を走査デンシトメトリーにより定量した 。各プロットにつき直線的フィルム応答範囲の各試料を定量すべく、異なる期間 露光した数枚のオートラジオグラムを得た。

核ランオフ（ｒｕｎ−ｏｆ　ｆ）転写 核の分離およびインビトロで［α−”Ｐ］　ＬＩＴＰの存在下に形成された転写 体の分析は先の報告に従って行われた（ロートン（Ｌａｗｔｏｎ）ら（１９８７ ））。固定化さねた配列はＰＡＬ、ｃＤＮＡｐ　Ｐ　Ａ　Ｌ　５　（Ｌドワーズ （Ｅｄｖａｒｄｓ）ら（１９８５））；　ＣＨＳ、　　ｃＤＮＡ　　ＣＨＳＩ（ ライダー（Ｒｙｄｅｒ）ら（１９８４））　：　ＨＲＧ　ＰＳｃ　ＤＮＡ５　　 Ｈｙｐ２．１３およびＨ１’ｐ４．１（：Ｉルピン（Ｃｏｒｂｉｎ）ら（１９８ ７））であった。Ｈｌはエリジター処理のよる影響を受けない構成的に転写され た遺伝子からの配列を含むｃＤＮＡクローンである。ＰＡＬ、ＣＨ６およびＨＲ ＧＰ遺伝子の転写速度はＨ１転写速度を参照して判定された。

ＰＡＬはＬ−フェニルアラニンからリグニンおよびファイトアレキシンを含めた フェニルプロパノイド系天然物質が生合成される際の第１反応を触媒する。ＣＨ ５はフラボノイド色素およびイソフラボノイド系ファイトアレキシンの生成に特 異的なフェニルプロパノイド生合成経路の支流の第１反応を触媒する。

ＧＳＨは懸濁培養されたマメ類細胞において低い基礎水準からＰＡＬおよびＣＨ Ｓ転写体の実質的な、ただし一時的な同調蓄積を生じた（第１および２図）。こ れら転写体の最大蓄積はＧＳＨ添加の約６時間後に見られ、その後比較的低い水 準にまで低下する。ＧＳＨはＨＲＧＰ転写体Ｈｙｐ４．１およびＨｙｐ２．１３ の蓄積をも生じ、これらは菌類エリジターにより誘発されることが先に示されて いる（第１−１図）。エリジター処理細胞の場合と同様に、これらＨＲＧＰ転写 体の蓄積はＰＡＬおよびＣＨＳの場合より遅いが、より持続的である。ＧＳＨ濃 度１０−１００μＭは、最適濃度の菌類エリジターにつき観察されたものに匹敵 するか、またはそれより高い水準のＰＡＬ。

ＣＨＳ、Ｈｙｐ２．１３およびＨｙｐ４．１転写体の蓄積を生じた（第３図）。

転写活性化 低い基礎水準からの顕著な防御遺伝子転写体の蓄積は、ＧＳＨがこれらの遺伝子 の転写を刺激することを示唆した。ＰＡＬ。

ＣＨ３およびＨＲＧＰ遺伝子転写に対するＧＳＨの作用は、ＧＳＨ処理後の種々 の時点で細胞から分離された核によりインビトロで形成された転写体を分析する ことにより監視された。核の分離およびランオフ転写アッセイの解析については 先に報告されている（ロートン（Ｌａｖｔｏｎ）（１９ｇ？））。ＣＤＮＡクロ ーンＨ１はエリジター処理により影響されない多数の転写体に相補的な配列を含 む。内部対照としてのＨ１遺伝子の構成性転写と比較して、ＧＳＨはＰＡＬ、Ｃ ＨＳおよびＨＲＧＰ遺伝子の転写を顕著に刺激した（第４図）。

蛋白質合成パターン インビトロで全細胞ＲＮＡの翻訳により合成されたポリペプチド産生物の二次元 ゲル電気泳動分析によって、蛋白質合成の全般的パターンに対する影響を調べた （第５図）。この基準によれば、ＧＳＨは未処理の対照細胞の場合と比較して蛋 白質合成パターンに主要な変化を生じた。たとえばＧＳＨは一連のＰＡＬおよび ＣＨＳイソポリペプチドを含めた多数のポリペプチドの合成を顕著に刺激した（ 第５図）。ＧＳＨが蛋白質合成パターンに与える影響は、同じ細胞を菌類ニリン ターで処理したのちに見られるものと近似していた。しかしさらにＧＳＨは、そ れらの発現水準が菌類エリジターによってほとんど影響されない４種類のポリペ プチドの合成を顕著に刺激した（第５図）。

ＧＳＨと菌類エリジターを同時に添加した場合、蛋白質合成パターンはＧＳＨ単 独の場合と同様に変化した。

酵素活性および産生物の蓄積 Ｇ　Ｓ　Ｉ−１処理は抽出性ＰＡＬ活性を顕著にがっ持続的に増大させた（第２ 図）。最も速やがな酵素活性増大期はＧＳＨ添加の３−８時間後に起こり、従っ てＰＡＬ転写体の最大蓄積の時期と密接に相関していた。８時間後のＰＡＬ酵素 活性の誘発に関する用量応答性はＰＡＬ転写体の蓄積のものと類似し、１０μＭ 程度の低いＧＳＨ濃度で顕著な効果を示した（第１図）。ＧＳＨによるＰＡＬ酵 素活性の刺激はその経路のフラックスを増大させ、ファイトアレキシン系最終産 生物ファゼオリンをかなり蓄積させた（データは示されていない）。ＧＳＨ処理 は細胞の著しい褐変をも生じた。これはフェノール系物質の蓄積に特徴的なもの である。

ＧＳＨの特異性 抽出性ＰＡＬ酵素活性の誘発が、ＧＳＨの作用の特異性を監視するためのパラメ ーターとして利用された。Ｇ５５Ｇは１ｍＭ濃度で弱いＰＡＬ活性刺激を生じた にすぎず、０．１ｍＭ以下の濃度ではこの酸化型グルタチオンは有意の作用を示 さなかった（第６図）。さらに、細胞をアスコルベート、システィン、または混 合物グルタメート、グリシンおよびシスティンで処理しても抽出性ＰＡＬ活性は 増大しなかった（第２図）。ジチオトレイトールもＰＡＬ活性を誘発しなかつた （データは示されこの例に示したデータは、外的ＧＳＨがマメの懸濁培養細胞に おいて遺伝子発現および蛋白質合成のパターンに顕著な変化を生じることを証明 する。これには防御遺伝子の特異的活性化および対応する転写体の蓄積が含まれ る。これらの作用は先に菌類エリジターによる処理後に観察されたものと質的に 類似するが、特に予想外の特色はＧＳＨの実質的な量的効果である。

たとえばＰＡＬおよびＣＨＳ転写体の誘発は最適濃度の菌類エリジターの場合よ り数倍増大し、かつより持続的である。さら１：　Ｇ　Ｓ　Ｈ処理後に得られた 約２００μｋａ　ｔ／ｋｇ　（ｍ白質）というＰＡＬ酵素活性は、細胞懸濁培養 物または他の誘発系において観察されたもののうち最高である（ロートン（Ｌａ ｖｔｏｎ）ら（１９８３））。

ＧＳＨの効果は、遺伝子活性化に対する選択的効果、転写体の蓄積および蛋白質 合成に関しても、他の還元剤、成分アミノ酸または酸化型グルタチオンが効果を もたないことにおいても特異的である。インビボでＧＳＨは０．０５−１．５ｍ Ｍの濃度におイテ見出される（ビーロースキー（Ｂｉｅｌａｖｓｋｉ）ら（１９ ８６）　；レネンバーグ（Ｒｅｎｎｅｎｂｅｒｇ）（１９Ｂ２’）ニスミス（Ｓ ｍｉｔｈＸ１９７５）；およびスミスら（１９８５））。従って防御遺伝子に対 する作用はＧＳＨの生理的濃度において起こる。ただしインゲンおよびダイズを 含めた若干のマメ科植物においては、主なｉ１Ｍ１分子量チオールはｇ−Ｌ−グ ルタミル−し−システイニル−β−アラニン（ホモグルタチオン）、であり、痕 跡量のグルタチオンを含むにすぎない（プライス（Ｐｒｉｃｅ）（１９５７）） 。

重金属、たとえばカドミウムはグルタチオンの代謝を混乱させ、構造（ｇ−グル タミル−システイニル）、−グリシン（ｎ＝３〜７）をもつファイトケラチンの 合成を生じる（グリル（Ｇｒｉｌｌ）ら（１９８５））。重金属はダイズの子葉 においてファイトアレキシンの合成を刺激することも示されており（メスタ（ｌ ｌｏｅｓｔａ）ら（１９８０））、ＧＳＨが植物防御遺伝子の発現に及ぼす作用 が可能性のある機構として示唆される。さらにＧＳＨは遊離基を除去する還元剤 として作用することにより細胞代謝において保護的役割を果たしくマイスター０ １ｅｉｓｔｅｒ）ら（１９８３））および（レネンバーグ（Ｒｅｎｎｅｎｂｅｒ ｇ）（１９８２））、トウモロコシの根に対する熱ショックは細胞のＧＳＨ濃度 を高めることが最近示された（二一トーソテｏ　（Ｎｉｅｔｏ−Ｓｏｔｅｌｏ） ら（１９８６））、酸化反応、たとえばスーパーオキシドアニオンの遊離および 脂質の過酸化は機械的損傷および感染に対する初期応答である（カイ（Ｃｈａｉ ）ら（１９８７））。従ってＧＳＨは、菌類エリジターなどの外的刺激の作用を 仲介する細胞内二次メツセンジャーとして、または初期混乱から離れた部位にお いて防御遺伝子を活性化する生物学的ストレスの後続細胞内信号として、これら のレドックス混乱の二次信号としての機能をもつと思われる。

しかし外的ＧＳＨと菌類エリジターの作用間の近似性は必ずしもエリジター作用 の生理学的役割を表すものではない。たとえば最近の証明は、動物細胞の表面に ある多くのレセプター、たとえばβ−アドレナリン作用物質レセプターが分子内 ジスルフィド架橋をもち、これをチオール化合物で開裂させると作用物質の結合 と同様にレセプターが活性化されることを示している（マルボン（Ｍａｌｂｏｎ ）ら（１９８７））。従フてマメの細胞においてＧＳＨがニリンターレセプター 内のこのような結合を開裂させ、こうしてエリジターの不在下で防御遺伝子活性 化を開始するという可能性があるが、これはこの信号形質導入経路におけるＧＳ Ｈの生理学的役割を示すものではない。興味深いことであるが、ｐ−クロロメル クリ安息香酸およびｐ−クロロメルクリベンゼンスルホン酸を含めた多数のスル フヒドリル試薬が、ダイズ胚軸におけるグリセオリンおよびシロツメフサ（Ｌａ ｄｉｎｏ　ｃｌｏｖｅｒ）カルスにおけるメディカルピンの合成を誘発する（ゲ スティン（Ｇｕｓｔｉｎｅ）（１９８７）およびシュトッセノ喧５ｔｏｓｓｅｌ ）（１９８４））。

