JP2002171989A - 新規β−マンナナーゼ遺伝子およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 常温における酵素反応性のより高いβ−マン
ナナーゼ酵素、或いは少量の添加量で効果のあるより高
い比活性を有する酵素の大量製造法の提供。 【解決手段】 バチルス由来の特定のアミノ酸配列を有
し、β−マンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド
結合を非特異的に加水分解して、マンノース及びマンノ
オリゴ糖を生成する活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列。上記のＤＮＡ配列を含有する発現ベクタ
ー。上記の発現ベクターにより形質転換された細胞。上
記の形質転換細胞を培養し、この培養物中から上記活性
を有するタンパク質を採取する、βーマンナナーゼの製
造法。上記のβーマンナナーゼ活性を有するタンパク質
のコーヒー飲料製造のための使用。上記タンパク質をコ
ーヒー抽出液に常温で作用させるコーヒー飲料における
沈殿生成防止法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なβ−マンナ
ナーゼの遺伝子に関するものであり、より具体的には従
来のものより低温でも活性を示し、また酵素タンパクあ
たりの比活性が高い新規なβ−マンナナーゼの遺伝子に
関するものである。更に本発明は、該遺伝子を含む発現
ベクター、該ベクターにより形質転換された細胞、該形
質転換体を用いたβ−マンナナーゼの製造法、該組換え
酵素タンパク質のコーヒー飲料製造のための使用もしく
は該酵素タンパク質を用いたコーヒー飲料における沈殿
生成防止方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、コーヒー飲料は缶入り製品として
の流通量が増加している。コーヒー抽出液は保存中に濁
りや沈殿を発生しやすく、これらを抑える製法の開発が
望まれている。さらに近年では、本格風味を提供するた
めの原料コーヒー豆の使用量増加、販売地域拡大による
市場滞留期間の長期化および自動販売機や温缶機による
加温などにより、沈殿が生じ、商品価値を著しく低下さ
せるという問題が生じている。コーヒー抽出液の沈殿は
コーヒー豆由来のガラクトマンナンに起因し、マンナン
分解酵素を利用して沈殿発生を抑える飲料の製造方法が
特開平７−１８４５４６号公報に、また繊維素分解酵素
を用いた沈殿防止方法が特公昭４７−１９７３６号公報
に、酵素を用いた混濁防止法が特開平４−４５７４５号
公報に開示されている。

【０００３】また、マンナン分解酵素は、バチルス属由
来の酵素が特公昭６３−１８４７４、特公平３−６５７
５４号公報に、ペニシリウム・パープロゲナム由来の酵
素が特開昭６３−２０９５８６号公報に、クロストリジ
ウム・テルチウム、ラクトバチルス属由来の酵素が特開
平５−１７６７６７号公報に、リゾプス・ニーベウスが
特公昭４９−１２７１０号公報にそれぞれ開示されてい
る。さらに報告があるものとしてトリコデルマ・レーゼ
イ（Appl. Microbiol. (1993 39:58-62)、ストレプトマ
イセス属（Agric. Biol. Chem., 48(9), 2189-2195, 19
85）、エンテロコッカス・カゼリフラバス（J. Fermen
t. Bioeng., vol.76(1), 14-18, 1993）、ビブリオ属
（Appl. and Environ. Microbiol. Nov., 1990, 3505-3
6510）、エアロモナス属（J. Fac. Arg., Kyushu Uni
v., 27(3. 4), 89-98(1983)由来のマンナナーゼ等があ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上述の方法で
は例えば、市販されているマンナン分解酵素であるアス
ペルギルス・ニガー由来の酵素セルロシンＧＭ５（阪急
共栄物産株式会社）、ガマナーゼ（ノボノルディスクバ
イオインダストリー株式会社）、また論文にて報告され
ている酵素であるトリコイデルマ・レーゼイ由来酵素、
ペニシリウム・パープロゲナム由来のβ−マンナナーゼ
等は、その至適温度は概ね70〜80℃であり、常温におけ
る酵素反応性が低い。さらに蛋白重量あたりの比活性が
低いため、コーヒー抽出液の沈殿解消を工業的に行うに
は、処理温度を高くする（４０〜５０℃）ことが必要で
あった。その結果、工程が複雑化し、またコーヒー本来
の香味、品質の劣化の問題を生じていた。２０〜３０℃
程度の常温で十分に作用させるためには酵素添加量を上
げることも考えられるが、その場合上述の酵素は比活性
が低いために多量の酵素を添加せざるをえず、酵素蛋白
質由来の異味を生じる問題がある。本発明は、常温にお
ける酵素反応性のより高い酵素、あるいは少量の添加量
で効果のある、より高い比活性を有する酵素を大量に製
造できる技術を提供することを目的とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等はかかる実情
において、コーヒー飲料における沈殿防止に更に適した
活性を有するβ−マンナナーゼを産生する微生物を、微
生物保存機関より取寄せた菌株にて探索した結果、単輪
生のペニシリウム属および単輪生のユーペニシリウム属
に属する微生物から高いマンナン分解活性を持つ菌株を
多数見出した。単輪生とはペニシリウム属の同定を行う
際に重要なぺニシリの形態的特徴の一種であり、分生子
柄より直接フィアライドを輪生し、メトレ、ラミなどの
分岐を持たないぺニシリの状態を表している。一方、分
生子柄に分岐を持つ複輪生、多輪生もある。本発明者等
は、さらに自然界からも検索した結果、群馬県の土壌か
ら高いマンナン分解活性株を複数株見出し、分離同定あ
るいは分離観察したところ、分離された微生物のうち、
コーヒー沈殿防止に適した活性を有するものの全てが単
輪生のペニシリウム（Penicillium）属に属する微生物
であることがわかった。コーヒー飲料においてその本来
の風味、品質を損なわない沈殿生成防止方法を提供する
ためには、本酵素の大量取得が望まれる。従来の育種方
法は、主として、紫外線や変異誘発剤によって得られる
変異株から選択する方法に限られていたため、安定な変
異体を単離するのが困難な場合もある。また、従来法に
よる育種の場合、好まざる形質変化を伴うことも多い。
したがって本酵素の大量生産のためには、本酵素の遺伝
子を取得し、遺伝子工学的にそれを生産することが望ま
れる。さらに、その遺伝子を取得出来れば、蛋白工学の
技術を用いて酵素の変異体を作成し、耐pH性の向上、反
応速度が増大された酵素を得ることも期待できる。

【０００６】本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、上
記酵素マンナナーゼが常温でも高活性を有することを見
出し、さらにβ-マンナナーゼの部分アミノ酸配列情報
をもとに、当該酵素の生産菌（Penicillium multicolo
r mch13-2）から調製したcDNAライブラリーより当該酵
素をコードする遺伝子を取得することに成功し、また、
酵母等の微生物での発現にも成功した。本発明はそれら
の知見に基づいて完成するに至ったものである。従っ
て、本発明は該酵素（β-マンナナーゼ）の遺伝子（DNA
配列）を提供するものである。本発明による一つの態様
のDNA配列は、配列番号２のアミノ酸番号１〜３８９で
示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において
１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは
付加されたアミノ酸配列を有し、かつβ−マンナンのβ
−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合を非特異的に加水
分解して、マンノースおよびマンノオリゴ糖を生成する
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であ
る。本発明による他の態様のDNA配列は、配列番号２の
アミノ酸番号５〜３８９で示されるアミノ酸配列、また
は該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が
置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有
し、かつβ−マンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノ
シド結合を非特異的に加水分解して、マンノースおよび
マンノオリゴ糖を生成する活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列である。さらに本発明は、該遺伝子
を含む発現ベクター（代表的には組換えプラスミド）、
該ベクターにより形質転換された細胞、該形質転換体を
用いた組換えβ−マンナナーゼ及びその製造法を提供す
るものである。また、本発明による組換えβ−マンナナ
ーゼは上記遺伝子の発現産物、すなわち、上記のタンパ
ク質である。本発明はまた、上記酵素タンパク質の、コ
ーヒー飲料製造のための（特に沈殿生成防止のための）
使用も提供するものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】［ＤＮＡ配列］本発明によるＤＮ
Ａ配列（β−マンナナーゼ遺伝子）は、上述のように、
配列番号２のアミノ酸番号１〜３８９または５〜３８９
で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列におい
て１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしく
は付加されたアミノ酸配列を有し、かつβ−マンナンの
β−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合を非特異的に加
水分解して、マンノースおよびマンノオリゴ糖を生成す
る活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であ
る。本発明において、タンパク質をコードするＤＮＡ配
列は、上記定義のアミノ酸配列に対応する塩基配列（コ
ード配列）、および更に非コード配列を含む塩基配列を
包含するものである。

