CN109929816A

CN109929816A - 多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G编码基因及其与制备和应用

Info

Publication number: CN109929816A
Application number: CN201711352484.6A
Authority: CN
Inventors: 尹恒; 周海川; 于作琛; 鞠酒; 王文霞
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: CN109929816B

Abstract

本发明公开了一种来源于嗜热毁丝霉菌的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G的编码基因及其制备方法与应用。本发明所涉及的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G来源于嗜热毁丝霉菌(Myceliophthora thermophila)。本发明还提供了一种制备该新型多糖裂解单加氧酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该新多糖裂解单加氧酶的基因克隆到毕赤酵母表达载体上，获得可异源表达该酶的毕赤酵母重组菌株，用该菌株异源表达制备的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G可以降解PASC(用磷酸处理过的微晶纤维素)生成纤维寡糖和纤维寡糖酸。本发明提供的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G可广泛应用于化工、农业、饲料添加和医药等领域，具有较大的生产潜力和经济价值。

Description

多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G编码基因及其与制备和应用

技术领域

本发明涉及一种多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G的基因序列及其制备方法和应用。本发明还提供了该多糖裂解单加氧酶的重组质粒和重组基因工程菌株。本发明的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G可广泛应用于农业、食品、饲料添加及医药等领域。

背景技术

随着能源紧张问题的加剧以及全球温室效应的加剧，寻求新型可替代化石燃料的可再生能源已迫在眉睫。除太阳能和风能等洁净能源外，含量丰富的生物质能源成为人们关注的焦点。木质纤维素是自然界中分布最广且数量最多的生物质资源，全球每年纤维素的产量高达约8×10¹³kg，合理地利用这类资源将会对能源危机的缓解具有重大意义。目前，如何高效、环保的利用纤维素等难溶多糖是该类生物质开发和利用面临的重大难题。纤维素的利用主要通过化学法和酶法对其进行降解，与化学法相比酶法具有设备简单、反应条件温和及环境友好等优点。酶法主要是通过利用内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-1,4-D-葡萄糖苷酶组成的酶系对纤维素进行降解。由于传统的纤维素酶系均属于糖苷水解酶家族，它们对于底物结晶区的降解效率较低，且成本较高，这使得传统的纤维素酶系难以满足工业应用的需求，限制了纤维素等生物质的高效利用。

多糖裂解单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMO)是一类在二价金属离子和电子供体的存在下氧化破坏难溶的多糖晶体结构的酶。它的出现提高了难溶多糖的降解效率，使得生物质的高效转化成为可能。多糖裂解单加氧酶的来源非常丰富，目前已从细菌(如Streptomyces coelicolorA3(2))、真菌(如Neurosporacrassa OR74A)和病毒(如Anomalacupreaentomopoxvirus CV6M)等微生物中发现该类酶。然而，目前已经报道的多糖裂解单加氧酶氧化降解纤维素所得到的产物的聚合都主要集中在2-6之间，对于高聚合度的氧化产物相对较少。本发明中的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G来源于嗜热毁丝霉，是一个新型的多糖裂解单加氧酶，在还原剂的存在下，可将纤维素氧化降解为聚合度在2-9的寡糖酸片段，其中聚合度在4-8之间的产物最为丰富，弥补了大片段氧化产物的空白。该酶的克隆表达为后续纤维素的高效降解奠定基础。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G的方法。

本发明的第三个目的是提供含有上述的多糖裂解单加氧酶Mtlpmo9g基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的另一个目的是提供新型多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G在纤维素降解中的应用。

本发明所提供的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G，来源于嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，其氨基酸序列具有如下特征中的至少一个：

1)序列表中SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-227或18-227位氨基酸残基序列，其中1-17位为信号肽，18-227位为有活性的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G的氨基酸序列。

2)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-227或18-227位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有多糖裂解单加氧酶活性不变的氨基酸序列。

本发明还提供了多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G的编码基因(命名为Mtlpmo9g)，具有下述核苷酸序列特征中的至少一个：

1)序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解纤维素的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

4)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的核苷酸序列。

本发明的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的MtLPMO9G的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶MtLPMO9G的方法，是将编码基因Mtlpmo9g克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的多糖裂解单加氧酶。

