CN100370030C - 一种β-甘露聚糖酶基因及其编码产物的氨基酸序列和制备方法 - Google Patents

一种β-甘露聚糖酶基因及其编码产物的氨基酸序列和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种β-甘露聚糖酶基因及其编码产物的氨基酸序列和制备方法，该制备方法经提取经魔芋精粉诱导的高活性的Armillariella tabescens总RNA，利用Genebank的同源序列设计简并引物进行PCR扩增出保守区，然后再根据保守区设计基因特异性引物进行3’RACE和5’RACE，克隆出β-甘露聚糖酶基因的全长cDNA。可与毕赤酵母等构建真核表达载体建立高效表达的酵母基因工程菌株。

Description

一种β-甘露聚糖酶基因及其编码产物的氨基酸序列和制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种酸性β-甘露聚糖酶基因及其编码产物的氨基酸序列和制备方法。
背景技术
β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)，是一类能够水解含β-1，4D-甘露糖苷键的内切水解酶，属于半纤维素酶类。水解的底物有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖和甘露聚糖，产物有少量的单糖和2～10个单糖分子构成的寡糖。在纸浆漂白、饲料加工、食品加工、生物量转化等方面具广阔的应用前景。
β-甘露聚糖酶主要来源于微生物。在微生物生产的β-甘露聚糖酶中，根据最适作用pH值范围可分为酸性β-甘露聚糖酶、中性β-甘露聚糖酶和碱性β-甘露聚糖酶。不同用途的β-甘露聚糖酶需要具有不同的酶学性质。目前，新的β-甘露聚糖酶的克隆和高活性的β-甘露聚糖酶的分离成为寻找新的β-甘露聚糖酶的热点。
由于β-甘露聚糖酶应用的不断拓宽，实践中对各种具有特殊性质的β-甘露聚糖酶要求越来越高，虽然已有报道从多种微生物中获得β-甘露聚糖酶，但是仍然需要更适合实际应用需要的高效β-甘露聚糖酶，寻找更多可供研发的β-甘露聚糖酶。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种编码Armillariella tabescens(假密环菌)的酸性β-甘露聚糖酶的基因序列及其基因编码的氨基酸序列，扩大β-甘露聚糖酶基因资源，从而为开发适合不断发展的对β-甘露聚糖酶的需要及基因工程改造的需要，提供更加丰富的优良候选基因。
本发明的另一目的在于提供上述β-甘露聚糖酶的基因序列的制备方法。
本发明涉及的Armillariella tabescens(假密环菌)是无毒可食用的丝状真菌，它具有高效表达β-甘露聚糖酶及容易纯化制备酶制剂的特征。
本发明的目的通过下述技术方案实现：所述β-甘露聚糖酶的基因序列是通过下述方法制备的：提取经魔芋精粉诱导的高活性的Armillariella tabescens总RNA，利用Genebank的同源序列设计简并引物进行PCR扩增出保守区，然后再根据保守区设计基因特异性引物进行3’RACE(快速扩增末端)和5’RACE，克隆出全长目的基因。
所述β-甘露聚糖酶基因具有如下核苷酸序列：
ATGCATCTGCTCGCTTTTCTGTCTCTGAGTACATTCCTGTGCTCTGCGTTCGCTGCTGTTCCT
GAGTGGGGCCAATGTGGCGGCATTGGATGGACAGGACGGACCACTTGCGTTAGTGGTACAG
TATGCGCAGCTCTCAATGACTATTATTCTCAATGTGTGCCTGGAACGGCCACAACAACGGCCG
CTCCCACGACTGCTACATCAACAACCATTTCTTCCACTTCTCGCACAACTGCTACGTCGACCA
CAGCTTCCGCACCATCTTCTACTGGCTTTGTAACTACCTCTGGCACAGAGTTCCGCCTCAACG
GTGCCAAATTTACTATCTTCGGCGCCAACTCATACTGGGTCGGGTCGATGGGCTATAGCACTA
CAGATATGAATAAGGCCTTCGCAGACATCGCGGCTACAGGTGCCACCGTCGTCCGCACATGG
GGCTTCAATGAGGTAACGAGTCCTAACGGGATTTATTACCAGAGTTGGTCCGGAAGTACACCA
ACTATCAACACAGGTTCTACGGGTCTTCAAAACTTTGATGCCGTCGTCGCTGCCGCTGCTGC
ACATGGCTTGAGGCTTATTGTTGCCTTAACGAACAACTGGTCCGACTATGGTGGAATGGATGT
ATACGTTAACCAAATTGTCGGGTCTGGCTCTGCGCACGATTTATTCTATACCGACTGTGAGGTT
ATATCTACTTACATGAACTACGTCAAGACCTTCGTCTCGCGCTATGTGAACGAACCTACTATTTT
AGGTTGGGAGCTTGCAAATGAACCTAGATGCAAGGGGAGTACCGGGACGACCTCTGGATCAT
GCACTGCAACGACTATCACAAAATGGGCCGCGGCAATTTCAGCGTACATCAAGTCGATCGATC
CCAACCATCTTGTCGGGATAGGAGATGAAGGGTTCTACAATGAACCTAGCGCACCTACATATC
CATATCAAGGTAGCGAAGGTATCGATTTTGATGCAAATTTGGCCATTAGAAGCATTGATTTCGG
TACATTCCATTCCTATCCTATCAGCTGGGGTCAAACCACTGATCCTCAGGGATGGGGTACGCA
ATGGATCGCTGATCATGCAACGTCAATGACAGCTGCGGGAAAGCCCGTAATCTTAGAGGAGT