【０００８】・微生物の寄託 本発明の典型的な遺伝子（ＤＮＡ配列）を含むプラスミ
ドpPMN1（後記する実施例５参照）で形質転換された、
本β-マンナナーゼを著量に発現する酵母キャンディダ
・ユティリス（Candida utilis）、IFO0098PMN1は、工
業技術院生命工学技術研究所に平成１２年（２０００
年）１１月１０日に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-7360の番
号のもとに寄託されている。

【０００９】・β-マンナナーゼ遺伝子のクローニング 本β-マンナナーゼは精製酵素のＳＤＳ-ＰＡＧＥによ
り、分子量４２,０００〜４５,０００であった。一般に
ある特定の蛋白質をコードする遺伝子を単離する場合、
蛋白質の部分アミノ酸配列を決定し、その縮重コドンか
らなる混合オリゴヌクレオチドをプロープとして遺伝子
ライブラリーから単離することが可能である。また、本
発明において実施したようなPCRによる部分断片の取得
の後、その断片をプロープとして遺伝子ライブラリーか
ら単離することも可能である。本発明者らは上記β-マ
ンナナーゼの部分アミノ酸配列を決定した。さらにPCR
による部分断片の取得の後、その断片をプロープとした
cDNAのクローニングに成功し、遺伝子構造の解析を行な
った。従って、上記典型的な遺伝子によってコードされ
ているβ-マンナナーゼは、配列番号２のアミノ酸番号
１〜３８９番あるいは５〜３８９番のアミノ酸からなる
ものである。

【００１０】・β-マンナナーゼをコードする遺伝子 本発明によるβ-マンナナーゼをコードしている遺伝子
（ＤＮＡ配列もしくはＤＮＡ断片）の具体例としては、
以下に記す断片を挙げることが出来る。このＤＮＡ断片
は、Penicillium属に属する菌体、より好ましくはPenic
illium multicolor mch13-2株より調製されるmRNAを鋳
型としたcDNAライブラリーより単離することができる。
Penicillium multicolor mch13-2株からのその好まし
い単離法については後記する実施例において詳細に説明
されている。本発明の好ましい態様によれば、本発明に
よるβ-マンナナーゼをコードするＤＮＡ配列の好まし
い具体例としては、配列番号１（β-マンナナーゼ遺伝
子を含むＤＮＡ断片）に示される塩基配列の20番目から
1186番目、あるいは32番目から1186番目までの塩基配列
が挙げられる。

【００１１】一般に、蛋白質のアミノ酸配列が与えられ
れば、それをコードする塩基配列は、いわゆるコドン表
を参照して容易に定まる。よって配列番号２に示される
アミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を適宜選択す
ることが可能である。従って、本発明において配列番号
２（β-マンナナーゼのアミノ酸配列）に示されるアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とは、配列番号１に示
される塩基配列の20番から1186番、あるいは32番目から
1186番目の配列を有するもの、およびその縮重関係にあ
るコドンが使用されている以外は同一（すべてのコドン
が縮重関係にある場合を除く）の塩基配列を有し且つ配
列番号２に示されるアミノ酸をコードする塩基配列をも
意味するものとする。なお、配列番号３はマンナナーゼ
のコード領域の塩基配列（アミノ酸配列併記）を示す。

【００１２】本発明による代表例としての配列番号１に
示される塩基配列の20番から1186番、あるいは32番目か
ら1186番目までの配列を有するＤＮＡ断片は塩基配列が
定まっていることから、そのＤＮＡ断片を取得する一つ
の手段は、核酸合成の手法に従って製造することである
（例えばFujimoto, H et al. Bio/Technology, 11, 115
1-1155, 1993参照）。またこの配列は、前記したPenici
llium属に属する菌体、より好ましくはPenicillium mu
lticolor mch13-2株から遺伝子工学的な手法を用いて得
ることができる。例えば、Molecular Cloning: A Labor
atory Manual(Sambrook、 Maniatis ら、 Cold Spring H
arbour Laboratory Press(1989))などに記載の方法で好
ましく行なうことができる。具体的な方法は、後記する
実施例に詳細に説明されている。

【００１３】［酵素タンパク質（β-マンナナーゼ酵
素）］本発明によるβ-マンナナーゼ酵素は、前述のよ
うに、β−マンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシ
ド結合を非特異的に加水分解して、マンノースおよびマ
ンノオリゴ糖を生成する以下の活性を有することを特徴
とするものである。本発明によるβ-マンナナーゼ酵素
の好ましい具体例としては、配列表の配列番号２のアミ
ノ酸番号１〜３８９または５〜３８９で示されるアミノ
酸配列、またはその等価配列を有するポリペプチドが挙
げられる。ここで、その等価配列とは、配列番号２に示
されるアミノ酸配列において、１または複数もしくは数
個のアミノ酸の変化、すなわちアミノ酸の挿入、置換、
または欠失、若しくは両末端への付加がなされたもので
あって、且つ上記したβ-マンナナーゼ活性を依然とし
て保持するものである。その等価配列におけるβ-マン
ナナーゼ活性の保持とは、その活性を利用した実際の使
用態様において、配列番号２に示される配列（アミノ酸
番号１〜３８９または５〜３８９）を全て有するポリペ
プチドと、同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度の
活性が維持されていることをいうものとする。このよう
な 等価配列は、配列番号２に示されている配列を参照
すれば、当業者であれば容易に選択し、製造することが
できる。

【００１４】［Penicillium multicolor mch13-2株］
本発明によるＤＮＡ断片（ＤＮＡ配列）の起源として有
用なPenicillium multicolorに属するmch13-2株は本発
明者らが群馬県の土壌から分離した菌株であって以下の
ような性質を示すものである。 [1]生理的、生態的性質 1）培地における生育状態 (1)CYA培地(CZAPEK YEAST AUTOLYSATE AGAR PITT, 197
3) 5℃：生育せず。 25℃：表面--色調はオレンジ色、外周は白いマージン有
り。放射状の深いしわが有る。透明な浸出液有り。 裏面--はっきりしたオレンジ色。 37℃:生育せず。 (2)MEA培地(MALT EXTRACT AGAR; AFTER BLAKESLEE, 191
5) 25℃：表面--色調は暗いオレンジ色、中央がけば立つよ
うに盛り上がっている。色は明るいオレンジ、または白
色。外周は白いマージン有り。 裏面--暗いオレンジ色。 2)生育速度 (1)CYA培地(CZAPEK YEAST AUTOLYSATE AGAR PITT, 197
3) 5℃：生育せず。 25℃：直径29〜35mm（7日目） 37℃：生育せず。 (2)MEA培地(MALT EXTRACT AGAR; AFTER BLAKESLEE, 191
5) 25℃:直径24〜29.5mm（7日目） [2]顕微鏡的所見 (1)分生子柄: 長さ--滑面、無色、110〜300μm×2〜3
μm (2)ペニシリ: 単輪生 (3)ラミ： 形成せず (4)メトレ： 形成せず (5)フィアライド： アンプル形、11〜14μm×2〜3μm (6)分生子: 球形〜楕円形〜倒卵形、滑面--無色〜淡緑
色、3〜5μm×3〜4μm (7)菌核: 形成せず。