所述的重组表达多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

用于重组表达的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichiacoli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillussubtilis 9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichoderma viride，Trichodermareesei，Aspergillus niger、Aspergillus nidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori，Antharaea eucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。

上述的多糖裂解单加氧酶在纤维素降解中可以应用，包括如下应用中的一种或二种；

1)在断裂纤维素糖苷键，获得纤维寡糖中的应用；

2)在氧化降解木质素等生物质，获得纤维寡糖和纤维寡糖酸中的应用；

所述多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G与纤维素酶系混合后，在协同降解纤维素、制备生物乙醇方面可以应用。

本发明的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G的基因序列是通过无限制克隆(RF克隆)技术从嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)中克隆得到。该基因编码区长684bp，编码了227个氨基酸，分子量约26KDa，属于糖苷水解酶61家族(现称为AA9家族)。毕赤酵母重组表达获得的MtLPMO9G，在40℃、PH＝5.0的条件下可以氧化降解经过磷酸处理后的微晶纤维素(PASC)。本发明的多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G与同家族已经报道的LPMO进行序列比对，结果发现同源性最高仅为62％，且由于MtLPMO9氧化产物的聚合度跨度较广，可广泛应用于农业、食品、饲料添加及医药等领域以及生物能源炼制等方面，

附图说明

图1:PCR鉴定多糖裂解单加氧酶Mtlpmo9g基因与pPICZαA质粒的连接情况。A.引物设计示意图，正向引物位于启动子上，反向引物位于终止子中。B.电泳检测PCR产物。各泳道加入的样品分别是：泳道1-BM 5000+DNA Marker；泳道2-PCR产物。

图2:重组多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G表达的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。各泳道加入的样品分别是：泳道1-protein ruler；泳道2-纯化后的MtLPMO9G；

图3：质谱分析MtLPMO9G降解PASC的产物.

图4：HPAEC分析MtLPMO9G降解PASC的产物

图5：协同降解实验：比较MtLPMO9G和CBH II协同降解PASC与CBH II单独降解PASC的纤维二糖生成情况。

具体实施方式

实施例1多糖裂解单加氧酶全长基因克隆

运用真菌RNA提取试剂盒(上海生工，SK8659)获得嗜热毁丝霉的总RNA，并通过反转录得到cDNA。以合成的cDNA为模板进行PCR扩增(不包含信号肽)。PCR反应条件为：98℃预变性3min，98℃变性10s,55℃退火5s,72℃延伸2min,共30个循环，72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，切胶回收目的片段，通过无限制克隆法(RF克隆)将目的基因连接到表达载体pPICZAαA后测序。

实施例2多糖裂解单加氧酶基因序列分析

测序的结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，分析其同源性。采用Simple Modular Architecture Research Tool(SMART)在线工具分析序列的结构域。获得的多糖裂解单加氧酶基因(命名为Mtlpmo9g)编码区长684bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。Mtlpmo9g编码227个氨基酸和1个终止密码子，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，蛋白质理论分子量为25kDa，预测等电点为7.8。SMART分析表明，LPMO M2的氨基酸序列中1-17位为信号肽。通过运用MEGA7.0构建进化树分析，发现Mtlpmo9g的结构域特征与AA9家族成员更为相似，由此表明MtLPMO9G为AA9家族的一名新成员。

(1)SEQ ID No:1的信息(参见序列表)

(a)序列特征

*长度：684碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)

(2)SEQ ID No:2的信息(参见序列表)

(A)序列特征

*长度：227残基

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

序列表

SEQ ID NO.1

ATGAAGCTGAGCGCTGCCATCGCCGTGCTCGCGGCCGCCCTTGCCGAGGGGCACTATACCTTCCCCAGCATCGCCAACACGGCCGACTGGCAATATGTGCGCATCACGACCAACTTCCAGAGCAACGGCCCCGTGACGGACGTCAACTCGGACCAGATCCGGTGCTACGAGCGCAACCCGGGCACCGGCGCCCCCGGCATCTACAACGTCACGGCCGGCACAACCATCAACTACAACGCCAAGTCGTCCATCTCCCACCCGGGACCCATGGCCTTCTACATTGCCAAGGTTCCCGCCGGCCAGTCGGCCGCCACCTGGGACGGTAAGGGCGCCGTCTGGTCCAAGATCCACCAGGAGATGCCGCACTTTGGCACCAGCCTCACCTGGGACTCCAACGGCCGCACCTCCATGCCCGTCACCATCCCCCGCTGTCTGCAGGACGGCGAGTATCTGCTGCGTGCAGAGCACATTGCCCTCCACAGCGCCGGCAGCCCCGGCGGCGCCCAGTTCTACATTTCTTGTGCCCAGCTCTCAGTCACCGGCGGCAGCGGGACCTGGAACCCCAGGAACAAGGTGTCGTTCCCCGGCGCCTACAAGGCCACTGACCCGGGCATCCTGATCAACATCTACTACCCCGTCCCGACTAGCTACACTCCCGCTGGTCCCCCCGTCGACACCTGCTAA

SEQ ID NO.2

MKLSAAIAVLAAALAEGHYTFPSIANTADWQYVRITTNFQSNGPVTDVNSDQIRCYERNPGTGAPGIYNVTAGTTINYNAKSSISHPGPMAFYIAKVPAGQSAATWDGKGAVWSKIHQEMPHFGTSLTWDSNGRTSMPVTIPRCLQDGEYLLRAEHIALHSAGSPGGAQFYISCAQLSVTGGSGTWNPRNKVSFPGAYKATDPGILINIYYPVPTSYTPAGPPVDTC

实施例3Mtlpmo9g基因在毕赤酵母中的重组表达

将构建完成的重组质粒pPICZAαA转化毕赤酵母X-33感受态细胞，涂布在含100μg/Ml博莱霉素的YPD培养基固体平板上，28℃培养48-72h，挑取单克隆用YPD液体培养基过夜培养，提取基因组DNA并利用Mtlpmo9g上下游引物进行PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明成功获得含有Mtlpmo9g基因的重组毕赤酵母。通过甲醇诱导表达及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，进一步验证重组菌株的正确性。利用阴离子交换色谱对MtLPMO9G进行纯化，结果如图2所示，成功的获得了较高纯度的蛋白。

实施例4多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G氧化降解PASC的产物分析

取5mg PASC，加入多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G(1μM)、维生素C(1mM)和20mM醋酸铵缓冲液(PH 5.0)，40℃反应48h后终止反应，离心除去不溶底物，取上清，用savage法按savage试剂：反应产物＝1：4的比例振荡并离心除去产物中蛋白质后用MALDI-TOF检测产物。如图3所示产物主要为DP＝5-9的寡糖以及DP＝5-9的糖酸。HPAEC分析分析氧化产物显示，MtLPMO9G的与PASC反应的氧化产物包含2-9各个聚合度的糖酸(如图4)。其中聚合度为4-8的氧化产物最为丰富，与已经报道的同类酶相比产物聚合度较大，有较大的应用价值。

实施例5.多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G与CBH II协同降解PASC

以含有5mg的PASC，1μM的CBH II、1Mm的维生素C和20mM醋酸铵缓冲液(PH 5.0)的反应体系为对照，在上述体系中添加1μM的MtLPMO9G进行协同反应实验,40℃反应24h后终止反应，离心除去不溶底物，取上清，用savage法按savage试剂：反应产物＝1：4的比例振荡并离心除去产物中蛋白质后用HPAEC进行分析，通过峰面积计算所得产物的量。如图5显示，协同反应产物的量显著高于CBH II单独反应。证明MtLPMO9G可以提高纤维素降解效率，为纤维素的降解提供新的思路。

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G编码基因及其与制备和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagctga gcgctgccat cgccgtgctc gcggccgccc ttgccgaggg gcactatacc 60

