CN111925999B

CN111925999B - 一种泰乐菌素还原酶突变体及其用途

Info

Publication number: CN111925999B
Application number: CN202010772169.4A
Authority: CN
Inventors: 苏建宇; 岳思君; 刘永衡; 朱慧
Original assignee: Ningxia University
Current assignee: Ningxia University
Priority date: 2020-08-04
Filing date: 2020-08-04
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2040-08-04
Also published as: CN111925999A

Abstract

本发明提供了一种泰乐菌素还原酶突变体，其是对泰乐菌素还原酶基因第640‑642位碱基进行定点突变，使之形成终止密码子，突变菌株合成泰乐菌素还原酶蛋白时，肽链延伸至第213位氨基酸时终止，形成只包含一个结构域的不完整酶蛋白。本发明突变体在保留该酶部分活性的同时，显著降低其对泰乐菌素的还原活性，从而显著降低了发酵产物中雷洛霉素的含量，提高了泰乐菌素有效成分的积累水平，同时又不影响弗氏链霉菌的正常生长，最终提升了泰乐菌素的产品质量。

Description

一种泰乐菌素还原酶突变体及其用途

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种泰乐菌素还原酶突变体及其用途。

背景技术

泰乐菌素是广泛应用于兽药及饲料添加剂的兽用抗生素，工业生产中主要采用弗氏链霉菌作为生产菌株。泰乐菌素主要由泰乐菌素A(tylosin)、脱碳霉糖泰乐菌素B(desmycosin)、大菌素C(macrocin)和雷洛菌素D(relomycin)4种组分构成，其中泰乐菌素A是最主要的活性组分，因此泰乐菌素A的含量是衡量泰乐菌素发酵产品的标准，实际生产中要求泰乐菌素4种组分含量必须大于95％，其中泰乐菌素A必须达到80％以上。由于发酵生产中泰乐菌素高水平的积累容易导致部分泰乐菌素A转化为雷洛菌素D，因此最终降低了泰乐菌素产品的质量。

泰乐菌素还原酶(Tylosin reductase)是催化泰乐菌素A组分还原为雷洛菌素D组分的酶。泰乐菌素还原酶以NAD为辅酶，属醛酮还原酶超家族，该酶含有一个996个核苷酸的开放阅读框，由331个氨基酸残基构成，包括两个蛋白结构域。虽然敲除泰乐菌素还原酶基因可以终止泰乐菌素A转化为雷洛菌素的还原过程，但同时弗氏链霉菌的正常生长也受到影响，致使这种基因敲除菌株不具有生产价值。

发明内容

针对现有技术不足，本发明旨在提供一种泰乐菌素还原酶突变体及其用途，利用定点突变技术来对泰乐菌素还原酶的基因序列进行改造，从而降低泰乐菌素还原酶的活性，进而降低泰乐菌素还原活性，提高泰乐菌素产品的质量。

本发明目的之一是提供一种能够降低泰乐菌素还原活性的泰乐菌素还原酶突变体。所述泰乐菌素还原酶突变体的氨基酸序列是由如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第214位的色氨酸突变为终止子得到的氨基酸序列。

优选地，所述泰乐菌素还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明目的之二是提供所述泰乐菌素还原酶突变体的编码基因。所述编码基因是由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第640-642位的碱基TGG替换为TGA、TAG或TAA，最终形成相应的终止密码子UGA、UAG或UAA。

优选地，所述泰乐菌素还原酶突变体的编码基因如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示。

本发明目的之三是提供所述泰乐菌素还原酶突变体催化泰乐菌素A还原为雷洛菌素的用途。

本发明目的之四是提供所述泰乐菌素还原酶突变体在降低对泰乐菌素还原活性中的用途。

本发明目的之五是提供包含所述泰乐菌素还原酶突变体的重组载体或宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。

优选地，所述宿主细胞为弗氏链霉菌。

本发明目的之六是提供所述重组载体或宿主细胞制备泰乐菌素的用途。

本发明目的之七是提供所述泰乐菌素还原酶突变体的制备方法，对包含所述泰乐菌素还原酶突变体的宿主细胞进行培养，当发酵液OD₆₀₀达到0.6时，添加0.5mM诱导剂IPTG，并从培养物中分离纯化泰乐菌素还原酶突变体。