TTGGAGTCACCACTAATCAAGCAACTGTTTATGGCGCCTGGTATCAGGAAGTTGTCTCTTCGG
GTCTTACTGGTGCTCTTATTTGGCAAGCTGGTTCTTATTTATCATCCGGAGCTACTCCGGACGA
CGGATATGCAATTTATCCTGATGATCCTGTATATCCCCTGGAAACCTCCTATGCGGTTACATTGA
AAGCGCGGGCGTAG3’
所述β-甘露聚糖酶基因的编码产物，具有如下氨基酸序列：
MHLLAFLSLSTFLCSAFAAVPEWGQCGGIGWTGQTTCVSGTVCAALNDYYSQCVPGTATTTAAPTTAT
STTISSTSRTTATSTTASAPSSTGFVTTSGTEFRLNGAKFTIFGANSYWVGLMGYSTTDMNKAFADTAAT
GATVVRTWGFNEVTSPNGIYYQSWSGSTPTINTGSTGLQNFDAVVAAAAAHGLRLIVAITNNWSDYGG
MDVYVNQIVGSGSAHDLFYTDCEVISTYMNYVKTFVSRYVNEPTILGWELANEPRCKGSTGTTSGSCT
ATTITKWAAAISAYIKSIDPNHLVGIGDEGFYNEPSAPTYPYQGSEGIDFDANLAISSIDFGTFHSYPISWG
QTTDPQGWGTQWIADHATSMTAAGKPVILEEFGVTTNQATVYGAWYQEVVSSGLTGALIWQAGSYLS
SGATPDDGYAIYPDDPVYSLETSYAVTLKARA。所述β-甘露聚糖酶的基因序列的制备方法包括如下步骤：
(1)提取经魔芋精粉诱导的Armillariella tabescens总RNA，从Genebank蛋白数据库中检索出β-甘露聚糖酶序列，经多序列比对软件clustalx和蛋白质分类与同源性数据库block make分析得到氨基酸序列保守区；最后用引物设计软件CodeHop针对上述保守区设计出简并引物，以简并引物：5’GGTCCGGTGCTAGGCCTACNATHAAYAC3’；5’CGCGGTTCATTTGCCARYTCCCANGC3’进行保守区克隆，扩增得到298bp大小的片段(片段A)；通过Blastx(基本局域联配搜寻工具)，进行相似性搜索，检索结果表明，与β-甘露聚糖酶具有最大同源性，但并不完全相同，这表明所扩增片段为新的潜在的β-甘露聚糖酶cDNA序列；
(2)根据上述所获得的片段A，设计基因特异性引物(5’TCCACCATAGTCGGACCAGTTGTTCG3’)，通过5’RACE末端扩增获得675bp的片段(片段B)，与保守区有101bp的重叠；
(3)片段A和片段B拼接成序列M，再根据序列M设计基因特异性引物(5’ACAGAGTTCCGCCTCAACGGTGCCAA3’)，通过3’RACE末端扩增获1266bp的片段(片段C)，与5’RACE有321bp的重叠；
(4)将上述3个片段(片段A、B、C)进行序列拼接，得到大小为1449bp的核苷酸序列，ORF编码由445个氨基酸组成的蛋白质，其中N端的前18个氨基酸为信号肽(MHLLAFLSLSTFLCSAFA)，成熟肽由427个氨基酸组成。
通过本发明从Armillariella tabescens克隆到的β-甘露聚糖酶基因cDNA序列与报道的序列不同，表达产物为重组酸性β-甘露聚糖酶。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：本发明通过基因重组来生产酸性β-甘露聚糖酶，扩大β-甘露聚糖酶基因资源，从而为开发适合不断发展的对β-甘露聚糖酶的需要及基因工程改造的需要，提供更加丰富的优良候选基因。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：β-甘露聚糖酶基因的克隆
提取经魔芋精粉诱导的高活性的Armillariella tabescens总RNA，从Genebank蛋白数据库中检索出4个物种与真菌亲缘关系较近β-甘露聚糖酶序列，物种分别是：Agaricus bisporus(双孢磨菇)，Aspergillus fumigatus Af293(烟曲霉)，Aspergillus aculeatus(棘孢曲霉)，Hypocrea jecorina或Trichodermareesei(里氏木霉)，经多序列比对软件clustalx分析，得出序列之间的保守区，再输入block make(蛋白质分类与同源性数据库)分析得到无间隙的氨基酸序列保守区；最后用引物设计软件CodeHop(Consensus Degenerate HybridOligonucleotide Primers)针对这些保守区设计出多对简并引物，以其中的一对简并引物(5’GGTCCGGTGCTAGGCCTACNATHAAYAC3’；5’CGCGGTTCATTTGCCARYTCCCANGC3’)进行保守区克隆，取约1ul总RNA合成第一条cDNA进行PCR，扩增条件94℃变性2min，第一个循环按94℃30s，69℃30s，72℃1min，以后每个循环的退火温度下降1℃，共计5个循环；然后按94℃30s，64℃30s，72℃1min进行30循环，最后72℃5min；扩增得到约300bp大小的片段，将PCR产物回收并克隆到PMD-18T载体上，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选和酶切鉴定阳性克隆，挑取正确的阳性克隆(蓝色克隆)进行测序；测序结果显示得到的片段大小为298bp(片段A)，通过软件Blastx，进行相似性搜索，检索结果表明，与β-甘露聚糖酶具有最大同源性，但并不完全相同，这表明所扩增片段为新的潜在的β-甘露聚糖酶cDNA序列。