第１図、ＧＳＨ（１ｍＭ）に応答した防御遺伝子転写体の蓄積。

第２図、ＧＳＨ（１ｍＭ）に応答した（Ａ）ＰＡＬおよびＣＨ５転写体ならびに （Ｂ）ＰＡＬ酵素活性の誘発の動力学。白地記号：対照：黒地記号：　ＧＳＨ処 理、ＰＡＬ（白地および黒地の丸）；ＣＨ８（白地および黒地の四角）。パネル （Ｂ）において点線はＰＡＬ　　ｍＲＮＡ水準の変化を示す。

第３図、ＧＳＨによる防御遺伝子転写の誘発に関する用量応答。Ｅ＝最終濃度６ ０μｇグルコース当量／ｍｌのエリジター。

第４図、防御遺伝イ転写に対するＧＳＨの作用。ＧＳＨ処理の１．７５時間後の 細胞から、または相当する未処理対照細胞から核を分離した。

第５図、蛋白質合成パターンに対するＧＳＨの作用。下記より単離された全細胞 ＲＮＡのインビトロ翻訳により合成された［３５Ｓ）メチオニン標識産生物の二 次元ゲル電気泳動分析＝（Ａ）未処理対照細胞；または下記による処理の４時間 後の細胞：　　（Ｂ）ＧＳＨ（１ｍＭ）；　　（Ｃ）菌類ニリンター（６０μｇ ／ｍｌ、グルコース当量）；　　（Ｄ）ＧＳＨプラス菌類エリジター。パネルＢ において白地矢印はＧＳＨおよび菌類エリジターの双方により誘発された種を表 し；黒地矢印はＧ　Ｓ　Ｈにより誘発されたが、菌類エリジターによっては誘発 されなかった種を表し；　／／　ｐ　＃はＰＡＬサブユニットを表し；　Ｉ／　 （／／はＣＨＳサブユニットを表す。）ｌＩＥＦ／／：第１次元における等電点 集束法；／／ＳＤＳ　ＰＡＧＥ−／：第２次元におけるＳＤＳポリアクリルアミ ドゲル電気泳動。

第６図、Ｇ５５ＧによるＰＡＬ活性の誘発：１ｍＭ（黒地三角、頂点上向き）； ０．１ｍＭ（黒地三角、頂点下向き）；０゜０１ｍＭ（黒丸）；対照（白地四角 ）。Ｇ５５Ｃ；による誘発を０．１ｍＭ　　ＧＳＨにより得たもの（白丸）と比 較した。

応答 処理　　　　　　　　　　　　ＰＡＬ活性０１１１１　　　　　４時１１　　　 　８時間（ｌｌｋａｔ／ｋｇｉＨ） 未処理　　　　　　　　　４　　　２　　　６ＳＨ ０、０１ｍＭ　　　　　　　　　　　　２５　　　　２１０、１ｈＭ　　　　　 　　　　　　　４０　　　１１７１、００１Ｍ　　　　　　　　　　　　３０　 　　１３６エリンター　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　３６　　　　　　　４３エリツタ−＋Ｇ　　Ｓ　　Ｈ，１、ＯｍＭ　　　 　　　　　　　　　　　　　　６１　　　　　　　　１４２エリジターは６０μ ｇグルコース当量／ｍｌの濃度で施された。

＄２茎、ＰＡＬ活性の水準に対するＧＳＨ，成分アミノ酸およびアスコルビン酸 の作用。

処理　　　　　　　　　　　　ＰＡＬ活性未処理細胞　　　　　　　１８２２　 　　１２ＧＳＨ−１０５９８ ノステイン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７　 　　　　２３システイン、グ１ルン、グルタメート　　　　　　　　　　　　　 　　　１９　　　　　２１化合物はすべて０．１ｍＭの濃度で試験された。

実験の部　■ エレクトロボレート処理プロトプラストにおける植物防御遺伝子プロモーターの エリジター調節竿 植物は微生物の攻撃に対し抗生物質の合成、溶解酵素の刺激、および細胞壁の強 化により応答する（ダーヴイル（Ｄａｒｖｉｌｌ）ら（１９８４）、ディクソン （Ｄｉｘｏｎ）ら（２９８３）、ディクソンら（１９８６）およびニーベル（Ｅ ｂｅｌ）（１９８６））。これらの防御は菌類の細胞壁および培養液または代謝 産物からのグリカンおよび糖蛋白質エリジター、たとえばアラキドン酸、および グルタチオンによっても誘発される（ダーヴイル（Ｄａｒｖｉｌｌ）ら（１９８ ４）、ディクソン（Ｄｉｘｏｎ）ら（１９８３）、ディクソンら（１９８６）、 ニーベル（Ｅｂｅｌ）（１９８６）、実験の部Ｉ、およびウィンゲート（ｗｉｎ ｇａｔｅ）ら（１９８８））。エリジター、創傷または感染は、これらの防御の 成立に関与する遺伝子の転写を急速に刺激する（実験の部１１ならびにウィンゲ ー）　（ｌｉｎｇａｔｅ）ら（１９８８）、チャペル（Ｃｈａｐｐｅｌ　１　） ら（１９８４）、クレー？　−（Ｃｒａｍａｒ）ら（１９８５ａ）、ゾムジッヒ （Ｓｏｍｍｓｉｃｈ）ら（１９８６）、ロートン（Ｌａｖｔｏｎ）ら（１９８７ ）およびヘトリック（Ｈｅｄｒｉｃｋ）ら（１９８８））。抵抗機構の活性化に おけるこの初期事象を解明するために本発明者らは、エレクトロボレート処理さ れたダイズブロトブラストにおける、カルコンシンターゼ（ＣＨ３）をコードす る防御遺伝子（’）５’　−側フランキング領域が細菌のクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子に融合したもの、およびツバリン シンターゼ（ＮＯ８）遺伝子の３゛−側フランキング領域からなるキメラ遺伝子 の発現につき研究した。

ＣＨ３は４−フマロイル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡからのアセテートユニット ３個との縮合によりナリンゲニンカルコンを与える反応を触媒する。これはマメ 類におけるイソフラボノイド系ファイトアレキシン抗生物質、および高等植物に 遍在するフラボノイド色素の合成に特異的なフェニルプロパノイド代謝の１支流 の最初の工程である（ディクソン（Ｄｉｒｏｎ）ら（１９８３）およびハールブ ｏ、ｙり（Ｂａｈｌｂｒｏｃｋ）ら（１９７９））。エリジターは５分以内にマ メの細胞におけるＣＨＳ転写を刺激してＣＨ５ｍＲＮＡを一時的に蓄積し、その 最高水準は３−４時間後であり、これはファイトアレキシン合成の開始と相関す る（クレイマー（Ｃｒａｍｅｒ）ら（１９８５＋）、ロートン（Ｌａｖｔｏｎ） ら（１９８７）およびライダー　（Ｒｙｄｅｒ）ら（１９８４））。

この例は、グルタチオン、またはマメの病原体コレクトリクム・リンデムチアナ ムの菌糸体細胞壁から熱により遊離する高分子量物質である菌類エリジター調製 物（菌類エリジター）が、ダイズブロトブラスト中へエレクトロボレートされた キメラＣＨＳ−ＣＡＴ−ＮＯＳ遺伝子の急速がっ顕著な、ただし一過性の発現を 生じることを示す。ＣＨ８−ＣＡＴ−ＮＯ３遺伝子の応答は、エリジター処理細 胞懸濁培養物における内在ＣＨＳ遺伝子のものと近似する。これらのデータは、 ＣＨＳコード領域のすぐ上流の４２９ｂｐヌクレオチド配列が、ニリンター物質 、たとえばグルタチオンまたは菌類エリジターによる調節を及ぼすのに十分であ ることを示す。５′側欠失体の機能分析により、誘発性防御の形成を開始するエ リシテーションシグナルの形質導入はＴＡＴＡボックスと−１７３の間に位置す るエリジター調節されるアクチベーター、および−１７３と−３２６の間の上流 サイレンサーを伴うことが示唆される。

ｐＤ○４００は、先に報告されているカリフラワーモザイク’）イに７．（Ｃａ ＭＶ）３５Ｓブｏ−ｔ−一ター構造体ｐＤＯ４３２（オウ（ＯＷ）ら（１９８６ ））ｊ：相当するが、ただし大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）クロラ ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含む８８３ｂｐ ＢａｍＨＩフラグメント（アルドン（Ａｌｔｏｎ）ら（１９７９））がｐＤ○４ ３２のルシフニラーゼリポーター遺伝子に代わっている。ｐＣＨ８１５は、ＣＨ ３１５遺伝子の全長およびフランキング配列を含む２．ｌｋｂ　　ＨｉｎｄｌＩ Ｉ７メ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）ゲノムフラグメントー−リボ プローブベクターｐＳＰ６４中ヘサブクローン化されたものｍ−からなる（ライ ダー（Ｒｙｄｅｒ）ら（１９８７））。ｐｃＨｃｌにおいてｆｌフラグメントが ｐＤＯ４００の３５Ｓ転写体プロモーターｎｄｌｌｌ／ＸｂａＩポリリンカーフ ラグメントで置換してｐＣＮｌｏｏを形成することにより構成された。ｐｃＮｌ ｏｏを１フラグメントー−その末端が同様にクレノーフィルインにより平滑処理 されたものｍ−の平滑末端リゲーションに用いた。

この構造体をＭ１３リバースプライマー（チェノ（Ｃｈｅｎ）ら（１９８５）） による変性二本鎖プラスミドのジデオキシ−チェーンターミネーション（サンガ ー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（１９７７））によって配列決定した。