【００１５】以上に示した菌学的性質を「ザ・ジーナス
・ペニシリウム・アンド・イッツ・テレオモルフィック
・ステイツ・ユーペニシリウム・アンド・タラロマイセ
ス（The Genus PENICILLIUM and its teleomorphic sta
tes Eupenicillium and Talaromyces）」（1979）（ジ
ョン・ アイ・ピット（John I Pitt））及び「菌類図
鑑」（1978）（宇田川俊一、椿啓介他）に照合したとこ
ろ、本菌株はペニシリウム・スクレオチオラム(Penicil
lium sclerotiorum)に類似の形態を示すことがわかっ
た。本発明者らは、微生物保存機関より取寄せたペニシ
リウム・スクレオチオラムからも高いマンナン分解活性
を見出している。しかし、本菌株は菌核を形成しない点
でペニシリウム・スクレオチオラムとは異なっていた。
そこでさらに調べたところ、従来ペニシリウム・スクレ
オチオラムに分類されていたが、菌核を形成しないこと
で分類が分かれた菌株であるペニシリウム・マルチカラ
ーであることがわかり、最終的に本発明者は本菌株をペ
ニシリウム・マルチカラー(Pen icillium multicolor)mc
h13-2株と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所
にFERM BP-6831として寄託されている。前述した通り、
本発明のDNA配列に係る遺伝子の取得に使用する真菌は
単輪生のPenicillium属および単輪生のEupenicillium属
に属するものが代表的であるが、上述のような性能を有
するものであればよく、単輪生のPenicillium属、単輪
生のEupenicillium属およびそれらの変種に限定される
ものでない。

【００１６】上記の菌体の培養にあたっては、培地に菌
体を接種し、常法に従い培養すればよい。培地中には、
資化しうる炭素源及び窒素源を適量含有せしめることが
好ましい。培養に使用される栄養源としては、従来知ら
れている各種培養材料を用いることができるが、炭素源
としては、例えばローカストビーンガム、グアーガム、
コンニャクマンナン、コプラミール等が好ましい。ロー
カストビーンガムはイナゴ豆より抽出されたガラクトマ
ンナンで、またグアーガムはグアプラントの種子から得
られるガラクトマンナンであり、主として食品の増粘、
保水、品質改良などの目的で利用されている。また、コ
ンニャクマンナンはコンニャクから抽出したグルコマン
ナンであり、コプラミールはココナッツヤシよりヤシ油
を絞った残渣で、ガラクトマンナンを含有する。窒素源
も特に制限はないが、例えば酵母エキス、ペプトン、硫
酸アンモニウム、大豆、大豆フレーク、コーンスティー
プリカー、ピーナッツミール、綿実ミール、カゼイン水
解物、魚紛、その他一般的に培地成分として利用される
成分が利用できる。さらに培地には、炭素源、窒素源の
他に必要に応じて無機塩、ビタミン類、ミネラル類など
を添加することができ、例えばマグネシウム塩、ナトリ
ウム塩、リン酸塩、カリウム塩、カルシウム塩、マンガ
ン塩、コバルト塩、亜鉛塩などや、有機微量栄養源を適
宜用いることも可能である。

【００１７】［β-マンナナーゼをコードする遺伝子の
発現］本発明によるＤＮＡ配列（β-マンナナーゼ酵素
をコードするＤＮＡ断片）を、宿主細胞内で複製可能で
かつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特に
発現ベクターの形態として宿主細胞の形質転換を行なえ
ば、宿主細胞において本発明によるβ-マンナナーゼを
産生させることができる。従って、本発明によれば、さ
らに本発明によるβ-マンナナーゼをコードする遺伝子
を含んだＤＮＡ分子、特に発現ベクターが提供される。
このＤＮＡ分子は、ベクター分子に本発明によるβ-マ
ンナナーゼをコードするＤＮＡ断片を組み込むことによ
って得ることができる。本発明の好ましい態様によれ
ば、このベクターはプラスミドである。本発明によるＤ
ＮＡ配列の作成は、前掲のMolecular Cloning: A Labor
atoryManual (Sambrook、 Maniatis ら、 Cold Spring H
arbour Laboratory Press(1989))に記載の方法に準じて
行なうことができる。

【００１８】本発明において利用されるベクターは、使
用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイルス、プラ
スミド、コスミドベクターなどから適宜選択できる。例
えば、宿主細胞が大腸菌の場合はλファージ系のバクテ
リオファージ、ｐＢＲ、ｐＵＣ系のプラスミド、枯草菌
の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、
ＹＣｐ系のベクター、あるいは後記する実施例で使用さ
れるｐCRAL1’が挙げられる。このプラスミドは形質転
換体の選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカー
としては薬剤耐性マーカー、栄養要求マーカー遺伝子を
使用することができる。さらに、本発明による発現ベク
ターとしてのＤＮＡ分子は、β-マンナナーゼ遺伝子の
発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、転写開
始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写
終結シグナルなどの転写調節信号、翻訳調節信号などを
有しているのが好ましい。

【００１９】プロモーターとしては、挿入断片に含まれ
る宿主中でも機能することができるプロモーターはもち
ろんのこと、大腸菌においてはラクトースオペロン（la
c）、トリプトファンオペロン（trp）等のプロモータ
ー、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）、酸
性フォスファターゼ（PHO）、ガラクトース遺伝子（GA
L）、グリセルアルデビド３リン酸脱水素酵素遺伝子（G
AP）等のプロモーターが好ましく用いることができる。
配列番号２に示している配列はシグナルペプチドを含ん
でおり、後記する実施例で示すようにこの配列をそのま
ま、酵母由来のプロモーター、ターミネーターに挿入し
酵母に導入し分泌発現をさせることができる。シグナル
ペプチドを使用した場合は培養上清からの精製も容易に
なるので好ましい。またシグナルペプチドを酵母由来の
ものに置き換えることも好ましい。

【００２０】宿主細胞としては、大腸菌、酵母以外に、
枯草菌、高等真核生物を用いることができる。枯草菌と
してはBacillus属に属する微生物を用いることが好まし
い。該属は一般的に蛋白質を菌体外へ分泌する。またプ
ロテアーゼを殆ど分泌しない株（例えばBacillus brevi
s）も知られており、このような株を宿主として用いる
ことも好ましい。本発明においては、後記する実施例に
示すように、食用酵母であるCandida utilisを宿主とし
てGAPプロモーターの支配下にこの遺伝子を発現させた
ところ、培地に高い酵素活性が認められた。このことに
より、組換え体において本遺伝子を発現することによっ
て活性型の本β-マンナナーゼを大量に生産可能である
ことが示された。

【００２１】従って本発明は、上記の形質転換細胞を培
養し、この培養物中から、β−マンナンのβ−１，４−
Ｄ−マンノピラノシド結合を非特異的に加水分解して、
マンノースおよびマンノオリゴ糖を生成する活性を有す
るタンパク質を採取することを特徴とする、βーマンナ
ナーゼの製造法にも関する。形質転換細胞の培養は、基
本的に基になる宿主細胞の通常の培養条件と同じ条件で
行なうことができる。培養物（好ましくは、上清もしく
は濾液）から、形質転換体の産生する組換えβ-マンナ
ナーゼを精製するには、公知の分離、精製方法を適当に
組み合わせて行なうことができる。例えば塩沈殿、溶媒
沈殿のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾
過、ゲル濾過およびＳＤＳ-ポリアクリル電気泳動のよ
うな分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグ
ラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマ
トグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性
の差を利用する方法、さらに等電点電気泳動のような等
電点の差を利用する方法等が挙げられる。

【００２２】［酵素タンパク質の用途］本発明による酵
素タンパク質は、コーヒー飲料製造のため（特に、コー
ヒー飲料における沈殿生成防止のため）に使用すること
ができる。すなわち、本発明は、上記のβーマンナナー
ゼ活性を有するタンパク質の、コーヒー飲料製造のため
の使用、および、上記のタンパク質を、コーヒー抽出液
に常温で作用させることを特徴とするコーヒー飲料にお
ける沈殿生成防止法にも関する。

【００２３】本発明において、β-マンナナーゼ酵素タ
ンパク質は、単独または食品用賦形剤、保存料、安定剤
など必要に応じて他の添加剤を含んだ形の酵素剤として
使用される。食用賦形剤としては、一般的な食用賦形
剤、例えば乳糖、ソルビトール、マルチトール、デキス
トリン、グルコース、デンプン類、多糖類、ガム類、ペ
クチン等が使用できる。保存料としては、例えばエタノ
ールやパラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸ナトリウム
などが単独または併用で使用できる。その他、食品に添
加できる通常使用される他の添加剤なども適宜使用でき
る。添加剤の使用量は適宜設定できるが、具体的には例
えば、液状酵素剤（例えば培養上清中）の場合、静菌剤
としてエタノールを１０％、パラオキシ安息香酸エステ
ルを０．０１％添加することができる。また、本発明に
よるβ-マンナナーゼの酵素剤中での配合比率は特に制
限はないが、酵素剤１ｇあたり１〜100,000ユニット、
望ましくは10,000〜50,000ユニットになるように配合す
れば、工業的利用上から望ましい。なお、本明細書で使
用する％表示は、特に断りのない限り重量％を意味す
る。