优选地，所述制备方法步骤如下：将包含所述泰乐菌素还原酶突变体的宿主细胞以1：50V/V的接种量转接于发酵培养基中，于20℃、150r/min发酵培养，当发酵液OD₆₀₀达到0.6时，添加0.5mM诱导剂IPTG，共计发酵培养12h，分离纯化蛋白，获得泰乐菌素还原酶突变体。

本发明的有益效果：

泰乐菌素主要由泰乐菌素A(tylosin)、脱碳霉糖泰乐菌素B(desmycosin)、大菌素C(macrocin)和雷洛菌素D(relomycin)4种组分构成，其中泰乐菌素A活性最高，是衡量泰乐菌素发酵产品的标准，实际产品中泰乐菌素A的含量必须达到80％以上。在实际发酵生产中高水平的泰乐菌素积累容易导致部分泰乐菌素A转化为雷洛菌素D，使得终产品中泰乐菌素A的含量降低，影响泰乐菌素产品的质量。泰乐菌素还原酶是催化泰乐菌素A组分还原为雷洛菌素D组分的酶，虽然敲除泰乐菌素还原酶基因可以终止泰乐菌素A转化为雷洛菌素D的还原过程，但同时弗氏链霉菌的正常生长也受到影响，丧失生产价值。

本发明提供的新型泰乐菌素还原酶突变体是对弗氏链霉菌泰乐菌素还原酶基因第640-642位碱基进行定点突变，使之形成终止密码子，突变菌株合成泰乐菌素还原酶蛋白时，肽链延伸至第213位氨基酸时终止，形成只包含一个结构域的不完整酶蛋白。本发明突变体在保留该酶部分活性的同时，显著降低其对泰乐菌素的还原活性，从而显著降低了发酵产物中雷洛霉素的含量，提高了泰乐菌素有效成分的积累水平，同时又不影响弗氏链霉菌的正常生长，最终提升了泰乐菌素的产品质量。利用本发明突变体催化合成泰乐菌素的方法简单、操作易行、表达稳定。

附图说明

图1a-图1b：pET-15b表达载体示意图。

图2：野生型泰乐菌素还原酶和突变型泰乐菌素还原酶对泰乐菌素的催化活性。

图3：ATCC19609及重组菌株发酵产品中泰乐菌素A和雷洛菌素组分含量对比。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，实施方案中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。

实施例1：泰乐菌素还原酶突变基因的构建和表达

(1)原始目的基因的获得：

弗氏链霉菌泰乐菌素还原酶基因根据Shir-Ly Huang等人(S L Huang,T CHassell,W K Yeh.Purification and properties of NADPH-dependent tylosinreductase from Streptomyces fradiae[J].Journal of Biological Chemistry,1993,268(25):18987.)报道的泰乐菌素还原酶两段功能结构域氨基酸序列(表1)，通过NCBI查找获得泰乐菌素还原酶完整蛋白序列，再根据该蛋白序列在NCBI中查找弗氏链霉菌同源基因序列，该序列来源于一株产生泰乐菌素的弗氏链霉菌菌株(Streptomyces fradiae ATCC19609)。

表1泰乐菌素还原酶两段功能结构域氨基酸序列

用Primer Premier 6.0设计上下游引物，其中上游引物5'端引入NcoⅠ酶切位点和组氨酸标签，下游引物5'端引入Xho I酶切位点(表2)。以实验室保存的弗氏链霉菌总DNA为模版，PCR扩增泰乐菌素还原酶基因(氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，核苷酸基因序列如SEQ ID NO：2所示)，产物长度1036bp。

表2泰乐菌素还原酶扩增引物序列

(2)还原酶突变基因的构建

通过合成突变基因的方式构建泰乐菌素还原酶突变基因(基因序列如SEQ ID NO：4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)。进行基因碱基定点替换，将弗氏链霉菌泰乐菌素还原酶基因第642位碱基G突变为A，使得第640-642位编码色氨酸的三联碱基TGG突变为TGA，最终形成终止密码子UGA。以突变基因构建同源重组载体，该载体含有由泰乐菌素还原酶基因上游1kb、突变后泰乐菌素还原酶基因、泰乐菌素还原酶基因下游1kb组成的重组单元。PCR产物与质粒pET-15b进行NcoⅠ与Xho I双酶切，T4连接酶连接获得重组表达载体(参照图1a和图1b)。

