EP1131446A1 - Mannanase de coffea arabica - Google Patents

Mannanase de coffea arabica

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Publication number
EP1131446A1
EP1131446A1 EP99959268A EP99959268A EP1131446A1 EP 1131446 A1 EP1131446 A1 EP 1131446A1 EP 99959268 A EP99959268 A EP 99959268A EP 99959268 A EP99959268 A EP 99959268A EP 1131446 A1 EP1131446 A1 EP 1131446A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna fragment
seq
coffee
mannanase
protein
Prior art date
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Ceased
Application number
EP99959268A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pierre Marraccini
John Rogers
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Societe des Produits Nestle SA
Nestle SA
Original Assignee
Societe des Produits Nestle SA
Nestle SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Societe des Produits Nestle SA, Nestle SA filed Critical Societe des Produits Nestle SA
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Publication of EP1131446A1 publication Critical patent/EP1131446A1/fr
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C12N15/8246—Non-starch polysaccharides, e.g. cellulose, fructans, levans
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    • C12N9/2494—Mannan endo-1,4-beta-mannosidase (3.2.1.78), i.e. endo-beta-mannanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01078—Mannan endo-1,4-beta-mannosidase (3.2.1.78), i.e. endo-beta-mannanase
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the use of DNA fragments of coffee coding for at least one enzyme involved in the hydrolysis of polysaccharides consisting of at least simple or branched mannan molecules and linked together by a ⁇ bond (l- > 4).
  • polysaccharides which contain mannose are frequently present in the cell walls of higher plants in particular in legumes and are considered as a reserve of carbohydrates in seeds.
  • galactomannans In the coffee bean, there are notably galactomannans. The latter represent around 24% of the dry weight of the grain (Bradbury and Halliday, J Agric Food Chem 3_8_, 389-392, 1990). These polysaccharides are formed of a linear chain of mannosyl residues which are linked to each other by ⁇ -l-> 4 type bonds and to which monomers of ⁇ -galactosyl residues are attached.
  • endo- ⁇ -mannanase (EC 3.2.1.78) is a hydrolase which degrades the polymers of (l-> 4) - ⁇ -mannanes, thus facilitating the exit of the rootlet during germination and releasing small oligosaccharides which are then used as an energy source for the growth of the young plant.
  • the invention is therefore intended to provide new means for controlling, modifying and / or restoring the hydrolysis of coffee polysaccharides consisting of at least simple or branched mannan molecules and linked together by a ⁇ bond (l-> 4) .
  • the present invention relates to any DNA fragment originating from coffee coding for at least one enzyme involved in the hydrolysis of such polysaccharides.
  • the present invention also relates to the use of all or part of such DNA fragments as a primer for carrying out a PCR or as a probe for detecting in vitro or modifying in vivo at least one coffee gene coding for at least one endo- ⁇ - mannanase.
  • the present invention also relates to any protein originating from the coffee seed coded by a coffee gene and involved in the hydrolysis of polysaccharides consisting of at least simple or branched mannan molecules and linked together by a ⁇ bond (l-> 4 ) and having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or any amino acid sequence homologous to the latter.
  • Another subject of the invention relates to any microorganism and any plant cell comprising, integrated into its genome or by means of a replicable plasmid, a DNA fragment according to the present invention.
  • the invention relates to a food, cosmetic or pharmaceutical composition comprising a DNA fragment or a protein according to the invention.
  • FIG. 1 represents the plasmid pMAN1 of 3.58 kb.
  • FIG. 2 represents the plasmid pMAN2 of 2.98 kb.
  • FIG. 3 represents the plasmid pMAN3 of 3.78 kb.
  • FIG. 4 represents the plasmid pMAN4 of 4.56 kb.
  • homologous sequence means any nucleic acid or amino acid sequence having an identical function, differing from the sequences according to the invention only by substitution, deletion or addition of a small number of nucleic bases or amino acids, for example
  • homologous sequence that which has more than 70% homology with the sequences according to the invention, in particular more than 80% or 90%.
  • the homology is determined by the ratio between the number of bases or amino acids of a homologous sequence which are identical to those of a sequence according to the invention, and the total number of bases or d amino acids of said sequence according to the invention.
  • fragment which hybridizes means any fragment capable of hybridizing to the fragments according to the invention by the Southern-Blot method (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989, chapters 9.31 to 9.58).
  • the hybridization is carried out under stringent conditions so as to avoid non-specific or unstable hybridizations.
  • fragment or "DNA fragment” must be understood as a double stranded DNA of chromosomal origin, which can be synthesized, reproduced in-vitro for example by the known method called "Polymerase Chain
  • sequences SEQ ID NO: refer to the sequences presented in the list of sequences below.
  • the synthetic oligonucleotides SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 11 to SEQ ID NO: 12 mentioned in the description and presented in the list of sequences below, are provided by Eurogentec (Science Park of Sait Tilman-4102 Seraing-Belgium).
  • the present invention relates to any DNA fragment from coffee encoding at least one enzyme involved in the hydrolysis of polysaccharides consisting of at least pure or branched mannan molecules linked together by a ⁇ bond (l-> 4).
  • the DNA fragment from the coffee according to the invention codes for at least one endo- ⁇ -mannanase.
  • the invention relates to any DNA fragment having the nucleic sequence SEQ ID NO: 1 or any DNA fragment homologous or hybridizing to this nucleic sequence.
  • the invention relates to the DNA fragment delimited by nucleotides lia 1294 of the nucleic sequence SEQ ID NO: 1.
  • the invention also relates to the new enzymes coded by the genes of the sequence SEQ ID NO: 1, in particular the sequences which are homologous to them. It is thus possible to envisage using them to modify or degrade in vitro such polysaccharides, for example. For this, it is preferable to purify at least one of these enzymes, by conventionally overexpressing their gene in a bacterium and by isolating them conventionally, by precipitation and / or chromatography from the culture medium, for example.
  • the invention also relates to the use of all or part of DNA fragments.
  • the subject of the present invention is a protein derived from the coffee seed coded by a coffee gene and involved in the hydrolysis of polysaccharides consisting of at least pure or branched mannan molecules linked together by a ⁇ bond (l -> 4) and having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or any amino acid sequence homologous to the latter.
  • the endo- ⁇ -mannanase can contain at least one of the following amino acid sequences: SEQ ID NO: 8 to 10.
  • Another object of the present invention relates to a process for the hydrolysis of polysaccharides consisting of at least pure or branched mannan molecules linked together by a ⁇ bond (l-> 4), in which (1) a clone is cloned into a vector.
  • DNA fragment coding for the enzyme according to the invention, said vector further comprising a sequence allowing autonomous replication or integration into a host cell, (2) a host cell is transformed by said vector, (3) then the transformed host cell is cultured under conditions suitable for the hydrolysis of such polysaccharides.
  • the present invention therefore opens the possibility of using DNA fragments according to the invention to modify the production of polysaccharides consisting at least of pure or branched mannan molecules linked together by a ⁇ bond (l-> 4) in a host cell, in particular a coffee bean cell. It is thus possible to envisage expressing or overexpressing in a coffee bean cell the expression of the DNAs according to the invention, in order to produce such polysaccharides intended to modify the aroma and the structure of the coffee beans, for example.
  • the present invention also makes it possible to have new means for identifying coffee genes involved in the hydrolysis of polysaccharides consisting of at least pure or branched mannan molecules linked together by a ⁇ bond (l-> 4).
  • the present invention also provides new enzymes involved in the hydrolysis of such polysaccharides. These enzymes can thus be advantageously used to synthesize or modify in vitro such polysaccharides.
  • the present invention also relates to a plant cell comprising, integrated into its genome or by means of a recombinant vector, a DNA fragment coding for at least one enzyme involved in the hydrolysis of polysaccharides consisting of at least pure mannan molecules or branched linked together by a ⁇ bond (l-> 4).
  • this plant cell comprises a DNA fragment having the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or a DNA fragment having a nucleic sequence homologous or which hybridizes to the nucleic sequence SEQ ID NO: 1 or a fragment d DNA comprising at least nucleotides 11 to 1294 of the nucleic sequence SEQ ID NO: 1.
  • this plant cell is a coffee cell. It is possible in particular to choose, as coffee cells, cells derived from the plant of Coffea canephora var. robusta, Coffea arabica or any other species of the genus Coffea.
  • the present invention also relates to any plant or any seed consisting of plant cells comprising, integrated into its genome or by means of a recombinant vector, a DNA fragment coding for at least one enzyme involved in the hydrolysis of polysaccharides constituted by fewer pure or branched mannan molecules linked together by a ⁇ bond (l-> 4).
  • Any microorganism comprising, integrated into its genome or by means of a replicable plasmid, a DNA fragment according to the invention, so that it expresses at least one enzyme involved in the hydrolysis of polysaccharides consisting at least pure or branched mannan molecules linked together by a ⁇ bond (l-> 4), is also an object of the present invention.
  • Another subject of the invention relates to any food, cosmetic or pharmaceutical composition comprising a DNA fragment according to the invention or a protein according to the invention.
  • the present invention relates to a process for treating coffee beans, in which all or part of the protein according to the invention is used.
  • the sediments After overexpression of the DNA fragment according to the invention in a microorganism, in a fungus or in an undifferentiated plant cell, the sediments can be treated with the more or less purified enzyme, so as to increase the extraction yields.