【００２４】上記のようなβ−マンナナーゼ酵素タンパ
ク質を用いた本発明によるコーヒー飲料の沈殿生成防止
法は、コーヒー抽出液に、本発明によるβ−マンナナー
ゼ酵素タンパク質（もしくは酵素剤）を作用させること
を特徴とするものであり、上記のβ−マンナナーゼ酵素
剤をコーヒー抽出液に作用もしくは接触させる方法であ
る限り特に限定されるものではないが、具体的には、例
えば下記のようにして実施することができる。通常この
方法は、基本的に上記β−マンナナーゼ酵素（もしくは
酵素剤）をコーヒー抽出液に添加して適当な時間、酵素
反応処理に付すことからなるが、この際、上記酵素に加
えて他の沈殿防止剤、例えばアルカリ性ナトリウム塩ま
たはアルカリ性カリウム塩などを添加することも可能で
ある。

【００２５】コーヒー抽出液は、通常焙煎豆から抽出し
た液、それを濃縮したエキス、あるいは一旦インスタン
トコーヒーに加工したものを熱水で溶かした液のいずれ
でも使用可能である。コーヒー飲料としては、コーヒー
抽出液をそのままもしくは熱水等で希釈するものの他、
乳類（全粉乳、脱脂粉乳、牛乳など）、糖類（砂糖な
ど）等の通常コーヒー飲料に使用される添加剤を加えた
ものも対象となる。コーヒー抽出液の上記酵素剤による
処理において、この反応温度、時間、ｐＨ、添加量は酵
素の活性等により適宜設定すればよいが、該酵素剤を用
いる場合、通常、原料の焙煎豆に対して酵素剤を０．０
２％〜４．０％程度になるようにコーヒー抽出液に添加
して、約２０〜７０℃、ｐＨ４〜６の条件で３０分以上
反応させればよいが、好ましくは、酵素剤を０．２〜
２．０％添加して、常温、ｐＨ約５．５の条件で２時間
以上反応させることが望ましい。本発明において、常温
とは、約２０℃〜４０℃の範囲をいうが、好ましい態様
では２５℃〜３５℃である。

【００２６】他の沈殿防止剤としての上記塩（アルカリ
性ナトリウム塩およびアルカリ性カリウム塩）として
は、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素
二ナトリウム、炭酸カリウム等があげられるが、香味の
点からアルカリ性ナトリウム塩が好ましく、特に炭酸水
素ナトリウムが最も好ましい。これらの塩は、最終製品
（水で希釈して焙煎豆含量を一定濃度に調整したもの）
に対して通常０．０３〜０．３０％、好ましくは０．０
５〜０．２０％添加する。添加時期は、酵素反応より前
またはこれと同時であっても良いが、酵素処理後の方が
好ましい。上記酵素処理と塩処理との併用処理による方
法では、特に乳類を添加したコーヒー飲料の場合におい
て、より高い沈殿防止効果を発揮することができる。乳
類を添加したコーヒー飲料の場合の沈殿防止効果につい
ては、特開平７−１８４５４６号公報も参照されたい。

【００２７】添加した本発明酵素タンパク質は、反応後
において特に除去する必要はなく、また、この酵素反応
は、酵素の添加の他に、固定化酵素などによる接触反応
によりコーヒー抽出液中に直接酵素が含まれないように
することも可能である。上述のような本発明の沈殿防止
方法により、常温においても多量の酵素を添加しなくて
も酵素反応を遂行してコーヒー飲料の沈殿防止を可能と
し、これにより酵素蛋白由来の異味を生じることのない
本来の風味を維持したコーヒー飲料を製造することがで
きる。

【００２８】

【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明は以
下の実施例によってその範囲が限定されるものではな
い。また操作手順は特に記載しない限りMolecular Clon
ing:A Laboratory Manual (Sambrook、 Maniatis ら、 C
old Spring Harbour Laboratory Press(1989))に記載の
方法に従った。

【００２９】［実施例１］ 本発明のβ−マンナナーゼ
を産生する微生物 β-マンナナーゼ生産菌、Penicillium multicolor mch1
3-2株は、群馬県の土壌より単離した。１５ｍｌの試験
管に分注した１０ｇ／リットルのローカスト・ビーン・
ガム、１０ｇ／リットルのバクトペプトン（ディフコ社
製）、１ｇ／リットルのイースト・エキストラクト（デ
ィフコ社製）、２ｇ／リットルのリン酸２水素カリウ
ム、及び０．５ｇ／リットルの硫酸マグネシウム・７水
和物からなる液体培地に植菌して振とう培養を行い、β
-マンナナーゼ活性を測定し、最も活性の高い菌株とし
てmch13-2株を得た。なお、本発明のβ-マンナナーゼの
活性測定は次の方法により行った。１０ｇ／リットルの
ローカストビーンガム溶液３ｍｌと１５０ｍＭ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５.０）２ｍｌに被験液１ｍｌを加
えて４０℃で３０分反応させた。反応液中に生じた還元
糖をソモギーネルソン法にて定量した。β-マンナナー
ゼ活性は被験液１ｍｌが１分間に１μmoleのマンノース
に相当する還元力を生じる酵素活性を１Ｕｎｉｔとして
示した。

【００３０】［実施例２］ Penicillium multicolor m
ch13-2由来のβ−マンナナーゼの精製 １０ｇ／リットルのローカスト・ビーン・ガム、１０ｇ
／リットルのバクトペプトン（ディフコ社製）、１ｇ／
リットルのイースト・エキストラクト（ディフコ社
製）、２ｇ／リットルのリン酸２水素カリウム、及び
０．５ｇ／リットルの硫酸マグネシウム・７水和物を含
む培地１リットルを、５リットルのバッフル付き三角フ
ラスコに入れ、１２１℃、４０分滅菌した。Penicilliu
m multicolor mch13-2株を、上記のようにして調製した
５リットル三角フラスコ培地１６本に植菌し、２７℃、
１６０ｒｐｍにて、４日間培養した。培養液はヌッチェ
にて菌体を濾過分離し、培養上清約１４Ｌを得た。な
お、以後の操作は全て４℃にて行った。また、β−マン
ナナーゼ活性測定法は実施例1に記載の方法にて行っ
た。上記のようにして得られた培養上清を、限外濾過膜
（分子量カット１３０００）にて濃縮し、１１８ｍｌの
濃縮液を得た。次に、４０％飽和となるよう硫酸アンモ
ニウムを添加し、１００００×ｇ、１５分間遠心分離
し、活性画分である上清を１２６ｍｌ得た。これに７５
％飽和となるよう硫酸アンモニウムを添加し、１０００
０×ｇ、１５分間遠心分離し、活性画分である沈殿を得
た。上記のように遠心分離して得られた沈澱を１．５Ｍ
の硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、３４ｍｌとした。同緩衝
液にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：TO
SOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650S １２０ｍｌ）に通
した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次に３００ｍｌの
１．５Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配でβ−マンナナーゼを溶
離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１０００
０）にて濃縮し、引き続き５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）にて洗浄、脱塩した。

【００３１】次いで同緩衝液にて平衡化したイオン交換
クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel DEAE-TOY
OPEARL 650S １２０ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液
にて洗浄し、引き続き３００ｍｌの０〜０．５Ｍ食塩の
線状勾配でβ−マンナナーゼを溶離した。活性画分を限
外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮し、引き
続き０．２Ｍの食塩を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄、濃縮した。次に濃縮液を
ゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Pharmacia HiLo
ad 16/60Superdex 200pg ）にアプライし、同緩衝液に
てβ−マンナナーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜
（分子量カット１００００）にて濃縮した。次に、この
濃縮液を２５ｍＭビス・トリス緩衝液（ｐＨ４．８５）
にて平衡化したクロマトフォーカシング（カラム：Phar
macia Mono P HR5/20 ）にアプライし、１０％Polybuff
er 74 （Pharmacia 製、塩酸にてｐＨ３．５に調製した
もの）で目的のβ−マンナナーゼを溶出した。活性画分
を限外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮し
た。最終的にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、
及び等電点電気泳動にて単一バンドを示す精製酵素を得
た。各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比
活性を以下の第１表に示す。なお、蛋白量は、BSA（牛
血清アルブミン）を標準物質として、フォーリン・ロー
リー法にて測定した。