(3)将重组载体转入大肠杆菌中，重组载体转化菌株通过抗生素筛选获得转化子，并将转化子测序检测：

取感受态细胞E.coli RosettagamiB(DE3)置于冰浴中，待感受态细胞融化后，分别在100μL感受态细胞悬液中加入上述构建的重组质粒5μL，同时在另一组中加入水(作为阴性对照)，轻弹管壁后冰上放置30分钟。42℃水浴中热击90S(注：精确计算时间，过长将对细胞造成伤害),热击后立即置于冰上冷2-5分钟(禁止摇动)。加250μL无抗性LB，37℃，150r/min，3h以上。取100μL菌液涂板到含抗性平板上，37℃培养24h。用含有50μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的平板筛选，培养；当OD₆₀₀达到0.6时，添加0.5mM诱导剂IPTG，20℃条件下LB培养基培养12h以上使重组蛋白进行大量表达，并分离纯化进行蛋白质测量及泰乐菌素还原酶活性测定。

(4)采用分光光度法测定酶活：

以NADPH为辅酶，测定泰乐菌素还原酶对醛、酮、糖类物质的还原活性。即以1min催化氧化1μmol NADPH的酶量被定义为1个酶活力单位；反应体系为1000ul，2％乙腈共溶，缓冲溶液为100mmol/L PBS，在OD₃₄₀测吸光度。

实验组：本发明实施例1构建的泰乐菌素还原酶突变体的表达，经测定突变后的泰乐菌素还原酶酶活力为0.014μmoL/mg·min(如图2所示)。

对照组：将上述步骤(1)的野生型泰乐菌素还原酶基因(SEQ ID NO：2)，按照上述同样的方式连接到pET-15b表达载体，得到重组质粒，并将重组质粒转入大肠杆菌中，重组载体转化菌株通过抗生素筛选获得转化子，并将转化子测序检测，挑选阳性转化子进行上述步骤(3)的表达。泰乐菌素还原酶还原活性测定结果如图2所示，该酶对泰乐菌素的酶活力为0.128μmol/mg·min，表明突变后的泰乐菌素还原酶仍然具有醛酮还原的活性，但活性已经降低至原始的1/10左右。

(5)弗氏链霉菌ATCC 19609中泰乐菌素还原酶基因的定点突变及效果验证

采用CRISPR/Cas9技术对弗氏链霉菌ATCC 19609中泰乐菌素还原酶基因进行定点突变。为构建用于泰乐菌素还原酶基因突变的pKCcas9Tls，设计了针对第214个氨基酸残基附近序列的sgRNA，以及第641位碱基G替换为A的泰乐菌素还原酶基因。以大肠杆菌ET12567(pUZ8002)为中间宿主，通过大肠杆菌-链霉菌属间结合转移将编辑质粒导入弗氏链霉菌ATCC 19609菌株(可购买来源：中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC 11034)，使该菌株泰乐菌素还原酶基因第640-642位的TGG突变为TGA、TAG或TAA，详细操作参照文献方法(HeH,Guosong Z,Weihong J,et al.One-step high-efficiency CRISPR/Cas9-mediatedgenome editing in Streptomyces[J].Acta Biochimica Et Biophysica Sinica，2015，47(4)：231-243.)。弗氏链霉菌突变株与弗氏链霉菌ATCC 19609在TYB固体培养基培养48h(玉米淀粉10.0g,NH₄NO₃ 1.0g,K₂HPO₄0.5g,MgS0₄·7H₂0 0.5g,FeS0₄·7H₂0 0.01g，NaCl5.0g,琼脂粉25.0g，去离子水1000mL)，生长状态无明显差异，二者在发酵培养基发酵培养168h(鱼粉6.6g/L,玉米浆30g/L,CaCO₃ 2.2g/L,KCl 1.1g/L,豆油41.0g/L,甜菜碱0.72g/L,(NH₄)₂HPO₄ 0.44g/L,NiS0₄·6H₂00.0044g/L,CoCl₂·6H₂0 0.0033g/L,MgS0₄·7H₂00.1g/L)；泰乐菌素及雷洛菌素含量检测采用HPLC法，具体参照Shir-Ly Huang等方法(S LHuang,T C Hassell,W K Yeh.Purification and properties of NADPH-dependenttylosin reductase from Streptomyces fradiae[J].Journal of BiologicalChemistry,1993,268(25):18987.)，发酵终产品中泰乐菌素及雷洛菌素含量检测结果对比如图3所示，相比于野生菌株ATCC 19609，重组菌株的泰乐菌素含量所占总组分百分比从85.92％提升到91.94％，相反，雷洛菌素含量所占总组分百分比从10.30％下降到4.22％。