  • the coffee liquor can also be treated, so as to reduce the sedimentation due to the mannan which gels.
  • the total grain RNAs are extracted after 22 days of germination (days after soaking water - JAI 22).
  • the grain is rapidly ground in liquid nitrogen and the powder obtained is resuspended in 8 ml of pH 8.0 buffer containing 100 mM Tris HC1, 0.1% w / v SDS and 0.5% v / v of ⁇ -mercaptoethanol, it is homogenized with a volume of phenol saturated with Tris HC1 100 mM pH 8.0, then centrifuged at 12,000 g for 10 min. at 4 ° C., so as to extract the aqueous phase which is centrifuged (i) once with an equivalent volume of phenol, (ii) twice with an equivalent volume of phenol: chloroform (1: 1) and (iii ) twice with an equivalent volume of chloroform.
  • the total nucleic acids are then precipitated for 1 h at -20 ° C by adding to the aqueous phase 1/10 by volume of 3M sodium acetate, pH 5.2 and 2.5 volumes of ethanol.
  • RNA is then taken up in 500 ⁇ l of H 2 0 and quantified by spectrophotometric assay at 260 nm. Their quality is analyzed by agarose gel electrophoresis in the presence of formaldehyde.
  • the poly A + messenger RNAs are then purified from 500 ⁇ g of total RNA using the Oligotex-dT purification system.
  • the bacteria which contain recombinant vectors are selected on boxes of LB medium (Luria-Bertani) containing 20 ⁇ g. ml "1 of ampicillin, 80 ⁇ g. ml " 1 of methicillin and in the presence of IPTG and X-Gal (Sambrook et al., 1989). They are then grown on petri dishes, to obtain approximately 300 clones per dish. These clones are transferred to a nylon filter and then treated according to the recommendations provided by Boehringer Mannheim (Boehringer Mannheim GmbH, Biochemica, Postfach 310120, Mannheim 31, DE).
  • Plasmids from this cDNA library are also extracted from an overnight culture of these transformants, in the presence of 25 ml of LB medium containing 50 ⁇ g. ml "1 of ampicillin, and using the" QiaFilter Plasmid MidiKit "kit (Qiagen INC., USA).
  • the synthesis of the second strand of the cDNA is then carried out by carrying out an RT (Reverse Transcription) -PCR reaction (US Patent 4,683,195 and US Patent 4,683,202) using the synthetic oligonucleotide MAN2, having the nucleic sequence SEQ ID NO: 3, and the synthetic oligonucleotide DT15, having the nucleic sequence SEQ ID NO: 4.
  • RT Reverse Transcription
  • the synthetic oligonucleotide MAN2 corresponds to the amino acid sequence located between amino acids 206 and 212 of the protein sequence of Lycopersicon esculentum (Bewley et al., Planta 203 r 454-459, 1997) which is also conserved within the endo- ⁇ -mannanase protein sequences of Trichoderma reesei (Stalbrand et al, GenBank Accession Number L25310, 1993) and Aspergillus aculeatus ( Christgau et al, Biochem Mol Biol Internat 917-925, 1994)
  • the PCR reaction is carried out in the presence of 1 to 10 ng of first strand of cDNA, in a final volume of 50 ⁇ l containing 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH 8.8, 1.5 mM MgCl 2 , 0.1 mg. ml "1 gelatin, 0.2 mM of each dNTP, 0.25 ⁇ M of each oligonucleotide (MAN2 and DT15) and 3 units of Taq DNA polymerase (Stratagene, USA).
  • the reaction mixture is covered with 50 ⁇ l of oil mineral and incubated for 35 cycles (94 ° C-30 s, 45 ° C-30 s, 72 ° C-3 min.) followed by a final extension at 72 ° C for 7 min.
  • PCR fragment 50 ng of PCR fragment are added to a ligation mixture which comprises 10 mM KC1, 6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 20 mM Tris-HCl pH 8, 0.1% Triton X-100, 2 mM MgCl 2 , 10 ⁇ g. ml "1 BSA, 10 ng of the cloning vector pPCR-Script SK (+), 5 units of the restriction enzyme Sfr1, 4 units of T4 DNA ligase and 5 M of rATP.
  • This reaction is incubated for 60 min. 25 ° C. and is then used to transform the Escherichia coli XL2-Blue MRF 'strain (Stratagene, USA).
  • the bacteria which contain recombinant vectors are selected, on LB medium dishes, containing 20 ⁇ g. Ml " of ampicillin , 80 ⁇ g. ml "1 of methicillin and in the presence of IPTG and X-Gal (Sambrook et al, 1989).
  • This vector contains the PCR fragment obtained above, which is cloned at the Sfr1 site of the vector pPCR-Script (SK +).
  • This cDNA was sequenced according to the “T7 sequencing kit” protocol (Amersham Pharmacia Biotech AB, SE-751 84 Uppsala, Sweden), in the presence of alpha- ( 35 S) -dATP.
  • the transformants are transferred to a Nylon Hybond N + filter (Amersham International pic, Amersham place, Little Chalfont, Buckinghamshire HP7 9NA, UK) according to the supplier's recommendations and analyzed by molecular hybridization with the MAN1 probe (50 ng).
  • This probe is obtained after digestion of the vector pMAN1 with the restriction enzyme Smai. It was purified on electrophoresis gel and labeled by primer extension at random with 50 ⁇ Ci of alpha- ( 32 P) -dCTP according to the protocol of the Megaprime kit (Amersham, UK). After hybridization, washing and autoradiography of the filters, a positive clone is detected which shelters the recombinant vector pMAN2, described in FIG. 2 below.
  • This vector contains a DNA fragment of approximately 1000 bp which has been sequenced on both strands (Eurogentec Bel sa- Parc Scientifique du Sart Tilman - 4102 Seraing- Belgium). It actually comprises the last 1022 base pairs of the sequence SEQ ID NO: 1, but again constitutes only a partial cDNA of the endo- ⁇ -mannanase from coffee.
  • a PCR reaction was carried out according to the conditions described above, but with the exception of the following parameters. 20 ng of the plasmid DNA library (22 JAI) were used, the synthetic oligonucleotide MAN60, corresponding to the sequence SEQ ID NO: 5 and the universal oligonucleotides ForM13 and RevM13, which correspond respectively to the sequences SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7. These primers are each located approximately 100 bp on either side of the Sfr1 cloning site of the vector pPCR-Script Amp SK (+).
  • the primer MAN60 is itself located between nucleotides 803 and 819 of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • an amplification fragment [MAN60 / ForM13] of approximately 900 bp was obtained which was digested with the restriction enzyme Smal, in order to eliminate the sequences of the plasmid pPCR-Script Amp SK (+).
  • This digested DNA was ligated into the vector pPCR-Script Amp SK (+) to give the vector pMAN3 described in FIG. 3 below.
  • Analysis of its sequence reveals that it corresponds to the 5 ′ end of the cDNA coding for coffee mannanase and that it is located between nucleotides 1 and 819 of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • This enriched library was amplified in Escherichia coli, then was screened using the MAN3 cDNA probe described above which was labeled by primer extension at random according to the protocol of the Megaprime kit (Amersham, UK). At the end of this screen, a positive clone was selected which contains a cDNA of approximately 1600 bp cloned in the vector pPCR Script Amp SK (+). This recombinant plasmid is named pMAN4, described in FIG. 4 below., And the cDNA it shelters has been sequenced. Its analysis in the Genbank database (release 106.0) (Genetics Computer Group Inc., University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711 USA) showed that it corresponds to the entire sequence SEQ ID NO: 1 .
  • the sequence SEQ ID NO: 1 contains an open reading phase of 428 codons, which begins with the ATG codon at position 11 and ends with a TGA codon (A at position 1294).
  • the protein deduced from this complementary DNA has an approximate molecular weight of 48349 Da and has a very hydrophobic protein segment which corresponds to the first 30 amino acids of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • This protein sequence could correspond to a signal peptide type sequence . In this case, the molecular weight of the protein is expected to be less than or equal to 45,000 Da in its mature form.
  • the first two are located in the potential signal peptide, in positions 8 and 11 of the sequence SEQ ID NO: 2, and are therefore assumed to be absent in the mature form of mannanase.
  • the other two are located in the C-terminal position, in positions 389 and 412 of the sequence SEQ ID NO: 2.
  • Test 2 Measurement of the endo- ⁇ -mannanase activity peak during germination
  • Grains of the variety Coffea arabica var. caturra 2308 are harvested at the mature stage and treated as defined above during the isolation of the RNAs.
  • the powder is homogenized at a rate of 1 g per 5 ml in an extraction buffer (phosphate-citrate 200/100 mM pH 5.0, metabisulfite Na 2 S 2 0 5 10 mM, EDTA 5 mM, protease inhibitor 'Complete' [cat. no 1836 145, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany] 1 tablet / 50 ml) for 20 min. at 4 ° C.
  • the homogenate is then centrifuged at
  • the reaction begins with the addition of the extract, and proceeds at 37 ° C with stirring.
  • an aliquot of 400 ⁇ l of medium is taken every 15 min. for 1 h, heated to 100 ° C for 5 min. then centrifuged at 12000 g for 2 min.
  • the optical density of the supernatant is measured at 590 nm and the specific activity is expressed in AU (optical absorption units) min "1 mg protein " 1 , after having determined the protein concentration in each extract by the method of Bradford (Bradford, Anal. Biochem. 22, 248-254, 1976).
