KR102107412B1

KR102107412B1 - 곤충 유래 유전자를 이용한 20-히드록시엑디손 함량이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체

Info

Publication number: KR102107412B1
Application number: KR1020180132913A
Authority: KR
Inventors: 류기중; 부경환; 천병년; 서정규; 김지원
Original assignee: 주식회사 우정바이오; 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2017-11-02
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2020-05-07
Also published as: US11326181B2; WO2019088730A3; US20200299720A1; WO2019088730A2; KR20190050296A

Abstract

본 발명은 곤충 유래 유전자를 이용한 20-히드록시엑디손 함량이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것이다.

Description

곤충 유래 유전자를 이용한 20-히드록시엑디손 함량이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing transgenic plant with increased content of 20-hydroxyecdysone using genes from insect and the plant thereof}

엑디스테로이드(ecdysteroids)는 곤충의 탈피를 조절하는 스테로이드성 호르몬으로, 1954년 처음 알려졌다. 그 후, 1966년 NaKanishi와 Koreeda에 의해 식물에서 처음으로 엑디스테로이드가 발견되었다. 엑디스테로이드는 2,3,14-트리하이드록시-△-7-케토스테로이드의 1 군으로서, 공지의 엑디스테론(ecdysterons) 또는 엑디손(ecdysones) 등을 포함하는 폴리히드록실화 스테로이드류에 속하는 화합물이다. 식물에서 이들의 작용은 완전하게 알려지지는 않았으나, 식물의 엑디스테로이드는 일부 비순응 식식성 곤충(nonadapted phytophagous insect)에 대해서 섭식 저해, 기피 및 살충 등의 효과를 보여 식물 방어기전에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

한편, 일반적으로 식물은 형질전환이 쉽고 단백질 생산을 위한 소재로서 경제적으로 저렴하기 때문에 생물약제로 사용가능한 단백질(biopharmceutical protein) 및 펩타이드(peptide)의 생산에 많은 잠재력을 가지고 있다. 현재까지 대부분의 생의약품은 전형적으로 배양된 포유류 세포, 박테리아, 곰팡이 등을 형질전환시켜 이로부터 생산되어 왔다. 그러나 이러한 포유류 세포, 박테리아, 곰팡이들에 비해 식물에서 치료 단백질을 생산하는 것은 병원균의 오염에 의한 위험의 감소 및 높은 생산 수율을 가져올 수 있으며, 종자나 다른 저장 기관에서의 생산과 같이 경제적 측면과 함께 질적인 측면에서 여러 가지 장점을 가진다. 또한, 형질전환한 곡류의 경작, 수확, 저장, 처리 또한 현재의 기반구조를 사용할 수 있으며, 비교적 적은 자본의 투자만을 필요로 하기 때문에 생의약품의 상업적인 생산에서 매우 큰 전망을 갖게 해준다.

한편, 한국등록특허 제1526190호에는 '시금치 유래의 CYP85 유전자를 이용한 20-히드록시엑디손 함량이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0469139호에는 '엑디손 유도 발현 체계를 이용한 Cdc25B2 또는 Cdc25B3을 과발현하는 형질전환 EcR-293 세포주'가 기재되어 있으나, 본 발명의 곤충 유래 유전자를 이용한 20-히드록시엑디손 함량이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 대해서는 기재된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 누에나방 유래 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone) 생합성 관련 유전자 5종, 초파리 유래 20-히드록시엑디손 생합성 관련 유전자 6종의 정보를 수집하여 식물체의 코돈에 최적화하고, 상기 곤충 유래 유전자를 담배 식물체에 도입한 결과, 야생형 담배 식물체에 비해 곤충 유래 20-히드록시엑디손 생합성 관련 유전자가 도입된 담배 식물체에서, 20-히드록시엑디손의 함량이 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 곤충 유래 SDR(short-chain dehydrogenase/reductase) 단백질과 C-14 히드록시라제(hydroxylase) 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질; C-25 히드록시라제 단백질; C-22 히드록시라제 단백질; C-2 히드록시라제 단백질; 및 C-20 히드록시라제 단백질;을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 야생형 식물에 비해 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)의 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 야생형 식물에 비해 20-히드록시엑디손의 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 곤충 유래 SDR 단백질과 C-14 히드록시라제 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질; C-25 히드록시라제 단백질; C-22 히드록시라제 단백질; C-2 히드록시라제 단백질; 및 C-20 히드록시라제 단백질;을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 20-히드록시엑디손 함량 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 곤충 유래 SDR 단백질과 C-14 히드록시라제 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질; C-25 히드록시라제 단백질; C-22 히드록시라제 단백질; C-2 히드록시라제 단백질; 및 C-20 히드록시라제 단백질;을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, 상기 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 20-히드록시엑디손 함량 증가 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 곤충 유래 SDR 단백질과 C-14 히드록시라제 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질; C-25 히드록시라제 단백질; C-22 히드록시라제 단백질; C-2 히드록시라제 단백질; 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여, 야생형 식물에 비해 내충성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 야생형 식물에 비해 내충성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 곤충 유래 SDR 단백질과 C-14 히드록시라제 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질; C-25 히드록시라제 단백질; C-22 히드록시라제 단백질; C-2 히드록시라제 단백질; 및 C-20 히드록시라제 단백질;을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 내충성 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 곤충(누에나방, 초파리) 유래 20-히드록시엑디손 생합성 관련 효소의 코딩 유전자를 식물체의 코돈에 맞춰 최적화시킨 후, 이를 식물체에 발현시켜 식물체 내 20-히드록시엑디손의 함량을 증가시켰다. 20-히드록시엑디손은 일부 해충에 대해 섭식저해, 기피 및 살충효과를 나타내는 물질이므로, 본 발명의 곤충 유래 20-히드록시엑디손 생합성 관련 유전자를 사용하여 내충성이 증가된 농산물의 개발이 가능하고, 증가된 20-히드록시엑디손을 이용하여 해충 방제 조성물을 개발할 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 본 발명의 실험 과정을 보여주는 도면이다.
도 2는 곤충의 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone, 20E) 생합성 경로 및 관련 유전자를 보여준다.
도 3은 본 발명의 곤충 유래 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 모식도이다.
도 4는 식물체에 도입된 누에나방 유래 20E 생합성 유전자의 발현 유무를 RT-PCR로 확인한 결과(A)와, 최종 생성된 20E의 함량을 분석한 결과(B)이다. WT: 야생형 담배, IS: 누에나방 유래 20E 생합성 유전자 발현유도 담배, M: 크기 마커, a: C-14 히드록시라제(hydroxylase), b: C-25 히드록시라제, c: C-22 히드록시라제, d: C-2 히드록시라제, e: C-20 히드록시라제.
도 5는 누에나방 유래 20E 생합성 유전자가 도입된 식물체의 20E 함량을 HPLC로 분석한 결과이다. 20E: 표준품, WT: 야생형 담배, IS: 누에나방 유래 20E 생합성 유전자 발현유도 담배.
도 6은 식물체에 도입된 누에나방 유래 20E 생합성 유전자 발현 시, 20E의 전구물질(7-dehydrocholesterol, 7DHC) 공급 여부에 따른 유전자 발현 수준 및 20E 함량 변화를, RT-PCR(A)과 함량 분석한 결과(B)이다. WT: 야생형 담배, WT+7DHC: 전구물질을 공급한 야생형 담배, IS: 누에나방 유래 20E 생합성 유전자 발현유도 담배, IS+7DHC: 누에나방 유래 20E 생합성 유전자 발현유도 및 전구물질 공급 담배.
도 7은 누에나방 유래 20E 생합성 유전자가 도입된 식물체에 20E의 전구물질(7DHC)을 공급한 경우에 20E 함량을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 8은 식물체에 도입된 초파리 20E 생합성 유전자의 발현 유무를 RT-PCR로 확인한 결과(A)와, 최종 생성된 20E의 함량을 분석한 결과(B)이다. WT: 야생형 담배, IS: 초파리 유래 20E 생합성 유전자 발현유도 담배, M: 크기 마커, SDR: short-chain dehydrogenase/reductase, a: C-14 히드록시라제, b: C-25 히드록시라제, c: C-22 히드록시라제, d: C-2 히드록시라제, e: C-20 히드록시라제.
도 9는 초파리 유래 20E 생합성 유전자가 도입된 식물체의 20E 함량을 HPLC로 분석한 결과이다. 20E: 표준품, WT: 야생형 담배, IS: 초파리 유래 20E 생합성 유전자 발현유도 담배.
도 10은 식물체에 도입된 초파리 유래 20E 생합성 유전자 발현 시, 20E의 전구물질(7DHC) 공급 여부에 따른 유전자 발현 수준 및 20E 함량 변화를, RT-PCR(A)과 함량 분석한 결과(B)이다. WT: 야생형 담배, WT+7DHC: 전구물질 공급한 야생형 담배, IS: 초파리 유래 20E 생합성 유전자 발현유도 담배, IS+7DHC: 초파리 유래 20E 생합성 유전자 발현유도 및 전구물질 공급 담배.
도 11은 초파리 유래 20E 생합성 유전자가 도입된 식물체에 20E의 전구물질(7DHC)을 공급한 경우에 20E 함량을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 12는 최종 생성된 20E 화합물을 UPLC-MS/MS로 검증한 결과이다. 20E standard: 20E 표준품, tobacco leaf extract: 곤충 유래 20E 생합성 유전자 발현유도 담배 잎 추출물.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

곤충 유래 SDR(short-chain dehydrogenase/reductase) 단백질과 C-14 히드록시라제(hydroxylase) 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질; C-25 히드록시라제 단백질; C-22 히드록시라제 단백질; C-2 히드록시라제 단백질; 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형 식물에 비해 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)의 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 SDR, C-14 히드록시라제, C-25 히드록시라제, C-22 히드록시라제, C-2 히드록시라제 및 C-20 히드록시라제 효소는, 7-디히드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol)을 시작물질로 하여 20-히드록시엑디손을 생합성하는데 관련된 효소들이다(도 2 참고).

본 발명에 따른 상기 20-히드록시엑디손 생합성 관련 효소들은, 누에나방(Bombyx mori), 초파리(Drosophila melanogaster), 박각시나방(Manduca sexta), 배추좀나방(Plutella xylostella), 집파리(Musca domestica), 붉은밀가루 갑충(Tribolium castaneum), 아노펠레스 감비애(Anopheles gambiae), 이집트숲모기(Aedes aegypti), 열대집모기(Cluex quinquefasciatus), 벌(Apis mellifera), 또는 진딧물(Acyrthosiphon pisum) 등의 곤충 유래 효소일 수 있고, 바람직하게는 누에나방 또는 초파리 유래의 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 SDR(short-chain dehydrogenase/reductase) 또는 C-14 히드록시라제(hydroxylase)는 20-히드록시엑디손 생합성 경로 중, 7-디히드로콜레스테롤에서 케토디올(ketodiol; 2-, 22-, 25-trideoxyecdysone)로의 전환 단계에 관여하는 효소로, SDR, C-14 히드록시라제 각각, 또는 SDR 및 C-14 히드록시라제가 함께 전환 단계에 작용할 수도 있다.

본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 SDR, C-25 히드록시라제, C-22 히드록시라제, C-2 히드록시라제 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하거나; C-14 히드록시라제, C-25 히드록시라제, C-22 히드록시라제, C-2 히드록시라제 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하거나; 또는 SDR, C-14 히드록시라제, C-25 히드록시라제, C-22 히드록시라제, C-2 히드록시라제 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 상기 SDR 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고; C-14 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고; C-25 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고; C-22 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4 또는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고; C-2 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5 또는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고; C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 SDR, C-14 히드록시라제, C-25 히드록시라제, C-22 히드록시라제, C-2 히드록시라제 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 7; 서열번호 2 또는 서열번호 8; 서열번호 3 또는 서열번호 9; 서열번호 4 또는 서열번호 10; 서열번호 5 또는 서열번호 11; 및 서열번호 6 또는 서열번호 12;의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 서열번호 1 내지 6의 염기서열은 누에나방 유래의 유전자이며, 서열번호 7 내지 12는 초파리 유래의 유전자로, 상기 서열번호 1 내지 12의 염기서열은 식물체의 코돈에 최적화된 염기서열로, 상기 식물체는 옥수수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 SDR, C-14 히드록시라제, C-25 히드록시라제, C-22 히드록시라제, C-2 히드록시라제 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

본 발명의 재조합 벡터는, 곤충 유래 SDR, C-14 히드록시라제, C-25 히드록시라제, C-22 히드록시라제, C-2 히드록시라제 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자를 각각 포함하는 재조합 벡터 또는, 상기 유전자 모두를 포함하는 하나의 재조합 벡터일 수 있고, 바람직하게는 상기 유전자 각각을 포함하는 재조합 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, SDR, C-14 히드록시라제, C-25 히드록시라제, C-22 히드록시라제, C-2 히드록시라제 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-DNA 영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "지속적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 지속적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 지속적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.

본 발명의 20-히드록시엑디손의 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된, 야생형 식물에 비해 20-히드록시엑디손의 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 상기 식물체의 형질전환된 종자를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체는 담배, 애기장대, 감자, 가지, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 담배일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 또는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 곤충 유래 SDR(short-chain dehydrogenase/reductase) 유전자와 서열번호 2 또는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 C-14 히드록시라제(hydroxylase) 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자; 서열번호 3 또는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 C-25 히드록시라제 유전자; 서열번호 4 또는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 C-22 히드록시라제 유전자; 서열번호 5 또는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 C-2 히드록시라제 유전자; 및 서열번호 6 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 C-20 히드록시라제 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone) 함량 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 곤충 유래 SDR 유전자와 C-14 히드록시라제 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자; C-25 히드록시라제 유전자; C-22 히드록시라제 유전자; C-2 히드록시라제 유전자; 및 C-20 히드록시라제 유전자를 함유하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 20-히드록시엑디손 함량을 증가시킬 수 있는 것이다.

본 발명은 또한, 곤충 유래 SDR(short-chain dehydrogenase/reductase) 단백질과 C-14 히드록시라제(hydroxylase) 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질; C-25 히드록시라제 단백질; C-22 히드록시라제 단백질; C-2 히드록시라제 단백질; 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, 상기 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone) 함량 증가 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 SDR, C-14 히드록시라제, C-25 히드록시라제, C-22 히드록시라제, C-2 히드록시라제 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열의 범위는 전술한 것과 같다.

본 발명은 또한,

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 야생형 식물에 비해 내충성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

용어 '내충성'이란 식물이 충해(蟲害)에 대하여 나타내는 저항성과 내성을 포함하는 것으로, 기생식물에 대한 해충의 선호성 저지, 해충에 대한 기주의 생육저해성, 강한 보상력이나 회복력에 의하여 충해의 영향을 받지 않는 내성 등을 포함한다.

본 발명의 곤충 유래 SDR 단백질과 C-14 히드록시라제 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질; C-25 히드록시라제 단백질; C-22 히드록시라제 단백질; C-2 히드록시라제 단백질; 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체는 20-히드록시엑디손의 함량이 증가하게 되는데, 20-히드록시엑디손은 일부 해충에 대해서 섭식저해, 기피 및 살충 활성을 나타내는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체는 증가된 20-히드록시엑디손의 영향으로 내충성이 증가될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된, 야생형 식물에 비해 내충성이 증가된 형질전환 식물체 및 상기 식물체의 형질전환된 종자를 제공한다.