实施例2：弗氏链霉菌泰乐菌素还原酶突变基因的构建和表达

构建突变基因2(基因序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)。即进行基因碱基定点替换，将弗氏链霉菌泰乐菌素还原酶基因第641位碱基G替换为A。使得第640-642位编码色氨酸的三联碱基TGG突变为TAG，最终形成终止密码子UAG。还原酶突变基因的原始基因获得、突变基因的构建和表达方式同实施例1的步骤。本实施例2获得的突变酶的酶活效果、重组菌株的泰乐菌素及雷洛菌素发酵产量与实施例1的结果相近。

实施例3：弗氏链霉菌泰乐菌素还原酶突变基因的构建和表达

构建突变基因3(基因序列如SEQ ID NO：6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)。即进行基因碱基定点替换，将弗氏链霉菌泰乐菌素还原酶基因第641位碱基和642位碱基由GG替换为AA。使得第640-642位编码色氨酸的三联碱基TGG突变为TAA，最终形成终止密码子UAA。还原酶突变基因的原始基因获得、突变基因的构建和表达方式同实施例1的步骤。本实施例3获得的突变酶的酶活效果、重组菌株的泰乐菌素及雷洛菌素发酵产量与实施例1的结果相近。

虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁夏大学

<120> 一种泰乐菌素还原酶突变体及其用途

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 331

<212> PRT

<213> Streptomyces fradiae ATCC 19609

<400> 1

Met Glu Tyr Thr Gln Leu Gly Arg Ile Gly Leu Lys Val Ser Arg Leu

1 5 10 15

Val Leu Gly Thr Met Asn Phe Gly Pro Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ser