根据所获得的部分cDNA序列，设计基因特异性引物(5’TCCACCATAGTCGGACCAGTTGTTCG3’)，取约1ul总RNA合成第一条cDNA，进行5’RACE末端的扩增，条件为94℃3min第一个循环按94℃45s，71℃45s，72℃1.5min，以后每个循环的退火温度下降1℃，共计5个循环。然后按94℃1min，66℃1min，72℃1.5min，30个循环，最后72℃5min，扩增产物经筛选、鉴定、测序，获得675bp的片段(片段B)，与保守区有101bp的重叠，片段A和片段B拼接成序列M，再根据序列M设计基因特异性引物(5’ACAGAGTTCCGCCTCAACGGTGCCAA3’)，取约1ul总RNA合成第一条cDNA，进行3’RACE末端的扩增。条件为94℃3min45s，72℃5min第一个循环按94℃45s，71℃45s，72℃3min，以后每个循环的退火温度下降1℃，共计4个循环；然后按94℃1min，68℃45s，72℃3min，30个循环，最后72℃5min，扩增产物经筛选、鉴定、测序。通过3’RACE末端扩增获1266bp的片段(片段C)，与5’RACE有321bp的重叠。所得的片段(片段A、B、C)均为同一基因的部分序列。用序列分析软件将上述3个片段(片段A、B、C)进行拼接，得到大小为1449bp的核苷酸序列，ORF编码由445个氨基酸组成的蛋白质，其中N端的前18个氨基酸为信号肽(MHLLAFLSLSTFLCSAFA)，成熟肽由427个氨基酸组成。
实施例2：高拷贝重组表达质粒pPICZαA-M的构建
参照pPICZαA载体的酶切位点，将β-甘露聚糖酶基因cDNA序列去除信号肽序列后加EcoRI和KpnI酶切位点，并在终止密码子TAG前加CAC CACCAC CAC CAC CAC(6His)进行全长PCR，引物为(5’CCGGAATTCGCTGTTCCTGAGTGGGGCCAATG3’；5’CGGGGTACCCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCGCCCGCGCTTTCAATGTAAC3’)，扩增条件94℃变性4min，第一个循环按94℃45s，70℃45s，72℃3min，以后每个循环的退火温度下降1℃，共计5个循环。然后按94℃45s，65℃45s，72℃3min进行25循环，最后72℃5min，扩增得到约1300bp大小的片段，测序结果显示得到的片段大小为1308bp和拼接的序列一致。
实施例3：β-甘露聚糖酶在毕赤酵母GS115中高效表达
SacI单酶切重组表达质粒pPICZ αA-M，电转化毕赤酵母GS115，重组表达组氨酸标签的β-甘露聚糖酶。在分别含100ug/ml、500ug/ml、1000ug/ml的zeocin的平板上均有生长，分别挑取单菌落平板培养，经1％甲醇诱导，重组菌GS115-pPICZαA-M在含有魔芋精粉的平板上均出现明显的水解圈，表现出高活性的β-甘露聚糖酶。分别挑取100ug/ml、500ug/ml、1000ug/ml的zeocin上生长的重组菌GS115-pPICZαA-M在BMGY培养基25ml/250ml中28～30℃，220～270转培养过夜，OD值达2～6，再转入BMMY培养基200ml/1000ml中28～30℃，220～270转培养，108小时，每隔12小时抽样检测，以GS115-pPICZαA为对照，蛋白含量测定及SDS-PAGE分析，发现在1000ug/ml的zeocin上生长的重组菌GS115-pPICZαA-M的目的蛋白含量较高，达细胞分泌总蛋白含量的50％以上。
SEQUENCE LISTING
<110>暨南大学
<120>一种β-甘露聚糖酶基因及其编码产物的氨基酸序列和制备方法
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1338
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>通过Genebank的同源序列设计简并引物进行PCR扩增出保守区，然后再根据保守区设计基因特异性引物进行3’RACE和5’RACE，克隆出β-甘露聚糖酶基因编码的核苷酸序列
<400>1
atgcatctgc tcgcttttct gtctctgagt acattcctgt gctctgcgtt cgctgctgtt 60
cctgagtggg gccaatgtgg cggcattgga tggacaggac ggaccacttg cgttagtggt 120
acagtatgcg cagctctcaa tgactattat tctcaatgtg tgcctggaac ggccacaaca 180
acggccgctc ccacgactgc tacatcaaca accatttctt ccacttctcg cacaactgct 240
acgtcgacca cagcttccgc accatcttct actggctttg taactacctc tggcacagag 300
ttccgcctca acggtgccaa atttactatc ttcggcgcca actcatactg ggtcgggtcg 360
atgggctata gcactacaga tatgaataag gccttcgcag acatcgcggc tacaggtgcc 420
accgtcgtcc gcacatgggg cttcaatgag gtaacgagtc ctaacgggat ttattaccag 480
agttggtccg gaagtacacc aactatcaac acaggttcta cgggtcttca aaactttgat 540
gccgtcgtcg ctgccgctgc tgcacatggc ttgaggctta ttgttgcctt aacgaacaac 600
tggtccgact atggtggaat ggatgtatac gttaaccaaa ttgtcgggtc tggctctgcg 660
cacgatttat tctataccga ctgtgaggtt atatctactt acatgaacta cgtcaagacc 720
