JPH06505154A

JPH06505154A - β−１，４−ガラクタナーゼ及びＤＮＡ配列

Info

Publication number: JPH06505154A
Application number: JP4504874A
Authority: JP
Inventors: デルライヒ，クルト; ダルベーゲ，ヘンリク; ミッケルセン，ヤン　メーラー; ミシェラー，マルツェル; クリステンセン，フレミング　マルク
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1991-02-06
Filing date: 1992-02-06
Publication date: 1994-06-16
Anticipated expiration: 2016-12-17
Also published as: DK0571475T3; DE69206258D1; CA2100775A1; EP0498137A1; AU1246792A; WO1992013945A1; GR3018913T3; NZ241560A; EP0571475B1; JP3240002B2; AU649789B2; ES2080486T3; US5474922A; ATE130630T1; EP0571475A1; DE69206258T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 β−１，４−ガラクタナーゼ及びＤＮＡ配列本発明は、β−１，４−ガラクタナーゼ、対応するＤＮＡ配列、ベクター、形質転換された宿主、β−１，４−ガラクタナーゼの生産方法、酵素調製、及びβ−１，４−ガラクタナーゼの使用を含んで成る。

本発明は、遺伝子工学に関係し、そしてβ−１，４−ガラクタナーゼの部分的なアミノ酸配列及び部分的なりＮＡ配列を提供する。β−１，４−ガラクタナーゼ（ＥＣ番号３．２．１．８９）は、ガラクタンを分解する炭水化物酵素のグループである。正式名称は、１，４−β−Ｄ−ガラクタンガラクトヒドロラーゼであるが、その短縮用語であるβ−１，４−ガラクタナーゼを、請求項と共に本明細査中で使用する。Ｒ，Ｆ、　Ｈ，Ｄｅｋｋ、ｅｒａｎｄ　Ｇ、Ｎ、Ｒｉｃｈａｒｄｓ、”　ヘミセルロース、それらの生成、精製、性質及び作用機構”ｉｎ　Ｒ，Ｓ、Ｔｉｐｓｏｎ　ａｎｄ　Ｄ、Ｈｏｒｔｏｎ、炭水化物化学及び生物化学の進歩、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ３２．２７７−３５２（１９７６）、Ｒ，Ｆ、　Ｈ，Ｄｅｋｋｅｒ’酵素のヘミセルロースグループ、ｉｎ　Ｊ、Ｍ、Ｖ、Ｂｌａｎｃｈａｒｄ　ａｎｄ　Ｊ、Ｒ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、食品中のポリサッカライド、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、９３−１０８（１９７９）　、及びＡ、　Ｇ、　Ｊ、　Ｖｏｒａｇａｎ、　Ｆ、　Ｇｅｅｒｓｔ　ａｎｄ　Ｗ、　Ｐｉｆｉｎｉｋ“酵素によるフルーツの加工におｌｊるヘミセルロース″、ｉｎ　Ｐ、ＤｅｐｕＹ、食品加工における酵素の使用、ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｅｔＤｏｅｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｌａｖｏｉｓｉｅｒ、４９７−５０２（１９８２）を引用することができる。ガラクタンは、多くのガム、寒天、及び果実ペクチンと一緒になって見られ、そしてそれらは、例えば果実及び野菜内の細胞壁の成分である。

上記の部分的なアミノ酸配列は、そのような酵素を発現する生物のためのゲノムのライブラリー、またはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのために使用することができるＤＮＡプローブの構築のために使用することができ、これによって、親ＤＮＡ分子がそこから生じた微生物種に挿入された場合に、β−１，４− ガラクタナーゼの過剰生産のために、または非形質転換条件下β−１，４−ガラクタナーゼと密接に関係するいかなる酵素も生産しない宿主微生物に挿入された場合に、密接に関係する酵素を伴わないでβ−１，４−ガラクタナーゼの生産のために使用することができるＤＮＡを得ることができる。以下から明らかなように、上記のＤＮＡ配列は、外の方法によっても確立することができる。

したがって、本発明の目的は、新規β−１，４−ガラクタナーゼの提供並びに今まで可能なものよりもより良い収率及びより高い純度でβ−１，４−ガラクタナーゼを生産する方法及び手段の提供、そして今まで可能なものよりももっと効率よく植物の細胞壁組織の分解のための、単独でのまたは他の酵素と組み合わされてのβ−１，４−ガラクタナーゼの使用の提供にある。元の製品での割合と比較して、β−１，４−ガラクタナーゼの割合が増加または減少している新規製品の提供も、本発明の目的である。

本発明に従って得られる組み換えＤＮＡ配列は、β−１，４−ガラクタナーゼ活性をもつポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、またはこのようなβ−１，４− ガラクタナーゼをコードする配列と実質的に相同な配列をもつＤＮＡ配列を含んで成る。

本発明の組み換えＤＮＡ配列をどのように作るかは、以下で詳細に説明する。

β−１，４−ガラクタナーゼの精製のため１こアスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）から生産される粗酵素調整物は、以下のように生産することができる。簡潔にするために、この粗アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）　Ｉｌｌｌｌ合物以下ではＡ、　ａ、　ｅ、　ｐと称する。

遺伝子供与体としてのアスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｔ＋１ｅａｔｕｓ）　ＣＢＳ　１０１．４３株は、以下の方法により、パイロットプラントの規模で発酵された。

以下の組成：ペプトンＤｉｆｃｏ　６　ｇアミノリン叶ｔａｎａ　４　ｇ内袖出物Ｄｉｆｃｏ　１．５　ｇＫＨｔ　ＰＯａ　Ｍｅｒｋ　２０　ｇ麦芽抽出物Ｅｖｅｒｓ　２０　ｇイオン交換Ｈ、０１０１００Ｏまでをもつ寒天基質が、Ｆｅｒｎｂａｃｋフラスコ中で調整された。

ｐＨを、５．３０と５．３５の間に調整した。次に４０ｇの寒天Ｄｉｒｃｏを添加し、そしてその混合物を１２０°Ｃで２０分間オートクレーブで処理した（この基質をＥ−寒天と名ずける）。

ＣＢＳ　１０１．４３株をＥ−寒天の斜面（Ｓｌａｎｔ）上で培養した（３７° Ｃ）。この斜面からの胞子を、滅菌されたスキムミルク内に懸濁し、そしてその懸濁液をバイアル内で凍結乾燥した。１つの凍結乾燥されたバイアル内の中身をＦｅｒｎｂａＣｔｌフラスコに移した。次にそのフラスコを３０℃で１３日間インキュベートした。

以下の組成：ＣａＣＯ５１，２ｋｇグルコース　７．２ｋｇＲｏｆｅｃ（コーン澄酒の乾燥物）　３．６ｋｇ大豆油　１．２ｋｇをもつ基質を５００　リッターの種母発酵槽内で調製した。

水道水を加え、約２４０リツターの全容量とした。ＣａＣ０＊の添加の前に約５．５のｐＨに調整した。上記の基質を種母発酵槽内で１２１°Ｃで１時間滅菌した。接種前の最終容量は、約３００リツターであった。

上記Ｆｅｒｎｔ＋ａｃｈフラスコの胞子懸濁液を、種母発酵槽に移した。種母発酵の条件は：発酵槽のタイプ：約２．３の高さ／直径の比をもつ一般的なエアレーション及び攪拌装置のある発酵槽攪拌＝３００ｒｐＩ１１（２ツのタービン翼）エアレーション：３００ｎリッター／分温度：３０〜３１℃ 時間：　約２８時間であった。

接種後２８時間目付近で、１５０リツターを、種母発酵槽から主発酵槽に移した。

以下の組成：焼いた大豆粉　９０　ｋｇＫＨ＊　ＰＯ４２０ｋｇＰｌｕｒｏｎｉｃ■消泡剤　１５０　ｍｌをもつ基質を２５００リツターの主発酵槽内で調製した。

水道水を、約９００リツターの全容量まで添加した。上記の焼いた大豆粉を水に懸濁した。ｐＨをＮａＯＨで８．０に調製し、そして温度を５０°Ｃまで上昇させた。その後、約９２５Ａｎｓｏｎ単位のＡｌｃａｌａｓｅ＠　０．６Ｌを、この懸濁液に添加した。この混合液を、エアレーション無しで及び１１００ｒｐの攪拌で、５０℃で４時間及びｐＨ−８，０（Ｎａ　！　Ｃｏｔ添加）に保った。

その後、残りの基質成分を添加し、そしてｐＨをリン酸で約６．０に調整した。

この基質を、主発酵槽内で、１２３℃でｔ　’／　ｚ時間滅菌した。接種前の最終容積は、約１０８０リツターであった。

次に、１５０リツターの種母培養液を添加した。

発酵条件は：発酵槽のタイプ：約２．７の高さ／直径の比をもつ一般的なエアレージジン及び攪拌装置のある発酵槽攪拌：　２５０　ｒｐｍ（２つのタービン翼）エアレージジン：　１２０Ｏｎリツタ一／分温度＝３０℃ 時間：　約１５時間であった。

２４発酵時間から１１６発酵時間までに、以下の組成：ペクチンｇｅｎｕつ　２２　ｋｇ濃リン酸　６　ｋｇＰｌｕｒｏｎｉｃ＠消泡剤　５０　ｍｌつ　Ｇｅｎｕペクチン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ　ｐｅｃｔｉｎ　ｆａｃを育するペクチンの溶液を、約８リツター／時間の一定速度で、主発酵槽に無菌的に添加した。

水道水を添加し、約３２５リツターの全容量とした。上記基質を、１２１’Ｃで１時間その投与タンク内で滅菌した。投与開始前の最終容積は、約３６０リツターであった。この部分の供給が尽きた時、他の同様の部分を調製した。１回の発酵のためのペクチン溶液の全容量は、約７２５リツターであった。

約１５１発酵時間の後、上記発酵工程を停止した。約１８５０リツターの培養液を、約５℃まで冷却し、そして上記酵素を以下の方法に従って回収した。

上記液を、Ｈｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌ珪藻土（濾過助剤）でプレコートされた真空ドラムフィルターＣＤｏｒｒ　０１ｉｖｅｒ）上でドラム濾過した。

濾液を蒸発により、培養液の容量の約１５％に濃縮した。濾過助剤として０．２５％Ｈｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌをもツ５ｅｉｔｚ濾過シート（タイプ５ｕｐｒａ１００）上で、その濃縮物を濾過した（以下の表では、濾過Ｉと称する）。その濾液を、ｐＨ５，５で５６１ｇの（ＮＨ４）　ｔ　ＳＯ４／リッターで沈殿させ、そして濾過助剤として４％のＨｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌ珪藻土を添加した。その沈殿物及び濾過助剤を、フレームフィルター上の濾過により分離する。その濾過ケーキを水に溶解し、そして不溶成分をフレームフィルター上の濾過により分離する。その濾液を、濾過助剤として０．２５％Ｈｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌをもツ５ｅｉｔｚ濾過シート（タイプ５ｕｐｒａｌｏＯ）上でチェック濾過する（以下の表では、濾過Ｉｒと称する）。

この濾液を、限外濾過装置上で完全濾過する。完全濾過後、この液体を１２．７％の乾燥物含有量まで濃縮する（以下の表では、濃縮物中の乾燥物含有量と称する）。

プロテアーゼ活性の部分的除去のための任意の塩基処理を、この段階で実施することができる。この塩基処理を使用する場合には、ｐｉ（９，２で１時間実施し、その後ｐＨ値を５．０に調整する。

そして、上記液体を、細菌減少の目的のために、チェック濾過及び濾過を行い、そしてその濾液を、５ｔＯｋｅＳからの凍結乾燥装置上で凍結乾燥する。

純粋なβ−１，４−ガラクタナーゼは、表１に示すように、Ａ、　ａ、　ｅ、　ｐ。

から得ることができる。

表１ β−１，４−ガラクタナーゼの精製ステップｌの補足ニステップ２の準備のための濃縮及び緩衝液の交換、小粒子及び約５０％の色の除去ステップ２の補足：Ｈ［Ｃは、疎水的相互作用クロマトグラフィーである。この無色のβ−１，４− ガラクタナーゼの分画は、ステップ０．８−０．２入１（ＮＨａ　）　ｔ　ＳＯａステップ３の補足：ａ−サンプル内の塩濃度を減少するための希釈ｂ−ステップ４の準備のための緩衝液の交換ステップ４の補足・［ＥＣは、イオン交換クロマトグプフイー′である。このβ−１，４−ガラクタナーゼの分画は、ステップ０．２５−０．５Ｍ　ＮａＣ１からプールされる。

ステップ５の補足。

ステップ６の準備のための緩衝液の改造ステップ６の補足：この活性β−１，４−ガラクタナーゼの分画は、ステップ０．４Ｍ　（ＮＨ、’ ）、　ＳＯ４の範囲内でプールされた。この分画は、［ＥＦ（等電点電気泳動）で１つのバンドを示す。５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムのポリアクリルアミドゲル電気泳動）／銀上で、３つのバンドが検出され、ここで、その主分画は、本テスト中の蛋白質の８０％より多くの量となる。同様の模様が、ＤＤＴ（ジチオトレイトール）と共に／を伴わず現れた。上記Ａ、　ａ、　ｅ、　ｐ、に対する抗体の方法によるイムノプロット法は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ／銀と同様の模様を作り出した。

これらの３つのバンドをＨＰＬＣで分離しようとする全ての試みは失敗した。Ｎ −末端のさらなる調査により、このサンプルが純粋な酵素の分画であること、そしてそのバンドを伴うものかそのサンプル調製及び作業条件から生じた人工産物であることが示された。

表２に示された以下のことは、その濃縮率が、その精製の進行とステップ　手順　蛋白　酵素活性　比活性　酵素　濃縮率（ｍｇ）　（［Ｊ−ｕｎｊｔｓ）　（ｔｌ／ｍｇ）　収率（％）開始　粗酵素２．８４２　５３９．０００　１９０　１００　１．０ＣＬ４Ｂ　８４７　４４０．０００　５１９　８２　２．７４　ＡＣＣＥＬＬＤＥＡＥ　３１　３３０．０００　１０．６４５　６１　５６．１６　蛋白ＰＡＫフェニル５ＰＷ　８　２５０．０００　３１．２５０　４６　１６４．８単位（ｕｎｉｔ）の定義表２の中で示されたＵ単位は、β−１，４−ガラクタナーゼの活性単位であり、以下のように定義する：１単位は、以下に記載するように、３０’Ｃ及び１分間で、ポテトのガラクタンから１Ｍモルのガラクトースを放出する酵素の量以下の部分的なアミノ酸配列は、自動配列決定法ＣＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３７Ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｅｅｒ）により、その精製されたβ−１，４−ガラクタナーゼから決定された。

それ故、本発明に記載のβ−１，４−ガラクタナーゼは、この事実によって、それが以下の部分的アミノ酸配列。

または、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の、上記配列に対する相同性をもつ部分的アミノ酸配列を示すと特徴付けられる。上記部分的配列の第１番目のＡｔａは、Ｎ−末端のアミノ酸であると推定される。

上記配列に基礎を置き、上記サンプルの純度は、９０％より高いと推定される。

β−１，４−ガラクタナーゼのアミノ酸配列は、ＵＷ−ＧＣＧデータバンク、公然と利用できるデータバンク（これに関して、ＵＷは、ライスコンシン大学の短縮形である）の中の他の蛋白質との相同性を示さない。

上記のβ−１，４−ガラクタナーゼは、以下に示すように、さらに特徴ずけられる。

図４及び図５は、β−１，４−ガラクタナーゼのそれぞれ、ｐＨ活性及びｐＨ安定性を示す。

このβ−１，４−ガラクタナーゼは、ｐＨ３，５−４，０に最適ｐＨをもつ比較的幅広いｐＨスペクトルを示す。

上記のβ−１，４−ガラクタナーゼは、比較的酸性で安定である。この安定性は、室温で１時間処理された時、ｐＨ２から８の間で良好である。

図６及び図７は、β−１，４−ガラクタナーゼのそれぞれ、温度活性依存状態及び温度安定性依存状態を示す。

このβ−１，４−ガラクタナーゼの最適温度は、３０°Ｃ付近にあり、そして、この温度活性範囲は、比較的幅広である。果実及びワインの分野のためには、低温範囲での活性は、非常に顛著である：５℃で約６０％の活性１０°Ｃで約８０％の活性５−５５℃の温度範囲では、このβ−１，４−ガラクタナーゼ活性は、ｐＨ４，５で１時間の処理後著しくは影響されない（その最初の活性の２８０％）。

分子量：　４０．００００ダルトン等電点：ｐ８２．８Ｋｍ−値：そのＭｉＣｈａｅｌｉＳ−Ｍｅｎｔｅｎ−速度式及びそれに対応するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ−速度式は、それぞれ図８及び図９から現れる。

結果としてのＫｍ−値は、基質濃度の％で表現される（ｍｏｌｅ／ｌではない、この理由は、その基質の分子量分布が均一でないことにあり；それ故、その分子量の正確な数値を計算するのは不可能であった）。

上記β−１，４−ガラクタナーゼは、≧０．３％の基質濃度により阻害される。

その理論的及び計算されたＫｍ−値は、Ｋｍ　＝　０．４１％ＮＮＰＡＧ−ポテトーガラクタンである。

アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）株により生産されたペクチナーゼ調製物（Ｐｅｃｔｉｎｅｘ■）から、他のβ−１，４−ガラクタナーゼが、単離され、そして、部分的アミノ酸配列が決定された二二の部分的なアミノ酸配列が、請求項１に示すアミノ酸配列の７０％より大きい部分で相同性を示すことから、上記のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）株に起源をもつβ−１，４−ガラクタナーゼは、本発明の範囲内にある。また、このβ−１，４−ガラクタナーゼが植物の細胞壁の分解剤として利用できることが見いだされている事実、並びに請求項１で特徴ずけたβ−１，４−ガラクタナーゼとそれらの相同性が７０％よりも大きいという事実も、その相同性が７０％より大きいという事実に関して、請求項１の範囲を正当化する。

本発明に記載のβ−１，４−ガラクタナーゼの好ましい態様は、このβ−１，４ −ガラクタナーゼが、３．０−５．０の、好ましくは３．５−４．０の最適ｐＨを、２．０−３．５の、好ましくは２．５−３．１の等電点を、３０．０００と５０゜０００の間の、好ましくは３７．０００と４５．０００の間の分子量を、そして、１０と５０℃の間の、好ましくは２５と４０°Ｃの間の最適温度を示す事実により特徴ずけられる。

本発明は、本発明に記載のβ−１，４−ガラクタナーゼのためのコーディングにより特徴ずけされる組み換えＤＮＡ配列も含んで成る。

本発明に記載の上記の組み換えＤＮＡ配列の好まれる態様は、それが以下の部分的なりＮＡ配列の少なくとも１つを含んで成ることにより特徴ずけられる：４）　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＴｒＧ　ＴＧＧ　ＧＡＧ　ＧＧＡ　ＧＧＧ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＴＧＣＴＣＣＧＴＣＡＣＧ５）　ＡＣＧ　ＴＡＡ　ＣＴＡ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　入ＧＧ　ＴＡＧ　ＴＴＡ　ＧＴＴ　ＴＡＣＴＣＣＡＡＧ　ＴＣＴ　ＣＣＡＡＡＧ　ＧＡＣＣＡＴ　Ｔｒ’Ｔ　にＣＴ　ＡＣＡ　ＣＡＣＣＧＣＣ本発明に記載の上記の組み換えＤＮＡ配列の好まれる態様は、それが以下の：ａ）上記アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｔｅａｔｕｓ）のβ−１，４−ガラクタナーゼのＤＮＡ挿入物ｐＨＤ４３８ｂ）　ａ）を含んで成る成熟β−１，４−ガラクタナーゼＤＮＡのためのコード領域にハイブリダイズし、そして、β−１，４−ガラクタナーゼ活性をもつポリペプチドのための構造遺伝子、並びに場合によってはプロモーター、シグナルまたはリーダーペプチドのためのコード領域、及び／または転写ターミネータ−を含んで成るＤＮＡ挿入物をさらに含んで成るＤＮＡ配列ｃ）Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨ）から引用する比較的ストリンジェントな条件下（１，０ＸＳＳＣ，０，１！％ＳＤＳ、　６５℃）で、請求項３に示す配列の中の１つとハイブリダイズするに十分な相同性をもつＤＮＡＮＡ配列　ａ）　、ｂ）、もしくはＣ）に定義したＤＮＡ配列の派生物、または、ｅ）成熟β−１，４−ガラクタナーゼまたはそれらのシグナルペプチドもしくはリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列並びにａ）、ｂ）、もしくはＣ）に定義したＤＮＡ配列に関してその遺伝子コードの意味の範囲内で縮重しているＤＮＡ配列から選ばれたＤＮＡ配列を含んで成るという事実により特徴ずけられまた、本発明は、ベクターが本発明に記載の組み換えＤＮＡ配列を含んで成るという事実により特徴ずけされるところのベクターも含んで成る。

本発明に記載のベクターの好ましい態様は、そのプロモーターがアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼのプロモーター、好ましくはｐｉ（Ｄ４３８であるという事実により特徴ずけされる。このベクターは、１９９２年２月３日、ＤＳＭに寄託されている（寄託番号ＤＳＭ６９０１）。

また、本発明は、形質転換された宿主が本発明に記載のベクターを含むという事実により特徴ずけされるところの形質転換された宿主も含んで成る。

本発明に記載の形質転換された宿主の好ましい態様は、その形質転換された宿主がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株であるという事実により特徴ずけされる。ここことによって、そのβ−１，４−ガラクタナーゼの良好な生産能力を得る。

本発明に記載の形質転換された宿主の好ましい態様は、その形質転換された宿主がアスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）　、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）の種であるという事実により特徴ずけされる。

このことによって、そのβ−１，４−ガラクタナーゼの良好な生産能力を得る。

本発明に記載の形質転換された宿主の好ましい態様は、その形質転換された宿主が微生物（形質転換されない条件下では、β−１，４−ラクタナーゼしか生産しない、好ましくはバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）またはパン酵母（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））であるという事実により特徴ずけされる。これにより、高いβ−１，４−ガラクタナーゼ活性をもつ”あつらえの“酵素調製物及び広い範囲にわたる他の望まれる特異的酵素活性を得ることができる。

また、本発明は、本発明に記載の形質転換された宿主の使用によるβ−１，４− ガラクタナーゼの生産方法も含んで成る。この方法によって、そのβ−１，４− ガラクタナーゼを、高い収率で得ることができる。

また、本発明は、本発明に記載の方法により生産されたとき、そのβ−１，４− ガラクタナーゼも含んで成る。そのβ−１，４−ガラクタナーゼを高い収率で得ることができる。

また、本発明は、酵素ｍ製物が本発明に記載のβ−１，４−ガラクタナーゼで（好ましくは、少なくとも１．１の濃縮率で）濃縮された、植物細胞壁の分解または修飾のために使用できるペクチナーゼ調製物を含むという事実によって、特徴ずけされるところの酵素ｍ製物も含んで成る。この方法により、そのペクチナーゼ調製物の植物細胞壁の分解能力の上昇を得ることができる。

本発明に記載の酵素調製物の好ましい態様は、上記ペクチナーゼ調製物が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｆｌｕｓ）属に属する微生物により、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）　、アスペルギで特徴ずけされる。このような調製物は、非常に良好な全液化力並びにリンゴをすりつぶしたもの及び同様の生体物質の著しい粘度減少を提供することがきる。このことは、そのペクチナーゼがＡ、　ａ、　ｅ。

ｐ、である場Ｃには、本明細書の以降の章の中で記載されるであろう。

本発明に記載の酵素調製物の好まれる態様は、そのβ−１，４・・ガラクタナーゼが、本発明に記載の方法により生産されたβ−１，４−ガラクタナー・ゼであるという事実により特徴ずけされる。この調製物の生産コストは比較的低い。

また、本発明は、ガラクタンの分解または修飾のための剤として、本発明に記載のβ−１，４−ガラクタナーゼを使用することも含んで成る。

本発明に記載のβ−１，４−ガラクタナーゼの使用に関する好まれる態様は、植物細胞壁の分解または修飾のための剤としての使用である。今のところ、植物細胞壁を分解することは、植物細胞壁の高い分解活性のために、本発明に記載のβ −１，４−ガラクタナーゼの最も好まれた使用となっている。

また、本発明は、ガラクタンの分解または修飾のための剤として、本発明に記載の酵素調製物を使用することも含んで成る。

本発明に記載の酵素ｍ製物の使用に関する好まれる態様は、植物細胞壁の分解または修飾のための剤としての使用である。今のところ、植物細胞壁を分解することは、植物細胞壁の高い分解活性のために、本発明に記載の酵素調製物の最も好まれた使用となっている。

図１Ｏは、プラスミドｐＹＨＤ１０７のマツプであり、ここで、“ＴＰＩプロモーター“は、パン酵母（Ｓ、　ｃｅｒｅｖ　ｉｓ　１ａｅ）のトリオースリン酸イソメラーゼのプロモーターを示し、”ターミネータ−′は、転写ターミネータ −を示し、“Ａｍｐ’は、アンピシリン耐性を仲介している遺伝子を示し、２μ ｏｒｉ“は、酵母のプラスミド２μの複製起点を示し、そして“ＵＲＡ３”は、宿主株内のウラシル欠失を補足する選択マーカーをコードしている遺伝子を示している。

商業的に利用可能なプラスミドｐＹＥＳ　Ｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｓｐｅ［で切断し、ＫｌｅｎｏｗのＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＮＴＰでフィルインし、そしてＣ１ａ［で切断した。そのＤＮＡを、アガロースゲル上でサイズ分画し、そして約２０００塩基対のフラグメントを電気溶出により精製した。上記と同様のプラスミドを、Ｃ１ａｌ／Ｐｖｕｌ［で切断し、そして約３４００塩基対のフラグメントを電気溶出により精製した。この２つのフラグメントを、酵母のＴＰＩプロモーターを含む平滑末端の５ｐｈｌ／ＥｃｏＲＩフラグメントに連結した。このフラグメントを、プラスミド〔ここでは、そのパン酵母（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＴＰ［プロモーター（Ｔ、Ａｌｂｅｒｓ　ａｎｄ　Ｇ、Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　１．１９８２．ｐｐ、４１９−４３４）が、僅か（こ修飾されていた〕から単離し：内部のＳｐｈ１部位を、この部位のコアを構成している４塩基対を欠失することにより除去した。さらに、そのプロモーターの上流の余分な配列を、Ｂａ１ｌエンドヌクレアーゼ処理とこれに続＜　５ｐｈＩリンカ−の付加により、取り除いた。最後に、大腸菌（Ｅ、　ｃｏＲ［）リンカ−を１０位に付加した。これらの修飾の後、このプロモーターを、Ｓｐｈ　Ｉ−ＥｃｏＲＥフラグメントの中に含める。元のプロモーターと比較してこのプロモーターの効率は、上記の修飾によっては影響されないようである。得られるプラスミドＰＹＨＤ１７を図１０に示す。

供与体生物十分なエアレージジンを確保するための攪拌を伴って大豆が豊富な発酵培地中で増殖されたアスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉ素で凍結し、そして、１ｇの石英砂と共にすり体内で粉状に押しつぶした。そのＲＮＡをチオシアン酸グアニジウムで抽出し、そして、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９．　ｏｐ、　ｃｉｔ、に本質的に、記載されたように、ＣｓＣｌを通して遠心分離した。ポリＡ　ＲＮＡを、オリゴｄＴセルロース上のクロマトグラフィーにより、全ＲＮＡから単離した。

ｃＤＮＡの合成製造者の取扱説明書に従ってＩｎｖｉ　ｔｒｏｇｅｎからのｃＤＮＡ合成キットにより、ｃＤＮＡの合成を実施した。このＤＮＡを、Ｂｓｔｘ［リンカ−（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の付加によりその発現ベクターに適応し、そしてアガロースゲル上でサイズ分画した。５−６００塩基対よりも大きいＤＮＡのみを、そのライブラリーの構築で使用した。この適応されたｃＤＮＡを、Ｂｓｔｘ■で切断された適切なベクターに連結した。テスト連結（そのライブラリーのサイズを決定するための）の後、そのライブラリーを５０の寒天プレートの上に置いた。約５００から５０００の別個のクローン（そのライブラリーのサイズに依存する）を含んでいるプレートのそれぞれに、３ｍｌの培地を加えた。そのバクテリアをこすり取り、１ｍｌのグリセロールを添加し、そして５０のプールとして一８０″ Ｃで保存した。その残りの２ｍｌをＤＮＡ単離のために使用した。もし、そのＤＮＡの量が所望の酵母形質転換細胞の数を与えるのに不十分である（以下を参照のこと）ときは、−夜繁殖させた一８０°Ｃの保存バクテリアの５０μｍで接種した５００ｍ１の培地（ＴＢ）から、大規模なりＮＡを調製した。

酵母ライブラリーの構築ｌまたはそれより多くのプールからのＤＮＡを、以下に記載するように酵母に形質転換した。全てのバクテリアのクローンを酵母内でテストすることを確保するために、元のプール内のバクテリアのクローンの数よりも、５倍多い酵母の形質転換細胞の数を限界として設定した。

酵母の形質転換使用した酵母株は、ｙＮＧ２３１．　（ＭＡＴ　ａｌｐｈａ、　Ｉｅｕ２．　ｏｒｉ３−５２．　ｈｉｓ４−５３９゜ｐｅｐ−ｄｅｌｔａ　ｌ、ｃｉｒ＋）であった。１つの＝＋ｏニーを、３０℃で一夜１０［１１１のＹＰＤ中で増殖させた（この培養細胞は、５℃で数日間保存できる）。

この培養液の１Ｏ１３０、及び６０μｌを、１０ｈ＋ｌのＹＰＤを含む３つの振とうフラスコに添加し、そして３０℃で一夜振とうしながらインキュベートした。０．３−０．４に最も近い吸光度、。、をもっ培養液が選択された。Ｂｅｃｋｍａｎ還心分離（ス還御分離、１０分間）において５０ｍ１のチューブにその細胞を収穫し、この細胞を２％５ｍｌのＨ，０に再懸濁し、上記のように遠心分離し、０．ＩＭ　ＬｉＡｃ　５１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃ１，１ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５を含む５ａ＋１の緩衝液に再懸濁し、そして再び遠心分離した。この細胞を５００μｍの上記緩衝液に再懸濁し、そして３０’Ｃで６０分間インキュベートした。２５０ｇｇの担体ＤＮＡ　（無菌のサケの精子ＤＮＡ　ｌ０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、そして１００μｌの部分を用意した。形質転換されるべきＤＮＡ（約５μｇ）を上記１００μｌの部分に添加し、緩やかに混合し、そして３０℃ で３０分間インキュベートした。７００ｇｇの４゜％ＰＥＧ　４０００．０．　ＩＭ　ＬｉＡｃ　、　１０＋ｄ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ、　１ｍ＆Ｉ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５を添加し、そしてインキュベーションを４２°Ｃで５分間続け、マイクロ遠心分離機内で短時間回転させ、１００−２００ｇｇＨｔＯに再懸濁し、そしてウラシルを伴わなずにＳＣプレート上に置き、次に３ｏ″Ｃで３日間インキュベーションを行った。

担体ＤＮＡの調製１００ｍｇのサケの精子ＤＮＡを計量して取り出し、そして１０ｍ１の１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５（ＴＥ）に−夜で溶解した。

次にこの溶液を、粘着性がなくなるまで、氷水中のプラスチックコンテナ内で音波破砕した。次にこの溶液を、フェノールで抽出し、そしてＥｔＯＨで沈殿させ、そしてそのペレットを５ｍｌのＴＥ内で洗浄しそして再懸濁した。この懸濁液をＥｔＯＨで沈殿させ、そしてそのペレットを５ｍｌのＴＥ内で洗浄しそして再懸濁した。この吸光度３．、を測定し、そしてその懸濁液を１０ｍｇ／ｍｌになるまでＴＥで希釈した。

１００ｍ１のＹＰＤ（Ｓｈｅｒｍａｎ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８１）を、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐユベーションする。

この菌糸体をミラクロス（ａ＋１ｒａｃｌｏｔｈ）を通して濾過し、そして２００ｍ１の０．６　Ｍ　Ｍｇ５Ｏｉで洗浄する。この菌糸体を１５ｍ１の１．２　Ｍ　Ｍｇ５Ｏａ　、１０１１１Ｍ　ＮａＨｔ　ＰＯａ　、　ｐＨ”５．８に再懸濁する。この懸濁液を氷上で冷却し、そして１２０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍ　＠２３４．バッチ１６８７を含む１ｍｌの緩衝液を添加する。５分後、１２ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ　ｔｙｐｅＨ２５）の１ｍｌを添加し、そして、ａｎｄ下で観察されたサンプル内に多数のプロトプラストが見えるようになるまで、緩やかな攪拌を伴うインキュベーションが、３７℃で１．５−２．５時間続けられる。

この懸濁液をミラクロス（ｍｉｒａ（ｌｏｔｈ）を通して濾過し、その濾液を無菌チューブに移し、そして５ｍｌの０．６Ｎソルビトール、１００ｎｔｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ冨７．ｏで重層する。遠心分離を１００ｇで１５分間実施し、そしてそのプロトプラストを上記１ｊｇＳＯ４緩衝剤の頂上から回収する。５ＴＣ（１，２Ｍソルビトール、ｌｏｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（Ｃ１、ｐＨｘ７．５、ｌＯｍＵ　ＣａＣ１ｔ　）の２容量を上記プロトプラスト懸濁液に添加し、そしてその混合液を１０００ｇで５分間遠心分離する。このブトブラストのペレットを３ｍｌのＳＴＣに再懸濁し、そして再びペレット化する。これを２回繰り返す。最後に、そのプロトプラストを０．２−１　ｍｌのＳＴＣに再懸濁する。

１００μｇのプロトプラストの懸濁液を、１０μｌのＳＴＣ中で、５−２５μｇの適切なりＮＡと混合する。プロトプラストをｐ３ＳＲ２（プラスミドを担持するアスペルギルス・ニジュランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）のａｎｄ　Ｓ遺伝子）と混合する。この混合物を室温で２５分間放置する。０．２ｍｌの６０％ＰＥＧ　４０００（８Ｄ）１２９５７６）、１０ｍＭ　ＣａＣ１を及び１０＋ｎＭ　Ｔｒｊｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ＝７．５を添加し、そして注意して混合（２回）し、そして最後に０．８５Ｉｎｌの上記と同様の溶液を添加し、そして注意して混合する。この混合物を室温で２５分間放置し、２５００ｇで１５分間回転し、そしてそのペレットを２ｍｌの１．２Ｍソルビトールに再懸濁する。もう１回沈降させた後、そのプロトプラストを、適切なプレート上に筐り広げる。

プロトプラストを、１．０ＭシュクロースｐＨ＝７．０、窒素源としての１００１Ｍアセトアミド、及びバックグラウンドの増殖を阻害するための２０ｍＭＣｓＣ１を含む最少プレー）（Ｃａｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　１１３（１９６６）５１−５６）上に塗り広げる。３７℃で４−７日間のインキュベーションの後、胞子を拾い、そして単一コロニーを作るために筐り広げる。この手順を繰り返し、そして２回の再単離の後、単一コロニーの胞子を、定義された形質転換細胞として保存する。

されている）の派生物である。このプラスミドと対象的に、ｐＨ０４１３は、そのプロモーターとターミネータ−の間にユニークな制限部位のストリングをもっている。このプラスミドは、上記ターミネータ−の３゛末端にある約２００塩基対の長いフラグメント（不所望のＲε部位を含む）を除去することにより、そして次に、上記プロモーターの５°末端にある約２５０塩基対の長いフラグメント（これも不所望の部位を含む）を除去することにより構築された。この２００塩基対の部位は、Ｎａｒｌ（ｐＵｃベクター内に位置する）及びＸｂａｌ（上記ターミネータ−へのちょうど３゛）での解裂し、そして次のＫｌｅｎｏｖ　ＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＮＴＰでその生成末端をフィルインし、ゲル上での上記ベクターを精製し、そして上記ベクターのフラグメントを再連結することにより取り出された。このプラスミドは、ｐＨ０４１３と呼ばれた。ｐＨ０４１３を、５ｔｕＩ（上記プロモーターの５゛末端に位置する）及びＰｖｕ　Ｉ　Ｉ（上記ｐｕＣベクター内の）で切断し、ゲル上で分画し、そして再連結し、ｐｆ（０４１４を得た。Ｉｇｌｌは、プラスミドｐＪ（Ｄ４１４のマツプであり、ここでは、−ＡＭＣターミネータ−”は、上記アスペルギルス・ニガー（Ａ、　ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼのターミネータ−を示し、モして“ＴＡＫＡプロモーター′は、アスペルギルス・オリザエ（Ａ、　ｏｒｉ　ｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼのプロモーターを示している。

ポテトのガラクタンの生産 β−１，４−ガラクタンは、以下の手順によりポテト繊維から得ることができる：澱粉工場からの新鮮な廃原料を出発物質として使用する（非常に低いスターチの含有量、１７％付近の乾燥物質基質（ＤＮＳ））。

ガラクタンの抽出に先立って、上記の残存の溶解性澱粉を、α−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ　＠１２０Ｌ）処理により除去しなければならない。

上記のポテト繊維を水（１部分の繊維：３部分の水）で希釈し、ＮａＯＨでｐＨをＰ）１６．５に調整し、そしてその混合液を６５°Ｃまで加熱する。上記α− アミラーゼ（Ｄ＾ＩＳに基礎を置＜０．２％のＴｅｒＩＩＩａｍｙｌ■１２０Ｌ）を添加し、そしてその残存澱粉を２時間未満の処理時間で破壊する。

その後、僅かな調整を伴う、柑橘類のペクチンからのガラクタンのためのＬａｂａＶｉｔＣｈ他（１９７６）の一般的な手順に従って、ガラクタンの抽出を実施する（Ｌａｂａｖｔｔｅｈ、Ｊ、　Ｍ、　Ｆｒｅｅｎ＋ａｎ、　Ｐ、　Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｎ、植物細胞壁の構造、双子葉植物の一次細胞壁の構造成分を分解するβ−１，４−ガラクタナーゼの精製及び特徴付け、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ。、　２５１．５９０４−５９１０（１９７６））。上記の澱粉を含まない物質のｐＨをｐＨ１１，４に調整し、そして次にその混合液を９０℃まで加熱し、そして２０時Ｍ攪拌する（Ｐｌ（を調整しながら）。室温まで冷却した後、その混合液をｐＨ６−７へ中性としく８３　ＰＯ４で）、遠心分離し、濾過し、そして限外濾過する。

このようにして作られたアラビノガラクタン（約４０．０００ダルトンの分子量）を、次に、上記のガラクタンからアラビノースの側鎖を除去するために、１００°Ｃで１時間０．０５Ｍのトリフルオロ酢酸で処理する。この反応を溶液を冷却することにより停止し、そして上記のトリフルオロ酢酸を蒸発させる。最後に、この溶液を限外濾過して砂糖を含まない状態にし、そして凍結乾燥する。

結果物としてのβ−１，４−ガラクタンは、１３．０００付近の分子量を示す。

大豆ガラクタンの生産アラビノガラクタンは、出発物質として大豆の残存物を使用して生産する。原理的には、Ｊ、　Ｂｉａｌ、　Ｃｈｅ＋ｎ、　、　２５１．　ｐ、　５９０４−５９１０（１９７６）中にＬａｂａｖｉｔｃｈ他により発表された方法と同様の方法を使用する。

培地ＹＰＤ：　１０ｇの酵母抽出物、２０ｇのペプトン、°Ｈ１０で８１０ｍ１　とし、オートクレーブにかけ、９０ｍ１の２０％グルコース（滅菌濾過した）を添加したものＹＰＧ−寒天＝２５ｇルのＢａｃｔａｇａｒ、　１５ｇ凡のグルコース、５ｚルのＫ　、　ＰＯ４，０，５ｇ／ＬノｌＪｇＳＯ４−７Ｈｓ　Ｇ　、ｐＨを５．０（：［９整し、７−　トクレーブにかけたもの１０ＸＢａｓａｌ塩：　６６、ｌ１１ｇの酵母ナイトロジェンベース、１００ｇのコハク酸、６０ｇのＮａＯＨニＨｔ　Ｏを加えＩｏｏｏｍｌ　＋：し、滅菌濾過しタモノ５Ｃ−ＵＲＡ：　９０ｍ１のＢａ５ａｌ塩、２２．５ｍｌの２ｏ％カザミノ酸、９ｍｌの１％トリプトファンにＨｔＯを加え８０６ｍ１にし、オートクレーブにかけ、３゜６ｍｉの５％トレオニン及び９０ｍ１の２０％グルコースを添加したもの５Ｃ−Ｈ寒天二アミノ酸を含まない７．５ｇ／ｌの酵母ナイトロジエンベース、Ｉｌ、　３ｇ／Ｉのコハク酸、６．８ｇ／ｌのＮａＯＨ、ビタミンを含まない５，６ｇ／ｌのカザミノ酸、０．１ｇ／ｌのトリプトファン及び２０ｇ／ｌの寒天（ＢａｃｔＯ）、１２１″Ｃで２０分間オートクレーブにかけ、オートクレーブ後、４５０ｍ１の寒天当たり、５５＋ｎｌの２２％グルコース溶液及び１．８ｍｌの５％トレオニン溶液を添加したものＹＮＢ−１寒天：　３．３ｇ／ｌのＫ１．　ＰＯい１６．７ｇ／ｌの寒天、ＰＨを７に調整し、１２１”ｃで２０分間オートクレーブにかけ、オートクレーブ後、４５０ｍ１の寒天当たり、アミノ酸を含まない２５ｍ１の１３．６％の酵母ナイトロジエンベース、２５ｍ１の４０％グルコース溶液、１．５ｍｌの１％Ｌ− ロイシン溶液及び１．５ｍｌの１ｚヒスチジン溶液を添加したものＹＮＢ−１肉汁：　ＹＮＢ−１寒天のような組成であるが上記の寒天を含まないもの大豆ガラクタン重層ゲル：１％アガロース、０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液中の０．１％ガラクタン、ＰＨ４，５、重層を寒天プレート上に注ぐ前に、このゲルを沸騰させ、そして次に５５℃まで冷却する。

ＦＧ−４−寒天＝３５ｇルの寒天、３０ｇへの大豆粉、１５ｇ凡のマルトデキストリン（Ｇｌｕｃｉｄｅｘ６）　、５ｚ凡のＢａｃｔｏペプトン、ｐＨ７，１２１℃で４０分間オートクレーブにかけたものＦＧ−４培地：３０ｇ凡の大豆粉、１５ｇ凡のマルトデキストリン（Ｇｌｕｃｉｄｅｘ６）　、５ｇへのＢａｃｔｏペプトン、１２１℃で４０分間オートクレーブにかけたものＭＤＵ−２培地：４５ｇ凡のマルトース、１ｚルのＭｇ５（Ｉｔ　−７Ｈｚ　Ｏ，１ｚルのＮａＣｌ、２ｇ／ＬのＫ　ｔ　ＳＯ４，１２ｇ／ＬのＫＬ　ＰＯａ　、０．１ｍｌ几のＰｌｕｒｏｎｉｃ６１Ｌ　、　０．５ｍｌ凡の微量金属溶液、ｐＨ５，０，１２１℃で２０分間オートクレーブにかけ、１５ｍ１の５０％滅菌濾過した尿素をオートクレーブ後に添加したもの微量金属溶液：　１３．９ｚルのＦｅＳＯ４−７Ｈｔ　Ｏ，８，４５ｇ几のＭｎ５０４−ＨｚＯ１６，８ｚルのＺｎＣ１ｚ　、２．５ｇへのＣｕ５Ｏｉ　−５Ｈｚ　Ｏ，０，２４ｇ／ＬのＮｊＣＩｔ−６Ｈｔ　Ｏ，３ｚ凡のクエン酸例１５０ブールの中の約３００．０００の別個のクローンを構成しているアスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）ＣＢＳ　１０１．４３のライブラリーを、前に記載したように、大腸菌（ε、ｃｏｌｉ）内で構築した。

上記ライブラリーからの２０個のクローンからＤＮＡを単離し、そしてｃＤＮＡ挿入のための分析に供した。その挿入頻度が〉９０％であることが判明し、その平均的な挿入物のサイズは、約１４００塩基対であった。

スベルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）のライブラリーからのＤＮＡを、酵母に形質転換し、そして２０−３０．０００コロニーを含むプレートを、それぞれのプールから得た。そのコロニーをこすり取り、そしてグリセロール内で一８０°Ｃで保存した。

上記ライブラリーからの酵母細胞を、全体として約２５０．０００コロニーになるようにＹＮＢ寒天上に塗布した。プレート当たりのコロニー数は、５０から５００までのバラツキであった。増殖から４または５日間後、その寒天プレートの、５Ｃ−Ｈ寒天プレートの２セツト上へのレプリカ平板法を行った。次にこれらのプレートを３０℃で２−４日間インクベートし、その後、上記寒天プレートの２セツトを、ガラクタナーゼ活性の検出のためにβ−１，４−ガラクンの重層ゲルを使用して重層した（β−１，４−ガラクンは、前に示したように生産されている）。４０℃で一夜インキユベーションした後、酵素反応を、コンゴーレッドで染色した。最初に、１０１０−ｌ５の０．５Ｍ　ｔｒｉｓ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８，４を上記プレートに注ぎ、そして約３０分後除去した。上記の１０１０−ｌ５の０．１χコンゴーレツド溶液を、上記重層に注ぎ、そしてｌｏ−２０分後に除去した。次に上記プレートを、上記プレート上に１０１０−ｌ５の２ＭＮａＣ１に注ぐことにより、ｌまたは２回洗浄した。このＮａＣ１溶液を１５−２５分後に除去した。ガラクタナーゼ陽性のコロニーは、赤い背景上に、透明または薄い赤い明るい領域をもつコロニーとして同定された。

酵素陽性コロニーからの細胞を、寒天上で単一コロニーを単離するために塗布し、そして酵素を生産性の単一コロニーを同定し、そして先に記載したガラクタン重層法により選択した。

ガラクラナーゼ陽性酵母単離物を同定し、そして陽性を確認した。

例２ＤＮＡの単離上記単離物を、５０ｍ１のガラス試験管内の２０ｍ１のＹＮＢ−１肉汁に接種した。この試験管を３０°Ｃで２日間振とうした。この細胞を、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により収穫した。

この細胞を、１ｍｌの０．９Ｍソルビトール、Ｏ，ＩＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ７，５に再懸濁した。上記のペレットをＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、そしてフルスピードで３０秒間回転した。この細胞を、０．４ｍｌの０．９Ｍソルビトール、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ　、　１４ｍＭのβ−ｌメルカプトエタノールに再懸濁した。

１００、ｃｚｌの２ｍｇ／ｍｌチモラーゼ（Ｚｙｍｏｌａｓｅ）を添加し、そしてその懸濁液を、３７°Ｃで３０分間インキュベートし、そして３０秒回転した。このペレット（スフェロプラスト）を、０．４ｍｌの７８に再懸濁した。９０ μ！の（１，５ｍｌの０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，０、０，６ｍｌの２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ　ｐＨ８，０。

０、６ｍｌの１０χＳ［ｌＳ）を添加し、そしてその懸濁液を６５℃で３０分間インキュベートした。８０μｌの５　Ｍ　ＫＯＡｃを添加し、そして懸濁液を氷上で少なくとも６０分間インキュベートし、そしてフルスピードで１５分間回転した。上澄を、［：ｔＯＨ（室温）で満たされた新しいチューブに移し、次に、緩やかであるが十分な混合及び３０秒間の回転を行った。

このペレットを、冷７０％ＥｔＯＨで洗浄し、３０秒間回転し、そして室温で乾燥した。そのペレットを５０μｌのＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）に再懸濁し、そして１５分間回転した。その上澄を、新しいチューブに移した。２゜５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅを添加し、次に３７°Ｃで３０分間インキュベーションし、そして緩やかな混合を伴いながら５００μｌのイソプロパツールを添加した。この混合液を３０秒間回転し、そして上澄を除去した。このペレットに冷９６％ＥｔＯＨで濯ぎ、そして室温で乾燥した。

二のＤＮＡを、約１００μｍ／ｍｌの最終濃度となるように５０μｌの水に溶解した。

上記のＤＮＡを、標準的な手順により、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）に形質転換した。２つの大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のコロニーを単離し、そして制限酵素ＨｉｎｄｌＩＩ及びＸｂａｌ（そのＤＮＡ挿入物を切り取る）で分析した。

上記の陽性クローンのいくつかの部分的なりＮＡ配列を決定した、請求項４を見よ。このクローンが、上記の精製β−１，４−ガラクタナーゼのＮ末端と同一な、Ｎ末端のアミノ酸配列をもつ蛋白質をコードすることが判明した。

例３ガラクタナーゼの発現ガラクタナーゼを発現するために、ＤＮＡの５°コンチクストと一緒になった外来のシグナル配列（原則として、特許公開番号ＷＯ９１／１７２４３から知られた配列）を、その翻訳開始コドンに導入することとし、これによって、高いレベルの翻訳開始という結果となるはずである。ＰＣＲアプローチの使用により、上記のシグナルペプチドを導入した。

プライマー１、シグナルペプチドＨｉｎｄＩＩＩ下線を引いた配列は、遺伝子の５″末端と相同的であり、そして！は、上記シグナルペプチドの切ｉｓ位を示す。

プライマー２．３゛末端５°ＧＧＧＣＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＧＣＧＴＧＡＣ３′製造者の指示に従って、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ、ＵＳＡからのＧｅｎｅ　Ａｍｐキット及び装置を使用して、上記のＰＣＲ反応を実施した。

その条件はニー５００　ｎｇのプライマー（元のｃＤＮＡクローン）−１００ピコモルのプライマー１一１００ピコモルのプライマー２一１０μｍの１０ｐｃｒ緩衝液一１０μｍの２ｍ＆ｌ　ｄＮＴＰ −１００μｍまでのＨｔｏ −２，５ＵのＴＡＱポリメラーゼであった。

３０サイクルを、９４℃で１分間、３７℃で２分間、７２℃で２分間実施した。

上記反応物の部分を、１％のアガロースゲル上で分析した。期待されたバンドを観察した（約１３５０塩基対）。そのＤＮＡをフェノールで抽出し、エタノールで沈殿させ、そして上記の制限酵素Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／Ｘｂａｌで消化した。このＤＮＡをゲル上でサイズ分画し、そしてそのガラクタナーゼの遺伝子に対応するフラグメントを精製した。次にこの遺伝子をＨｉｎｄ［Ｉ／Ｘｂａｌにより消化されたｐＨ０４１４に連結し、上記のプラスミドｐＨＤ４３８（図１２を見よ）を結果として得た。

大腸菌（ε、ｃｏｌｉ）内でのこのＤＮＡの増幅後、上記のプラスミドｐＨ０４３８を、先に記載したように、アスペルギルス・オリザエ（ＡｓｐｅｒｇｉｌＬｕ３　ｏｒｉｚａｅ）に形質転換した。

アスペルギルス・オリザエ（ＡｓｐｅｒｇｉｌＬｕ　ｏｒｉｚａｅ　）形質転換細胞のテストＦＧ−４寒天を入れたベトリ皿の中心に、１８個の形質転換細胞のそれぞれを接種した。３０℃で５日間インキュベーションした後、コルク穴あけ道具によりそのコロニーの中心から、直径４ｍｍのプラグを取り出した。このプラグを、ガラクタンの重層ゲルに埋め込み、４０℃で一夜インキュベーションを行った。このガラクタナーゼの活性を、前記のように、コンゴーレッドにより染色した。この形質導入細胞のいくつかは、３０ｍｍの明るいゾーンをもち、そしてこれにより、１４ｍｍの明るいゾーンを作り出したアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｉｚａｅ）の背景よりもより高いガラクタナーゼ活性を示している。このことは、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｉｚａｅ）におけるβ−１，４−ガラクタナーゼの効率的な発現を証明している。

上記のより高いガラクタナーゼ活性をもつ８個の形質転換細胞を選び、そして接種し、そしてＹＰＧ−寒天上で維持した。

上記の８個の形質転換細胞を、ＹＰＧ−寒天上から、ＦＧ−４及びＭＤＵ−２培地の入った５００ｍ１の振とうフラスコ上に接種した。良好なエアレ−ジョンを確保するための十分な攪拌を伴う発酵の４日後、その培養肉汁を２０００ｇで１０分間遠心分離し、そしてその上澄みを分析した。

それぞれの上澄みの１５μｌの容量を、ガラクタナーゼの重層ゲル用した。２０時間のインキコベーション後、コンゴーレッドにより１、−のガラクタナーゼ活性を肉眼観察できるようにしｆニー。

５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｅｘｃｅｌ −Ｐ、ｅｌグラジエンｌ−８−１８）において、上記のアスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｅｕｌｅａｔｕｓ）のガラクタナーゼを、アスベルギルス−アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｅｕｌｅａｔｕｓ）から精製されたガラクタナーゼに対して高められた抗血清に対するウェスタンプロット法により同定した。

本発明に記載のβ−１，４−ガラクタナーゼの使用本発明に記載のβ−１，４− ガラクタナーゼは、植物の細胞壁分解酵素として使用されることができ、したがって、ＧＢ　２１１５８２０Ａの３５ページ上に示された出願を含んでいる。

もし本発明に記載のβ−１，４−ガラクタナーゼがペクチナーゼユニットと一緒に使用されれば、相乗作用の効果または上昇効果が、特に、リンゴをすりつぶしたものの上のＴＬＰ（全液化力）に関して証明され得る。上記のペクチナーゼが上記のＡ、　ａ、　ｅ、　ｐ、である場合は、これは特別な性質を備えたペクチナーゼ調製物であるが（ＧＢ　２１１５８２ＯＡを見よ）、著しく高い相乗作用効果または上昇効果が、特に、リンゴをすりつぶしたものの上のＴＬＰに関して証明され得る。

ＴＬＰは、酵素調製物の全液化活性である。この活性は、この酵素調製物における全ての単一活性の全体としての効果である。この反応は、しオロジー的に進行される。細か（粉砕されたリンゴすりつぶし物におけるその全体の粘度（＝液士　構造物の粘度の機能）の減少を、回転式粘度計を使用して連続して２時間以内観察した。

ＭＯＤ方程式（ここで、ＰｅｅｔｉｎｅｘＡＰ−１８のＴＬＰ　＝　０　、及びＰｅｃｔｉｎｅｘ　Ｕｌｔｒａ　５Ｐ−ＬのＴＬＰ　＝　１００の定義による）に基礎を置き（Ｍｏｓｔ　Ｕｎｉｔｓ）、上記の酵素を比較する。

上記のＭＯＵ、：Ｌニットのより詳細な記述は、Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ｆｅｒｍｅｎｔ（Ｓｅｈｗｅｉｚ）ＡＧ、　Ｎｅｕｍａｔｔ、　ＣＨ−４２４３Ｄｉｔ　ｔｉｎｇｅｎ、　Ｓｗｉ　ｔｚｅｒｌａｎｄから１．リクエストに基付き得ることができる“　リンゴジュースにおけるペクチナーