KR20130012403A - 식물체 발아 또는 생장 조절 ａ２０ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물체 종자의 발아 또는 생장 조절 단백질, 이를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 및 식물체 종자의 발아 또는 생장 조절 단백질의 세포내 수준을 조절하여 식물체 종자의 발아 또는 생장을 조절하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 벼를 포함하는 식물체 종자의 발아 또는 생장 조절을 통해 수발아 억제 품종 개발, 단간 품종 개발 등이 가능할 것으로 기대된다.

Description

식물체 발아 또는 생장 조절 Ａ２０ 유전자 및 이의 용도{Ａ２０ gene controlling germination or growth, and use thereof}

본 발명은 식물체 발아 또는 생장 조절 유전자 및 이의 용도에 관한 발명이다.

세계 인구의 증가와 농업에 유용한 경작지의 감소는 농업의 효율성을 증가시키는 연구에 박차를 가하게 하였다. 작물 및 원예농업 향상을 위한 전통적인 방식은 바람직한 특성을 갖는 식물체를 동정하기 위하여 선택적 육종기법을 이용하였다. 그러나, 상기 선택적 육종기법에는 몇 가지 약점이 있는데, 즉 노동집약적이며 양친으로부터 원하는 형질이 항상 전해지는 것이 아니어서 이종의 유전적 요소를 갖는 식물로 귀착된다는 것이다. 이에, 분자생물학의 진보는 인간이 동물 및 식물의 생식질(germplasm)을 변형하게 했고, 식물유전공학은 유전물질(전형적으로 DNA 또는 RNA 형태)을 분리 및 조작하고 이 유전물질을 식물체 내로 도입하게 했다. 상기 기술에 의해 다양한 향상된 경제적, 농업적, 원예적 형질을 갖는 작물 또는 식물 개발 연구가 진행되고 있다.

많은 식물의 종자는 인간과 동물의 영양에 중요하므로 종자 수확량은 특히 중요한 문제이다. 옥수수, 벼, 밀, 캐놀라 및 대두 등과 같은 작물은 종자 자체의 직접적인 소비 또는 가공종자로 육성된 육류 소비를 통해 전체 인간 칼로리 흡수량의 절반 이상을 차지한다. 상기 작물들은 설탕, 기름 및 산업적 가공공정에 사용되는 많은 종류의 대사물의 재료이기도 하다. 종자는 배 (어린 줄기와 뿌리의 근원) 및 배유 (발아 동안 및 실생의 초기 생장 동안 배 생장의 양분 공급원)를 포함한다. 종자 발달에는 많은 유전자가 관여되며, 종자로부터 뿌리, 잎 및 줄기로 대사물의 이동이 필요하다. 특히 배유는 탄수화물, 오일 및 단백질의 대사 전구체를 동화하여, 이들을 알곡을 채우기 위한 저장성 고분자로 합성한다. 최종 목적에 따라, 형질을 변형한 것이 다른 것에 비해 월등히 유리할 수 있다. 사료 또는 목재 생산, 또는 바이오연료 생산을 위해서는 예를 들면, 식물체의 영양기관 부분의 생장 증가가 바람직하며, 곡분, 전분 또는 유지 생산을 위해서는 종자에 관련된 매개변수의 증가 또는 향상이 특히 바람직하다. 종자 매개변수 중에서도 용도에 따라 특정한 일부가 다른 것에 비해 훨씬 중요하다. 종자 크기의 증가 또는 종자 수의 또는 임의의 다른 종자관련 형질의 증가의 형태로 종자 수확량 증가에 영향을 미칠 수 있다.

이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, Ａ20 유전자를 이용하여 벼를 포함하는 식물에서의 발아 또는 생장을 조절하여, 수발아 억제 품종 개발, 단간 품종 개발 등을 통해 이로 인한 생산성 향상 및 안전한 농산물공급을 가능하게 하고자 하는 데에 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 Ａ20 유전자 및 이의 용도를 제공하는 바, 보다 상세하게는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 세포내 조절함으로써 식물체 종자의 발아 또는 생장을 조절하는 방법에 관한 것이다.

이하. 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 식물체 종자의 발아 또는 생장 조절 단백질에 관한 것이다.

상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에는 이의 기능적 동등물이 포함된다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 종자의 발아 또는 생장을 조절하는 활성을 의미한다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 야생형에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 A20 단백질의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 A20 단백질의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와　같은　다른 단백질과　융합으로 만들어진　융합단백질　등이 이에 포함된다. 또한, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편(fragment)으로서 야생형의 A20 단백질과 실질적으로 대등한 생리활성을 갖는 폴리펩타이드는 야생형 A20 단백질의 기능적 동등물의 또 다른 바람직한 그룹을 형성한다. 상기 "단편"은 단백질의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위 내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 메카니즘을 가진 것을 말하며 야생형에 존재하는 것이거나, 프로테이즈를 사용하여 절단한 것이거나 화학적으로 절단된 것이 모두 포함된다.

또한, 다른 양태로 본 발명은 A20 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.

본 발명에 따른 A20 단백질을 암호화하는 염기 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 염기 서열은 야생형 단백질과 그의 기능적 동등물을 암호화하는 염기 서열 및 이들 서열과 고긴축 조건 (high stringent condition) 하에서 하이브리드화하는 서열들을 모두 포함한다. 고긴축 조건은 공지된 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 바와 같다. 바람직하게, 본 발명에 따른 A20 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 및 이의 서열 변이체가 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 서열 변이체는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "상동성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

또한, 다른 양태로 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서의 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 적합한 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 상기 선택 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서의 용어, "프로모터"는 정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 작동 가능하게 연결된다(operably linked)는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, pGA2897 벡터를 사용하였고, nopaline synthase (NOS) 프로모터에 의해 조절되는 neomycin phosphotransferaseII (NPTII) 유전자, cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터에 의해 조절되는 hygromycin phosphotransferase (HPT)유전자와 Maize ubiquitine 프로모터와 NOS terminator 그리고 pGA1611의 T-DNA부위를 구성한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있다.

또한 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 형질전환체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다.

상기 식물은 벼, 보리, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 캐놀라, 대두, 마초, 기장, 사탕수수, 라이그래스, 및 오차드그래스 등의 식물일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, A20유전자 과발현 벡터는 아그로 박테리움 투메파시엔스 (LBA4404)에 형질전환되었으며, 벼 캘러스에 접종하여 형질전환체를 제작하였다.

다른 양태로, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 세포내 수준(level)을 조절하여 식물체 종자의 발아 또는 생장을 조절하는 방법, 보다 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 과발현시켜 식물체 종자의 발아를 억제하는 방법, 식물체 뿌리 생장을 촉진하는 방법 또는 식물체 슈트(shoot) 생장을 억제하는 방법 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 과발현시켜 식물 식물체 종자의 발아 또는 생장이 조절된 식물에 관한 것이다.

상기 "세포 내 수준"이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 1의 A20 유전자 또는 이의 변이체를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 서열번호 1의 A20 유전자 또는 이의 변이체의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 서열번호 1의 A20 유전자 또는 이의 변이체를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 단백질 또는 단백질의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질 또는 단백질의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법의 보다 구체적인 예로 1군 인트론 타입, M1 RNA 타입, 망치머리(hammerhead) 형 또는 머리핀(hairpin) 형　또는　microRNA　형 등의 전사된 mRNA에 작용하는 RNA를 암호화하는 DNA서열로 형질전환하거나, 표적 유전자 서열과 동일 또는 유사한 서열을 가지는 DNA의 형질전환을 통한 동시억제(cosuppression)를 유도할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 서열번호 2의 단백질 또는 이에 대한 기능적 동등물의 세포내 수준을 조절하는 것은 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 증가 또는 감소시키는 방법은 각각 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 2의 단백질 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 증진시키거나, 프로모터에 상기 유전자에 대한 안티센스 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 그 발현을 감소시킬 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다.

Ａ20 유전자를 이용하여 벼를 포함하는 식물에서의 발아 또는 생장을 조절함으로써, 수발아 억제 품종 개발, 단간 품종 개발 등을 통해 이로 인한 생산성 향상 및 안전한 농산물공급이 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 A20유전자 과발현을 위한 식물발현용 재조합 벡터구성도로서 Maize ubiquitine promoter를 사용하여 과발현시키며, 식물선발용 항생제 마커는 하이그로마이신 저항성 유전자를 사용하였다.
도 2는 A20 과발현 형질전환체의 유전자 발현을 정량 RT-PCR 방법으로 검정한 것으로서 DJ는 동진벼를 의미하며, Ox-1,3,6는 독립적인 형질전환체를 의미한다.
도 3은 과발현 형질전환체의 발아율을 검정한 대표 사진과 정량화한 표이다.
도 4는 과발현 형질전환체의 뿌리와 shoot부위의 성장을 비교한 대표사진과 정량화한 표이다.

이들 실시예는 단지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되는 것은 아니다.

<실시예 1> 벼에서 A20유전자의 분리 및 벼 과발현용 vector제작

본 실험에 사용된 벼 품종은 동진벼이며, 멸균된 현미종자는 1/2MS에 1% Sucrose, 그리고 0.4% phytagel이 첨가된 고체 배지(pH5.8)에서 장일조건으로 2주간 생육하였다. 이들 식물체로부터 Trizol을 이용하여 전 RNA를 분리 후 역전사 효소를 이용하여 5㎍의 RNA로부터 30㎍의 cDNA를 합성하였다. 이들 cDNA로부터 A20 유전자의 coding 지역은 Forward primer-CACCATGGTGGGGCTTGTGGGAGGA, Reverse primer-CTGTTCAAGTGGCGAGGTGGG를 이용하여 PCR을 통하여 중폭되었다. pENTR/D-Topo kit를 이용하여 PCR 산물로 Entry clone이 제작 되였으며, 유전자의 과 발현을 위하여 LR 반응에 의하여　ubiquitin promotor를 가지고 마커 유전자로서 하이그로마이신을 사용할 수 있는 binary vector인 pGA2897 vector로 cloning되었다.

<실시예 2> 벼 형질전환체 제작

벼 형질전환에 사용하는 볍씨는 껍질을 벗긴 현미를 사용한다. 볍씨를 70% ethanol에서 1분간 침지시킨 후 락스를 50% 소독한 용액에서 40분간 소독한다. 이때 락스 30mL당 10uL Tween 20을 떨어뜨린 것을 사용하는 것이 더 바람직하다.

소독액을 모두 따라 버린 후 볍씨를 멸균수로 5회 세척한다. 소독액이 잘 세척이 되면 여과지를 이용해 볍씨에서 물기를 제거한 후 2N6 배지에 볍씨를 치상한다. 이때 볍씨는 배지 안에 박아 넣어 배지와 접촉이 잘되도록 하며 씨눈은 위로 향하도록 한다. 2N6 배지는 문헌에 기재한 배지에 일부 수정된 배지로 만든다 (문헌 [Hiel et al., 1994] 참조). 즉 N6 배지 (Chu et al., Scin Sin (1975)18:659-668 참조)의 다량원소, 미량원소, 비타민을 함유한 혼합물 4g/L와 30g/L sucrose, 0.5g/L proline, 0.5g/L glutamine, 0.3g/L casamino acids, 0.01g/L myo-inositol, 2mg/L 2,4-D, 4g/L phytagel이 첨가된 고체 배지(pH5.8)이다. 배양온도는 28℃이며 암처리한다.

2N6에서 5일간 배양하며, 캘러스가 유도되면 배유를 제거한다. 배유는 캘러스가 훼손되지 않도록 핀셋을 이용하여 조심스럽게 제거하며, 자엽과 뿌리 부분은 그대로 두어야 캘러스가 훼손되는 것을 방지한다.

아그로박테리움은 목적 유전자가 삽입된 것을 준비하여 AB 고체 배지에 3일간 배양한 후 AAM 액체 배지에 모아서 현탁액을 만든다. 흡광도기계를 이용하여 현탁액의 농도를 측정하며 먼저 OD₅₉₅=0.1이 되도록 만든 후 AAM으로 10배 희석하여 OD₅₉₅=0.01이 되도록 만든다.

현탁액에 배유를 제거한 캘러스를 2분간 침지시켜 아그로박테리움을 접종하며, 2분 동안 부드럽게 용액을 흔들어 주는 것이 바람직하다. 접종이 끝나면 캘러스에서 현탁액만을 따라 버리며 여과지를 이용하여 여액을 제거한다. 이 작업은 신속히 진행하며 캘러스가 지나치게 여과지 위에 오래 방치되어 마르지 않도록 주의한다. 캘러스는 2N6-AS 배지에 옮겨서 공동배양한다. 2N6-AS배지는 2N6 배지에 10g/L glucose와 100uM acetosyringone을 추가하여 만든 배지로 pH5.2로 조정한다. 배지 위에는 미리 여과지를 한 장씩 깔아놓아서 충분히 배지 성분이 스며들게 한 다음, 접종이 끝난 캘러스를 여과지 위에 올려놓는다. 여과지는 공동배양 기간 동안 아그로박테리움이 과도하게 성장하여 캘러스가 물러지는 현상을 방지하기 위한 것이다. 공동배양은 25℃에서 7일간 암배양 한다.

공동배양이 끝나면 캘러스에 유용 유전자를 삽입하는 기능을 맡았던 아그로박테리움이 더 이상 필요 없으므로 세척 작업을 통해 제거한다. 세척은 멸균증류수 1L에 항생제인 carbenicillin을 500mg을 넣은 용액으로 수행하며, 캘러스를 3회 정도 세척한 뒤 여과지를 사용하여 여액까지 모두 제거한다. 아그로박테리움 LBA4404 균주를 사용하는 경우에는 공동배양 기간 동안 아그로박테리움의 과도한 성장이 이루어지지 않았기 때문에 위의 세척 작업을 하지 않는 것이 더 바람직하다. 캘러스는 2N6 배지에 항생제인 cefotaxime 200mg/L, Hygromycin 40mg/L가 첨가된 2N6-CH 배지로 옮긴다. 이때 핀셋을 이용하여 자엽과 뿌리 부분을 제거하며 캘러스는 2~3조각으로 나누어 배지와 닿는 면적이 최대가 되게 옮겨 배양한다. 배양온도는 28℃가 적당하며 암배양기에서 14일간 배양하여 형질전환된 캘러스를 유도한다.

14일 후, 항생제인 하이그로마이신이 첨가된 2N6-CH 배지에서 형질전환된 캘러스가 분열하면서 성장하면 슈트와 뿌리를 유도할 수 있는 재분화 배지인 MSR 배지로 계대배양한다. 형질전환된 캘러스의 구분은 새롭게 분화된 캘러스 덩어리의 유무로 판단하며 갈변되어 죽은 캘러스는 버린다.

A20 과발현 형질전환체의 유전자 발현을 정량 RT-PCR 방법으로 검정한 실험 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타나는 바와 같이, 독립적인 형질전환체 OX-1, OX-3 및 OX-6 모두에서 본 발명에 따른 유전자가 과발현되었음을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> A20 과발현체의 발아능 및 생장 비교 검정

표면 살균된 현미종자를 1/2MS에 1% Sucrose, 그리고 0.4% phytagel이 첨가된 고체 배지(pH5.8)에 장일 조건 30℃에서 생육하여 green shoot가 발생되었을 경우 발아종자로 계산하여 발아율을 조사하였고 12시간 간격으로 132시간까지 관찰하였다. 치상 후 7일째 되는 날 사진 촬영하였다. 이러한 발아된 종자들은 하이그로마이신이 첨가된 배지에서 선별되었다.

종자 자체에 의한 생장을 제외한 생장비교를 위하여 하이그로마이신이 첨가된 1/2MS에 1% Sucrose, 그리고 0.4% phytagel이 첨가된 고체 배지(pH5.8)에 위와 같이 5일간 발아시킨 종자 중 생육이 비슷한 종자들을 1/2MS에 1% Sucrose, 그리고 0.4% phytagel이 첨가된 고체 배지(pH5.8)로 치상 한 후 샤아레를 수직으로 세워 식물체를 생육시킨 후 5일 후 shoot와 root 길이 조사와 사진 촬영하였다.

과발현 형질전환체의 발아율 평가 결과를 도 3에, 과발현 형질전환체의 뿌리와 shoot 부위 성장을 비교한 결과를 도 4에 각각 나타내었다.