ttccccagca tcgccaacac ggccgactgg caatatgtgc gcatcacgac caacttccag 120

agcaacggcc ccgtgacgga cgtcaactcg gaccagatcc ggtgctacga gcgcaacccg 180

ggcaccggcg cccccggcat ctacaacgtc acggccggca caaccatcaa ctacaacgcc 240

aagtcgtcca tctcccaccc gggacccatg gccttctaca ttgccaaggt tcccgccggc 300

cagtcggccg ccacctggga cggtaagggc gccgtctggt ccaagatcca ccaggagatg 360

ccgcactttg gcaccagcct cacctgggac tccaacggcc gcacctccat gcccgtcacc 420

atcccccgct gtctgcagga cggcgagtat ctgctgcgtg cagagcacat tgccctccac 480

agcgccggca gccccggcgg cgcccagttc tacatttctt gtgcccagct ctcagtcacc 540

ggcggcagcg ggacctggaa ccccaggaac aaggtgtcgt tccccggcgc ctacaaggcc 600

actgacccgg gcatcctgat caacatctac taccccgtcc cgactagcta cactcccgct 660

ggtccccccg tcgacacctg ctaa 684

<210> 2

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Leu Ser Ala Ala Ile Ala Val Leu Ala Ala Ala Leu Ala Glu

1 5 10 15

Gly His Tyr Thr Phe Pro Ser Ile Ala Asn Thr Ala Asp Trp Gln Tyr

20 25 30

Val Arg Ile Thr Thr Asn Phe Gln Ser Asn Gly Pro Val Thr Asp Val

35 40 45

Asn Ser Asp Gln Ile Arg Cys Tyr Glu Arg Asn Pro Gly Thr Gly Ala

50 55 60

Pro Gly Ile Tyr Asn Val Thr Ala Gly Thr Thr Ile Asn Tyr Asn Ala

65 70 75 80

Lys Ser Ser Ile Ser His Pro Gly Pro Met Ala Phe Tyr Ile Ala Lys

85 90 95

Val Pro Ala Gly Gln Ser Ala Ala Thr Trp Asp Gly Lys Gly Ala Val

100 105 110

Trp Ser Lys Ile His Gln Glu Met Pro His Phe Gly Thr Ser Leu Thr

115 120 125

Trp Asp Ser Asn Gly Arg Thr Ser Met Pro Val Thr Ile Pro Arg Cys

130 135 140

Leu Gln Asp Gly Glu Tyr Leu Leu Arg Ala Glu His Ile Ala Leu His

145 150 155 160

Ser Ala Gly Ser Pro Gly Gly Ala Gln Phe Tyr Ile Ser Cys Ala Gln

165 170 175

Leu Ser Val Thr Gly Gly Ser Gly Thr Trp Asn Pro Arg Asn Lys Val

180 185 190

Ser Phe Pro Gly Ala Tyr Lys Ala Thr Asp Pro Gly Ile Leu Ile Asn

195 200 205

Ile Tyr Tyr Pro Val Pro Thr Ser Tyr Thr Pro Ala Gly Pro Pro Val

210 215 220

Asp Thr Cys

225

Claims

1.多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G，其氨基酸序列具有下列特征中的至少一个：

1)序列表中SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-227或第18-227位氨基酸残基序列；

2)对序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有多糖裂解单加氧酶活性的氨基酸序列。

2.一种权利要求1所述多糖裂解单加氧酶编码基因Mtlpmo9g，其核苷酸序列具有如下特征中的至少一个：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的核苷酸序列；

4)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解纤维素的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

3.如权利要求1所述的多糖裂解单加氧酶的制备方法，其特征在于：是将多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G编码基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的多糖裂解单加氧酶；上述多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G编码基因具有下列特征中的至少一种：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列，

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列，

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的酶的核苷酸序列；

4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的重组表达多糖裂解单加氧酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或二种以上。

5.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于：用于重组表达多糖裂解单加氧酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichiacoli JM109、Escherichia coli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomycescerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces lacti等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillussubtilis R25、Bacillus subtilis 9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteriaCOCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichoderma viride，Trichoderma reesei，Aspergillus niger、Aspergillus nidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori，Antharaea eucalypti等)，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)中的一种。

6.一种权利要求1所述的多糖裂解单加氧酶的应用，其特征在于：该酶对纤维素类底物PASC有氧化降解活性。

7.一种权利要求1所述的多糖裂解单加氧酶在纤维素降解中的应用，其特征在于：包括如下应用中的一种或二种；

1)在断裂纤维素糖苷键，获得纤维寡糖中的应用；

2)在氧化降解木质素等生物质，获得纤维寡糖和纤维寡糖酸中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述多糖裂解单加氧酶MtLPMO9G与纤维素酶系混合后，在协同降解纤维素、制备生物乙醇方面的应用。