ttcgtctcgc gctatgtgaa cgaacctact attttaggtt gggagcttgc aaatgaacct 780
agatgcaagg ggagtaccgg gacgacctct ggatcatgca ctgcaacgac tatcacaaaa 840
tgggccgcgg caatttcagc gtacatcaag tcgatcgatc ccaaccatct tgtcgggata 900
ggagatgaag ggttctacaa tgaacctagc gcacctacat atccatatca aggtagcgaa 960
ggtatcgatt ttgatgcaaa tttggccatt agaagcattg atttcggtac attccattcc 1020
tatcctatca gctggggtca aaccactgat cctcagggat ggggtacgca atggatcgct 1080
gatcatgcaa cgtcaatgac agctgcggga aagcccgtaa tcttagagga gtttggagtc 1140
accactaatc aagcaactgt ttatggcgcc tggtatcagg aagttgtctc ttcgggtctt 1200
actggtgctc ttatttggca agctggttct tatttatcat ccggagctac tccggacgac 1260
ggatatgcaa tttatcctga tgatcctgta tatcccctgg aaacctccta tgcggttaca 1320
ttgaaagcgc gggcgtag                                               1338
<210>2
<211>445
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>通过Genebank的同源序列设计简并引物进行PCR扩增出保守区，然后再根据保守区设计基因特异性引物进行3’RACE和5’RACE，克隆出β-甘露聚糖酶基因编码的氨基酸序列
<400>2
Met His Leu Leu Ala Phe Leu Ser Leu Ser Thr Phe Leu Cys Ser Ala
1               5                   10                  15
Phe Ala Ala Val Pro Glu Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr
            20                  25                  30
Gly Gln Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Val Cys Ala Ala Leu Asn Asp
        35                  40                  45
Tyr Tyr Ser Gln Cys Val Pro Gly Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ala Pro
    50                  55                  60
Thr Thr Ala Thr Ser Thr Thr Ile Ser Ser Thr Ser Arg Thr Thr Ala
65                  70                  75                  80
Thr Ser Thr Thr Ala Ser Ala Pro Ser Ser Thr Gly Phe Val Thr Thr
                85                  90                  95
Ser Gly Thr Glu Phe Arg Leu Asn Gly Ala Lys Phe Thr Ile Phe Gly
            100                 105                 110
Ala Asn Ser Tyr Trp Val Gly Leu Met Gly Tyr Ser Thr Thr Asp Met
        115                 120                 125
Asn Lys Ala Phe Ala Asp Ile Ala Ala Thr Gly Ala Thr Val Val Arg
    130                 135                 140
Thr Trp Gly Phe Asn Glu Val Thr Ser Pro Asn GlyIle Tyr Tyr Gln
145                 150                 155                160
Ser Trp Ser Gly Ser Thr Pro Thr Ile Asn Thr Gly Ser Thr Gly Leu
                165                 170                 175
Gln Asn Phe Asp Ala Val Val Ala Ala Ala Ala Ala His Gly Leu Arg
            180                 185                 190
Leu Ile Val Ala Ile Thr Asn Asn Trp Ser Asp Tyr Gly Gly Met Asp
        195                 200                 205