ｐＣＨＣｌをＨｉｎｄｌＩＩで消化したのち、エギソヌクレアーゼＩＩＩおよび マングビーン（ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ処理することにより欠失突然 変異体を構成した（ヘニコフ（Ｂｅｎｉｋｏｆｆ）した。正確な終末点は上記の 配列決定法により判定された。ｐＨＣＮＩは、ネズミヒストンＨ４遺伝子のプロ モーター領域かｅｍｉｄ）ベクター）中へクローニングすることにより構成され た。この構造体をさらにＥｃｏＲＩ／Ｘｂａ　Ｉで開裂させ、マメ（Ｐｈａｓｅ ｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｌ、　）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ　Ｌ 、）およびタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔｏｂａｃｕｍ　Ｌ、　）細胞懸濁培 養物の由来および維持は報告に従い、ただし細胞をふるい分け（２５０ミクロン メツシュ）により採取し、７日毎に新鮮な維持培地に移した（クレイ７−　（Ｃ ｒａｍｅｒ）ら（１９８５ｂ）およびノルマン（Ｎｏｒｍａｎ）ら（１９８６） ）、プロトプラスト分離のために細胞（７ｇ、新鮮な重量）を二次培養の４日後 に採取し、１００ｍ１のプロトプラスト分離培地中で２７℃において４時間、暗 所で振どう（９０ｒ　ｐｍ）することによりインキュベートした（フロム（Ｆｒ ｏｃｉ）ら（１９８５））。

プロトプラストは細胞残層からふるい分けおよび７０Ｘｇで５分間の遠心分離に より分離された。エバンスブルーで染色することにより生存率を判定し、プロト プラストを５Ｘ１０’／ｍ１に調整した。掃作前にプロトプラストをエレクトロ ポレーション媒質（フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら（１９８５））中で２回洗浄した。

エレクトロボレー／・ヨンおよび一過性アッセイエレクトロポレーンヨンは報告 に従い（フロム（Ｆｒｏａｍ）ら（１９８５））、プロトプラスト分離の３時間 後に、最適パルス２５０■によりｌＱｍｓｅｃ間行われた。特に指示しない限り 、３０μｇの被験構造体ＤＮＡをキャリヤーとしての５０μｇのウシ胸腺Ｄ　Ｎ 　Ａと共にエレクトロポレートした。プロトプラストは０３Ｍマンニトールを含 有する維持培地５ｍｌ中に２７℃で暗所において、撹拌することな（維持された 。第８図）でネル（Ａ）に示した実験においては、プロトプラストを分析用とし てエレクトロポレーションの８時間後に採取した。他のすべての実験においては 、プロトプラストをエレクトロポレーション後に２１時間インキュベートしたの ち、コレトトリクム・リンデムチアナムの菌糸体細胞壁から熱により遊離した菌 類エリジター調製物（菌類エリジター、クレイ７−　（Ｃｒａｍｅｒ）ら（１９ ８５ｂ））また１よグルタチオン（実験の部１およびウィンゲート（Ｖｉｎｇａ ｔｅ）ら（１９８８）参照）−−０，３Ｍマンニトールを含有する維持培地中、 それぞれ６０μｇグルコース当量／ｍｌおよび１ｍＭの最終濃度となる量−一を 添加した。対照プロトプラストには０．３Ｍのマンニトールを含有する維持培地 を等容量添加した。遠心分離によりプロトプラストを採取し、報告に従って基質 ［＋４Ｃ］　クロラムフェニコールの転化率をラジオメトリー測定することｊこ より、抽出物をＣＡＴ活性につきア・ソセイした（フロム（Ｆｒｏｗｎ）ら（１ ９８５））。反応生成物を薄層クロマトグラフィーにより分離し、オートラジオ グラフィーにより視覚化し、シンチレーション計数により定量した。蛋白質をブ ラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６））によりアッセイした。一般 的なＣＡＴア・ノセイ法は、５μｇの蛋白質を含有する試料を３７℃で３時間イ ンキュベートし、）、、０００−５．０００ｃｐｍの基質をアセチル化物に転化 することよりなる。

ＲＮ、Ａ分析 プロトプラスト（３Ｘ１．０’）を０．０１％ＳＤＳ含有０゜１Ｍトリス−ＭＣ Ｉ、ｐＨ９，０，１００μｍに再懸濁した。

フェノールおよびクロロホルムで抽出したのち、上澄液を０゜３Ｍ酢酸ナトリウ ムの存在下に２容量の９５％エタノールで沈澱させた。ＲＮＡをさらに処理し、 報告に従いノーザーンブロットハイブリダイゼーションにより分析した（クレイ マー（Ｃｒａｍｅｒ）う（１９８５ｂ））。ハイブリダイゼーションプローブは ニックトランスレージＪンにより標識した大ｍａｃＡＴ遺伝子配列を含む０１Ｃ ＨＳプロモ一ター機能を分析するために、ＣＨ３１５遺伝子の５゛側フランキン グ領域がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のコード 配列と融合したものおよびツバリンシンターゼ（ＮＯ５）の３′側フランキング 領域からなるキメラ遺伝子（第７図）を懸濁培養細胞由来のプロトプラスト中へ エレクトロポレートしたのち、その発現を調べた。

ＣＨ３１５はマメのゲノムにおける６個のＣＨＳ遺伝子の１つであり、主要なエ リジター誘発されたＣＨ８転写体をコードする（ライダー（Ｒｙｄｅｒ）ら（１ ９８７））、このキメラＣＨ３−ＣＡＴ−ＮＯ５遺伝子構造体ｐＣＨＣ１はＣＨ Ｓ１５の５′側非翻訳ヌクレオチド配列４２９ｂｐを含み、これは転写開始部位 の上流の３２６ｂｐ、および１０３ｂｐの転写リーダー配列よりなる（第７図） 。パセリにつき最近報告されたように（ダングル（Ｄａｎｇｌ）ら（１９８７） ）、マメおよびダイズのプロトプラストは、内在防御遺伝子によりコードされる 転写体の蓄積およびフェニルプロパノイド産生物の出現に関しては、それらが由 来する懸濁培養細胞と類似の様式でエリジターに応答する（データは示されてい ない）。しかしエレクトロポレートされたマメのプロトプラストは、タバコおよ びダイズのプロトプラストと比較して低い生存率および弱いＣＨＳ−ＣＡＴ−Ｎ ＯＳ遺伝子発現率を示すにすぎなかった（第８図）。マメに近似する後者が、エ リジター調節の研究の生な焦点であった。

プロトプラストの調製に際して遊離する内在エリジターおよび他のストレス因子 による誘発（ダングル（Ｄａｎｇｌ）ら（１９８７）およびミース（Ｍｉｅｔｈ ）ら（１９８６））を最小限に抑えるために、新たに分離したプロトプラストを ニレクトロポレーション前に３時間、およびエリシテーション前にさらに２１時 間インキュベートした。グルタチオン添加後に顕著なＣＡＴ活性水準上昇が３時 間以内に観察されたのに対し、未処理対照においてはこの期間にＣＡＴ活性の有 意の変化はなかった（第８図）。プローブとしてのニックトランスレートされた ＣＡＴ遺伝子配列とのノーザーンブロットハイプリダイゼーションは、ＣＡＴ活 性のグルタチオン刺激がＣＡＴ転写の誘発を反映することを示した（第９図）。

従ってＣＡＴ活性ノ誘発はｃＨ８−ＣＡＴ−ＮＯＳ遺伝子の転写の誘発と相関す る可能性がある。これに対しグルタチオンは、ＣＡＴ−ＮＯＳリポータ−カセッ トと融合したネズミヒストンＨ４遺伝子のプロモーターからなるキメラ遺伝子を エレクトロポレートされたプロトプラストにおいては、ＣＡＴ活性を変化させな かった（第８図）。

種々のプロトプラストＩ製動試料を別個にエレクトロポレートおよび誘発させた 場合、ＣＨ５−ＣＡＴ−ＮＯ５遺伝子の応答は高度の再現性を示した（第８図） 。３０−５０μｇのキメラ遺伝子を用いた場合、最適なエリジター調節が見られ た（第１０図）。より多量の構造体をエレクトロポレートさせると、対照プロト プラストにおいて高水準の発現およびこれに応じてグルタチオンによる弱い調節 が生じた。菌類エリジターもキメラ遺伝子の発現を誘発した（第８図）が、懸濁 培養細胞中の内在ＣＨＳ遺伝子に関しては応答はグルタチオンの場合より若干弱 かった（実験の部Ｉおよびウィンゲート（Ｖｉｎｇａｔｅ）ら（１９８ｇ）参照 ）。

ＣＨＳ−ＣＡＴ−ＮＯＳ遺伝子はグルタチオン添加の３時間後に一時的に最高水 準で発現し、次いで６時間後に比較的低い水準にまで減衰した（第８Ｄ図）。グ ルタチオンの不在下ではこの期間にわたってＣＡＴ活性の誘発は見られなかった 。このキメラ遺伝子はタバコ細胞由来のプロトプラスト中へエレクトロポレート された場合もグルタチオンによって調節されたが、応答はより弱く、最高ＣＡＴ 活性は６時間後に見られた（第８Ｄ図）。これらの誘発力学は、プロトプラスト が由来するそれぞれの懸濁培養細胞中の内在防御遺伝子の発現の場合に近似して いた（ライダー（Ｒｙｄｅｒ）ら（１９８４）　ニゲラブ（Ｇｒａｂ）ら（１９ ８５）　；バーン（Ｂａｈｎ）およびラム（Ｌａｍｂ）、未発表の所見）。

これらのデータは、ＣＨ３１５の−３２６までの配列がグルタチオンまたは菌類 エリジターによる調節を与えるのに十分であることを示した。−３２６から−１ ７３までの欠失はダイズブロトブラストにおいて外的刺激前のＣＡＴ活性の基礎 水準を高め、さらにグルタチオンに対する応答を著しく増大させた（第１１図） 。これに対しさらに−１３０までの欠失は、基礎および誘発双方の発現を全プロ モーターにつき見られたものとほぼ同じ各水準にまで低下させた。−７２までの 欠失は、グルタチオン処理プロトプラストにおける発現を未処理対照プロトプラ ストにおいて見られた基礎水準にまで低下させた。グルタチオン調節を失わせる この欠失は、一過性アッセイにおける誘発の特異性に関して付加的な内部対照と なる。この構造体においてＣＨＳプロモーター配列は機能性ＴＡＴＡボックスに 隣接するベクター配列により置換されているからである。ＴＡＴＡボックス（− ２９から−２１まで）を除去する−１９までの欠失は、対照およびグルタチオン 処理双方のプロトプラストにおいてこのキメラ遺伝子の発現を完全に失わせた。

５′側欠失体は菌類エリジター調製物による誘発に対しても類似の相対的作用を 示した（データは示されていない）。たとえば−１７３までの欠失は菌類エリジ ターに対する応答を同様に高め、ただしこの誘発の増大は同一構造体につきグル タチオンに応答して得たものより若干弱かった。グルタチオンの場合と同様に、 さらに−１３６まで、および−７２までの欠失は菌類エリジターに対する応答を 漸減させた。