본 발명의 상기 식물체는 전술한 바와 같다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 또는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 곤충 유래 SDR(short-chain dehydrogenase/reductase) 유전자와 서열번호 2 또는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 C-14 히드록시라제(hydroxylase) 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자; 서열번호 3 또는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 C-25 히드록시라제 유전자; 서열번호 4 또는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 C-22 히드록시라제 유전자; 서열번호 5 또는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 C-2 히드록시라제 유전자; 및 서열번호 6 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 C-20 히드록시라제 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 내충성 증가용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 곤충 20-히드록시엑디손 생합성 유전자

곤충의 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone, 이하 20E) 생합성 유전자는, KEGG(http://www.kegg.jp/)의 곤충 20E 생합성 경로를 기반으로 누에나방(Bombyx mori) 및 초파리(Drosophila melanogaster) 유전자 6종의 정보를 수집하였다(도 2). 상기 6종의 유전자는 SDR(short-chain dehydrogenase/reductase), C-14 히드록시라제(hydroxylase), C-25 히드록시라제, C-22 히드록시라제, C-2 히드록시라제 및 C-20 히드록시라제로, SDR을 제외한 5종은 모두 시토크롬 P450 패밀리에 속하는 유전자들이다.

상기 곤충 20E 생합성 관련 누에나방 또는 초파리 유래 유전자 6종의 염기서열을 식물에서 발현이 용이하도록 옥수수의 코돈사용빈도(codon usage)를 기반으로 코돈 최적화 하였다. 코돈 최적화한 염기서열을 기반으로 6종의 유전자를 합성하였다.

2. 식물발현벡터 제작 및 아그로박테리움 형질전환

합성한 유전자 6종 중 누에나방 유래 5종(C-14 히드록시라제, C-25 히드록시라제, C-22 히드록시라제, C-2 히드록시라제 및 C-20 히드록시라제) 및 초파리 유래 6종(SDR, C-14 히드록시라제, C-25 히드록시라제, C-22 히드록시라제, C-2 히드록시라제 및 C-20 히드록시라제) 각각을 식물발현벡터(pB7WG2D)에 게이트웨이 시스템을 이용하여 삽입하였다. 상기 각 유전자의 발현은 35S 프로모터에 의해 조절되도록 하였고, 선발마커로 제초제 저항성 유전자 bar를 사용하였다(도 3). 제작한 식물발현벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV2260에 형질전환 하였다.

3. 식물에서 곤충 20E 생합성 유전자의 일시적 발현 유도

형질전환된 아그로박테리움을 100㎍/㎖ 리팜피신(rifampicin) 및 50㎍/㎖ 스펙티노마이신(spectinomycin)을 함유하고 있는 5㎖ LB 액체배지에 접종하여 28℃에서 200rpm의 교반속도로 하룻밤 동안 현탁배양하였다. 현탁배양액 1㎖을 100㎍/㎖ 리팜피신, 50㎍/㎖ 스펙티노마이신 및 200μM 아세토시린곤(acetosyringone)을 함유한 25㎖ LB 액체배지에 재접종하여 28℃에서 200rpm으로 현탁배양하여 OD₆₀₀이 1.0 수준이 될 때까지 배양하였다. 배양액의 OD₆₀₀ 값을 측정한 다음 3,000rpm으로 10분간 원심분리한 후, 상등액을 제거한 후 세포 펠렛을 10mM MES 버퍼(10mM MgCl₂, 10mM MES (pH 5.5))로 현탁하였다. 현탁액을 3,000rpm으로 10분간 재원심분리한 후 상등액을 제거하고, 세포 펠렛을 10mM MES 버퍼로 재현탁하여 최종 OD₆₀₀ 값이 3.0이 되도록한 후, 아세토시린곤을 최종 농도가 200μM이 되도록 첨가한 후 상온에서 하룻밤 동안 정치하였다.

각각의 아그로박테리움 용액을 동량 첨가하여 혼합한 후 아그로인필트레이션(agroinfiltration)을 수행하였다. 간단하게, 1㎖ 주사기(주사바늘 제거)에 아그로박테리움 용액을 채운 후 담배(Nicotiana benthamiana)의 잎 뒷면에 주입하는 방식으로 수행하였다. 아그로인필트레이션한 담배는 27℃에서 7일간 생육한 후 아그로인필트레이션을 수행한 잎만 수확하여 분석에 사용하였다.

4. 유전자 발현 및 20-히드록시엑디손(20E) 생합성 분석

도입된 곤충 20E 생합성 유전자의 발현 유무는 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)로 확인하였다. RT-PCR은 아그로인필트레이션한 담배 잎에서 추출한 총 RNA 100ng을 주형으로 하고, 도입된 20E 생합성 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 수행하였다(표 1). RT-PCR의 조건은 하기와 같다: 50℃, 30분 → 95℃, 5분 → [95℃, 30초 → 55℃, 30초 → 72℃, 1분 30초](30 회) → 72℃, 10분.

RT-PCR 프라이머 정보

유전자명		염기서열(5'→ 3') (서열번호)
누에나방 C-14 히드록시다제	F	CACCATGAGTTCGCTCATCATTGTG (서열번호 13)
누에나방 C-14 히드록시다제	R	TCACTTCCGAGGTATCAAATGCATC (서열번호 14)
누에나방 C-25 히드록시라제	F	CACCATGGACCTTTATTTTATTTGGCTG (서열번호 15)
누에나방 C-25 히드록시라제	R	TCAAATTGGCTCGCAGTAGTACTTC (서열번호 16)
누에나방 C-22 히드록시라제	F	CACCATGTTCGTTAGGCTCACCGTT (서열번호 17)
누에나방 C-22 히드록시라제	R	TCAGGAACTTCTTGGGATGAAGTTG (서열번호 18)
누에나방 C-2 히드록시라제	F	CACCATGCATCGCTTCCCGTCTATGTC (서열번호 19)
누에나방 C-2 히드록시라제	R	TCACTTAGAAATGCTGCGCGGTAG (서열번호 20)
누에나방 C-20 히드록시라제	F	CACCATGTCTCTCCCGGGAGTTTTCC (서열번호 21)
누에나방 C-20 히드록시라제	R	TCACCACTCGACAAGACGCAAGG (서열번호 22)
초파리 SDR	F	CACCATGAGCGGCAGTCAACTTCTC (서열번호 23)
초파리 SDR	R	TCAAATCTTCTCCTGTCTATTCG (서열번호 24)
초파리 C-14 히드록시다제	F	CACCATGCTGGCTGCTCTGATCTAC (서열번호 25)
초파리 C-14 히드록시다제	R	TCATAGTGGTCCGATCTTCTC (서열번호 26)
초파리 C-25 히드록시다제	F	CACCATGTCAGCGGACATAGTCGA (서열번호 27)
초파리 C-25 히드록시다제	R	TCAGTCCTGAACCACAGCTCC (서열번호 28)
초파리 C-22 히드록시다제	F	CACCATGTTGACCAAGCTGCTAAAG (서열번호 29)
초파리 C-22 히드록시다제	R	TCACTCGCGACGGAGGCGCAG (서열번호 30)
초파리 C-2 히드록시다제	F	CACCATGACCGAGAAGAGGGAGAG (서열번호 31)
초파리 C-2 히드록시다제	R	TCACTCTGTCCGTGGCCGGAG (서열번호 32)
초파리 C-20 히드록시다제	F	CACCATGGCCGTGATACTGTTGCTC (서열번호 33)
초파리 C-20 히드록시다제	R	TCAGAAAACGCGATCGCTGAG (서열번호 34)

또한, 20E 생합성 여부는 HPLC(high performance liquid chromatography)로 분석하여 20E 함량을 확인하였다. HPLC 분석을 위해 아그로인필트레이션한 담배 잎의 메탄올 추출물을 제작하였고, 헥산 상분배(phase partition)를 통해 지질성분을 제거한 후 분석에 사용하였다. 간단하게, 수확한 담배 잎 시료를 마쇄하고, 마쇄한 시료 100㎎에 메탄올 1㎖을 첨가하여 혼합한 후 55℃에서 1시간동안 정치시키고, 5,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액만 옮겼다. 상기 추출 과정을 3회 반복하여 취합한 메탄올 추출액에 증류수 0.75㎖을 첨가하고, 헥산을 4㎖ 가하여 상분리를 유도하고, 메탄올 상층액만들을 분리하였다. 분리된 메탄올 층이 완전히 마를 때까지 55℃에서 건조시킨 후, 메탄올을 최초 시료량 기준 일정량을 첨가하여 용해시키고, 용해액을 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액만을 취하여 분석에 사용하였다.

20E 함량분석을 위한 HPLC 분석 조건은 하기 표 2와 같으며, 검출된 20E 화합물의 검증은 UPLC-MS/MS(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry)로 분석하였고, UPLC-MS/MS 분석 조건은 하기 표 3과 같다.

20E 함량 분석을 위한 HPLC 조건

파라미터	조건
기기	Shimadzu HPLC system - DGU-20A - LC-20AD - SIL-20A - CTO-20A - SPD-M20A - CBM-20A
컬럼	Shim-pack GIS ODS column (250 x 4.6 mm ID, 5㎛)
이동상	11% Isopropanol + 0.1% TFA
유속	1 ㎖/분
검출 파장	242 nm
스캔 파장	190~800 nm
주입량	20 ㎕
컬럼 온도	40℃
실행 시간	60분

20E 화합물 검증을 위한 UPLC-MS/MS 조건

파라미터	조건
기기	UHPLC-MS/MS system - Agilent 1290 Infinity UHPLC - AB Sciex QTrap 6500 MS/MS
컬럼	SeQuant ZIC-cHILIC (100 x 2.1 mm ID, 3㎛, 100Å)
이동상	A: MeOH (5 mM ammoniumacetate, 0.1% formic acid) B: Water (5 mM ammoniumacetate, 0.1% formic acid) * A : B = 85 : 15
유속	130 ㎕/분
주입량	5 ㎕
실행 시간	5분

실시예 1. 식물체에 도입된 곤충 유래 20E 생합성 관련 유전자의 발현 분석

누에나방 유래 20E 생합성 유전자 5종(C-14 히드록시라제, C-25 히드록시라제, C-22 히드록시라제, C-2 히드록시라제 및 C-20 히드록시라제) 또는 초파리 유래 20E 생합성 유전자 6종(SDR, C-14 히드록시라제, C-25 히드록시라제, C-22 히드록시라제, C-2 히드록시라제 및 C-20 히드록시라제)을 각각 포함하는 식물발현벡터로 형질도입된 아그로박테리움을 이용하여 아그로인필트레이션한 담배 잎에서 상기 각 유전자의 발현 유무를 RT-PCR로 확인하였다. 그 결과, 아그로인필트레이션에 의해 누에나방 유래 유전자의 발현이 유도된 담배 잎 시료에서는 20E 생합성 관련 유전자 5종 모두가 발현되고 있었고(도 4A), 초파리 유래 유전자의 발현이 유도된 담배 잎 시료에서도 20E 생합성 관련 유전자 6종 모두가 발현되고 있음을 확인할 수 있었다(도 8A).

또한, 야생형 담배 잎과 곤충 유래 유전자의 발현을 유도한 담배 잎에서 20E의 함량을 분석한 결과, 야생형(WT)에 비해 누에나방 또는 초파리 유래 유전자의 발현을 유도한 담배(IS)에서 20E의 함량이 각각 약 7배 또는 4.5배 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 4B 및 도 8B).

실시예 2. 곤충 유래 20E 생합성 전구물질 공급 여부에 따른 20E 함량 변화 분석

20E의 함량을 증진시키기 위해서 일반적으로 전구물질을 공급하는 방법이 알려져 있다. 이에 본 발명의 곤충 유래 20E 생합성 관련 유전자의 발현을 유도한 담배 잎에 20E 생합성의 전구물질(7-dehydrocholesterol, 7DHC)을 공급하고, 이에 따른 20E 함량의 변화를 분석하였다. 상기 7DHC는 곤충 유래 유전자의 발현을 유도한 후 2일이 경과한 담배 잎에 7DHC를 60ppm의 농도로 함유한 10mM MES 버퍼 용액을 아그로인필트레이션과 동일한 방법으로 인필트레이션하여 공급하였다.

그 결과, 누에나방 또는 초파리 유래 20E 생합성 관련 유전자만을 발현시켰을 때(IS) 20E의 함량은 대조구(WT)에 비해 각각 약 3배 및 9배 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 곤충 유래 20E 생합성 관련 유전자 발현 시 전구물질인 7DHC를 공급한 경우에는(IS + 7DHC) 20E의 함량이 전구물질 미공급의 경우(IS)에 비해 조금 더 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 6B 및 도 10B). 이 결과는 증가된 20E의 함량은 곤충 유래 20E 생합성 관련 유전자 발현에 따른 것임을 의미하였다.

실시예 3. 20E의 함량 분석 및 20E 화합물의 검증

누에나방 또는 초파리 유래 20E 생합성 유전자 5종 또는 6종의 발현을 유도한 담배 잎 추출물에서 20E의 함량 및 화합물 검증을 HPLC와 UPLC-MS/MS를 통해 확인하였다.

HPLC 결과, 누에나방 유래 유전자(도 5 및 도 7) 또는 초파리 유래 유전자(도 9 및 도 11)의 발현을 유도한 담배 잎 시료에서 20E의 표준품의 머무름 시간(retension time)과 유사한 시간대에 피크를 확인할 수 있었다.

UPLC-MS/MS 결과, 표준품 20E의 분자량은 480 Da이며, 이 분자를 단편화하면 444, 370, 164 Da의 단편들이 형성되는 것을 확인할 수 있었는데, 담배 추출물의 20E 유사피크도 동일한 단편화(fragmentation) 패턴을 보이는 것으로 보아 20E로 판단되었다(도 12).