<110> Rural development administration <120> A20 gene controlling germination or growth, and use thereof <130> P11-037 (2011-0036-10-A) <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 630 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggtggggc ttgtgggagg aggaggttgg agggtcgggg atgatgcggc gggtgggggt 60 gggggaggag cggtggcggc gggggctgcg gcggcggcgg aggcggagca catgcggagg 120 ctccacagcc acgcccccgg cgagcaccag tgcagctccg cgctcgtcaa gcacatcaag 180 gctcctgttc acctcgtgtg gtcgctggtg cggagcttcg accagccgca gaggtacaag 240 ccgttcgtca gccgctgcgt cgtgcgcggc ggcgacctcg agatcggcag cgtgcgcgag 300 gtcaacgtca agaccggcct cccggcgacc accagcacgg agaggctcga gctgctcgac 360 gacgacgagc acatcctcag cgtcaagttc gtcggcggcg accaccgcct caggaactac 420 tcatccatcg taactgtcca tccggagagc atcgatggaa gaccagggac gcttgtgatt 480 gaatcatttg tggtggacgt gcctgatgga aatacaaagg acgagacatg ctactttgtc 540 gaggccgtga tcaagtgcaa cttaacatct ctcgccgagg tatcagagcg gctagcagtt 600 cagtcaccca cctcgccact tgaacagtag 630 <210> 2 <211> 209 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Val Gly Leu Val Gly Gly Gly Gly Trp Arg Val Gly Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Val Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Glu Ala Glu His Met Arg Arg Leu His Ser His Ala Pro Gly Glu 35 40 45 His Gln Cys Ser Ser Ala Leu Val Lys His Ile Lys Ala Pro Val His 50 55 60 Leu Val Trp Ser Leu Val Arg Ser Phe Asp Gln Pro Gln Arg Tyr Lys 65 70 75 80 Pro Phe Val Ser Arg Cys Val Val Arg Gly Gly Asp Leu Glu Ile Gly 85 90 95 Ser Val Arg Glu Val Asn Val Lys Thr Gly Leu Pro Ala Thr Thr Ser 100 105 110 Thr Glu Arg Leu Glu Leu Leu Asp Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Val 115 120 125 Lys Phe Val Gly Gly Asp His Arg Leu Arg Asn Tyr Ser Ser Ile Val 130 135 140 Thr Val His Pro Glu Ser Ile Asp Gly Arg Pro Gly Thr Leu Val Ile 145 150 155 160 Glu Ser Phe Val Val Asp Val Pro Asp Gly Asn Thr Lys Asp Glu Thr 165 170 175 Cys Tyr Phe Val Glu Ala Val Ile Lys Cys Asn Leu Thr Ser Leu Ala 180 185 190 Glu Val Ser Glu Arg Leu Ala Val Gln Ser Pro Thr Ser Pro Leu Glu 195 200 205 Gln <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for A20 gene <400> 3 caccatggtg gggcttgtgg gagga 25 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for A20 gene <400> 4 ctgttcaagt ggcgaggtgg g 21

Claims (10)

1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 식물체 종자의 발아 또는 생장 조절 단백질.
2. 제1항의 단백질을 암호화하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 것에 특징이 있는 유전자.
4. 제2항 또는 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
5. 제4항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체 종자의 발아 또는 생장이 조절된 형질전환체.
6. 제5항에 있어서, 상기 형질전환체는 종자의 발아 억제, 식물체 뿌리 생장 촉진, 또는 식물체 슈트(shoot) 생장 억제된 것에 특징이 있는 형질전환체.
7. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 세포내 수준(level)을 조절하여 식물체 종자의 발아 또는 생장을 조절하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 과발현시켜 식물체 종자의 발아 억제, 식물체 뿌리 생장 촉진, 또는 식물체 슈트(shoot) 생장 억제하는 것에 특징이 있는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 단백질을 과발현시키는 방법은 프로모터에 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 식물에 형질전환하거나, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 식물세포에 도입하는 방법에 의하는 것에 특징이 있는 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 식물은 벼, 보리, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 캐놀라, 대두, 마초, 기장, 사탕수수, 라이그래스 및 오차드그래스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.

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