  • AU optical absorption units
  • 1 1 9 endo- ⁇ -mannanase is 0.87 AU min " . Mg " x 10 " , which corresponds to an enrichment of the enzyme by a factor of 4 compared to the crude extract and a recovery of 10 AU min "1 of total activity, or 100%.
  • hydrophobic interaction column Separation on hydrophobic interaction column
  • the sample described above is then separated on a hydrophobic interaction column (Hiload HR 16/10 phenyl sepharose High performance, Amersham Pharmacia Biotech, Sweden).
  • the column is previously equilibrated with an equilibration buffer (50 mM sodium phosphate, 400 mM ammonium sulfate, pH 7.0).
  • the sample (1 ml) is then injected onto the column which is then washed with 5 column volumes of the equilibration buffer.
  • a gradient from 0 to 99.5% water in 0.5 column volumes is applied followed by another from 99.5 to 100% in 5 column volumes.
  • the activity is mainly concentrated in three fractions which are used to continue the purification.
  • the purification yield of this step is 79% compared to the previous step.
  • the specific activity is 27 AU min “1 , mg " 1 , ie an enrichment of approximately 137 times relative to the crude extract.
  • the total activity recovered is approximately 9 AU min "1 x 10 " 2 or 90% of the initial activity.
  • the three fractions described above are mixed, concentrated and changed buffer using Ultrafree tubes (Millipore, Bedford, MA, USA, centrifugation at 4000 g maximum).
  • the volume recovered is 1 ml.
  • This sample is injected into a Resource Q column (Amersham Pharmacia Biotech AB SE-751 84 Uppsala Sweden) anion exchange, previously equilibrated with 20 mM Tris / HCl buffer, pH 8.0. Elution is carried out with a linear gradient from 0 to 1 M NaCl in 20 column volumes.
  • the total activity recovered is present exclusively in two fractions.
  • the purification yield of this step is 58% compared to the previous step.
  • the specific activity is 167 AU min "1 , mg " 1 , ie an enrichment of approximately 836 times relative to the crude extract.
  • the total activity recovered is 0.9 AU min "1 , or approximately 9% of the initial activity.
  • the two recovered fractions are concentrated by centrifugation at 4000 g at 100 1 using the tubes
  • the fractions having the enzymatic activity at the outlet of the columns described above are analyzed during the purification by two-dimensional electrophoresis. To do this, the fractions are mixed and concentrated to 20 ⁇ l by centrifugation in the Ultrafree tubes (Millipore, USA) as described above. To this volume, 105 l of rehydration buffer (8 M urea, CHAPS 3% w / v, 0.8% v / v ampholines, DTT 1% w / v) are added and a non-linear 7 cm gel strip is rehydrated. (pH 3.0 to 10.0) (Immobiline Dry Strip, Amersham Pharmacia Biotech, Sweden), according to the manufacturer's instructions. The proteins are then separated according to their isoelectric point (pi) using, for example, the IPGphore system (Amersham
  • the gel strip of the first dimension is balanced in a first solution (urea 6 M, glycerol 30% v / v, SDS 2% w / v, DTT 2%, Tris-HCl 50 mM, pH 8.0) for 5 min ., then is balanced in a second solution (6 M urea, 30% v / v glycerol, 2% w / v SDS, 2.5% w / v iodoacetamide, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0) for 10 min.
  • a first solution urea 6 M, glycerol 30% v / v, SDS 2% w / v, DTT 2%, Tris-HCl 50 mM, pH 8.0
  • a second solution 6 M urea, 30% v / v glycerol, 2% w / v SDS, 2.5% w / v iodoacetamide, 50 mM Tri
  • the gel strip is then loaded into a 10-20% acrylamide concentration gradient gel (dimensions 10 x 10 x 0.75 cm) with a single well, and covered with an agarose solution (1% w / v agarose , SDS 0.5% w / v, traces of bromophenol blue) previously heated to 90 ° C and maintained at 40 ° C.
  • the gel is mounted in a vertical electrophoresis system and is subjected to a voltage of 170 V for 2 h. After migration, the proteins are stained with silver according to the method of Bjellqvist et al. (Electrophoresis, 14, 1357-1365, 1993).
  • the profile of the mixture of the last three fractions thus obtained shows the presence of a single group of proteins which consists of a line of 5 proteins having the same approximate molecular weight of 48 kDa but having slight differences in pi.
  • the proteins thus purified are analyzed by micro-sequencing of the amino acids. To do this, they are transferred to a PVDF membrane ('Problot', Perkin Elmer- Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404, USA) using, for example, a Trans-Blot transfer cell (Bio -Rad, 2000 Alfred Drive, Hercules, California 94547, USA).
  • a transfer solution methanol 10% v / v, CAPS-NaOH 10 mM pH 11.0
  • N-terminal sequencing of purified proteins and internal peptides is carried out with a Beckman automatic sequencer (Beckmann Instruments Inc., 250 Harbor Boulevard Box 3100, Fullerton, California, 92634 USA) according to the methods described in Teixeira et al. (Electrophoresis, 1 &, 1491-1497).
  • SEQ ID NO: 8 An N-terminal sequence of 22 amino acids, called SEQ ID NO: 8, and two others relating to independent internal peptides of 10 (called SEQ ID NO: 9) and 17 (called SEQ ID NO: 10) amino acids. All the sequences obtained are unambiguous, and show that the 5 proteins, which make up the line described above, are isozynias of endo- ⁇ -mannanase which share an identical sequence in the regions concerned.
  • the three sequences SEQ ID NO: 8 to 10 have a very strong homology with the sequence SEQ ID NO: 2. In particular, the sequence SEQ ID NO: 8 aligns with a strong homology against amino acids 35 to 50 of SEQ ID NO: 2.
  • This region corresponds exactly to the N-terminal sequence of endo- ⁇ -mannanase in the coffee bean in its mature form, which begins just after a leader peptide corresponding to amino acids 1 to 34 of SEQ ID NO : 2.
  • the internal sequences SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 align with very strong homology with the regions of SEQ ID NO: 2 corresponding respectively to amino acids 93 to 102 and 259 to 275. From the purification and micro-sequencing analysis described above, it can be concluded that the enzyme having endo- ⁇ -mannanase activity in the coffee seed being germinated shares the same sequence as the protein. described by the sequence SEQ ID NO: 2.
  • Test 4 Expression of coffee mannananse in Escherichia coli
  • This reaction is carried out in the presence of 50 ng of vector pMAN4, in a final volume of 100 ⁇ l containing 1.5 units of DNA polymerase Pwo (Boehringer Mannheim), 10 ⁇ l of buffer 10 x DNA polymerase Pwo (Boehringer Mannheim), 0.1 mM of each dNTP and 0.1 ⁇ M of each oligonucleotide (TAMl and TAM2).
  • the reaction mixture is incubated for 30 cycles (94 ° C-30 s, 40 ° C-60 s, 72 ° C-2 min.) followeded by a final extension cycle at 72 ° C for 7 min.
  • the use of the expression vector pQE31 makes it possible to introduce 6 histidines (6 His tag) in phase with the N-terminal end of coffee mannanase which then allows the purification of this recombinant protein after passage through a column of Ni-NTA resin containing Ni 2+ ions (Hochuli et al, J. Chromatography, ell, 177-184, 1987).
  • the ligation mixture was used to transform the competent cells of the strain M15 [pREP4] ⁇ Escherichia coli according to the recommendations provided by Qiagen (USA) and the recombinant bacteria were selected on dishes of LB medium containing 25 ⁇ g. ml "1 of kanamycin and 100 ⁇ g. ml " 1 of ampicillin.
  • the induction is carried out by the addition of IPTG (final concentration 1 mM) in the culture medium and the culture samples are taken every 30 min.
  • the bacteria are lysed and the soluble proteins (Escherichia coli) are extracted under denaturing conditions and separated on a column of Ni-NTA resin following the protocol defined by QIAGEN (QIAexpress System).
  • QIAGEN QIAexpress System

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Abstract

Fragment d'ADN issu de café codant pour au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiées liées entre elles par une liaison β (1-⊃4).

Description

MANNANASE DE COFFEA ARABICA
La présente invention se rapporte à l'utilisation de fragments d'ADN de café codant pour au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse des polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes simples ou ramifiées et liées entre elles par une liaison β (l->4).
ETAT DE LA TECHNIQUE:
Les polysaccharides qui contiennent du mannose sont fréquemment présents dans les parois cellulaires des végétaux supérieurs en particulier chez les légumineuses et sont considérés comme une réserve de carbohydrates dans les graines.
Dans plusieurs plantes, il a été montré que l'activité endo-β-mannanase est principalement détectée dans l'endosperme des graines en cours de germination (Bewley, Trends Plant Sci 2* 464-469, 1997).
Dans le grain de café, on trouve notamment des galactomannanes. Ces dernières représentent environ 24% du poids sec du grain (Bradbury and Halliday, J Agric Food Chem 3_8_, 389-392, 1990). Ces polysaccharides sont formés d'une chaîne linéaire de résidus mannosyl qui sont liés entre eux par des liaisons de type β-l->4 et sur laquelle sont fixés des monomères de résidus α-galactosyl. Il est également connu que l'enzyme appelée endo-β-mannanase (E.C 3.2.1.78) est une hydrolase qui dégrade les polymères de (l->4)- β -mannanes, ainsi facilitant la sortie de la radicelle pendant la germination et libérant des petits oligosaccharides qui sont utilisés ensuite comme source d'énergie pour la croissance de la jeune plante.