考察 以上のデータはＣＨＳプロモーターがエレクトロポレートされたプロトプラスト においてエリジター物質、たとえばグルタチオンおよび菌類エリジターにより適 宜調節されることを示す。

他の一過性発現系の場合と同様に、ＣＨ３−ＣＡＴ−ＮＯ３遺壬子が染色体ＤＮ Ａに挿入されず、本発明者らの実験がプラスミド上の遺伝子の発現を見ていると いう可能性はある。しかしプロトプラスト中へエレクトロポレートされたキメラ ＣＨＳ　−ＣＡＴ−ＮＯＳ遺伝子の応答は、誘発の力学ならびにイ″ンデューサ ーとしてのグルタチオンおよび菌類エリジターの相対効力に関して、エリジター 処理細胞懸濁培養物中の内在染色体ＣＨ８遺伝子のものとλ５似する。従ってこ こに記載するプロトプラスト系は、防御遺伝子のニリンター調節に関与するシス 作用性ヌクレオチド配列を分析するための簡便な機能アッセイ法を提供する。さ らに、現在キメラプロモーター／遺伝子融合体を呑む植物細胞を遺伝子工学的に 調製することができるので、キメラＩＬカセット／７またとえば誘発の外的誘発 可虹な植物防御遺伝子プロモーター−構造遺伝子−ターミネータ−カセット（Ｃ ＧＣ）を種々の有用な植物に導入することができる０、一般的にはカブラ〉（Ｃ ａｐｌａｎ）ら（１９８４）；オ、−シ、　（Ｈｏｒｓｅｈ）ら（１９８５）： ロデス（Ｒｈｏｄｅｓ）ら（１９８８）を参照されたい。

一連のネスト状５′側欠失体を用いた初期の研究は、エリジター調節されるアク 番ベーター要素が−１７３から下流にあることを示唆する。−１３０から−７２ までの５゛側欠失は基礎発現を高めることに９１−ってではなく、誘発を抑制す ることによってエリツタ−・調節に作用するので、このアクチベーターは正の／ ス作用性要票であると思われる。この機能アッセイはＣＨＳ遺伝子におけるＤＮ ａｓｅｌ？＋４化に過敏性の部位のパターンと一致する（ｏ−４−ン（ｌｉ、　 、４．　Ｌａｗｔｏｎ）およびラム（Ｃ，Ｊ、　Ｌａｍｂ）、未発表）。

調節蛋白質の結合に伴うクロマチン構造の局部的な開裂を示すこれらの部位３箇 所がニリンター処理細胞からの核のプロモーターの末端領域に認められるが、対 唄細胞からのものには認められない。これに対し、上流領域の各部位は非誘発細 胞およびエリジター処理細胞からの核に顕著なりＮａ５ｅＪ過敏性を示す。

Ｔ　、Ａ　Ｔ　Ａボックスと−１３０の間の配列はニリンター調節、たとえばグ ルタチオン甘たは菌類エリュ・・ターによる調節に必要かつ十分であるが、丘流 配列は発現を変化させると思われ、名犬誘発は−１７３までの配列が存在する場 合に得られる。こメ１は間−のトランス作用性因子（コまたは２以上）または− １７３と−１３０の間の独立した￥Ａ節要素−−ＴＲ要素と別個のものｍ−と相 互作用する多重シス作用性配列のび在を反映する可能性がある。あるいは−】７ ３と−１３０の間のヌクレオチド配列の欠失は遺伝子の発現に対し、この領域に 位置するシス作用性因子−２のトランス作用性因子の紘・８を失わせる。二とに よってではなく、−１３０の下流のアクチベ・−タ・−・要素への転写因子の結 合を変化させるクロマチニ・構造に対する間接的作用によ−２て影響を与える可 能性もある。

クロマチン構造の同様な間接的再配置も−３２６から−・１７３までの欠失１１ ″より見られた発現増強に関与すると思われる。

しかしこの発現増強は１、−３２６と−１７３の間に位！する別個のンス作用性 すイｌ、ンサー要素の除去を反映するという可能性もある。この領域への核因子 の特異的結合が最近検出され、さらにトランスの推定サイｌノンサー要素と全Ｃ Ｈ８−ＣＡＴ−ＮＯ３遺伝子（ｐ　ＣＨＣｌ　：）との共エレクト［コポレーシ 顎ンは発現を顕著に刺激する。こねは恐らく対応するトランス作用性リプレ・、 サーの結合に対する競合によると思われる（ロートン（Ｌａｖｔｏｎ）ら（１９ ８ｇ））。正と弁のエリジター調節される要素間の協力的相互作用は極めて２速 かつ顕著な一過性の遺伝子活性化に関する・・取得ｌ・機構の可能性を提示する が、ネスト状５−側欠失の機能分析は推定サイレンサーがエリジター調節される か否かを指示しない。

ＣＨ８の５′側フランキング領域の２配列要素、−２４２から−１９４までおよ び−７４から−５２まで（第７図）は、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ （Ｐ　Ａ　Ｌ　）すなわちフェニルプロパノイド生合成の第１酵素をコードする 同調調節される遺伝子のプロモーター中に強固に保守される（クレイマー（Ｃｒ ａｍｅｒ）ら、未発表の所見）。Ｐ　Ａ　Ｌ、、ブロモ−クー中に同様に配置さ メするこ１１らのモチーフは、サイレンサーおよびアクチベーター機能において もそれぞｊ役割を果−すと考えらねる。点突然変異体およびキメラブ０（−タ・ −の分析はサイレンサーおよびアクチベーター配列要素をより精確に規定し、か つエリジター調節におけるサイレユ・サーの機能を明確１′、−するであろう。

実験の部ＩＩ：示し、た研究１嘘グルタチオンと菌類エリジターが遺伝子発現お よび蛋白Ｖ、合酪のパターンに対シ９．て質的にほぼ等しい作用を及ぼすこ゛と を示した（ウインゲーｈ　（Ｗｉｎｇａｔｅ）ら（１９８８）も参照さメまたい ）。ここて調ベザこ５−側欠失はグルタチオ゛／および菌類エリジターによる調 節１＝対し同様な作用を及ぼした。ＣＨＳプロモーターをさらに解離させること により、これらの異なる２群のニリンターに由来する信号の形質導入に際し等し ＬＸシ・ス作用性要素が関与するか否かを判定することはかなり重要であろう。

プロトプラスト中へ、導入された遺伝子の発現は数例において証明されているが 、外的指示に応答した適切な調節につＬ′１ての唯一の先行報文はエレクトロボ レートされたトウモロコシプロトプラストにおけるアルコールデヒド１コゲ→− −−ゼ１　（ＡＤＨｌ）−ＣＡＴ−ＮＯＳキメラ遺伝子の、酸素枯渇により誘発 される刺激である（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら（１９８７））。ストレス誘 発される遺伝子、たとえばＡ　Ｄ　Ｈ１およびＣＨＳの活性化に関する信号形質 導入機構は、プロトプラストの分離および培養に際して機能性を保持すると思わ れる。エリジターに対する応答は著しく急速であるので、微生物認識と防御遺伝 子活性化の間の信号形質導入経路はごくわずかな工程を含むのであろう。従って こ、二で確認したシス作用性要素と相互作用するトランス作用性核因子の分析は 、植物防御誘発の基礎となる応答−カッブリング機構の解明のための鍵を提供す ると思われる。

第７図、　　（Ａ）ＣＨ３−ＣＡＴ−ＮＯ８および欠失構造体のｉ造。（Ｂ）Ｃ ＨＳ１５プロモーターおよびＣＡＴ融合ジャンクションのヌクレオチド配列。指 示された制限部位（ｌＢ＝旦課ｎＨＩ；Ｈ３一旦工旦ｄＩＩＩ：Ｈｆ＝月−ユユ ｆＩ・Ｋ＝べ且勇−１；Ｒ＝、Ｅｃｏ−ＲＩ　；Ｘコ入巾ａｌ：Ｘ２＝き一互旦 １１゜欠失突然変異体は矢印で示される。Ｔ　Ａ　ｉ”　ＡボーＪクスにはＦ線 を施す。エリジター誘発されるマメＰＡＬ遺伝子のブロモ・−ター中に保守され る配列には上線を施す。

第８図、懸濁培養細胞由来のプロトプラスト中へエレクトロポレートされたキメ ラＣ）Ｉｓ−ＣＡＴ−ＮＯ８遺伝子の発現。

（Ａ）マメ、ダイブおよびタバコのプロトプラストにおける発現の比較；　（Ｂ ）グルタチオンがダイズブロトブラストにおいてＣＨＳ−ＣＡＴ−ＮＯＳおよび Ｈ４−ＣＡＴ−ＮＯＳキメラ遺伝子の発現に及ぼす作用：ＣＣ）ｍ類細胞壁エリ ジターおよびグルタチオンによる誘発の比較：　（Ｄ）ダイブおよびタバコのプ ロトプラストにおけるグルタチオン誘発性発現の経過。ＣＡＴ＝真正な細菌ＣＡ Ｔ酵素；Ｔ＝タバコ；Ｂ＝マメ：Ｓ＝ダイズ；ＳＣ＝エレクトロボレートされた 遺伝子を含まないダイズブロトブラスト；Ｇ＝グルタチオン処理３時間後のプロ トプラスト、Ｅ＝菌菌類エリジター処理３問Ｃ＝当量の未処理対照プロトプラス ト。黒地の先頭はＣＡＴ主産生産生物３セチルクロラムフェニコールを表す。

第９図．ＣＨ３−ＣＡＴ−ＮＯ６遺伝子を含むエレクトロポレート処理プロトプ ラストにおけるＣＡＴ転写体の蓄積とＣＡＴ活性の相関関係。上方パネル：対照 プロトプラスト（Ｃ）またはグルタチオン処理３時間後のもの（Ｇ）−−ＣＡＴ 配列とハイブリダイズしたｍ−からの等量の全細胞ＲＮＡのノーザーンプロット 。下方パネル：相当するプロトプラストの抽出物からのＣＡＴ活性。

第１０図．エレクトロボレートされたキメラ構造体の量の関数としての、基礎水 準の発現に対するＣＨ５−ＣＡＴ−ＮＯＳのグルタチオン誘発。

第１１図．ダイズブロトブラスト中へエレクトロボレートされたＣＨ８−ＣＡＴ −ＮＯＳ遺伝子のグルタチオン調節に５′側欠失が及ぼす影響。プラス（＋）： グルタチオン添加の３時間後：マイナス（−）二当量の未処理対照。５′側欠失 体の構造は第７Ａ図に示される。誤差バーは別個のレプリケート間の標準偏差を 示す。