20 25 30

His Ala Ile Met Asp Ala Ala Leu Asp Ala Gly Ile Asn Phe Phe Asp

35 40 45

Thr Ala Asn Val Tyr Gly Trp Gly Glu Asn Lys Gly Arg Thr Glu Glu

50 55 60

Ile Leu Gly Ser Trp Phe Ala Gln Gly Gly Asp Arg Arg Asp Lys Val

65 70 75 80

Val Leu Ala Thr Lys Val Tyr Gly Asn Met Gly Leu Asp Gly Pro Ala

85 90 95

Trp Pro Asn His Asp Lys Leu Ser Ala Leu Asn Ile Arg Arg Ser Val

100 105 110

Asp Ala Ser Leu Lys Arg Leu Gly Thr Asp His Ile Asp Leu Tyr Gln

115 120 125

Phe His His Val Asp Arg Asp Thr Pro Trp Asp Glu Ile Trp Gln Ala

130 135 140

Met Asp Val Leu Val Arg Gln Gly Lys Ile Leu Tyr Val Gly Ser Ser

145 150 155 160

Asn Phe Ala Gly Trp Asn Ile Ala Gln Ala Asn Glu Thr Ala Ala Arg

165 170 175

His Gly Arg Leu Gly Leu Val Ser Glu Gln Cys Leu Tyr Asn Leu Cys

180 185 190

Glu Arg Arg Ala Glu Met Glu Val Val Pro Ala Ala Arg Glu Tyr Gly

195 200 205

Leu Gly Val Ile Ala Trp Ser Pro Leu His Gly Gly Leu Leu Gly Gly

210 215 220

Ala Ile Arg Lys Glu Gln Glu Gly Gly Asn Arg Arg Ala Ala Ser Gly

225 230 235 240

Arg Ala Ala Asp Ala Leu Lys Asp Pro Gln Gln Arg Glu Gln Ile Gln

245 250 255

Arg Tyr Glu Asp Leu Leu Asp Lys His Gly Leu Glu Pro Gly Glu Val

260 265 270

Ala Leu Ala Trp Leu Leu Thr Arg Pro Gly Val Thr Gly Pro Ile Val

275 280 285

Gly Pro Arg Thr Ala Asp Gln Leu Ala Ser Ala Val Arg Ala Ala Glu

290 295 300

Leu Thr Leu Thr Asp Glu Val Leu Thr Ala Leu Asp Glu Ile Phe Pro

305 310 315 320

Gly Pro Gly Pro Ser Pro Glu Ala Phe Ala Trp

325 330

<210> 2

<211> 996

<212> DNA

<213> Streptomyces fradiae ATCC 19609

<400> 2

atggaataca cgcaactcgg acgtatcgga ctcaaggtca gccgcctggt tctcggcacc 60

atgaacttcg gccccaccac cgacgaggcc gagagccacg cgatcatgga cgccgctctc 120

gacgcgggca tcaacttctt cgacaccgcc aacgtctacg gctggggcga gaacaagggc 180

cgcaccgagg agatcctcgg cagctggttc gcccagggcg gcgaccgccg cgacaaggtc 240

gtcctcgcca ccaaggtcta cggcaacatg gggctcgacg gtcccgcctg gccgaaccac 300

gacaagctct cggccctcaa catccgccgg tccgtggacg ccagcctcaa gcggctcggc 360

accgaccaca tcgacctcta ccagttccac cacgtcgacc gggacactcc gtgggacgag 420

atctggcagg cgatggacgt cctcgtccgg cagggcaaga tcctctacgt ggggtcgagc 480

aacttcgcgg gctggaacat cgcccaggcc aacgagaccg ccgcgcgcca cggccgcctc 540

gggctggtca gcgagcagtg cctgtacaac ctctgcgagc gccgcgccga gatggaggtc 600

gtcccggccg cccgggagta cggcctcggg gtcatcgcct ggtcgccgct ccacggcggg 660

ctgctcggcg gcgcgatccg caaggagcag gagggcggca accgccgcgc cgcctccggc 720

cgggccgccg acgcgctcaa ggacccgcag cagcgcgagc agatccagcg atacgaggac 780

ctgctcgaca agcacggcct ggagccgggc gaggtggcgc tggcctggct gctcacccgc 840

cccggcgtga ccggcccgat cgtcggcccg cgcacggcgg accaactggc ctcggcggtg 900

cgggccgccg aactgacgct cacggacgag gtgctcaccg ccctggacga gatcttcccg 960

ggcccgggcc cgtcaccgga ggcattcgcc tggtga 996

<210> 3

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Glu Tyr Thr Gln Leu Gly Arg Ile Gly Leu Lys Val Ser Arg Leu

1 5 10 15

Val Leu Gly Thr Met Asn Phe Gly Pro Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ser

20 25 30

His Ala Ile Met Asp Ala Ala Leu Asp Ala Gly Ile Asn Phe Phe Asp

35 40 45

Thr Ala Asn Val Tyr Gly Trp Gly Glu Asn Lys Gly Arg Thr Glu Glu

50 55 60

Ile Leu Gly Ser Trp Phe Ala Gln Gly Gly Asp Arg Arg Asp Lys Val

65 70 75 80

Val Leu Ala Thr Lys Val Tyr Gly Asn Met Gly Leu Asp Gly Pro Ala

85 90 95

Trp Pro Asn His Asp Lys Leu Ser Ala Leu Asn Ile Arg Arg Ser Val

100 105 110

Asp Ala Ser Leu Lys Arg Leu Gly Thr Asp His Ile Asp Leu Tyr Gln

115 120 125

Phe His His Val Asp Arg Asp Thr Pro Trp Asp Glu Ile Trp Gln Ala

130 135 140

Met Asp Val Leu Val Arg Gln Gly Lys Ile Leu Tyr Val Gly Ser Ser

145 150 155 160

Asn Phe Ala Gly Trp Asn Ile Ala Gln Ala Asn Glu Thr Ala Ala Arg

165 170 175

His Gly Arg Leu Gly Leu Val Ser Glu Gln Cys Leu Tyr Asn Leu Cys

180 185 190

Glu Arg Arg Ala Glu Met Glu Val Val Pro Ala Ala Arg Glu Tyr Gly

195 200 205

Leu Gly Val Ile Ala

210

<210> 4

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggaataca cgcaactcgg acgtatcgga ctcaaggtca gccgcctggt tctcggcacc 60

atgaacttcg gccccaccac cgacgaggcc gagagccacg cgatcatgga cgccgctctc 120

gacgcgggca tcaacttctt cgacaccgcc aacgtctacg gctggggcga gaacaagggc 180

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atctggcagg cgatggacgt cctcgtccgg cagggcaaga tcctctacgt ggggtcgagc 480

aacttcgcgg gctggaacat cgcccaggcc aacgagaccg ccgcgcgcca cggccgcctc 540

gggctggtca gcgagcagtg cctgtacaac ctctgcgagc gccgcgccga gatggaggtc 600

gtcccggccg cccgggagta cggcctcggg gtcatcgcct ga 642

<210> 5

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

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atgaacttcg gccccaccac cgacgaggcc gagagccacg cgatcatgga cgccgctctc 120

gacgcgggca tcaacttctt cgacaccgcc aacgtctacg gctggggcga gaacaagggc 180

cgcaccgagg agatcctcgg cagctggttc gcccagggcg gcgaccgccg cgacaaggtc 240

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gacaagctct cggccctcaa catccgccgg tccgtggacg ccagcctcaa gcggctcggc 360

accgaccaca tcgacctcta ccagttccac cacgtcgacc gggacactcc gtgggacgag 420

atctggcagg cgatggacgt cctcgtccgg cagggcaaga tcctctacgt ggggtcgagc 480

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gtcccggccg cccgggagta cggcctcggg gtcatcgcct ag 642

<210> 6

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

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gacgcgggca tcaacttctt cgacaccgcc aacgtctacg gctggggcga gaacaagggc 180

cgcaccgagg agatcctcgg cagctggttc gcccagggcg gcgaccgccg cgacaaggtc 240

gtcctcgcca ccaaggtcta cggcaacatg gggctcgacg gtcccgcctg gccgaaccac 300

gacaagctct cggccctcaa catccgccgg tccgtggacg ccagcctcaa gcggctcggc 360

accgaccaca tcgacctcta ccagttccac cacgtcgacc gggacactcc gtgggacgag 420

atctggcagg cgatggacgt cctcgtccgg cagggcaaga tcctctacgt ggggtcgagc 480

aacttcgcgg gctggaacat cgcccaggcc aacgagaccg ccgcgcgcca cggccgcctc 540

gggctggtca gcgagcagtg cctgtacaac ctctgcgagc gccgcgccga gatggaggtc 600

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<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> Streptomyces fradiae ATCC 19609

<400> 7

Met Glu Tyr Thr Gln Leu Gly Arg Ile Gly Leu Lys Val Ser Arg Leu

1 5 10 15

Val Leu Gly Thr Met Asn Phe Gly Pro Thr Thr Asp Glu Ala

20 25 30

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> Streptomyces fradiae ATCC 19609

<400> 8

Ala Ser Gly Arg Ala Ala Asp Ala Leu Lys Asp Pro Gln Gly Arg Glu

1 5 10 15

Gln Ile Gln Arg

20

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaaccatggc atcatcatca tcatcacatg gaatacacgc aactcggacg tatc 54

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaactcgagt caccaggcga atgcctcc 28

Claims

1.一种泰乐菌素还原酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.权利要求1所述泰乐菌素还原酶突变体的用途，其特征在于，用于催化泰乐菌素A还原为雷洛菌素。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述泰乐菌素还原酶突变体的催化活力是野生型的十分之一。

4.包含权利要求1所述泰乐菌素还原酶突变体的重组载体或宿主细胞。

5.如权利要求4所述的重组载体或宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌或弗氏链霉菌。

6.权利要求4所述重组载体或宿主细胞用于制备泰乐菌素的用途。

7.权利要求1所述泰乐菌素还原酶突变体的制备方法，其特征在于，对包含所述泰乐菌素还原酶突变体的宿主细胞进行培养，当发酵液OD₆₀₀达到0.6时，添加0.5mM诱导剂IPTG，并从培养物中分离纯化泰乐菌素还原酶突变体。

8.一种泰乐菌素还原酶突变体的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列是由SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列的第640-642位的碱基TGG替换为TGA、TAG或TAA得到的核苷酸序列。