Dans les procédés industriels, lors du traitement du café, les molécules de mannanes et leurs dérivés constituent une partie importante des sédiments insolubles. De plus, la fraction de ces molécules qui entre en solution lors de la première extraction (environ 50 %) est aussi très faiblement soluble, et est donc responsable pour la majorité des précipitations secondaires se manifestant pendant les étapes suivantes. Ainsi dans le brevet EP 0676145A, il a été démontré qu'il est possible d'hydrolyser les galactomannanes de café en utilisant une mannanase immobilisée extraite άΑspergillus niger.
Ainsi à ce jour, aucun gène ou groupe de gènes codant pour au moins une enzyme issue du café impliquée dans l'hydrolyse des polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes simples ou ramifiées et liées entre elles par une liaison β (l->4) n'a été identifié et/ou séquence.
Ainsi il serait intéressant d'isoler de telles enzymes issues de la graine café.
RESUME DE L'INVENTION:
L'invention se destine donc à fournir de nouveaux moyens pour contrôler, modifier et/ou restaurer l'hydrolyse des polysaccharides de café constitués au moins de molécules de mannanes simples ou ramifiées et liées entre elles par une liaison β (l->4).
A cet effet la présente invention concerne tout fragment d'ADN issu du café codant pour au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse de tels polysaccharides.
La présente invention concerne également l'utilisation de tout ou partie de tels fragments d'ADN comme amorce pour faire une PCR ou comme sonde pour détecter in vitro ou modifier in vivo au moins un gène de café codant pour au moins une endo-β-mannanase.
La présente invention concerne également toute protéine issue de la graine de café codée par un gène de café et impliquée dans l'hydrolyse des polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes simples ou ramifiées et liées entre elles par une liaison β (l->4) et ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO: 2 ou toute séquence en acides aminés homologue à cette dernière.
Un autre objet de l'invention concerne tout micro-organisme et de toute cellule végétale comprenant, intégré dans son génome ou par le moyen d'un plasmide replicable, un fragment d'ADN selon la présente invention. Enfin l'invention concerne une composition alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique comprenant un fragment d'ADN ou une protéine selon l'invention.
DESCRIPTION DES FIGURES:
La figure 1 représente le plasmide pMANl de 3,58 kb.
La figure 2 représente le plasmide pMAN2 de 2,98 kb.
La figure 3 représente le plasmide pMAN3 de 3,78 kb.
La figure 4 représente le plasmide pMAN4 de 4,56 kb.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION:
Au sens de la présente invention, on entend par "séquence homologue" toute séquence nucléique ou d'acides aminés ayant une fonction identique, ne différant des séquences selon l'invention que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un petit nombre de bases nucléiques ou d'acides aminés, par exemple
1 à 500 paires de bases (pb) ou 1 à 150 acides aminés.
Dans ce cadre, on considérera en particulier comme homologues deux séquences d'ADN qui, du fait de la dégénérescence du code génétique, codent pour un même polypeptide. De même, on considérera comme homologues deux protéines fonctionnelles qui sont reconnues par un même anticorps, le rapport des valeurs d'intensité de reconnaissance des deux protéines par l'anticorps n'excédant pas 100, par exemple.
On considérera aussi comme séquence homologue, celle qui présente plus de 70% d'homologie avec les séquences selon l'invention, en particulier plus de 80% ou 90%. Dans ce dernier cas, l'homologie est déterminée par le rapport entre le nombre de bases ou d'acides aminés d'une séquence homologue qui sont identiques à celles d'une séquence selon l'invention, et le nombre total de bases ou d'acides aminés de ladite séquence selon l'invention. Au sens de la présente invention, on entend par "fragment qui s'hybride" tout fragment capable de s'hybrider aux fragments selon l'invention par la méthode de Southern-Blot (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989, chapitres 9.31 à 9.58). De préférence, l'hybridation est conduite dans des conditions stringentes de manière à éviter des hybridations aspécifiques ou peu stables.
Enfin, le terme "fragment" ou "fragment d'ADN" doit être compris comme un ADN double brin d'origine chromosomique, qui peut être synthétisé, reproduit in-vitro par exemple par la méthode connue appelée "Polymérase Chain
Reaction", ou reproduit in-vivo dans une bactérie du type Escherichia coli, par exemple.
Dans la suite de la description, les séquences SEQ ID NO: font référence aux séquences présentées dans la liste des séquences ci-après. Les oligonucléotides de synthèse SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 7, et SEQ ID NO: 11 à SEQ ID NO: 12 mentionnés dans la description et présentés dans la liste des séquences ci-après, sont fournis par Eurogentec (Parc Scientifique du Sait Tilman-4102 Seraing-Belgium).
On a pu caractériser une séquence d'ADN de 1613 pb issue du café. Aussi la présente invention concerne tout fragment d'ADN issu du café codant pour au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiées liées entre elles par une liaison β (l->4).
De préférence, le fragment d'ADN issu du café selon l'invention code pour au moins une endo-β-mannanase.
On a pu montrer que tout ou partie de la séquence SEQ ID NO: 1 permet, suite à une transformation, d'hydrolyser des polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiées liées entre elles par une liaison β (1- >4) dans une cellule hôte, comme une cellule de plante ou un micro-organisme.
Vu l'intérêt de la présente invention, l'invention concerne tout fragment d'ADN ayant la séquence nucléique SEQ ID NO: 1 ou tout fragment d'ADN homologue ou s'hybndant à cette séquence nucléique. De préférence, l'invention concerne le fragment d'ADN délimité par les nucléotides l i a 1294 de la séquence nucléique SEQ ID NO: 1.
Ainsi, l'invention concerne aussi les nouvelles enzymes codées par les gènes de la séquence SEQ ID NO: 1, notamment les séquences qui leur sont homologues. On peut ainsi envisager de les utiliser pour modifier ou dégrader in- vitro de tels polysaccharides, par exemple. Pour cela, il est préférable de purifier au moins une de ces enzymes, en surexprimant classiquement leur gène dans une bactérie et en les isolant classiquement, par précipitation et/ou chromatographie du milieu de culture, par exemple.
L'invention concerne également l'utilisation de tout ou partie de fragments d'ADN. On peut notamment utiliser tout ou partie de fragments d'ADN selon l'invention, d'au moins 10 pb, comme amorce pour faire une PCR ou comme sonde pour détecter in vitro ou modifier in vivo au moins un gène de café codant pour au moins une endo-β-mannanase.
Par ailleurs, la présente invention a pour objet une protéine issue de la graine de café codée par un gène de café et impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiés liés entre elles par une liaison β (l->4) et ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO: 2 ou toute séquence en acides aminés homologue à cette dernière. L' endo- β-mannanase pouvant contenir au moins une des séquences en acides aminés suivantes: SEQ ID NO: 8 à 10.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiées liées entre elles par une liaison β (l->4), dans lequel (1) on clone dans un vecteur un fragment d'ADN codant pour l'enzymes selon l'invention, ledit vecteur comprenant en outre une séquence permettant la réplication autonome ou l'intégration dans une cellule hôte, (2) on transforme une cellule hôte par ledit vecteur, (3) puis on cultive la cellule hôte transformée dans des conditions appropriées pour l'hydrolyse de tels polysaccharides.
La présente invention ouvre donc la possibilité d'utiliser des fragments d'ADN selon l'invention pour modifier la production de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiées liées entre elles par une liaison β (l->4) dans un cellule hôte, notamment une cellule de grain de café. On peut ainsi envisager d'exprimer ou de surexprimer dans une cellule de grain de café l'expression des ADN selon l'invention, pour produire de tels polysaccharides destinés à modifier l'arôme et la structure des grains de café, par exemple.
La présente invention permet aussi d'avoir des moyens nouveaux pour identifier des gènes de café impliqués dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiées liées entre elles par une liaison β (l->4) .
Enfin, la présente invention fournie aussi de nouvelles enzymes impliquées dans l'hydrolyse de tels polysaccharides. Ces enzymes peuvent être ainsi avantageusement utilisées pour synthétiser ou modifier in-vitro de tels polysaccharides.
La présente invention concerne également une cellule végétale comprenant, intégré dans son génome ou par le moyen d'un vecteur recombinant, un fragment d'ADN codant pour au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiés liés entre elles par une liaison β (l->4).
De préférence, cette cellule végétale comprend un fragment d'ADN ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 1 ou un fragment d'ADN ayant une séquence nucléique homologue ou qui s'hybride à la séquence nucléique SEQ ID NO: 1 ou un fragment d'ADN comprenant au moins les nucléotides 11 à 1294 de la séquence nucléique SEQ ID NO: 1.
De préférence, cette cellule végétale est une cellule de café. On peut notamment choisir comme cellules de café des cellules issues de plante de Coffea canephora var. robusta, Coffea arabica ou toute autre espèce du genre Coffea.
La présente invention concerne également toute plante ou toute graine constituées de cellules végétales comprenant, intégré dans son génome ou par le moyen d'un vecteur recombinant, un fragment d'ADN codant pour au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiés liés entre elles par une liaison β (l->4). Tout micro-organisme comprenant, intégré dans son génome ou par le moyen d'un plasmide replicable, un fragment d'ADN selon l'invention, de manière à ce qu'il exprime au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiés liés entre elles par une liaison β (l->4), est également un objet de la présente invention.
Un autre objet de l'invention concerne toute composition alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique comprenant un fragment d'ADN selon l'invention ou une protéine selon l'invention.
Enfin, la présente invention concerne un procédé de traitement de grains de café, dans lequel on utilise toute ou partie de la protéine selon l'invention. On peut notamment utiliser toute ou partie de la protéine selon l'invention pour augmenter le pourcentage de matière sèche extraite, lors du traitement de grains de café. En utilisant toute ou partie de la protéine selon l'invention, on peut ainsi augmenter le rendement d'extraction tout en diminuant la quantité de sédiments.
Après surexpression du fragment d'ADN selon l'invention dans un microorganisme, dans un champignon ou dans une cellule végétale indifférenciée, on peut traiter les sédiments avec l'enzyme plus ou moins purifiée, de manière ainsi à augmenter les rendements d'extraction.
Après surexpression du fragment d'ADN selon l'invention dans un microorganisme, dans un champignon ou dans une cellule végétale indifférenciée, on peut également traiter la liqueur du café, de manière à diminuer la sédimentation dû aux mannanes qui gélifient.
La présente invention est décrite plus en détail ci-après à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention de fragments d'ADN, de plasmides recombinants et de bactéries transformées selon l'invention. Il va de soi, toutefois, que ces exemples sont donnés à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. La manipulation de l'ADN, le clonage et la transformation de cellules bactériennes sont, en l'absence de précisions contraires, effectués selon les protocoles décrits dans l'ouvrage de Sambrook et al. cité plus haut. Les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire. Test 1.Isolement de l'ADNc de l' endo-β-mannanase de café
1. Isolement des ARN totaux et des ARN messagers poly A+ à partir du grain de café en germination
Les graines de café (Coffea arabica var. caturra 2308) sont récoltées au stade mature, dépulpées immédiatement et séchées pendant trois jours à la température ambiante. Ces grains sont ensuite déparchés, séchés puis stérilisés pour être mis en germination en culture in-vitro. Pour ce faire, ils sont placés 1 heure dans du Rovral (0.12 % v/v), rincés à l'eau stérile, placés 1 heure dans une solution d'hypochlorite de calcium (6 % p/v) à laquelle on ajoute quelques gouttes d'émulsifiant Teepol, puis sont rincés par 4 passages à l'eau stérile avant d'être mis en culture dans des tubes à essai sur un milieu agar-eau. La germination se déroule à 25°C en présence de lumière. Le moment où les grains sont mis sur le lit d'agar est considéré comme jour après imbibition zéro (JAI = 0).
On extrait les ARN totaux de grains après 22 jours de mise en germination (jours après imbibition d'eau - JAI 22).
Pour ce faire, on broie rapidement le grain dans de l'azote liquide et la poudre obtenue est resuspendue dans 8 ml de tampon à pH 8.0 contenant du Tris HC1 100 mM, 0,1% p/v de SDS et 0,5% v/v de β-mercaptoéthanol, on l'homogénéise avec un volume de phénol saturé en Tris HC1 100 mM pH 8.0, puis on centrifuge à 12000 g pendant 10 min. à 4°C, de manière à extraire la phase aqueuse que l'on centrifuge (i) une fois avec un volume équivalent de phénol, (ii) deux fois avec un volume équivalent de phénol: chloroforme (1:1) et (iii) deux fois avec un volume équivalent de chloroforme.
On précipite alors les acides nucléiques totaux pendant 1 h à -20°C en ajoutant à la phase aqueuse 1/10 de volume d'acétate de sodium 3 M, pH 5.2 et 2,5 volumes d'éthanol.
Puis on centrifuge le tout à 12000 g pendant 30 min. à 4°C et l'on reprend le culot dans 10 ml d'H20, avant de précipiter à nouveau les acides nucléiques en présence de LiCl (2 M final) et d'éthanol (2,5 volumes). Après centrifugation, on reprend le culot d'ARN totaux dans 1 ml d'H20 et on le digère pendant 1 h à 37°C à la DNAse RQ1 (Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wisconsin 53711 USA), afin d'éliminer toute trace d'ADN, puis, on déprotéinise les ARN totaux par un traitement au phénol et au chloroforme, avant de les précipiter en présence d'acétate de sodium comme décrit ci-dessus.
On reprend alors les ARN totaux dans 500 μl d'H20 et on les quantifie par dosage spectrophotométrique à 260 nm. Leur qualité est analysée par électrophorèse en gel d'agarose en présence de formaldéhyde.
Pour ce faire, on purifie ensuite les ARN messagers poly A+ (ARNm) à partir de 500 μg d'ARN totaux en utilisant le système de purification Oligotex-dT
(Qiagen INC., 9600 De Soto Avenue, Chatsworth, California, 91311 USA), puis on évalue la quantité des ARN messagers à l'aide du kit DNA Dipstick
(InVitrogen BV, De Schelp 12, 9351 NV Leek, Netherlands).
2. Construction et criblage de la banque d'ADNc
On réalise la synthèse d'ADN complémentaire (ADNc), nécessaire à la construction des banques, selon les recommandations fournies dans le kit "Riboclone cDNA synthesis System M-MLV (H-)" (Promega, USA), hormis l'étape de ligature des adaptateurs EcόRI. Ceci permet de cloner ces ADNc directement dans le vecteur pPCR-Script Amp SK(+) (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, California 92037, USA). L'efficacité de cette réaction de synthèse d'ADNc est suivie par l'addition d'alpha-( P)-dCTP lors de la synthèse des deux brins d'ADN.
Après migration sur gel d'agarose alcalin (Sambrook et al, 1989), on estime la taille des ADNc néosynthétisés comme variant de 0.2 à plus de 4.3 kb. Les quantifications, à l'aide du kit DNA Dipstick (InVitrogen BV, De Schelp 12, 9351 NV Leek, Netherlands), montrent qu'environ 100 ng d'ADNc sont synthétisés à partir de 1 μg d'ARNm. Les ADNc ligaturés dans le vecteur pPCR-Script Amp SK(+) (Stratagene, USA) ont été utilisés pour transformer la souche d'Escherichia coli XL2-Blue MRP' (Stratagene, USA). On sélectionne les bactéries qui contiennent des vecteurs recombinants sur boîtes de milieu LB (Luria-Bertani) contenant 20 μg. ml"1 d'ampicilline, 80 μg. ml"1 de méthicilline et en présence d'IPTG et de X-Gal (Sambrook et al., 1989). On les cultive alors sur boîtes de pétri, pour obtenir environ 300 clones par boîte. On transfère ces clones sur filtre Nylon et on les traite ensuite selon les recommandations fournies par Boehringer Mannheim (Boehringer Mannheim GmbH, Biochemica, Postfach 310120, Mannheim 31, DE). On extrait également les plasmides de cette banque d'ADNc à partir d'une culture de nuit de ces transformants, en présence de 25 ml milieu LB contenant 50 μg. ml"1 d'ampicilline, et en utilisant le kit "QiaFilter Plasmid MidiKit" (Qiagen INC., USA).
3. Isolement de l'ADNc codant pour l'endo-β-mannanase de café
Dans une expérience préliminaire, on réalise la synthèse du premier brin d'ADNc selon les recommandations fournies dans le kit "Riboclone cDNA synthesis System M-MLV (H-)" (Promega, USA). L'efficacité de cette réaction est suivie par l'addition d'alpha-( P)-dCTP lors de la synthèse d'ADNc.
On effectue ensuite la synthèse du deuxième brin de l'ADNc en effectuant une réaction de RT (Reverse Transcription)-PCR (US Patent 4,683,195 et US Patent 4,683,202) en utilisant l'oligonucléotide de synthèse MAN2, ayant la séquence nucléique SEQ ID NO: 3, et l'oligonucléotide de synthèse DT15, ayant la séquence nucléique SEQ ID NO: 4. L'oligonucléotide de synthèse MAN2 correspond à la séquence en acides aminés localisée entre les acides aminés 206 et 212 de la séquence protéique de Lycopersicon esculentum (Bewley et al., Planta 203r 454-459, 1997) qui est également conservée au sein des séquences protéiques d'endo-β-mannanase de Trichoderma reesei (Stalbrand et al, GenBank Accession Number L25310, 1993) et d'Aspergillus aculeatus (Christgau et al, Biochem Mol Biol Internat 917-925, 1994)
On réalise la réaction de PCR en présence de 1 à 10 ng de premier brin d'ADNc, dans un volume final de 50 μl contenant 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH 8.8, 1.5 mM MgCl2, 0.1 mg. ml"1 gélatine, 0.2 mM de chaque dNTP, 0,25 μM de chaque oligonucléotide (MAN2 et DT15) et 3 unités d'ADN polymérase Taq (Stratagene, USA). On recouvre le mélange réactionnel avec 50 μl d'huile minérale et on l'incube pendant 35 cycles (94° C-30 s, 45° C-30 s, 72° C-3 min.) suivi d'une extension finale à 72° C pendant 7 min. A l'issue de cette réaction, on obtient un produit majoritaire de PCR d'environ 600 pb qui a été purifié sur gel d'électrophorèse en utilisant le système d'extraction d'ADN « Gel Nebulizer - Micropure 0.22 μm » (Amicon INC., 72 Cherry Hill Drive, Beverly, Massachusetts 01915 USA). Ce fragment est traité avec l'ADN polymérase Pfu (Stratagene, USA) pour convertir ses extrémités cohésives en extrémités franches. Cette réaction s'effectue dans un volume final de 13 μl contenant environ 200 ng de fragment d'ADN, 1 mM de dNTP,10 mM KC1, 6 mM (NH4)2S04, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1% Triton X-100, 2 mM MgCl2, 10 μg. ml"1 BSA et 2.5 unités d'ADN polymérase Pfu. On recouvre le mélange réactionnel avec 20 μl d'huile et on l'incube à 72°c pendant 30 min. Le mélange obtenu est dessalé sur cartouche Microcon 50 (Amicon INC., USA) et ligaturé dans le vecteur pPCR-Script Amp SK (+) (Statagene, USA).
Pour cela, on ajoute 50 ng de fragment de PCR dans un mélange de ligature qui comprend 10 mM KC1, 6 mM (NH4)2S04, 20 mM Tris-HCl pH 8, 0,1% Triton X-100, 2 mM MgCl2, 10 μg. ml"1 BSA, 10 ng du vecteur de clonage pPCR- Script SK(+), 5 unités de l'enzyme de restriction Sfrl, 4 unités de T4 ADN ligase et 5 M de rATP. Cette réaction est incubée pendant 60 min. à 25° C puis est utilisée pour transformer la souche d'Escherichia coli XL2-Blue MRF' (Stratagene, USA). On sélectionne les bactéries qui contiennent des vecteurs recombinants, sur boîtes de milieu LB, contenant 20 μg. ml" d'ampicilline, 80 μg. ml"1 de méthicilline et en présence d'IPTG et de X-Gal (Sambrook et al, 1989).
A l'issu de la transformation, on a isolé un clone qui abrite le plasmide recombinant pMANl, décrit à la figure 1 ci-après. Ce vecteur contient le fragment de PCR obtenu précédemment, qui est clone au site Sfrl du vecteur pPCR-Script (SK+). Cet ADNc a été séquence selon le protocole « T7 sequencing kit » (Amersham Pharmacia Biotech AB, SE-751 84 Uppsala, Suède), en présence d'alpha-(35S)-dATP. L'analyse de sa séquence montre qu'il est localisé entre les nucléotides 743 et 1369 de la séquence SEQ ID NO: 1 et est bordé à ses extrémités 5' et 3' par les séquences respectives homologues à l'oligonucléotide MAN2. Par comparaison avec la séquence protéique de la mannanase de Trichoderma reesei et d'Aspergïllus aculeatus, on déduit que l'ADNc ainsi clone correspond à un ADNc partiel de l' endo-β-mannanase de café. Pour isoler l'ADNc pleine longueur de l'endo-β-mannanase de café, on a ensuite réalisé une hybridation sur colonies en testant 1800 transformants âΕscherichia coli XL2-Blue MRF' de la banque d'ADNc réalisée à partir des grains de café en germination.
Les transformants sont transférés sur un filtre de Nylon Hybond N+ (Amersham International pic, Amersham place, Little Chalfont, Buckinghamshire HP7 9NA, UK) selon les recommandations du fournisseur et analysés par hybridation moléculaire avec la sonde MAN1 (50 ng). Cette sonde est obtenue après digestion du vecteur pMANl par l'enzyme de restriction Smaï. Elle a été purifiée sur gel d'électrophorese et marquée par extension d'amorce au hasard avec 50 μCi d'alpha-(32P)-dCTP selon le protocole du kit Megaprime (Amersham, UK). Après hybridation, lavage et autoradiographie des filtres, on détecte un clone positif qui abrite le vecteur recombinant pMAN2, décrit à la figure 2 ci-après. Ce vecteur contient un fragment d'ADN d'environ 1000 pb qui a été séquence sur les deux brins (Eurogentec Bel s.a- Parc Scientifique du Sart Tilman - 4102 Seraing- Belgium). Il comprend en fait les 1022 dernières paires de base de la séquence SEQ ID NO: 1, mais ne constitue à nouveau qu'un ADNc partiel de l'endo-β- mannanase de café.
Pour isoler l'extrémité 5' de l'ADNc de la mannanase de café, on a réalisé une réaction de PCR selon les conditions décrites précédemment, mais à l'exception des paramètres suivants. On a utilisé 20 ng de la banque d'ADN plasmidique (22 JAI), l'oligonucléotide de synthèse MAN60, correspondant à la séquence SEQ ID NO: 5 et les oligonucléotides universels ForM13 et RevM13, qui correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO: 6 et SEQ ID NO: 7. Ces amorces sont chacune localisés à environ 100 pb de part et d'autre du site de clonage Sfrl du vecteur pPCR-Script Amp SK (+). L'amorce MAN60 est quant à elle localisée entre les nucléotides 803 et 819 de la séquence SEQ ID NO: 1. Après cette réaction, on a obtenu un fragment d'amplification [MAN60/ ForM13] d'environ 900 pb qui a été digéré par l'enzyme de restriction Smal, afin d'éliminer les séquences du plasmide pPCR-Script Amp SK (+). Cet ADN digéré a été ligaturé dans le vecteur pPCR-Script Amp SK (+) pour donner le vecteur pMAN3 décrit à la figure 3 ci- après. L'analyse de sa séquence révèle qu'il correspond à l'extrémité 5' de l'ADNc codant pour la mannanase de café et qu'il est localisé entre les nucléotides 1 et 819 de la séquence SEQ ID NO: 1. Comme ces expériences ne nous ont pas permis d'isoler un ADNc pleine longueur codant pour la mannanase de café, nous avons décidé de cribler à nouveau la banque d'ADN plasmidique (22 JAI), en utilisant cette fois le kit "ClonCapture cDNA Sélection Kit" (Clontech Laboratories Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto California 94303-4230 USA). Dans ce cas, on utilise la sonde MAN3 que l'on obtient par une double digestion du plasmide pMAN3, avec les enzymes de restriction BamHl et Sacl. On effectue la biotinylation de cette sonde selon le protocole défini par Clontech (USA) et on l'utilise pour enrichir la banque d'ADNc en plasmide contenant tout ou partie des séquences de l'ADNc codant pour la mannanase de café. Cette banque enrichie a été amplifiée dans Escherichia coli, puis a été criblée en utilisant la sonde d'ADNc MAN3 décrite précédemment qui a été marqué par extension d'amorce au hasard selon le protocole du kit Megaprime (Amersham, UK). A l'issu de ce crible, on a sélectionné notamment un clone positif qui contient un ADNc d'environ 1600 pb clone dans le vecteur pPCR Script Amp SK (+). Ce plasmide recombinant est nommé pMAN4, décrit à la figure 4 ci-après., et l'ADNc qu'il abrite a été séquence. Son analyse dans la banque de donnée Genbank (release 106.0) (Genetics Computer Group Inc., University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711 USA) a montré qu'il correspond à la totalité de la séquence SEQ ID NO: 1.
4. Analyse de l'APNc pleine longueur codant pour l' endo-β-mannanase de café
L'analyse de la séquence nucléique montre que cet ADNc pleine longueur contient à son extrémité 5' une courte séquence transcrite non traduite de 10 pb et une très longue séquence (36 pb) correspondant à la queue de poly A+ dans l'extrémité 3' transcrite non traduite de 280 pb. Au sein de cette dernière séquence, on observe l'absence de motifs de AATAAA supposés intervenir dans les mécanismes de polyadénylation mais on constate en revanche la présence de plusieurs motifs nucléiques riches en GT (position) qui pourraient jouer ce rôle (Mogen et al, Plant Cell 2: 1261-1272, 1190)
On constate également la présence de deux séquences répétées inversées, très conservées entre elles ainsi que l'existence de deux grandes séquences répétées directes de 34 pb, en position 1383-1417 et 1440-1474, qui contiennent plusieurs des répétions du motif nucléique AGT(C/A)A(T/A)(G/A). Les fonctions précises de ses séquences sont inconnues mais l'on peut supposer qu'elles interviennent dans des mécanismes de stabilité des ARN messagers ou d'efficacité de la traduction par exemple (Gallie, Plant Mol Biol, 32, 145-158, 1996).
La séquence SEQ ID NO: 1 contient une phase ouverte de lecture de 428 codons, qui commence par le codon ATG en position 11 et se termine par un codon TGA (A en position 1294). La protéine déduite de cet ADN complémentaire a un poids moléculaire approximatif de 48349 Da et possède un segment protéique très hydrophobe qui correspond au 30 premiers acides aminés de la séquence SEQ ID NO: 1. Cette séquence protéique pourrait correspondre à une séquence de type peptide signal. Dans ce cas, on s'attend à ce que le poids moléculaire de la protéine soit inférieur ou égal à 45000 Da sous sa forme mature.
On note aussi l'existence de plusieurs sites potentiels de glycosylation (Asn
/ X / Ser ou Thr). Les deux premiers sont localisés dans le peptide signal potentiel, en position 8 et 11 de la séquence SEQ ID NO: 2, et sont donc supposés être absents dans la forme mature de la mannanase. Les deux autres sont localisés en position C-terminale, en position 389 et 412 de la séquence SEQ ID NO: 2.
Test 2: Mesure du pic d'activité de l'endo-β-mannanase durant la germination
Des grains de la variété Coffea arabica var. caturra 2308 sont récoltés au stade mature et traités comme défini précédemment lors de l'isolement des ARN.