Val Tyr Val Asn Gln Ile Val Gly Ser Gly Ser Ala His Asp Leu Phe
    210                 215                 220
Tyr Thr Asp Cys Glu Val Ile Ser Thr Tyr Met Asn Tyr Val Lys Thr
225                 230                 235                 240
Phe Val Ser Arg Tyr Val Asn Glu Pro Thr Ile Leu Gly Trp Glu Leu
                245                 250                 255
Ala Asn Glu Pro Arg Cys Lys Gly Ser Thr Gly Thr Thr Ser Gly Ser
                260             265                 270
Cys Thr Ala Thr Thr Ile Thr Lys Trp Ala Ala Ala Ile Ser Ala Tyr
        275                 280                 285
Ile Lys Ser Ile Asp Pro Asn His Leu Val Gly Ile Gly Asp Glu Gly
    290                 295                 300
Phe Tyr Asn Glu Pro Ser Ala Pro Thr Tyr Pro Tyr Gln Gly Ser Glu
305                 310                 315                 320
Gly Ile Asp Phe Asp Ala Asn Leu Ala Ile Ser Ser Ile Asp Phe Gly
                325                 330                 335
Thr Phe His Ser Tyr Pro Ile Ser Trp Gly Gln Thr Thr Asp Pro Gln
            340                 345                 350
Gly Trp Gly Thr Gln Trp Ile Ala Asp His Ala Thr Ser Met Thr Ala
        355                 360                 365
Ala Gly Lys Pro Val Ile Leu Glu Glu Phe Gly Val Thr Thr Asn Gln
    370                 375                 380
Ala Thr Val Tyr Gly Ala Trp Tyr Gln Glu Val Val Ser Ser Gly Leu
385                 390                 395                 400
Thr Gly Ala Leu Ile Trp Gln Ala Gly Ser Tyr Leu Ser Ser Gly Ala
                405                 410                 415
Thr Pro Asp Asp Gly Tyr Ala Ile Tyr Pro Asp Asp Pro Val Tyr Ser
            420                 425                 430
Leu Glu Thr Ser Tyr Ala Val Thr Leu Lys Ala Arg Ala
        435                 440                 445

Claims (3)

1.一种β-甘露聚糖酶基因，其特征在于，所述酶基因的核苷酸序列如下：
atgcatctgc tcgcttttct gtctctgagt acattcctgt gctctgcgtt cgctgctgtt     60
cctgagtggg gccaatgtgg cggcattgga tggacaggac ggaccacttg cgttagtggt    120
acagtatgcg cagctctcaa tgactattat tctcaatgtg tgcctggaac ggccacaaca    180
acggccgctc ccacgactgc tacatcaaca accatttctt ccacttctcg cacaactgct    240
acgtcgacca cagcttccgc accatcttct actggctttg taactacctc tggcacagag    300
ttccgcctca acggtgccaa atttactatc ttcggcgcca actcatactg ggtcgggtcg    360
atgggctata gcactacaga tatgaataag gccttcgcag acatcgcggc tacaggtgcc    420
accgtcgtcc gcacatgggg cttcaatgag gtaacgagtc ctaacgggat ttattaccag    480
agttggtccg gaagtacacc aactatcaac acaggttcta cgggtcttca aaactttgat    540
gccgtcgtcg ctgccgctgc tgcacatggc ttgaggctta ttgttgcctt aacgaacaac    600
tggtccgact atggtggaat ggatgtatac gttaaccaaa ttgtcgggtc tggctctgcg    660
cacgatttat tctataccga ctgtgaggtt atatctactt acatgaacta cgtcaagacc    720
ttcgtctcgc gctatgtgaa cgaacctact attttaggtt gggagcttgc aaatgaacct    780
agatgcaagg ggagtaccgg gacgacctct ggatcatgca ctgcaacgac tatcacaaaa    840
tgggccgcgg caatttcagc gtacatcaag tcgatcgatc ccaaccatct tgtcgggata    900
ggagatgaag ggttctacaa tgaacctagc gcacctacat atccatatca aggtagcgaa    960
ggtatcgatt ttgatgcaaa tttggccatt agaagcattg atttcggtac attccattcc   1020
tatcctatca gctggggtca aaccactgat cctcagggat ggggtacgca atggatcgct   1080
gatcatgcaa cgtcaatgac agctgcggga aagcccgtaa tcttagagga gtttggagtc   1140
accactaatc aagcaactgt ttatggcgcc tggtatcagg aagttgtctc ttcgggtctt   1200
actggtgctc ttatttggca agctggttct tatttatcat ccggagctac tccggacgac   1260
ggatatgcaa tttatcctga tgatcctgta tatcccctgg aaacctccta tgcggttaca   1320
ttgaaagcgc gggcgtag                                                 1338。
2.权利要求1所述的β-甘露聚糖酶基因的编码产物，其特征在于，所述编码产物具有如下氨基酸序列：
Met His Leu Leu Ala Phe Leu Ser Leu Ser Thr Phe Leu Cys Ser Ala
1               5                   10                  15
Phe Ala Ala Val Pro Glu Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr
            20                  25                  30
Gly Gln Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Val Cys Ala Ala Leu Asn Asp
        35                  40                  45
Tyr Tyr Ser Gln Cys Val Pro Gly Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ala Pro
    50                  55                  60
Thr Thr Ala Thr Ser Thr Thr Ile Ser Ser Thr Ser Arg Thr Thr Ala
65                  70                  75                  80
Thr Ser Thr Thr Ala Ser Ala Pro Ser Ser Thr Gly Phe Val Thr Thr
                85                  90                  95
Ser Gly Thr Glu Phe Arg Leu Asn Gly Ala Lys Phe Thr Ile Phe Gly
            100                 105                 110
Ala Asn Ser Tyr Trp Val Gly Leu Met Gly Tyr Ser Thr Thr Asp Met
        115                 120                 125
Asn Lys Ala Phe Ala Asp Ile Ala Ala Thr Gly Ala Thr Val Val Arg
    130                 135                 140
Thr Trp Gly Phe Asn Glu Val Thr Ser Pro Asn Gly Ile Tyr Tyr Gln
145                 150                 155                 160
Ser Trp Ser Gly Ser Thr Pro Thr Ile Asn Thr Gly Ser Thr Gly Leu
                165                 170                 175
Gln Asn Phe Asp Ala Val Val Ala Ala Ala Ala Ala His Gly Leu Arg
            180                 185                 190
Leu Ile Val Ala Ile Thr Asn Asn Trp Ser Asp Tyr Gly Gly Met Asp
        195                 200                 205
Val Tyr Val Asn Gln Ile Val Gly Ser Gly Ser Ala His Asp Leu Phe
    210                 215                 220
Tyr Thr Asp Cys Glu Val Ile Ser Thr Tyr Met Asn Tyr Val Lys Thr
225                 230                 235                 240
Phe Val Ser Arg Tyr Val Asn Glu Pro Thr Ile Leu Gly Trp Glu Leu
                245                 250                 255
Ala Asn Glu Pro Arg Cys Lys Gly Ser Thr Gly Thr Thr Ser Gly Ser
            260                 265                 270
Cys Thr Ala Thr Thr Ile Thr Lys Trp Ala Ala Ala Ile Ser Ala Tyr
        275                 280                 285
Ile Lys Ser Ile Asp Pro Asn His Leu Val Gly Ile Gly Asp Glu Gly
    290                 295                 300
Phe Tyr Asn Glu Pro Ser Ala Pro Thr Tyr Pro Tyr Gln Gly Ser Glu
305                 310                 315                 320
Gly Ile Asp Phe Asp Ala Asn Leu Ala Ile Ser Ser Ile Asp Phe Gly
                325                 330                 335
Thr Phe His Ser Tyr Pro Ile Ser Trp Gly Gln Thr Thr Asp Pro Gln
            340                 345                 350
Gly Trp Gly Thr Gln Trp Ile Ala Asp His Ala Thr Ser Met Thr Ala
        355                 360                 365
Ala Gly Lys Pro Val Ile Leu Glu Glu Phe Gly Val Thr Thr Asn Gln
    370                 375                 380
Ala Thr Val Tyr Gly Ala Trp Tyr Gln Glu Val Val Ser Ser Gly Leu
385                 390                 395                 400
Thr Gly Ala Leu Ile Trp Gln Ala Gly Ser Tyr Leu Ser Ser Gly Ala
                405                 410                 415
Thr Pro Asp Asp Gly Tyr Ala Ile Tyr Pro Asp Asp Pro Val Tyr Ser
            420                 425                 430
Leu Glu Thr Ser Tyr Ala Val Thr Leu Lys Ala Arg Ala
        435                 440                 445。
3.一种编码权利要求2所述的编码产物的β-甘露聚糖酶基因的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)提取经魔芋精粉诱导的假密环菌(Armillariella tabescens)总RNA，从Genebank蛋白数据库中检索出β-甘露聚糖酶序列，经多序列比对软件clustalx和蛋白质分类与同源性数据库block make分析得到氨基酸序列保守区；最后用引物设计软件CodeHop针对上述保守区设计出简并引物，以简并引物：5’GGTCCGGTGCTAGGCCTACNATHAAYAC3’；5’CGCGGT TCATTTGCCARYTCGCANGC3’进行保守区克隆，扩增得到298bp大小的片段A；
(2)根据上述所获得的片段A，设计基因特异性引物：5’TCCACCATAGTCGGACCAGTTGTTCG3’，通过5’RACE末端扩增获得675bp的片段B，与保守区有101bp的重叠；
(3)片段A和片段B拼接成序列M，再根据序列M设计基因特异性引物：5’ACAGAGTTCCGCCTCAACGGTGCCAA3’，通过3’RACE末端扩增获1266bp的片段C，与5’RACE有321bp的重叠；
(4)将上述3个片段进行序列拼接，最终得到大小为1449bp的核苷酸序列，ORF编码由445个氨基酸组成的蛋白质，其中N端的前18个氨基酸为信号肽，成熟肽由427个氨基酸组成。
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