参考資料 下記の参考資料は本明細書中に引用されたものである。各資料の内容をここに参 考として特に引用する。

刊行物 １、　Ａｌｔｏｎ．　Ｎ．に、　ａｎｄ　Ｖａｐｎｅｋ，　Ｄ．、　Ｎａｔｕｒ ｅ　２８２：　８６４−８６９　（１９７９）２、　　　　Ｅａｉｌｅｙ．　Ｊ ．Ａ．　　　ａｎｄ　　Ｄｅｖｅｒａｌｌ．　　Ｂ．Ｊ．、　　Ｐｏｒｒｎａｔ ｌｏｎ　　ａｎｄ　　ａｃ狽奄魔奄狽■ ｏｆ　　ｐｂａｓｅｏｌｌｉｎ　　ｉｎ　　ｔｈｅ　　１ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ 　　ｂｅｔｗｅｅｎ　　ｂｅａｎ　　ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ（Ｐｈａｓｅｏｌｕ ｓ　薗辿）　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｌｃａｌ　ｒａｃｅｓ　ｏｆＣｏｌｌ ｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ．　Ｐｈ　５ｉｏ１．　 Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌ．。

１：　４３５−４４９　（１９７１）。

３、　Ｂｉｅｌａｗｓｋｉ，　Ｗ．　ａｎｄ　Ｊｏｙ．　Ｋ．ＩＪ．、　Ｒｅｄ ｕｃｅｄ　ａｎｄ　ｏｘｉｄｌｚｅｄｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ａｎｄ　ｇｌｕ ｔａｔｈｉｏｎｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｉｎ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　Ｐｉｓ ｕｃ。

ｓａｔｉｖｕｍ．　Ｐｌａｎｔａ，　１６９：　２６７−２７２　（１９８６） 。

４、　Ｅｏｎｎｅｒ，　Ｗ．Ｍ．　ａｎｄ　Ｌａ５ｋｅｙ，　Ｒ．Ａ．、　Ａ　 ｆｉｌｍ　ｄｅｔｅｃｔｌｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｆｏｒ　ｔｒｉｔｉｕｍ−１ａｂ ｅｌｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｐ ｏｌｙ−。

ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌｓ．　Ｅｕｒ．　Ｊ．　ＢｉｏｃｈｅＩｌｌ．、 ４６：　８３−８８　（１’９７４）。

５、　Ｂｒａｄｆｏｒｄ，　Ｍ．Ｍ．、　Ａｎａｌ．　ＢｉｏｃｈｅＩｌｌ．、 ７２：　２４Ｂ−２５４　（１９７６１。

６、　Ｃａｐｌａｎ，　Ａ．、　）Ｉｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，　Ｌ． 、　Ｉｎｅｚ，　Ｄ．、　Ｖａｎ　Ｈａｕｔｅ。

Ｅ．、　Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ．　ＩＭ．、　５ｃｈｅ１１．　Ｊ．、　ａｎ ｄ　Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ，　Ｐ．。

”Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌ　１ｎ ｔｏ　Ｐｌａｎｔｓ″１ｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　＆　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ 　Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ．　Ｐ．Ｈ．　Ａｂｅｌｓｏｎ．　ｅｄ．。

Ｔｈｅ　Ａｒｎｅｒｉｃａｎ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　ｆａｔ　ｔｈｅ　Ａｄ ｖａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ。

Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，　Ｄ．Ｃ．、　１９Ｂ４　ａｔ　ｐｐ．４８０−４９３ 。

７、　　Ｃｈａｉ．　Ｈ．Ｂ．　　ａｎｄ　Ｄｏｋｅ．　Ｎ．、５ｕｐｅｒｏｘ ｉｄｅ　ａｎｉｏｎ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：　Ａｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｐ ｏｔａｔｏ　１ｅａｖｅｓ　ｔｏ　ｉＭｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　７ｉｎｆｅｓ ｔａｎｓ．　　　Ｐｈ　　ｔｏ　　ａｔｈｏｌｏ　　　、　　７７：　　６４５ −６４９　　（１９８））。

８、　Ｃｈａｐｐｅｌｌ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ，　Ｋ．、　Ｎ ａｔｕｒｅ　３１１：　７６−７８　（１９８４）９、　　　Ｃｈｅｎ．　Ｙ． 　　ａｎｄ　Ｓ＠＠ｂｕｒｇ，　Ｐ．、　ＤＮＡ．　４：　１６５−１７０　（ １９８５）。

１０、　　　Ｃｏｒｂｉｎ，　Ｄ．Ｒ．、　５ａｕｅｒ．　Ｎ．　　ａｎｄ　Ｌ ＠ｍｂ．　Ｃ．Ｊ．、　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｒｅｇ普| １ａｔ１ｏｎ　　ｏｆ　　ａ　　ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ　　 ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　　ｇｅｎｅ　　ｆａｍｉｌｙｉｎ　ｗｏｕｎｄｅｄ 　ａｎｄ　１ｎｆｅｃｔｅｄ　ｐｌａｎｔｓ．　　Ｍｏ１．　　Ｃｅ１１．　　 Ｂｉｏｌ．、　　７：４３３７−４３４４　　（１９８７）。

１１、　　　　Ｃｒａｍｅｒ，　Ｃ．Ｌ．、　　Ｂｅ１１．　　Ｊ．Ｎ．、　　 Ｒｙｄｅｒ，　　Ｔ．Ｂ．、　　Ｂａ１ｌｅｙ，　　Ｊ．ＡD。

５ｃｈｕｃｈ，Ｗ．、Ｂｏｌ＋ｖｅｌｌ，Ｇ．Ｐ．、Ｒｏｂｂｊｎｓ．Ｍ．Ｐ． 、Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．ａｎｄＬａｍｂ．Ｃ．Ｊ．、ＥＭＢＯ　Ｊ．、４：　　 ２８５−２８９　　（１９８５ｂ）。

１２、　　　Ｃｒａｅａｅｒ．Ｃ．Ｌ．、Ｒｙｄｅｒ，　　丁．Ｂ．、Ｂｅ１１ ．Ｊ．Ｎ．ａｎｄ　Ｌａｍｂ．Ｃ．Ｊ．。

Ｒａｐｉｄ　ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ　ｂｙ　ｆｕｎｇａｌｅｌｉｃｉｔｏｒ．　　５ｃｉｅｎｃｅ，２２７ ：　　１２４０−１２４３　　（１９８５ａ）。

１３、　　　Ｃｒ＠ｍｅｒ．Ｃ．Ｌ．、　Ｅｄｗａｒｄｓ，　Ｋ．、　Ｄｒｏｎ ，　Ｍ．、　Ｌｉａｎｇ，　Ｘ．、　Ｄｉｌｂｉｎｅ。

９、Ｌ．、　　Ｂｏｌｗｅｌｌ，　　Ｇ．Ｐ．、　　Ｄｉｘ’ｏｎ，　　Ｒ．Ａ ．、　　Ｌａｍｂ，　　Ｃ．Ｊ．、　　ａｎｄ　５ｃｈｕｃ■B Ｔｄ．、　　１９８９，　　Ｉｎ　Ｐｒｅｓｓ．　　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ． 　　Ｂｉｏｌ、　（１９８９）　。

１４、　　　Ｄａｎｇｌ，　Ｊ．Ｌ．、　）Ｉａｕｆｆｅ．　Ｋ．Ｄ．、　Ｌｊ ｐｐｈａｒｄｔ．　Ｓ．、　Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ，　Ｋ。

ａｎｄ　５ｃｈｅｅｌ，Ｄ．、ＥＭＢＯ　　Ｊ．、６：　　２５５１−２５５６ 　　（１９８７）。

１５、　　　Ｄａｒｖｉｌｌ．Ａ．　　ａｎｄＡｌｂｅｒｓｈｅｉｍ，Ｐ．、　 　Ａｎｎｕ．　　Ｒｅｖ．　　Ｐｌａｎｔ肋■鋭り，３５・２４３−２７５　（ １９８４）。

１６、　　　Ｄａｖｉｓ．　　Ｋ．Ｒ．、　　Ｄａｒｖｉｌｌ，　Ａ．Ｇ．　　 ａｎｄ　Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ．　Ｐ．、　Ｐｌａｎｔ　Ｍ盾戟B Ｂｉｏｌ．、６：　　２３−３２　　（１９８６）１７、　　　Ｄａｖｉｓ．に 、Ｒ．　　ａｎｄ　）Ｉａｈｌｂｒｏｃｋ．に、、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ　５ｉｏ１ ．、８５：　　１２［１６−１２９０　　（１９Ｅ＋７１。

１Ｂ．　　　Ｄｅｋｏｋ，Ｌ．Ｊ．　　ａｎｄ　０ｏｓｔｅｒｈｕｉｓ，Ｆ．Ａ ．、Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｆｒｏｓｔ　ｈａｒｄｅｎ−ｉｎｇ　ａｎｄ　５ａ ｌｉｎｉｔｙ　ｏｎ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ａｎｄ　５ｕｌｆｈｙｄｒｙｌ 　１ｅｖｅｌｓ　１ｎｓｐｉｎａｃｈ　１ｅａｖｅｓ．　　Ｐｈ　５ｉｏｌ　　 Ｐｌａｎｔ．、　　５８：　　４７−５１　　（１９８３）１９、　　　Ｄｉｘ ｏｎ．　Ｒ．Ａ．、　　Ｄｅｙ．　　Ｐ．Ｍ．　　ａｎｄ　Ｌａｍｂ．　　Ｃ． Ｊ．、　Ａｄｖ．　　Ｅｎｚ　ｍｏｌＲｅｌａｔ．　　Ａｒｅａｓ　　Ｍｏ１． 　　Ｂｉｏｌ．、５５：　　１−１３５　　（１９Ｂ３）。

２０、　　　　Ｄｉｘｏｎ．　　Ｒ．Ａ．、　　Ｂａ１ｌｅｙ．　　Ｊ．Ａ．、 　　Ｂｅ１１．　　Ｊ．Ｎ．、　　ＢＱ１ＭＧ！１１，　　f．Ｐ．。

ＣｒａＩｏｅｒ，Ｃ．Ｌ．、Ｅｄｗａｒｄｓ，に、、ｌ（ａｍｄａｎ．Ｍ．Ａ． Ｍ．Ｓ．、Ｌａｍｂ．Ｃ．Ｊ．。

Ｒｏｂｂｉｎｓ．Ｍ．Ｐ．、Ｒｙｄｅｒ，Ｔ．Ｂ．　　ａｎｄ　５ｃｈｕｃｈ， 　　組，Ｐｈ１１．　　Ｔｒａｎｓ。

Ｒ，Ｓａｃ、　　　Ｌｏｎｄｏｎ　　Ｂ、、　　３１４＋　　４１１−４２６　 　（１９８６）２１．　　　Ｄｏｕｇｌａｓ、　　Ｃ，、Ｈｏｆｆｍａｎ、　　 Ｈ，、５ｃｈｕｌｔｚ、　Ｗ、、　ａｎｄ　Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ、　Ｋ、。

５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　　ａｎｄ　　ｅｌｉｃｉｔｏｒ　　ｏｒ　　ｕ、ｖ、−Ｉ ｊｇｈｔ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ　ｔｗｏ　４− Ｃｏｕｍａｒａｔｅ：　　ＣｏＡ　ｌｉｇａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｐａｒｓ ｌｅｙ、　　ＥＭＢＯＪ、。

６（５）・　１１８９−１１９５　　（１９８７）２２、　　　Ｄｒｏｎ、Ｍ　 　、Ｃ１ａｕｓｅ、Ｓ、Ｄ、、Ｄｉｘｏｎ、Ｒ，Ａ、、Ｌａｗｔｏｎ、Ｍ、Ａ、 、ａｎｄＬａｍｂ、　　Ｃｊ、、　　Ｅｌｉｃｉｔｏｒ　　Ｒｅｇｕｌａｔｊｏ ｎ　　ｏｆ　　ａ　　Ｐｌａｎｔ　　Ｄｅｆｅｎｓｅ　　ＧｅｎｅＰｒｏｍｏｔ ｅｒ　ｉｎ　Ｅ］ｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ　ＰｒｏｔｏｐｌＡｓｔｓ、　Ｐｒ ｏｃ、’　　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　　　Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ、８５：　　６７３８−６７４２　　（１９ ８Ｂ）、（、−の報文の一部はここに実験の部■として含まれる。）２３、　　 Ｅｂｅｌ、　Ｊ、、　Ａｎｎｕ、　　Ｒｅｖ、　　肋ｆ」ａ基柱−、２４：　２ ３５−２６４　（１９８６）２４、　　　　Ｅｄｗａｒｄｓ、　　Ｋ、、　　Ｃ ｒａｍｅｒ、　　Ｃ，Ｌ、、　　Ｂｏｌｗｅｌｌ、　　Ｇ、Ｐ、、　　Ｄｉｘｏ ｎ、　　q，Ａ、。

５ｃｈｕｃｈ、　　Ｗ、　　　ａｎｄ　　Ｌａｍｂ、　Ｃ，Ｊ、、　　Ｒａｐｉ ｄ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ　　ｏｆｐｈｅｎｙ］ａｌａｎ ｉｎｅ　ａｍｍａｒ＋１ａ−２ｙａｓＰ＋ｒ＋ＲＮＡ　ｉｎ　ｅｌｉｃｉｔｏｒ −ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｅａｎ２５　　　Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ｒａｎｄ　Ｏｗｅｎ 、　Ｗ、Ｊ、、　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−５− ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ　ｏｆ　Ｚｅａ　ｌ１ｌａｙｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂ ｌｅ　ｆｏｒ　ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ｉｎ　　 ｐｌａｎｔｓ　　ａｎｄ　　５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ　　ｃｅ ｌｌｓ２７、　　　　Ｇ２Ｉｒｒｅｌｓ、　　、１．ｉ、、　　Ｔｗｏ−ｄｉｍ ｅｎｓｉｏｎａｌ　　８ｅｌ　　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ@　ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔｅｒ　　ａｎａｌｙｓｉｓ　　ｏｆ　　ｐｒｏｔｅｉ＋ｙ；　　ｓ ｙｒ＋ｔｈｅｓｉｚｅｄ　　ｂｙ　　ｃｌｏｎａｌ　　ｃｅ撃■ ｌｉｎｅｓ、　　　Ｊ　　　　Ｂｉｏｌ　　　Ｃｈｅｍ、、　　２５４：　　７ ９６ｉ−７９７７（１９７９）２Ｂ、　　Ｇｒａ’、＞、　Ｄ、、　Ｌｏｙａｌ 、　Ｒ，ａｎｄ　Ｅｂｅｌ、　Ｊ、、　Ａｒｃｈ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

巨８Ｐ！２γ含−，２４３：　５２３−５２９　（１９８５）２９、（＋ｒユＮ 、丁ミ、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、了−Ｌ、ａｎｄＺｅｎｋ、Ｈ，Ｈ，。

Ｐｈｙｔｏｃｈｅｉａｔｉｎｓ：　　Ｔｈｅ　　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　　ｈｅａ ｖｙ−ｍｅｔａｌ　　ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ　　ｏｆ　　ｈｊ ｇｈｅｒ　　ｐｌａｎｔｓ、　　　　５ｃｉｅｎｃｅ、　　　２３０：　　６７ ４−６７６　　（１９ＢT） ３０、　　　　　Ｇｕｓｔｌｎｅ、　Ｄ、Ｌ、、　　　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　　 ｏｆ　　ｍｅｄｉｅａｒｐｉｎ　　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉ刀@　ｊｎ Ｌａｄｉｎｏ　　ｃｌｏｖｅｒ　　ｃａｌｌｕｓ　　ｂｙ　　ｐ−ｃｈｌｏｒｏ ｍｅｒｃｕｒｊｂｅｎｚｏｉｃ　　ａｃｉｄ　　１ｓｒｅｖｅｒｓｅｄ　　ｂｙ 　　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、　　　Ｐｌａｎ３二り、　　８４：　　３ −６ひヱリ岳り、３０１０５−１３０　（１９７９）３２、　　　Ｈａｈｌｂｒ ｏｃｋ、に、、Ｋｎｏｂｌｏｃｈ、に、−１（、、にｒｅｕｚａｌｅｒ、Ｆ、、 Ｐｏｔｔｓ。

３３　　　　）１ｅａｒｉｃｋ、Ｓ、Ａ、、Ｂｅ１１．Ｊ、Ｎ、、Ｂｏｉｌｅｒ 、Ｔ、　　　ａｎｄ　　Ｌａｍｂ、Ｃ，Ｊ、。

り工ｙ」拘見伊計、　８６＋　１８２−１８６　（１９８８）３４、　　　）ｌ ｅｎｉｋｏｆｆ、Ｓ　　、Ｇｅｎｅ、２８：　　３５１−３５９　　（１９Ｂ４ ）。

３５、　　　）Ｉｏｒｓｃｈ、　Ｒ，、Ｂ、、　Ｐｒｙ、　Ｊ、Ｂ、、　Ｈｏｆ ｆｍａｒ＋ｎ、　Ｎ、Ｌ、、　Ｅｉｃｏｔｚ、　ｒｌ、。

Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、Ｇ、、　ａｎｄ　Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ、、　５ｃｉｅ ｎｃｅ、　２２７＋　１２２９−１２３１３６、　　　Ｌａｍｂ、　　Ｃ，ｊ、 、　　Ｂｅ１１．　　Ｊ、Ｎ、、　　Ｃｏｒｂｉｎ、　　Ｄ、Ｒ，、Ｌａ５ｖｔ ｏｎ、　　Ｍ、Ａ、、@　Ｍｅｈｄｙ。

Ｍ、Ｃ，、Ｒｙｄｅｒ、　　Ｔ、Ｅ、、　　５ａｕｅｒ、　　Ｎ、、　　ａｎｄ 　　Ｗａｌｔｅｒ、　Ｍ、Ｈ，、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆ　　ｄｅｆｅｎｓｅ 　　Ｈｅｎｅｓ　　ｊｒ＋　　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　　ｔｏ　　ｅｌｉｅｉｔｏｒ 　　ａｎｄ　　１ｎｆｅｃｔｉｏ＊ｂ Ａｒｎｔｚｅｎ　ａｎｄ　Ｃ，Ａ、　　Ｒｙａｎ）、　　ｐ、　　４９．　　Ａ ｌａｎ　Ｒ，Ｌｊｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ３７、　　　Ｌａｗｔｏｎ、Ｍ、Ａ、 、Ｄｉｘｏｎ、Ｒ，Ａ、、Ｈａｈｉｂｒｏｃｋ、に、　　ａｎｄ　Ｌａｍｂ、Ｃ ，Ｊ、。

ＴＸ’ｉ’Ｉｎ！３Ｃｆ’ｉｐｔｉＯｎａｌａｃｔｉ−ｖａｔｉｏｎｏｆｐｌａ ｎｔｄｅｆｅｎｓｅｇｅｎｅＳｂｙｆｕｎｇａｌ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ、　ｗｃ ｕｎｄｊｎｇ　ａｈｃｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、　　Ｅｕｒ、　　Ｊ。

３９、　　　　　Ｌａｗｔｏｎ、Ｍ　　八　、　　Ｋｒａｇｈ、　　Ｋ、、　　 、７ｐｎｋｉｎｓ、　　Ｓ、Ｍ、、　　Ｄｒｏｎ、　　Ｍ、A　　Ｃ１ａｕｓｅ 。

Ｓ、Ｄ、、Ｄｉｘｏｎ、Ｒ，Ａ、、ａｎｄＬａｍｂ、Ｃ，Ｊ、、Ｊ、Ｃｅｌ≦１ ．Ｂｉｏｅｈｅｎ２ｉ＋ｙｐ１．ｅｍｅｎｔ　　コづ２Ｃ，Ａｂｓｔｒａｃｔ　 　ＲＬ７０７４０、　　　Ｍａｌｂｏｎ、　　Ｃ，Ｃ，、Ｇｅｏｒｇｅ、　　Ｓ 、Ｔ、、　Ｍｏｘｈａｍ、　　Ｃ，Ｐ、、　　Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｅｕｌ≠■ ｄｌｓｕｌｆＭ（”　　ｂｒｉｄｇｅｓ：　　ａＶｅｎｕｅｓ　　ｔｏ　　１１ ’（ＩＣｅｐｔＯｒ　　ａＣｔｉＶａｔ）Ｏｎ、　　　Ｔｒ■獅モ撃■ Ｂｉｏｅｈｅｍ、　　　Ｓｃｉ、、　　１３７：　　１７２−１７５　　（１９ ８７）４１、　　　　ＭｃＭａｓｔｅｒ、　　Ｇ、に、　　　ａｎｄ　　Ｃａｒ ｍｉｃｈａｅｌ、　　Ｇ　　Ｇ、、　　Ａｎａｌｙｓｉｓ　　ｏｆ@　ｓｉｎｇ ユｅ− ａｎｄ　　ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　　ｎｕｃｌｅｉｃ　　ａｃ司ｓ　 　ｏｎ　　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　　ａｎｄａｇａｒｃ＋ｓｅ　　ｇｅ ｌｓ　　ｕｓｉｎｇ　　ｇｌｙｏｘａｌ　　ａｎｄ　　ａｃｒｉｄｉｎｅ　　ｏ ｒａｎｇｅ　　　　Ｐｒｏｃ。

４３、　　　Ｍｉｅｔｈ、　Ｈ，、５ｐｅｔｈ、　Ｖ、　　ａｎｄ　Ｅｂｅｌ、 　ｊ、、　Ｚ、　　Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ、、　４ｉｃ：コ９３−２０１　　 （１９８６） ４４、　　　Ｍｏｅｓｔａ、Ｐ、　　ａｎｄ　Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ、Ｈ，、Ｅｆ ｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｂｉｏｔｉｃ　ａｎｃｉａｂｉｏｔｉｃ　　ｅＪｉｅｉｔｏ ｒｓ　　ｏｒ＋　　ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ　　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　　ｉｎ 　　５ｏｙｂｅａｎＮａｔｕｒｅ、２８６＋　　７１０−７１１　　（１９８０ ）。

４５、　　　　　Ｎ１ｅｔｏ−５ｏｔｅｌｏ、　　Ｊ　　ａｎｄ　　Ｈｏ、　　 Ｔｈ、−Ｄ　　、　　Ｅｆｆｅｃｔ　　ｏｆ　　ｂｅｐｈｔ@　５ｈｏｃｋ　　 ｏｎ ｔｈｅ　　ｍｅｔ、ａｂｃ１３ｓ＋＋＋　　ｏｆ　　Ｈ］ｕｔａｔｈｉｏｒ＋ｅ 　　ユｎ　　ｍａｉｚｅ　　ｒｏｏｔｓ、　　　ＰｌａｎｔＰｈｖｓｊｏｌ、、 　　８２：　　１０３１−１０３５　　（１９８６）４６、　　　　　Ｎｏｒｍ ａｎ、　　Ｐ、Ｍ、、　　Ｗｉｎｇａｔｅ、　　Ｖ、Ｐ、Ｍ、、　　Ｆｉｔｔｅ ｒ、　　Ｍ、Ｓ、　　ａｎｄ　　kａｍｂ。

Ｃ，Ｊ　　、Ｐｌａｎｔａ、１６７：　　４５２−４５９　　（１９８６）４７ 、　　０＋ｖ、ＤＩＪ、、１−ｆｏｏｄ。Ｋ、Ｖ、、Ｄｅｌｕｃａ、Ｍ、、ｄｅ Ｗｅｔ、Ｊ、Ｒ，、Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ。

Ｄ、Ｄ、　　ａｎｄ　Ｈｏｗｅｌ］、Ｓ、Ｈ，，５ｃｊｅｎｃｅ、２３４：　　 ８８６−８５９　　（１９８６）４８、　　　　　Ｐｒコｃｅ、　　Ｃ，Ａ、、 　　Ａ　　ｎｅｗ　ｔｈｉｏｌ　　ｉｎ　　１ｅｌＪＬＩＩｌｌｅＳ、　　　　 ＮａｔｕｒｅA　　１８０＋　　１４８−ｉ４９ ４９、　　　　　Ｒ１？ｎｎｅｎｂａｒｇ、　　Ｈ，、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ 　　＋Ｉｌｅｔａｂｏｌｉｓｍ　　ａｎｄ　　ｐｏｓｓｉｂ撃■ ｂｉａｌｏｇｉｃａｌ　　ｒｏｌｅｓ　　ｉｎ　　ｈｉｇｈｅｒ　　ｐｌａｎｔ ｓ、　　　　＄ｘ二Ｃつ、　　２１２７７１−２７８１　　（１９Ｂ２） ５０、　　Ｒｈｏｄｅｓ、Ｃ八、　？１ｅｒｃＰ、　Ｄ八、　Ｍｅｔｔｌｅｒ、 　Ｉｊ、、　Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ。

Ｄ、、ａｎｄＤｅｔｍｅｒ、Ｊ−７，、ＧｅｎｅｔｉｃａｉｌｙＴｒａｎｓｆｏ ｒｍｅｄ？二ａｉｚｅＰｌａｎｔｓｆｒｏｍ　　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、　　 　　５ｃｉｅｎｃｅ、　　　２４０：　　２０４−２０７　　　（１９８Ｂ）Ｄ ｉｘｏｎ、　　Ｒ，Ａ、　　　ａｎｄ　　Ｌａｍｂ、　　Ｃ，Ｊ、、　　Ｅｌｉ ｃｉｔｏｒ　　ｒａｐｉｄｌｙ　　１ｎｄｕｃｅｓｃｈａｌｃｏｎｅ　　ｒｌｙ ｎｔｈａｓｅ　　ｏ＋ｌＡ　　ｉｎ　　Ｐｈａｓｅａ主ｕｓ　　ｖｄ　ｃｅｌｌ ｓ　　ａｔ　　ｔｈｅｏｎｓｅｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ　ｄ ｅｆｅｎｓｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ、　　Ｐｒｏｅ、　　Ｎａｔｌ。

Ａｅａｄ、　　　　Ｓｃｉ、　　　　ｔＪｓＡ、　　８１：　　５７２４−５７ ２８　　（コ９８４）。

５２、　　　　　Ｒｙｄｅｒ、　　Ｔ、Ｂ、、　　Ｈｅｄｒｉｃｋ、　　Ｓ、Ａ 、、　　Ｂｅ１１．　　Ｊ、Ｎ、、　　Ｌｉａｎｇ、　　Ｘ@　、　Ｃ１ｏｕｓ ｅ。

５３、　　　Ｓａｒ＋ｇｅｒ、Ｐ、、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、　　ａｎｄ　Ｃｏｕ ｌｓｅｎ、　　八、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、　　ＮａｔｌＡｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　 ＵＳＡ、’７４：　　５４６３−５４６７　　（１９’／７）。

５４、　　５ｈａｒｐ、　Ｊ、に、、　ＭｅＮｅｉｌ、　Ｍ、、　Ａｌｂｅｒｓ ｈｅｉａ＋、　Ｐ、、　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、B ２５０・　：１．１３２１−１１３３５　　（１９８４）５５、　　　Ｓｉｌｅ ｒ−Ｔｕｙｎｇ、　Ａ、　　ａｎｄ　Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ。Ｍ、Ｌ、、　Ｊ、　 　Ｍｏ１．　　Ｂｊｐｊ。

１５１：　　６０７〜６２５　　（１９８１）５６、　　　Ｓｍ１ｔｈ、　　１ ．に、、　　５ｕｌｆａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　 ｔｏｂａｃｃｏ　ｅｅｊｌ■ 菖μ匹、−即■税１．．　ｓｓ：　３０３−３０７　（１９７５）５７、　　　 Ｓｍ１ｔｈ、　　１．に、、　　Ｋｅｎｄａｌｌ、　　Ａ、Ｃ，、Ｋｅｙｓ、　 Ａ、Ｊ、、　Ｔｕｒｎｅｒ、　　Ｊ、Ｃ，ａｒ奄■ Ｌｅａ、　Ｐｊ、、　Ｔｈｅ　ｒｅＨｕ３．ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｂｒｙ　ｂｉ ｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｉｎ　１ｅａｖｅｓ　ｏ ｆ　ｂａｒｌｐｙ　（Ｈｏｒｄｅｕｍ　盟ｊ出！Ｌ、）Ｐｌａｎｔ　　Ｓｃｉ、 、　　４１：　　コ１−１７　　（１９８５）。

５８、　　　Ｓｏｍｍｓｉｃｈ、１．．５ｅｈＩ！ｌｅ、１ｚｅｒ、Ｅ、、Ｂｏ ｌｌｍａｎｎ、Ｊ、　　ａｎｄ　）Ｉａｈｌｂｒｏｃｋ。

Ｋ、、ＰｒｏＣ，Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ　　　Ｓｃｉ、　　１ｉｓＡ、８３＋ 　　２４２７−２４３０　　（１９８６）５９　　　　　ワｔｏｓｓｅ１．　　 Ｐ、、　　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　　ｂｙ　　５ｕｌｆｈｙｄｒｙｌ　　ｇｒｏ ｕｐｓ　　ｏｆ　　ｇ撃凾モ■潤mｉｎ ａｃｃｕｍｕｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　５ｏｙｂｅａｎ　ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ、　 　Ｐｌａｎｔａ、　１６０：　３ｉ４−３ｉ９６０、　　　Ｔｈｏｍａｓ、　　 Ｐ、Ａ、、　　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ＲＮ Ａ　ａｎｄ　ｓ＋ｎａＨＤmＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｔｏ　ｎ１ｔｒｏ−ｃｅｌｌｕ ｌｏｓｅ、　　Ｐｒｏｅ、　　Ｎａｔｌ、−−Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ　　　ＵＳ Ａ、１１：　　５２０１−５２０５　　（１９８０）６１、　　　Ｗａｌｋｅｒ 、Ｊ、Ｃ，、）！ｏｖａｒｄ、Ｅ、Ａ、、Ｄｅ？ｎｉｓ、Ｅ、Ｓ、　　ａｎｄ　 Ｐｅａｃｏｃｋ。

Ｗ、Ｊ、、Ｐｒｏｃ、　　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ｊｌｓ Ａ、８４：　　６６２４−６６２８６２、　　　Ｗｈｉｔａｈｅａｄ、　　１． Ｍ、、　Ｄｅｙ、　Ｐ、Ｍ、、　ａｎｄ　Ｄｉｘｏｎ、　Ｒ，Ａ、、　Ｐｌａｎ ｔａ、　　１５S： ６３、　　　Ｗｉｎｇａｔ＠、　Ｖ、Ｐ、Ｍ、、Ｌａｗｔｏｎ、　Ｍ、Ａ、　　 ａｎｄ　Ｌａａ＋ｂ、　Ｃ，Ｊ、、　Ｐｌａｎｔ巴■１立り、　ｉｎ　ｐｒｅｓ ｓ　（１９ＢＢ）。

（この参考資料の一部はここに実験の部Ｉとして示される。）特　　許 １、シンプソン、　　Ｒ，Ｂ、およびマーボッシアン、Ｌ・・　米国特許第４、 ６５８．０８２号、１９８７年４月１４日発行、　“異種ＤＮＡを含む無傷植物 の形成法”。

明細書の要約 以上の記載から当業者には、本発明が植物防御遺伝子の選択的誘発を制御する有 用な調節要素を開示することは分かるであろう。これらの要素は、環境および病 原体によるストレスに対して防御する能力が高められた植物を工学的に形成する ために用いることができる。これらの調節要素は植物自身の防御機構を予備活性 化するために使用しうる、環境に対して安全な物質を確認するためにも用いるこ とができる。初期ストレスまたは感染の前に植物の〃免疫〃状態を誘発するため にこれらの環境に対して安全な物質を用いることは、有害な殺虫薬に依存してい る現在の状態を排除するのに役立つであろう。

当業者は本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明を各種の用途お よび条件に適合させるべく変更および修正することができる。これらの変更およ び修正は適性かつ正当に以下の請求の範囲の均等範囲全体に含まれるものとする 。

浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　Ｉ ＦＩＧ、　３ 浄書（内容に変更なし） ｐＧ　ｒ、ｌ）　ｌｈｌ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　５Ａ　　　　　　　　　ＦＩＧ、　５８ＦＩＧ、５０　　　　　　　 　　ＲＧ、５Ｄ浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、９ 　　Ｇ ＃　　動！佳 浄Ｉ（内容に変側なし） 浄書（内容に変更なし） 日Ｇ、１１ −＋　　−＋−十−＋　　−＋ ｐＣＨＣｌ　　ｐＣＨＣ２ρＣＨＣ３ｐＣＨＣ４ｐＣＨＣ５補正書の翻訳文提出 書 （特許法第１８４条の７第１項） 特許庁長官　　　植　松　　　敏　　殿〕、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２１５０ ２、発明の名称 植物防御遺伝子調節要素 ３、特許出願人 住　所　　アメリカ合衆国カリフォルニア用９２０３７．　ラ・ホープ。

、ノース・トー１／イ・バインズ・ロード　１００１０名　称　　ザ・サルク・ インステチュート・フォー・バイオロジカル・住　所　　東京都千代１１区大手 町二丁目２番１号新大手町ビル　２、特許 請求の範囲 １、機能性結合した遺伝子のストレス調節された発現を指令する、実質的に純粋 な植物防御遺伝子プロモーターにおいて、該プロモーターが下記よりなる群から 選ばれるもの：フェニルプロパノイド生合成酵素であるフェニルアラニンアンモ ニア−リアーゼ（ＰＡ、Ｌ）、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）および４−クマレ ート：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）をコードする植物遺伝子のプロモーター、なら びに細胞壁のヒドロキシプロリンに富むＩＮ蛋白質をコードする植物遺伝子のプ ロモーター。

２、請求の範囲第１項に記載のプロモーター中の実質的に純粋な機能性ドメイン において、該機能性ドメインが（１）ニリンター調節されるアクチベータードメ インおよび（２）上流サイレンサードメインよりなる群から選ばれるもの。

３、下記よりなるＤＮＡ配列： ＡＣＣＡＡＴＴＡＴ丁ＧＧＴＴＡＣＴＡ＾＾ＴＴＴＡＡＣＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡ ＴＧＡＡＴＧＡＧＴＴＡＴＡ。

４、下記よりなるＤＮＡ配列。

ＣＡＣＧＴＧＡＴＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＣＴＡＣ。

５、請求の配列第３項または第４項に記載のＤ　Ｎ　Ａ配列と実質的な配列相同 性を有するＤＮＡ配列。

６、ｐｃＨｃｌおよびｐＣＩ（Ｃ２よりなる群から選ばれるキメラプラスミド。

７、下記よりなるキメラ遺伝子カセット（ＣＧＣ）　　・　（ａ）フェニルアラ ニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）、カルコンシンターゼ（ＣＨ３）および４ −フマレート　ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ、）をコードする植物遺伝子のプロモー ター、ならびに細胞壁のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺 伝子のプロモーターよりなる群から選ばれる少なくとも１種のプロモーター：該 プロモーターは（ｂ）少なくとも１種のリポータ−遺伝子；および（ｅ）少なく とも１種の３′側ターミネータ−に機能性結合している。

８、リポータ−遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ ＡＴ）およびベーターグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）よりなる群から選ばれる、請 求の範囲第７項に記載のキメラ遺伝子カセット（ＣＧＣ）。

９、下記よりなるキメラ遺伝子カセット（ＣＧＣ）：　　（ａ）フェニルアラニ ンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）、カルコンシンターゼ（ＣＨ３）および４− フマレート・ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）をコードする植物遺伝子のプロモーター 、ならびに細胞壁のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺伝子 のプロモーターよりなる群から選ばれるプロモーター：該プロモーターは　（ｂ ）植物において発現可能な少なくとも１種の構造遺伝子、および（ｃ）３＝側タ ーミネータ−に機能性結合している。

１０．３−側ターミネーターがツバリンシンターゼ（ＮＯ５）遺伝子の３゛側フ ランキング領域およびオクトビンシンターゼ（ＯＣ３）遺伝子の３′側フランキ ング領域よりなる群から選ばれる、請求の範囲第７項または第９項に記載のキメ ラ遺伝子カセット（ＣＧＣ）。

１１、植物防御遺伝子を活性化するために外的に用いられる還元型グルタチオン 。

１２、植物遺伝子の活性化法において、還元型グルタチオンにより活性化される 少なくとも１種のプロモーターに機能性結合した少なくとも１種の構造遺伝子を 含む植物材料に還元型グルタチオンを外的に施すことを含む方法。

コ３．プロモーターが、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）、カ ルコンシンターゼ（（：ＨＳ）および４−クマレー）　：　ＣｏＡリガーゼ（４ Ｃ１、）をコードする植物遺伝子のプロモーター、ならびに細胞壁のヒドロキシ プロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺伝子のプロモーターよりなる群から 選ばれる、請求の範囲第１２項に記載の方法。

１４　植物材料が請求の範囲第７項または第９項に記載のキメラ遺伝子カセット （ＣＧＣ）を含む、人間の努力により工学的に形成された植物材料。

１５、植物材料が下記の群から選ばれる、請求の範囲第１４項に記載の植物材料 。

手続補正書（方式） １．事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２１５０ 平成１年特許願第５０６４７６号 ２、発明の名称 植物防御遺伝子調節要素 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住所 名　称　　ザ・サルク・インステチュート・フォー・バイオロジカル・スタディ ーズ ４、代理人 住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　　平成　３年　７月３０日　（発送日）６、補正の対象 （１）出願人の代表音名を記載した国内書面国際調査報告 １？ｌｆｉＡｌｌｌＩＭ１＾＊ｅ−＜＋＋−１１１１Ｐｃ：１／１ｌｓ８９１０ ２ユ５０””””−””　”’−”　”　　ＰＣ：’１０５８９１０２１５０Ｐ ＣＴ／ＵＳ＋１ν／υ２１５０ ｘｔｔａｅｈｍａｎｔ　ｏｆ　　Ｆｏｒｍ　ＰＣ？／工５Ａ／２１０

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．機能性結合した遺伝子のストレス調節された発現を指令する、実質的に純粋 な植物防御遺伝子プロモーターにおいて、該プロモーターが下記よりなる群から 選ばれるもの：フェニルプロパノイド生合成酵素であるフェニルアラニンアンモ ニアーリアーゼ（ＰＡＬ）、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）および４−クマレー ト：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）をコードする植物遺伝子のプロモーター、ならび に細胞壁のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺伝子のプロモ ーター。
2. ２．請求の範囲第１項に記載のプロモーター中の実質的に純粋な機能性ドメイン において、該機能性ドメインが（１）エリシター調節されるアクチベータードメ インおよび（２）上流サイレンサードメインよりなる群から選ばれるもの。
3. ３．下記よりなるＤＮＡ配列： 【配列があります】
4. ４．下記よりなるＤＮＡ配列：： 【配列があります】
5. ５．請求の配列第３項または第４項に記載のＤＮＡ配列と実質的な配列相同性を 有するＤＮＡ配列。
6. ６．ｐＣＨＣ１およびｐＣＨＣ２よりなる群から選ばれるキメラプラスミド。
7. ７．下記よりなるキメラ遺伝子カセット（ＣＧＣ）：（ａ）フェニルアラニンア ンモニアーリアーゼ（ＰＡＬ）、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）および４−クマ レート：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、ならびに細胞壁のヒドロキシプロリンに富 む糖蛋白質をコードする植物遺伝子のプロモーターよりなる群から選ばれる少な くとも１種のプロモーター；該プロモーターは（ｂ）少なくとも１種のリポータ ー遺伝子：および（ｃ）少なくとも１種の３′側ターミネーターに機能性結合し ている。
8. ８．リポーター遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ ＡＴ）、ベーターグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−ラクタマ−ゼ（ｌａｃＺ） およびホタルのルシフェラーゼよりなる群から選ばれる、請求の範囲第７項に記 載のキメラ遺伝子カセット（ＣＧＣ）。
9. ９．下記よりなるキメラ遺伝子カセット（ＣＧＣ）：（ａ）フェニルアラニンア ンモニアーリアーゼ（ＰＡＬ）、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）および４−クマ レート：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、ならびに細胞壁のヒドロキシプロリンに富 む糖蛋白質をコードする植物遺伝子のプロモーターよりなる群から選ばれる少な くとも１種のプロモーター；該プロモーターは（ｂ）植物において発現可能な少 なくとも１種の構造遺伝子；および（ｃ）少なくとも１種の３′側ターミネータ ーに機能性結合している。
10. １０．３′側ターミネーターがノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子の３′側フ ランキング領域およびオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）遺伝子の３′側フランキ ング領域よりなる群から選ばれる、請求の範囲第７項または第９項に記載のキメ ラ遺伝子カセット（ＣＧＣ）。
11. １１．植物防御遺伝子を活性化するために外的に用いられる還元型グルタチオン 。
12. １２．植物遺伝子の活性化法において、還元型グルタチオンにより活性化される 少なくとも１種のプロモーターに機能性結合した少なくとも１種の構造遺伝子を 含む植物材料に還元型グルタチオンを外的に施すことを含む方法。
13. １３．プロモーターが、フェニルアラニンアンモニアーリアーゼ（ＰＡＬ）、カ ルコンシンターゼ（ＣＨＳ）および４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ） をコードするプロモーター、ならびに細胞壁のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白 質をコードする植物遺伝子のプロモーターよりなる群から選ばれる、請求の範囲 第１２項に記載の方法。
14. １４．植物材料が請求の範囲第７項または第９項に記載のキメラ遺伝子カセット （ＣＧＣ）を含む、人間の努力により工学的に形成された植物材料。
15. １５．植物材料が下記の群から選ばれる、請求の範囲第１４項に記載の植物材料 ：タバコ、バレイショ、ニンジン、アマ、ナス、トマト、トウガラシ、ヒマワリ 、アブラナ、コメ、トウモロコシ、およびテーダマツよりなる植物材料。