Les lots de grains sont récoltés à différents stades de germination (JAI 7, 14
...) puis sont broyés dans l'azote liquide. Ensuite la poudre est homogénéisée à raison de 1 g pour 5 ml dans un tampon d'extraction (phosphate-citrate 200/100 mM pH 5.0, métabisulfite Na2S205 10 mM, EDTA 5 mM, inhibiteur de protéase 'Complète' [cat. n° 1836 145, Boehringer Mannheim, Mannheim, Allemagne] 1 comprimé/50 ml) pendant 20 min. à 4°C. L'homogénat est ensuite centrifugé à
12000 g pendant 20 min. à 4°C, et le surnageant est repris et centrifugé une deuxième fois. Le surnageant, correspondant à l'extrait enzymatique brut, est ensuite aliquoté et congelé à -80°C. L'activité enzymatique de l'endo-β-mannanase est dosée selon la méthode suivante. Un extrait enzymatique brut de 400 μl est ajouté à 1.6 ml de tampon de réaction (NaCl 100 mM, acétate de sodium 200 mM pH 5.0) contenant du substrat insoluble (AZCL-Galactomannane, Megazyme, Co. Wicklow, Ireland) en quantité finale de 1 % p/v. La réaction débute par l'ajout de l'extrait, et se déroule à 37°C sous agitation. Pour calculer la pente initiale de la réaction, un aliquoté de 400 μl de milieu est prélevé toutes les 15 min. pendant 1 h, chauffé à 100°C pendant 5 min. puis centrifugé à 12000 g pendant 2 min. La mesure de la densité optique du surnageant se fait à 590 nm et l'activité spécifique est exprimée en UA (unités d'absorption optique) min"1 mg protéine"1, après avoir dosé la concentration protéique dans chaque extrait par la méthode de Bradford (Bradford, Anal. Biochem. 22, 248-254, 1976). Ainsi on trouve que l'activité est quasiment nulle pendant les 14 premiers jours après imbibition (JAI), et augmente après progressivement jusqu'à un pic maximum autour de 28 JAI. Après 28 JAI, l'activité baisse lentement.
Test 3: Etapes de purification de l'endo-β-mannanase
Selon les résultats décrits précédemment, la stratégie de purification se poursuit en utilisant 16 ml d'un extrait d'enzyme brut de 28 JAI ayant une activité
1 1 autour de 0.2 UA, min" . mg protéine" x 10" , un contenu de protéines totales d'environ 48 mg, et une activité totale de 9.6 UA min"1 x 10"2.
1. Précipitation au sulfate d'ammonium:
Dans un premier temps, l'extrait enzymatique brut est fractionné par une précipitation au sulfate d'ammonium à 4°C. Le sulfate d'ammonium est ajouté lentement sous agitation jusqu'à un niveau de saturation de 35 % et la solution est ensuite centrifugée à 12000 g à 4°C pendant 20 min. Le culot ainsi obtenu est repris dans un minimum (1 ml) de tampon d'extraction (voir ci-dessus). Dans cet extrait, la concentration protéique est estimée à 11 mg. ml"1. L'activité spécifique
1 1 9 endo-β-mannanase est de 0.87 UA min" . mg" x 10" , ce qui correspond à un enrichissement de l'enzyme d'un facteur 4 par rapport à l'extrait brut et une récupération de 10 UA min"1 de l'activité totale, soit 100 %.
2. Séparation sur colonne d'interaction hydrophobe L'échantillon décrit ci-dessus est ensuite séparé sur une colonne d'interaction hydrophobe (Hiload HR 16/10 phényl sépharose High performance, Amersham Pharmacia Biotech, Suède). La colonne est préalablement équilibrée avec un tampon d'équilibration (phosphate de sodium 50 mM, 400 mM sulfate d'ammonium, pH 7.0). L'échantillon (1 ml) est ensuite injecté sur la colonne qui est ensuite lavée avec 5 volumes de colonne du tampon d'équilibration. Un gradient de 0 à 99.5 % d'eau en 0.5 volumes de colonne est appliqué suivit d'un autre de 99.5 à 100 % en 5 volumes de colonne. L'activité est concentrée principalement dans trois fractions qui sont utilisées pour continuer la purification. Le rendement de purification de cette étape est de 79 % par rapport à l'étape précédente. L'activité spécifique est de 27 UA min"1, mg"1, soit un enrichissement d'environ 137 fois par rapport à l'extrait brut. L'activité totale récupérée est d'environ 9 UA min"1 x 10"2 soit 90 % de l'activité initiale.
3. Séparation par chromatographie échangeuse d'ions
Les trois fractions décrites ci-dessus sont mélangées, concentrées et changées de tampon grâce à des tubes Ultrafree (Millipore, Bedford, MA, USA, centrifugation à 4000 g maximum). Le volume récupéré est de 1 ml. Cet échantillon est injecté sur une colonne Resource Q (Amersham Pharmacia Biotech AB SE-751 84 Uppsala Suède) échangeuse d'anions, préalablement équilibrée avec un tampon Tris/HCl 20 mM, pH 8.0. L'élution est réalisée avec un gradient linéaire de 0 à 1 M NaCl en 20 volumes de colonne. L'activité totale récupérée est présente exclusivement dans deux fractions. Le rendement de purification de cette étape est de 58 % par rapport à l'étape précédente. L'activité spécifique est de 167 UA min"1, mg"1, soit un enrichissement d'environ 836 fois par rapport à l'extrait brut. L'activité totale récupérée est 0,9 UA min"1, soit environ 9 % de l'activité initiale.
4. Séparation par colonne de filtration sur gel
A partir de la colonne échangeuse d'anions, les deux fractions récupérées sont concentrées par centrifugation à 4000 g à 100 1 en utilisant les tubes
Ultrafree (Millipore Co, 80 Ashby Road Bedford, MA, USA). Cet échantillon est injecté sur une colonne Superdex 75 HR 10/30 (Amersham Pharmacia Biotech,
Suède) préalablement équilibrée avec un tampon de phosphate de sodium 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7.0. Les protéines sont éluées avec le même tampon avec un débit de 0.3 ml. min"1. Une courbe de calibration de la colonne est réalisée dans les mêmes conditions grâce à des standards de poids moléculaire. L'activité endo- - mannanase est répartie dans deux fractions, correspondant à un poids moléculaire entre 40 et 55 KDa. Le rendement de purification de cette dernière étape est de 48 %. L'activité spécifique est d'environ 1400 UA min"1, mg"1, soit un enrichissement de 7000 fois par rapport à l'extrait brut. L'activité totale est de 0.45 UA min"1, soit 4.5 % de l'activité initiale.
5. Analyses par électrophorèse bi-dimensionelle et micro-séquençage des acides aminés de l'enzyme purifiée
Les fractions possédant l'activité enzymatique en sortie des colonnes décrites précédemment sont analysées au cours de la purification par des électrophorèses bi-dimensionelles. Pour ce faire, les fractions sont mélangées et concentrées jusqu'à 20 μl par une centrifugation dans les tubes Ultrafree (Millipore, USA) comme décrit précédemment. A ce volume, on ajoute 105 1 de tampon de réhydratation (urée 8 M, CHAPS 3 % p/v, ampholines 0.8 % v/v, DTT 1 % p/v) et on réhydrate un gel strip de 7 cm non-linéaire (pH 3.0 à 10.0) (Immobiline Dry Strip, Amersham Pharmacia Biotech, Suède), selon les instructions du fabricant. Les protéines sont ensuite séparées en fonction de leur point isoélectrique (pi) en utilisant, par exemple, le système IPGphore (Amersham
Pharmacia Biotech, Suède) en employant un nombre total de 14 000 volt-heures.
Suivant la séparation des protéines en fonction de leur pi, elles sont ensuite séparées dans une deuxième dimension selon leur poids moléculaires. Cette séparation est réalisé selon les recommandations de Hochstrasser et al. (Anal Biochem, 123, 412-423, 1989) et de Gorg et al (Electrophoresis, 8, 122-124, 1987). Ainsi, le gel strip de la première dimension est équilibré dans une première solution (urée 6 M, glycérol 30 % v/v, SDS 2 % p/v, DTT 2 %, Tris-HCl 50 mM, pH 8.0) pendant 5 min., puis est équilibré dans une deuxième solution (urée 6 M, glycérol 30 % v/v, SDS 2 % p/v, iodoacétamide 2.5 % p/v, Tris-HCl 50 mM, pH 8.0) pendant 10 min. Le gel strip est ensuite chargé dans un gel de gradient de concentration d'acrylamide 10-20 % (dimensions 10 x 10 x 0.75 cm) avec un seul puit, et recouvert d'une solution d'agarose (agarose 1 % p/v, SDS 0.5 % p/v, traces de bleu de bromophénol) préalablement chauffée à 90°C et maintenue à 40°C. Le gel est monté dans un système d'électrophorese vertical et est soumis à une tension de 170 V pendant 2 h. Après la migration, les protéines sont colorées à l'argent selon la méthode de Bjellqvist et al. (Electrophoresis, 14, 1357-1365, 1993). Le profil du mélange des trois dernières fractions ainsi obtenu montre la présence d'un seul groupe de protéines qui consiste en une ligne de 5 protéines ayant le même poids moléculaire approximatif de 48 kDa mais possédant de faibles différences de pi.