<110> WOOJUNG BIO, Inc. Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for producing transgenic plant with increased content of 20-hydroxyecdysone using genes from insect and the plant thereof <130> PN18445 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 921 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bombyx mori_SDR <400> 1 atgtccgtct cacgcctggt cgctgtgacc gggtgcgata gtggacttgg ctgggcggtc 60 gcagcccgac tggcccgcga aggtttcatc accatcgccg gtatgcacaa aggaatagag 120 accgaagcag ccaaagccct cgagaaactc tgcgcacaca cgttccccct cgacgtgact 180 cgtgtggaga gcgttcagga attccggaag tacgtgctta ccgtcttgaa ggataaccct 240 aagtacaaat tccacgccgt ggtcaacaac gctggagtca tgacagttgg aaagtacgag 300 tggatgacag cctcgatgat tgagagcccg gtacatgtga atctcctcgg cgcgatgaga 360 gtcatctccg cgtttcttcc agagatccgg aagacggcaa tcgagactac aagcaaacct 420 aagcccagga tcatcaacgt cggttcgcat tgcggcctgc agcctttgcc cgccttcgct 480 gcatacagtg cgtcaaaagc tggccttctc gcgttgacaa ggtgtctaca tcttgagcac 540 agcgagcacg ggctggcggt gattgccttc 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cagcgttttc ccgcaacgga actaccgcct gccgtcgccg ctaaatacgt gcctatccct 180 agggtgaagg gactgcccgt agttgggaca cttgtggatc ttatagcagc cggcggagcc 240 actcaccttc ataagtacat cgacgcgagg cacaagcagt atggcccaat tttccgcgag 300 cgtctcggcg gcacccaaga tgcagtcttc gtttcgagcg caaatctcat gcgcggagtc 360 ttccaacacg aggggcagta tccgcagcac ccgttgccgg atgcctggac gctgtataac 420 cagcaacatg cttgccaaag gggactgttc ttcatggagg gcgcggagtg gctgcataac 480 agacgcatac tcaatagact gctgctcaac gggaatctga attggatgga tgtgcacatt 540 gagagctgta ccagaaggat ggtggatcag tggaaaagac gcactgcgga ggcggctgcg 600 attcccctag cggagtctgg tgagatccga agttacgaac tgcccctgct cgaacaacag 660 ctctaccgtt ggtctataga agttctgtgc tgcatcatgt ttggcacttc agtgctcacc 720 tgcccaaaga tccagtcctc gctcgactac ttcacgcaga ttgttcacaa ggtgttcgag 780 cattcgtcca ggctaatgac attcccccct cgcttggccc agattttgcg cttacccatc 840 tggcgggatt tcgaagccaa cgttgatgag gtgctcaggg aaggagccgc cattatcgat 900 cattgtatca gagtgcagga ggaccaaagg agaccacatg acgaggcgct ttaccatcgc 960 ctccaagcgg ccgacgtccc aggcgatatg atcaagcgca tattcgtcga cttggtcatt 1020 gctgcaggtg acacgaccgc attcagcagt cagtgggctt tgtttgccct ttcaaaagaa 1080 ccgaggttac agcaacgcct cgctaaggag agagctacaa acgattctcg cttgatgcat 1140 ggcctgatca aggaatccct gcgactgtac cccgtagctc cctttattgg gcggtatctt 1200 cctcaggatg ctcaacttgg cggtcacttt atcgaaaagg ataccatggt cctattatcc 1260 ttgtacactg caggtcgcga tccatcacac tttgagcaac cggaacgtgt gctcccggag 1320 cgctggtgca tcggtgagac agaacaggtg cacaaatcac acggcagtct gcctttcgcc 1380 atcgggcagc ggtcttgcat aggtcgccgt gttgcactca agcagctgca ctccttgctt 1440 ggccgatgtg ctgctcagtt tgagatgagc tgccttaacg agatgcctgt tgatagcgta 1500 ctcaggatgg tcaccgtgcc agatcggact ttgaggttag ccctccggcc acggacagag 1560 tga 1563 <210> 12 <211> 1563 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Drosophila melanogaster_C-20 hydroxylase <400> 12 atgaccgaga agagggagag gccgggcccg cttcgctggc tgagacacct gctcgaccaa 60 ctcctggtcc gaatccttag cctatccctc ttcaggtcgc gctgcgaccc gcctccactt 120 cagcgttttc ccgcaacgga actaccgcct gccgtcgccg ctaaatacgt gcctatccct 180 agggtgaagg gactgcccgt agttgggaca cttgtggatc ttatagcagc cggcggagcc 240 actcaccttc ataagtacat cgacgcgagg cacaagcagt atggcccaat tttccgcgag 300 cgtctcggcg gcacccaaga tgcagtcttc gtttcgagcg caaatctcat gcgcggagtc 360 ttccaacacg aggggcagta tccgcagcac ccgttgccgg atgcctggac gctgtataac 420 cagcaacatg cttgccaaag gggactgttc ttcatggagg gcgcggagtg gctgcataac 480 agacgcatac tcaatagact gctgctcaac gggaatctga attggatgga tgtgcacatt 540 gagagctgta ccagaaggat ggtggatcag tggaaaagac gcactgcgga ggcggctgcg 600 attcccctag cggagtctgg tgagatccga agttacgaac tgcccctgct cgaacaacag 660 ctctaccgtt ggtctataga agttctgtgc tgcatcatgt ttggcacttc agtgctcacc 720 tgcccaaaga tccagtcctc gctcgactac ttcacgcaga ttgttcacaa ggtgttcgag 780 cattcgtcca ggctaatgac attcccccct cgcttggccc agattttgcg cttacccatc 840 tggcgggatt tcgaagccaa cgttgatgag gtgctcaggg aaggagccgc cattatcgat 900 cattgtatca gagtgcagga ggaccaaagg agaccacatg acgaggcgct ttaccatcgc 960 ctccaagcgg ccgacgtccc aggcgatatg atcaagcgca tattcgtcga cttggtcatt 1020 gctgcaggtg acacgaccgc attcagcagt cagtgggctt tgtttgccct ttcaaaagaa 1080 ccgaggttac agcaacgcct cgctaaggag agagctacaa acgattctcg cttgatgcat 1140 ggcctgatca aggaatccct gcgactgtac cccgtagctc cctttattgg gcggtatctt 1200 cctcaggatg ctcaacttgg cggtcacttt atcgaaaagg ataccatggt cctattatcc 1260 ttgtacactg caggtcgcga tccatcacac tttgagcaac cggaacgtgt gctcccggag 1320 cgctggtgca tcggtgagac agaacaggtg cacaaatcac acggcagtct gcctttcgcc 1380 atcgggcagc ggtcttgcat aggtcgccgt gttgcactca agcagctgca ctccttgctt 1440 ggccgatgtg ctgctcagtt tgagatgagc tgccttaacg agatgcctgt tgatagcgta 1500 ctcaggatgg tcaccgtgcc agatcggact ttgaggttag ccctccggcc acggacagag 1560 tga 1563 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 caccatgagt tcgctcatca ttgtg 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tcacttccga ggtatcaaat gcatc 25 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 caccatggac ctttatttta tttggctg 28 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tcaaattggc tcgcagtagt acttc 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 caccatgttc gttaggctca ccgtt 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tcaggaactt cttgggatga agttg 25 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 caccatgcat cgcttcccgt ctatgtc 27 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tcacttagaa atgctgcgcg gtag 24 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 caccatgtct ctcccgggag ttttcc 26 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tcaccactcg acaagacgca agg 23 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 caccatgagc ggcagtcaac ttctc 25 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tcaaatcttc tcctgtctat tcg 23 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 caccatgctg gctgctctga tctac 25 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tcatagtggt ccgatcttct c 21 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 caccatgtca gcggacatag tcga 24 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tcagtcctga accacagctc c 21 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 caccatgttg accaagctgc taaag 25 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tcactcgcga cggaggcgca g 21 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 caccatgacc gagaagaggg agag 24 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 tcactctgtc cgtggccgga g 21 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 caccatggcc gtgatactgt tgctc 25 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 tcagaaaacg cgatcgctga g 21