【００３２】 第１表 精製画分 総酵素活性 総蛋白量 比活性 回収率 精製度 （Units ） （ｍｇ） （Units/mg）（％） （倍） 培養上清 201544 1439.6 140 100 1 硫安40-75％ 151980 775.2 196 75.4 1.4 飽和分画 Phenylトヨパール 23077 153.7 150 11.5 1.1 DEAEトヨパール 12922 54.5 237 6.4 1.69 ゲル濾過 5532 22.6 246 2.7 1.76 Mono P 2845 11.6 245 1.4 1.75 分子量の測定はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
により行った。マーカータンパク質として２００,００
０、１１６,３００、９７,４００、６６,３００、５５,
４００、３６,５００、３１,０００、２１,５００、１
４,４００を用いた。その結果、本酵素は糖鎖がついて
いると考えられ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動のバンドはスメアになった。分子量範囲は４２,００
０〜４５,０００であり、メインバンドの分子量は４３,
０００であった。

【００３３】［実施例３］ β-マンナナーゼの精製およ
び部分アミノ酸配列の決定Penicillium multicolor mch13-2株において上記酵素は
分子量約４２,０００〜４５,０００であった。上記β-
マンナナーゼについて、部分アミノ酸配列分析を岩松
（生化学 ６３、１３９〜１４３（１９９１））の方法
により、またＮ末端アミノ酸配列分析をMatsudaira T
(J. Biol.Chem. 262, 10035〜10038 ( 1987))の方法に
より行なった。精製酵素を泳動用緩衝液（１０％グリセ
ロール、２.５％ＳＤＳ、２％ ２-メルカプトエタノー
ル、６２ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６.８））に懸濁
させて、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供した。
泳動後、エレクトロブロッティングにより当該酵素をゲ
ルより１０ｃｍＸ７ｃｍのＰＶＤＦ膜（（ＰｒｏＢｌｏ
ｔ）アプライド バイオシステムズ）へ転写した。エレ
クトロブロッティング装置としてはザルトブロットＩＩ
ｓ型（ザルトリウス社）を用い、（島津製作所編の（プ
ロテインシーケンサの試料前処理方法について（１））
にしたがって、エレクトロブロッティングを１６０ｍＡ
で１時間行なった。こののち、ＰＶＤＦ膜を水で充分洗
浄し、１ｍｍ四方に切断した膜を消化用緩衝液（８％ア
セトニトリル、９０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９.
０））に浸し、アクロモバクタープロテアーゼＩ（和光
純薬）を１ｐｍｏｌ加え、３７℃で１５時間消化した。
アクロモバクタープロテアーゼＩ消化後、ＰＶＤＦ膜を
取り出し水で充分洗浄し、その膜を消化用緩衝液（８％
アセトニトリル、３０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液
（ｐＨ７．８））に浸し、エンドプロテイナーゼAsp-N
（ベーリンガー）を１ｐｍｏｌ加え、４０℃で１５時間
消化した。それぞれの消化物をＣ１８カラム（和光純薬
Wakosil AR II C18 300Å 2.0X150mm ）を用いた逆相
高速液体クロマトグラフィー（日立 Ｌ６２００）によ
り分離し、各サブユニットについて１１種類のペプチド
断片を得た。ペプチドの溶出溶媒としてはＡ溶媒（０.
０５％トリフルオロ酢酸）、Ｂ溶媒（０.０２％トリフ
ルオロ酢酸を含む２-プロパノール/アセトニトリル
７：３）を用い、溶出はＢ溶媒に関し、２〜５０％の直
線濃度勾配で０.２５ｍＬ/ｍｉｎの流速で４０分間溶出
させることにより行なった。得られた断片化ペプチドに
ついてのアミノ酸配列決定試験を、気相プロテインシー
クエンサーＰＰＳＯ-１０型（島津製作所）を用いマニ
ュアルに従って自動エドマン分解法により行なった。以
下に得られた部分アミノ酸配列を記す。なお消化に用い
たアクロモバクタープロテアーゼＩはリジン残基のカル
ボキシル基側を特異的に切断する為、以下の配列にＮ末
端側に括弧書きでＫ（リジン）を記す。 部分アミノ酸配列 AP-２ (K) AVVSRY AP-３ (K) ACVAAQKPCV AP-４ (K) CLVTDH AP- 6 (K) VYFQLLQNGTA DN- 2 EEYGVTT DN- 5 DDYTIYRGT DN- 9 DEGFGLNVGS DN- 10 SLDPEHMVAI DN- 12 DGSYPYTFAEG DN- 13 DLFWQY DN- 14 DGQANYIPGT

【００３４】［実施例４］ Penicillium multicolor m
ch13-2株cDNAライブラリーの作製 実施例２に記載の方法に従って、Penicillium multicol
or mch13-2株の菌体を取得した。菌体１１.８ｇよりRNA
Extraction Kit（Pharmacia Biotech）を用いてトータ
ルRNAを抽出した。抽出したトータルRNAからmRNA Purif
ication Kit （Pharmacia Biotech）を用いてmRNAを精
製した。mRNAよりoligo（dT）をプライマーとしてSuper
ScriptTM Choice System for cDNA Synthesisキット（G
IBCO BRL）を用いてcDNAを合成しEcoRIアダプターを接
続し、EcoRIで消化したλZipLoxTM（GIBCO BRL）に接続
（ライゲーション）した。GigapackIII Gold（Stratage
ne）を用いてパッケージングを行いライブラリーを完成
させた。

【００３５】［実施例５］ β-マンナナーゼcDNAのク
ローニング 部分アミノ酸配列AP-3、DN-2、DN-9、DN-5、DN-12をも
とにそれぞれセンス、アンチセンスプライマーを設計
し、実施例４で得たｍRNAを鋳型として２０通りのPCRを
行なった。結果、DN-9をセンスプライマーとして、DN-5
をアンチセンスプライマーとした組み合わせに増幅断片
が認められた。以下にDN- 9 （センスプライマー）、DN
- 5 （アンチセンスプライマー） の配列を示す。使用
している記号は全てＩＵＰＡＣ-ＩＵＢに基づく。 DN- 9 DEGFGLNVGS TTYGGNYTNAAYGTNGG（センスプライマー） DN- 5 DDYTIYRGT TADATNGTRTARTCRTC（アンチセンスプライマー）

【００３６】上記プライマーを用いて実施例４で得たmR
NAを鋳型としてＲＴ-ＰＣＲを行なった。逆転写反応は
ランダムプライマー（宝酒造）を用いて、逆転写酵素は
Super Script TM RNaseH Reverse Transcriptase (GIBC
O-BRL)を用い、添付のバッファーを用いて行なった。Ｐ
ＣＲの条件は９５度３０秒、５０度１分、７２度１分で
２５サイクル行なった。結果、約０.４ｋｂの断片が増
幅された。この断片についてＴＡクローニングキット
（Invitrogen）を用いてpT7Blueにサブクローニングを
行なった。この断片について塩基配列をオートシークエ
ンサーＡＢＩ３７０Ａ（アプライド バイオシステム
ズ）を用いて両側から決定し、アミノ酸配列に変換した
ところDN- 9、DN-5と共にDN- 12、AP- 3、DN -2の配列
が存在し、この断片がβ-マンナナーゼ遺伝子の一部で
あることを確認した。上記約０.４ｋｂの断片をプロー
ブとしてスクリーニングに用いた。プローブはMegaprim
e DNAlabelling systems (Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いα
-３２Ｐ ｄＣＴＰ（１１０ＴＢｑ/ｍｍｏｌ）でラベル
を行ない、ライブラリーより約５０，０００クローンか
らプラークハイブリダイゼーションを行ない、６個のポ
ジティブクローンを得た。３個のクローン（No.１、
６、１１）について２次スクリーニングを実施してシン
グルプラークを得た。これらのクローンについては、キ
ットに添付の方法に従って、ファージベクターよりイン
サートを含むプラスミドベクター（ｐZL1のEcoRI部位に
インサートを含む形）の形に変換した。マルチクローニ
ングサイトの両側より塩基配列決定を行なったところこ
れらのクローンは全て同一の領域を含むことが明かにな
った。最も長い領域をコードしていたNo.６のクローン
について同プラスミドをpMNと命名した。その後挿入さ
れていた約１．４ｋｂのEcoRI断片について塩基配列の
決定を行なった。すなわち、pBluescriptII KS+ (Strat
egene)、またはpUC118(宝酒造)に細分化した断片をサブ
クローニングし、さらにエキソヌクレアーゼIIIおよび
マングビーンヌクレアーゼを用いた連続した欠失変異体
を作製することにより、種々の変異欠失をもつプラスミ
ドを作製し、インサート領域が1377bpからなるEcoRI断
片の配列を決定した（配列番号１）。予想される構造遺
伝子の領域の解析を行なったところ、389個から構成さ
れるアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフ
レームが存在した（配列番号２）。このアミノ酸配列が
決定した部分アミノ酸配列の全てを含んでいることを確
認した。またこのアミノ酸配列をＳｗｉｓｓｐｒｏｔに
てホモロジー検索をかけたところ、７０％以上の相同性
を示す配列は見つからなかった。

【００３７】［実施例６］ β-マンナナーゼのオープ
ンリーディングフレームの取得 実施例５で確認した389アミノ酸をコードしているオー
プンリーディングフレームについて、５’上流側にXbaI
サイト、３’側にBamHIサイトを付加し、実施例５で得
られたプラスミド、pMNを鋳型としてＰＣＲを行ない増
幅断片を得た。以下にセンス、アンチセンスのプライマ
ー配列を記す。 MAN all F（センスプライマー） GGTCTAGACATGTGCTTGAATATGCAATTC MAN R （アンチセンスプライマー） CCGGATCCGTTAAATCCCGGCGACATG また配列番号２の５番目のアミノ酸（配列番号１の３２
番目の塩基よりコードするアミノ酸）もメチオニン（Me
t）であることから、同アミノ酸をＮ末端とするオープ
ンリーディングフレームについても同様に５’上流側に
XbaIサイト、３’側にBamHIサイトを付加する形で構築
を試みた。以下にセンスプライマーの配列を記す。アン
チセンスプライマーは上記Man Rを使用した。 MAN all F2（センスプライマー） AGTCTAGAATATGCAATTCTCTACTATCC MAN all FとMAN R の組み合わせ、およびMAN all F2とM
AN R の組み合わせでそれぞれPCRを行ないpUC118ののXb
aI、BamHI部位に挿入し、それぞれpUCMAN1およびpUCMAN
2と命名した。

【００３８】［実施例７］ Candida utilis組み込み用
β-マンナナーゼ発現ベクターの構築Candida utilisで発現を行なうための発現ベクターの構
築を行なった。rDNA断片についてpCLRE2（近藤ら J.
Bacteriol. 177:7171-7177 1995）よりApaIで部分消化
することにより、約1.2kbの断片を得た。同断片につい
てpBluescriptSK-のApaI部位に挿入した。同プラスミド
をｐCRA1と命名した。シクロヘキシミド耐性遺伝子（L4
1遺伝子）についてセンスプライマーとしてL5PstIプラ
イマー（CCTGCAGAGGAAACGTAAACAAAGAGGTTTCA）を、アン
チセンスプライマーとしてL3SalIプライマー（GGTCGACG
CTCGCTTTTGTGCGTGTGTGCATT）を用いて、上記pCLRE2を鋳
型としてPCRにより増幅し得た。同断片についてPstI、S
alIで消化した後、上記ｐCRA1についてXhoI、PstI消化
を行ない同部位に挿入した。作成されたプラスミドをｐ
CRAL1と命名した。ｐCRAL1についてXbaIで消化を行なっ
たのちに、クレノウ酵素（宝酒造）で修復を行ない、DN
Aリガーゼ（宝酒造）で連結を行ないｒDNA内のXbaI認識
部位を除いた。同プラスミドについてｐCRAL1’と命名
した（図１）。実施例６で得られたpUCMAN1およびpUCMA
N2より、β-マンナナーゼ遺伝子をXbaI-BamHI断片とし
て切り出し、Candida utilisのGAP1プロモーター、およ
びターミネーターを含み、プロモーターとターミネータ
ーの間にXbaI、BamHI 部位を有するpGAPPT10ベクター
（特願平11‐009276）の同該部位に挿入した。このプラ
スミドをそれぞれpGAPMAN1、pGAPMAN2と命名した。同プ
ラスミドよりGAPプロモーター、β-マンナナーゼ遺伝
子、ＧＡＰターミネーターを含む断片をそれぞれNotI‐
PstI断片として回収し、上記ｐCRAL1’のNotI、PstI部
位に挿入した。同プラスミドについてそれぞれｐPMN1、
ｐPMN2と命名した（図２）。

【００３９】［実施例８］ β-マンナナーゼのCandida
utilisでの発現、および同組換えβ-マンナナーゼの製
造 プラスミド、ｐPMN1、ｐPMN2について各１０μｇ、XhoI
で分解した後、Candida utilisＡＴＣＣ９９５０株を形
質転換した。形質転換は電気パルス法（ＷＯ/９５/３２
２８９号参照）により行なった。パルス条件は電気容量
を２５μＦ、抵抗値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ/
ｃｍとして行なった。ｐPMN1（IFO0098PMN1）、ｐPMN2
由来の株について１株ずつ、１５ｍｌの試験管に分注し
た２０ｇ／リットルのグルコース、２０ｇ／リットルの
バクトペプトン（ディフコ社製）、１０ｇ／リットルの
イースト・エキストラクト（ディフコ社製）、４０μg/
ｍｌのシクロヘキシミド（ｐＨ５.８）からなる液体培
地に植菌して振とう培養を行い、培養液中に分泌された
βーマンナナーゼ活性を実施例１の方法に従い、測定し
た。その結果、ｐPMN1由来の株では１３．６Ｕｎｉｔ/
ｍｌ、ｐPMN2由来の株では１２．６Ｕｎｉｔ/ｍｌであ
った。したがって、配列番号２の１〜３８９番、５〜３
８９番のいずれの配列でも同等のβーマンナナーゼ活性
が得られることが明らかとなった。そこでｐＰＭＮ１由
来の株についてＩＦＯ００９８ＰＭＮ１と命名した。

【００４０】

【発明の効果】本発明によれば、特にコーヒー飲料にお
ける沈殿生成防止に極めて有用な酵素タンパク質が提供
され、かつ該タンパク質を大量生産する技術を提供する
ことが可能となった。すなわち、本発明によるβーマン
ナナーゼ酵素タンパク質は、常温で反応性が高く比活性
も高いという特性から、特に、コーヒー本来の風味、品
質を損なわない沈殿防止方法を提供する上で重要な酵素
であり、また本発明によって得られた形質転換体は本酵
素を著量に生産することができるため、これら酵素を用
いる産業界に大いに貢献するものである。

【００４１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kirin Beer Kabushiki Kaisha <120> New Beta Mannanase Gene and Use Thereof <130> 128952 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1377 <212> DNA <213> penicillium multicolor <220> <221> CDS <222> (20)..(1186) <400> 1 attcaatgtt gcctcgtcc atg tgc ttg aat atg caa ttc tct act atc ctt 52 Met Cys Leu Asn Met Gln Phe Ser Thr Ile Leu 1 5 10 ctc tcc att acc tgt ctg gtt gct cag gta gca gcc acc cat cca aat 100 Leu Ser Ile Thr Cys Leu Val Ala Gln Val Ala Ala Thr His Pro Asn 15 20 25 ctg cat tca att ggc aaa ccg cga aat gct gtg aca cat gtt cgc cga 148 Leu His Ser Ile Gly Lys Pro Arg Asn Ala Val Thr His Val Arg Arg 30 35 40 aac gcc acc ggt act gct gtt ccc ggc act caa ggg gtg aac ttc aca 196 Asn Ala Thr Gly Thr Ala Val Pro Gly Thr Gln Gly Val Asn Phe Thr 45 50 55 atc gac ggc cag gca aac tac atc ccc gga aca aac agc tac tgg att 244 Ile Asp Gly Gln Ala Asn Tyr Ile Pro Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile 60 65 70 75 ggc tac ctg acc aac aat tcc gat gtc gat gcc gtg ctc gat cac atg 292 Gly Tyr Leu Thr Asn Asn Ser Asp Val Asp Ala Val Leu Asp His Met 80 85 90 tca gag tcc ggc ctc cgg gtc ctt cga gtc tgg ggc ttc agc gat gtc 340 Ser Glu Ser Gly Leu Arg Val Leu Arg Val Trp Gly Phe Ser Asp Val 95 100 105 aac agc aag cct acc gat ggc aaa gtg tac ttc cag cta ctg caa aat 388 Asn Ser Lys Pro Thr Asp Gly Lys Val Tyr Phe Gln Leu Leu Gln Asn 110 115 120 gga acg gca acc atc aac acc ggt gct gat ggt ctc cag cgt ctg gac 436 Gly Thr Ala Thr Ile Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp 125 130 135 tac gtt gtc tct gct gcc gag aag cgg gat atc aaa ctg atc atc aac 484 Tyr Val Val Ser Ala Ala Glu Lys Arg Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn 140 145 150 155 ttt gtc aac aac tgg tct gac tat ggg ggt ttc aat gcg tac aat gtt 532 Phe Val Asn Asn Trp Ser Asp Tyr Gly Gly Phe Asn Ala Tyr Asn Val 160 165 170 gca ttt gga ggt tcc agt acg agc tgg tat act act ccg gtg att caa 580 Ala Phe Gly Gly Ser Ser Thr Ser Trp Tyr Thr Thr Pro Val Ile Gln 175 180 185 gat gcc tac aag aca tac atc aag gct gtt gtt tcg cga tac agt aag 628 Asp Ala Tyr Lys Thr Tyr Ile Lys Ala Val Val Ser Arg Tyr Ser Lys 190 195 200 tct tcg gct ata ttt gcg tgg gaa ttg gcc aat gag ccc cgt tgc agt 676 Ser Ser Ala Ile Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Ser 205 210 215 ggt tgc aac acg tcg gtc atc tat aat tgg gct tcc tct act agt gcc 724 Gly Cys Asn Thr Ser Val Ile Tyr Asn Trp Ala Ser Ser Thr Ser Ala 220 225 230 235 tat atc aag tcc ctc gat cct gag cac atg gta gct att gga gat gag 772 Tyr Ile Lys Ser Leu Asp Pro Glu His Met Val Ala Ile Gly Asp Glu 240 245 250 ggg ttt ggt ctg aat gtc ggc tca gat gga agc tac ccg tac aca ttc 820 Gly Phe Gly Leu Asn Val Gly Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe 255 260 265 gca gag gga ctt gac ttt gca aag aat tta cag atc gac act atc gac 868 Ala Glu Gly Leu Asp Phe Ala Lys Asn Leu Gln Ile Asp Thr Ile Asp 270 275 280 ttt gga act ttc cat ctg tac cca tcg acc tgg agc gtc ccc aac aca 916 Phe Gly Thr Phe His Leu Tyr Pro Ser Thr Trp Ser Val Pro Asn Thr 285 290 295 ttc gga aac ggc tgg ata aca gcc cac gcc aaa gcc tgc gtc gca gca 964 Phe Gly Asn Gly Trp Ile Thr Ala His Ala Lys Ala Cys Val Ala Ala 300 305 310 315 caa aaa ccc tgc gtc atg gaa gag tac ggg gtc aca aca gac aaa tgc 1012 Gln Lys Pro Cys Val Met Glu Glu Tyr Gly Val Thr Thr Asp Lys Cys 320 325 330 aca atc gaa ggc caa tgg cag gga aca gcc att gaa aca cct gga att 1060 Thr Ile Glu Gly Gln Trp Gln Gly Thr Ala Ile Glu Thr Pro Gly Ile 335 340 345 ggt gca gat ctc ttc tgg cag tat gga gac agt ctc agt tca gga aac 1108 Gly Ala Asp Leu Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Ser Leu Ser Ser Gly Asn 350 355 360 tcg cct aat gat gac tat act att tac cgt ggc acg gat gac tat aag 1156 Ser Pro Asn Asp Asp Tyr Thr Ile Tyr Arg Gly Thr Asp Asp Tyr Lys 365 370 375 tgt ctt gtt act gat cat gtc gcc ggg att taactacatc cagatggatc 1206 Cys Leu Val Thr Asp His Val Ala Gly Ile 380 385 gacaaggaag ttgacgaatc tgggttcctg cagtttagca cggaactctt cggctagtct 1266 tatggatgta acattagtta gttcgagctt ttgttcatag gtctattcta gccaatcaat 1326 ttcttgtgta ggtgtcttag gcactttctt cagctcaaaa aaaaaaaaaa a 1377 <210> 2 <211> 389 <212> PRT <213> penicillium multicolor <400> 2 Met Cys Leu Asn Met Gln Phe Ser Thr Ile Leu Leu Ser Ile Thr Cys 1 5 10 15 Leu Val Ala Gln Val Ala Ala Thr His Pro Asn Leu His Ser Ile Gly 20 25 30 Lys Pro Arg Asn Ala Val Thr His Val Arg Arg Asn Ala Thr Gly Thr 35 40 45 Ala Val Pro Gly Thr Gln Gly Val Asn Phe Thr Ile Asp Gly Gln Ala 50 55 60 Asn Tyr Ile Pro Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Tyr Leu Thr Asn 65 70 75 80 Asn Ser Asp Val Asp Ala Val Leu Asp His Met Ser Glu Ser Gly Leu 85 90 95 Arg Val Leu Arg Val Trp Gly Phe Ser Asp Val Asn Ser Lys Pro Thr 100 105 110 Asp Gly Lys Val Tyr Phe Gln Leu Leu Gln Asn Gly Thr Ala Thr Ile 115 120 125 Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser Ala 130 135 140 Ala Glu Lys Arg Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Asn Trp 145 150 155 160 Ser Asp Tyr Gly Gly Phe Asn Ala Tyr Asn Val Ala Phe Gly Gly Ser 165 170 175 Ser Thr Ser Trp Tyr Thr Thr Pro Val Ile Gln Asp Ala Tyr Lys Thr 180 185 190 Tyr Ile Lys Ala Val Val Ser Arg Tyr Ser Lys Ser Ser Ala Ile Phe 195 200 205 Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Ser Gly Cys Asn Thr Ser 210 215 220 Val Ile Tyr Asn Trp Ala Ser Ser Thr Ser Ala Tyr Ile Lys Ser Leu 225 230 235 240 Asp Pro Glu His Met Val Ala Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly Leu Asn 245 250 255 Val Gly Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Ala Glu Gly Leu Asp 260 265 270 Phe Ala Lys Asn Leu Gln Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr Phe His 275 280 285 Leu Tyr Pro Ser Thr Trp Ser Val Pro Asn Thr Phe Gly Asn Gly Trp 290 295 300 Ile Thr Ala His Ala Lys Ala Cys Val Ala Ala Gln Lys Pro Cys Val 305 310 315 320 Met Glu Glu Tyr Gly Val Thr Thr Asp Lys Cys Thr Ile Glu Gly Gln 325 330 335 Trp Gln Gly Thr Ala Ile Glu Thr Pro Gly Ile Gly Ala Asp Leu Phe 340 345 350 Trp Gln Tyr Gly Asp Ser Leu Ser Ser Gly Asn Ser Pro Asn Asp Asp 355 360 365 Tyr Thr Ile Tyr Arg Gly Thr Asp Asp Tyr Lys Cys Leu Val Thr Asp 370 375 380 His Val Ala Gly Ile 385 <210> 3 <211> 1170 <212> DNA <213> penicillium multicolor <220> <221> CDS <222> (1)..(1167) <400> 3 atg tgc ttg aat atg caa ttc tct act atc ctt ctc tcc att acc tgt 48 Met Cys Leu Asn Met Gln Phe Ser Thr Ile Leu Leu Ser Ile Thr Cys 1 5 10 15 ctg gtt gct cag gta gca gcc acc cat cca aat ctg cat tca att ggc 96 Leu Val Ala Gln Val Ala Ala Thr His Pro Asn Leu His Ser Ile Gly 20 25 30 aaa ccg cga aat gct gtg aca cat gtt cgc cga aac gcc acc ggt act 144 Lys Pro Arg Asn Ala Val Thr His Val Arg Arg Asn Ala Thr Gly Thr 35 40 45 gct gtt ccc ggc act caa ggg gtg aac ttc aca atc gac ggc cag gca 192 Ala Val Pro Gly Thr Gln Gly Val Asn Phe Thr Ile Asp Gly Gln Ala 50 55 60 aac tac atc ccc gga aca aac agc tac tgg att ggc tac ctg acc aac 240 Asn Tyr Ile Pro Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Tyr Leu Thr Asn 65 70 75 80 aat tcc gat gtc gat gcc gtg ctc gat cac atg tca gag tcc ggc ctc 288 Asn Ser Asp Val Asp Ala Val Leu Asp His Met Ser Glu Ser Gly Leu 85 90 95 cgg gtc ctt cga gtc tgg ggc ttc agc gat gtc aac agc aag cct acc 336 Arg Val Leu Arg Val Trp Gly Phe Ser Asp Val Asn Ser Lys Pro Thr 100 105 110 gat ggc aaa gtg tac ttc cag cta ctg caa aat gga acg gca acc atc 384 Asp Gly Lys Val Tyr Phe Gln Leu Leu Gln Asn Gly Thr Ala Thr Ile 115 120 125 aac acc ggt gct gat ggt ctc cag cgt ctg gac tac gtt gtc tct gct 432 Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser Ala 130 135 140 gcc gag aag cgg gat atc aaa ctg atc atc aac ttt gtc aac aac tgg 480 Ala Glu Lys Arg Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Asn Trp 145 150 155 160 tct gac tat ggg ggt ttc aat gcg tac aat gtt gca ttt gga ggt tcc 528 Ser Asp Tyr Gly Gly Phe Asn Ala Tyr Asn Val Ala Phe Gly Gly Ser 165 170 175 agt acg agc tgg tat act act ccg gtg att caa gat gcc tac aag aca 576 Ser Thr Ser Trp Tyr Thr Thr Pro Val Ile Gln Asp Ala Tyr Lys Thr 180 185 190 tac atc aag gct gtt gtt tcg cga tac agt aag tct tcg gct ata ttt 624 Tyr Ile Lys Ala Val Val Ser Arg Tyr Ser Lys Ser Ser Ala Ile Phe 195 200 205 gcg tgg gaa ttg gcc aat gag ccc cgt tgc agt ggt tgc aac acg tcg 672 Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Ser Gly Cys Asn Thr Ser 210 215 220 gtc atc tat aat tgg gct tcc tct act agt gcc tat atc aag tcc ctc 720 Val Ile Tyr Asn Trp Ala Ser Ser Thr Ser Ala Tyr Ile Lys Ser Leu 225 230 235 240 gat cct gag cac atg gta gct att gga gat gag ggg ttt ggt ctg aat 768 Asp Pro Glu His Met Val Ala Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly Leu Asn 245 250 255 gtc ggc tca gat gga agc tac ccg tac aca ttc gca gag gga ctt gac 816 Val Gly Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Ala Glu Gly Leu Asp 260 265 270 ttt gca aag aat tta cag atc gac act atc gac ttt gga act ttc cat 864 Phe Ala Lys Asn Leu Gln Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr Phe His 275 280 285 ctg tac cca tcg acc tgg agc gtc ccc aac aca ttc gga aac ggc tgg 912 Leu Tyr Pro Ser Thr Trp Ser Val Pro Asn Thr Phe Gly Asn Gly Trp 290 295 300 ata aca gcc cac gcc aaa gcc tgc gtc gca gca caa aaa ccc tgc gtc 960 Ile Thr Ala His Ala Lys Ala Cys Val Ala Ala Gln Lys Pro Cys Val 305 310 315 320 atg gaa gag tac ggg gtc aca aca gac aaa tgc aca atc gaa ggc caa 1008 Met Glu Glu Tyr Gly Val Thr Thr Asp Lys Cys Thr Ile Glu Gly Gln 325 330 335 tgg cag gga aca gcc att gaa aca cct gga att ggt gca gat ctc ttc 1056 Trp Gln Gly Thr Ala Ile Glu Thr Pro Gly Ile Gly Ala Asp Leu Phe 340 345 350 tgg cag tat gga gac agt ctc agt tca gga aac tcg cct aat gat gac 1104 Trp Gln Tyr Gly Asp Ser Leu Ser Ser Gly Asn Ser Pro Asn Asp Asp 355 360 365 tat act att tac cgt ggc acg gat gac tat aag tgt ctt gtt act gat 1152 Tyr Thr Ile Tyr Arg Gly Thr Asp Asp Tyr Lys Cys Leu Val Thr Asp 370 375 380 cat gtc gcc ggg att taa 1170 His Val Ala Gly Ile 385

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpCRAL1’の構築方法を示した説明
図。

【図２】プラスミドｐPMN1の制限酵素地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 9/24 (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 加 藤 優 群馬県高崎市宮原町３番地 麒麟麦酒株式 会社研究開発部応用開発センター内 (72)発明者 岩 松 明 彦 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−５ 麒 麟麦酒株式会社基盤技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA12 CA01 DA12 FA02 HA01 4B027 FB21 FB22 FC05 FK07 FQ16 FQ19 4B050 CC01 CC03 DD03 DD04 FF04E FF05E FF11E FF12E FF13E LL02 4B065 AA67Y AA73X AB01 AC14 BA02 CA20 CA21 CA31 CA41

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号２のアミノ酸番号１〜３８９で示
   されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１
   もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付
   加されたアミノ酸配列を有し、かつβ−マンナンのβ−
   １，４−Ｄ−マンノピラノシド結合を非特異的に加水分
   解して、マンノースおよびマンノオリゴ糖を生成する活
   性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】配列番号２のアミノ酸番号５〜３８９で示
   されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１
   もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付
   加されたアミノ酸配列を有し、かつβ−マンナンのβ−
   １，４−Ｄ−マンノピラノシド結合を非特異的に加水分
   解して、マンノースおよびマンノオリゴ糖を生成する活
   性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】請求項１または２に記載のＤＮＡ配列を含
   有する発現ベクター。
4. 【請求項４】請求項３に記載の発現ベクターにより形質
   転換された細胞。
5. 【請求項５】宿主細胞が酵母である、請求項４記載の形
   質転換細胞。
6. 【請求項６】酵母がCandida utilisである、請求項５記
   載の形質転換細胞。
7. 【請求項７】構造遺伝子として請求項１または２に記載
   のＤＮＡ配列を含有し、プロモーターとしてグリセルア
   ルデヒド３リン酸脱水素酵素遺伝子のプロモーターを含
   有する発現ベクターにより形質転換された細胞。
8. 【請求項８】宿主細胞が酵母である、請求項７記載の形
   質転換細胞。
9. 【請求項９】酵母がCandida utilisである、請求項８記
   載の形質転換細胞。
10. 【請求項１０】請求項４〜９のいずれか１項に記載の形
    質転換細胞を培養し、この培養物中から、β−マンナン
    のβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合を非特異的に
    加水分解して、マンノースおよびマンノオリゴ糖を生成
    する活性を有するタンパク質を採取することを特徴とす
    る、βーマンナナーゼの製造法。
11. 【請求項１１】形質転換細胞が、構造遺伝子として請求
    項１または２に記載のＤＮＡ配列を含有し、プロモータ
    ーとしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素遺伝子
    のプロモーターを含有する発現ベクターにより形質転換
    されたCandida utilisである、請求項１０記載のβーマ
    ンナナーゼの製造法。
12. 【請求項１２】遺伝子組換え法によって得られ、配列番
    号２のアミノ酸番号1〜３８９で示されるアミノ酸配
    列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数のア
    ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸
    配列を有し、かつβ−マンナンのβ−１，４−Ｄ−マン
    ノピラノシド結合を非特異的に加水分解して、マンノー
    スおよびマンノオリゴ糖を生成する活性を有するタンパ
    ク質。
13. 【請求項１３】遺伝子組換え法によって得られ、配列番
    号２のアミノ酸番号５〜３８９で示されるアミノ酸配
    列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数のア
    ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸
    配列を有し、かつβ−マンナンのβ−１，４−Ｄ−マン
    ノピラノシド結合を非特異的に加水分解して、マンノー
    スおよびマンノオリゴ糖を生成する活性を有するタンパ
    ク質。
14. 【請求項１４】請求項１２または１３に記載のβーマン
    ナナーゼ活性を有するタンパク質を、コーヒー抽出液に
    常温で作用させることを特徴とする、コーヒー飲料にお
    ける沈殿生成防止法。
15. 【請求項１５】請求項１２または１３に記載のβーマン
    ナナーゼ活性を有するタンパク質の、コーヒー飲料製造
    のための使用。