Les protéines ainsi purifiées sont analysées par une micro-séquençage des acides aminés. Pour ce faire, elles sont transférées sur une membrane PVDF ('Problot', Perkin Elmer- Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404, USA) en utilisant, par exemple, une cellule de transfert Trans- Blot (Bio-Rad, 2000 Alfred Drive, Hercules, California 94547, USA). Ainsi, suivant la séparation de la deuxième dimension, le gel est récupéré et mis en agitation dans une solution de transfert (méthanol 10 % v/v, CAPS-NaOH 10 mM pH 11.0) durant 10 min. Pendant ce temps deux supports de mousse, deux morceaux de papier Whatman et une membrane PVDF-Problot (Perkin Elmer- Applied Biosystem, USA) sont humidifiés dans le même solution. Le gel, la membrane et les supports sont montés dans le système Trans-Blot, selon les instructions du fabricant (Bio-Rad, USA), et le transfert est réalisé sous un courant de 100 V pendant une heure à une température de 4°C. A la fin du transfert, les protéines transférées sur la membrane sont révélées avec une coloration légère de bleu de Coomassie selon les instructions du fabricant de la membrane Problot. Les différentes protéines sont excisées de la membrane, mélangées et séquencées ensemble. Le séquençage N-terminal des protéines purifiées et des peptides internes est réalisé avec un séquenceur automatique Beckman (Beckmann Instruments Inc., 250 Harbor Boulevard Box 3100, Fullerton, California, 92634 USA) selon les méthodes décrites dans Teixeira et al. (Electrophoresis, 1&, 1491- 1497).
Trois séquences sont obtenues par cette méthode. Une séquence N- terminale de 22 acides aminés, appelée SEQ ID NO: 8, et deux autres concernant des peptides internes indépendants de 10 (appelée SEQ ID NO: 9) et 17 (appelée SEQ ID NO: 10) acides aminés. Toutes les séquences obtenues sont sans ambiguïtés, et montrent que les 5 protéines, qui composent la ligne décrite précédemment, sont des isozynies de l'endo-β-mannanase qui partagent une séquence identique dans les régions concernées. Les trois séquences SEQ ID NO: 8 à 10 ont une très forte homologie avec la séquence SEQ ID NO: 2. En particulier, la séquence SEQ ID NO: 8 s'aligne avec une forte homologie contre les acides aminés 35 à 50 de SEQ ID NO: 2. Cette région correspond exactement à la séquence N-terminale de l'endo-β- mannanase du grain de café sous sa forme mature, qui commence juste après un peptide leader correspondant aux acides aminés 1 à 34 de SEQ ID NO: 2. De plus, les séquences internes SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10 s'alignent avec une très forte homologie avec les régions de SEQ ID NO: 2 correspondant respectivement aux acides aminés 93 à 102 et 259 à 275. A partir de la purification et l'analyse par micro-sequencage décrit ci- dessus, on peut conclure que l'enzyme ayant l'activité endo-β-mannanase dans la graine de café en cours de germination partage la même séquence que la protéine décrite par la séquence SEQ ID NO: 2.
Test 4: Expression de la mannananse de café dans Escherichia coli
Pour surexprimer et purifier la mannanase de café dans Escherichia coli, on a réalisé une amplification par PCR de la séquence d'ADNc comprise entre les nucléotides 89 et 1313 de SEQ ID NO: 1 avec les ohgonucléotides TAMl et TAM2 qui présentent respectivement les séquences SEQ ID NO: 11 et 12. Ces deux ohgonucléotides permettent d'introduire les sites uniques BamHI et Pstl dans la séquence de café amplifiée par PCR. Ils permettent également d'amplifier la séquence d'ADN de café codant pour la mannanase de café mais dépourvue de sa séquence d'adressage cellulaire appelée "peptide signal", qui est comprise entre les acides aminés 1 et 26 de la séquence SEQ ID NO: 2. Cette stratégie a été suivie afin de limiter les effets toxiques dus à une surexpression dans Escherichia coli des protéines qui contiennent des séquences très hydrophobes.
Cette réaction s'effectue en présence de 50 ng de vecteur pMAN4, dans un volume final de 100 μl contenant 1.5 unités d'ADN polymérase Pwo (Boehringer Mannheim), 10 μl de tampon 10 x ADN polymérase Pwo (Boehringer Mannheim), 0.1 mM de chaque dNTP et 0.1 μM de chaque oligonucléotide (TAMl et TAM2). On incube le mélange réactionnel pendant 30 cycles (94° C-30 s, 40° C-60 s, 72° C-2 min.) suivi d'un cycle extension finale à 72° C pendant 7 min. On digère ensuite 30 μl du mélange de PCR par les enzymes de restriction BamHI et Pstl selon les recommandations fournies par Promega (USA). Le fragment d'ADN de café (1231 pb) amplifié par PCR est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose 0.8% et purifié selon les recommandations fournies dans le kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, USA). Il est ensuite ligaturé dans le vecteur d'expression pQE31 (Qiagen, USA) préalablement digéré par les enzymes BamHI et stl et déphosphorylé par un traitement à la phosphatase alcaline d'intestin de veau. L'utilisation du vecteur d'expression pQE31 permet d'introduire 6 histidines (6 His tag) en phase avec l'extrémité N- terminale de la mannanase de café ce qui permet ensuite la purification de cette protéine recombinante après passage sur une colonne de résine Ni-NTA contenant des ions Ni2+ (Hochuli et al, J. Chromatography, éll, 177- 184, 1987).
Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer les cellules compétentes de la souche M15[pREP4] ^Escherichia coli selon les recommandations fournies par Qiagen (USA) et les bactéries recombinantes ont été sélectionnées sur boîtes de milieu LB contenant 25 μg. ml"1 de kanamycine et 100 μg. ml"1 d'ampicilline.
Pour tester l'expression de la mannanase de café dans Escherichia coli, les bactéries sont ensuite cultivées dans 50 ml de milieu LB liquide supplémenté avec les antibiotiques comme indiqué précédemment jusqu'à une DO à 600 nm =1. L'induction s'effectue par l'addition d'IPTG (concentration finale 1 mM) dans le milieu de culture et les prélèvements de culture sont réalisés toutes les 30 min. Les bactéries sont lysées et les protéines solubles ^Escherichia coli sont extraites en conditions dénaturantes et séparées sur une colonne de résine Ni-NTA en suivant le protocole défini par QIAGEN (QIAexpress System). Les fractions protéiques éluées successivement ont ensuite été analysées par électrophorèse SDS-PAGE. Nous avons pu ainsi montrer que la seule protéine capable de se fixer sur la colonne Ni-NTA correspond à la mannanase de café. Cette protéine est exprimée dans Escherichia coli avec un poids moléculaire approximatif de 45 kDa qui est en accord à celui observé par électrophorèse sur les fractions purifiées de la mannanase obtenue à partir des grains en germination à 28 JAI, et ceci compte tenu des modifications de séquence protéique qui ont été réalisées lors de la construction du vecteur d'expression.

Claims

Revendications
1. Fragment d'ADN issu de café codant pour au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiées liées entre elles par une liaison β (l->4).
2. Fragment d'ADN selon la revendication 1 codant pour au moins une endo-β- mannanase.
3. Fragment d'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'endo-β- mannanase comprend au moins l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO: 10.
4. Fragment d'ADN selon les revendications 1 et 2 présentant la séquence nucléique SEQ ID NO: 1.
5. Fragment d'ADN selon la revendication 4 comprenant au moins les nucléotides 11 à 1294 de la séquence nucléique SEQ ID NO: 1.
6. Fragment d'ADN qui est homologue ou qui s'hybride à un fragment d'ADN selon l'une des revendications 4 et 5.
7. Vecteur recombinant comprenant un fragment d'ADN selon l'une des revendications 4 à 6.
Utilisation de tout ou partie de fragments d'ADN selon les revendications 4 à 6, d'au moins 10 pb, comme amorce pour faire une PCR ou comme sonde pour détecter in vitro ou modifier in vivo au moins un gène de café codant pour au moins une endo-β-mannanase.
9. Protéine issue de la graine de café codée par un gène de café et impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiés liés entre elles par une liaison β (l->4) et ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO: 2 ou toute séquence en acides aminés homologue à cette dernière, ladite protéine comprenant au moins l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO: 10.
10. Cellule végétale comprenant, intégré dans son génome ou par le moyen d'un vecteur recombinant, un fragment d'ADN codant pour au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiés liés entre elles par une liaison β (1- >4).
11. Cellule végétale selon la revendication 10 comprenant un fragment d'ADN selon l'une des revendications 4 à 6.
12. Cellule végétale selon les revendications 10 et 11 caractérisée par le fait qu'il s'agit d'une cellule de café.
13. Plante ou graine constituées de cellules végétales selon l'une des revendications 10 à 12.
14. Microorganisme comprenant, intégré dans son génome ou par le moyen d'un plasmide replicable, un fragment d'ADN selon l'une des revendications 4 à 6 de manière à ce qu'il exprime au moins une enzyme impliquée dans l'hydrolyse de polysaccharides constitués au moins de molécules de mannanes pures ou ramifiées liées entre elles par une liaison β (l->4).
15. Composition alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique comprenant un fragment d'ADN selon les revendications 1 à 6 ou une protéine selon la revendication 9 .
16. Procédé de traitement de grains de café, dans lequel on utilise toute ou partie de la protéine selon la revendication 9.
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