Claims

곤충 유래 SDR(short-chain dehydrogenase/reductase) 단백질과 C-14 히드록시라제(hydroxylase) 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질; C-25 히드록시라제 단백질; C-22 히드록시라제 단백질; C-2 히드록시라제 단백질; 및 C-20 히드록시라제 단백질 ; 을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형 식물에 비해 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)의 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법으로서,
상기 SDR 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 7의 염기서열; C-14 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 8의 염기서열; C-25 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 9의 염기서열; C-22 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4 또는 서열번호 10의 염기서열; C-2 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5 또는 서열번호 11의 염기서열; 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 20-히드록시엑디손의 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
삭제
제1항의 방법에 의해 제조된, 야생형 식물에 비해 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)의 함량이 증가된 형질전환 식물체.
제3항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 1 또는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 곤충 유래 SDR(short-chain dehydrogenase/reductase) 유전자와 서열번호 2 또는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 C-14 히드록시라제(hydroxylase) 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자; 서열번호 3 또는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 C-25 히드록시라제 유전자; 서열번호 4 또는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 C-22 히드록시라제 유전자; 서열번호 5 또는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 C-2 히드록시라제 유전자; 및 서열번호 6 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 C-20 히드록시라제 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone) 함량 증진용 조성물.
곤충 유래 SDR(short-chain dehydrogenase/reductase) 단백질과 C-14 히드록시라제(hydroxylase) 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질; C-25 히드록시라제 단백질; C-22 히드록시라제 단백질; C-2 히드록시라제 단백질; 및 C-20 히드록시라제 단백질 ; 을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜, SDR와 C-14 히드록시라제 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질; C-25 히드록시라제 단백질; C-22 히드록시라제 단백질; C-2 히드록시라제 단백질; 및 C-20 히드록시라제 단백질을 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone) 함량을 증가시키는 방법으로서,
상기 SDR 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 7의 염기서열; C-14 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 8의 염기서열; C-25 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 9의 염기서열; C-22 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4 또는 서열번호 10의 염기서열; C-2 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5 또는 서열번호 11의 염기서열; 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 식물체의 20-히드록시엑디손의 함량을 증가시키는 방법.
곤충 유래 SDR(short-chain dehydrogenase/reductase) 단백질과 C-14 히드록시라제(hydroxylase) 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질; C-25 히드록시라제 단백질; C-22 히드록시라제 단백질; C-2 히드록시라제 단백질; 및 C-20 히드록시라제 단백질 ; 을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 야생형 식물에 비해 내충성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법으로서,
상기 SDR 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 7의 염기서열; C-14 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 8의 염기서열; C-25 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 9의 염기서열; C-22 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4 또는 서열번호 10의 염기서열; C-2 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5 또는 서열번호 11의 염기서열; 및 C-20 히드록시라제 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 야생형에 비해 내충성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제7항의 방법에 의해 제조된 야생형 식물에 비해 내충성이 증가된 형질전환 식물체.
제8항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 1 또는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 곤충 유래 SDR(short-chain dehydrogenase/reductase) 유전자와 서열번호 2 또는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 C-14 히드록시라제(hydroxylase) 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자; 서열번호 3 또는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 C-25 히드록시라제 유전자; 서열번호 4 또는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 C-22 히드록시라제 유전자; 서열번호 5 또는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 C-2 히드록시라제 유전자; 및 서열번호 6 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 C-20 히드록시라제 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 내충성 증가용 조성물.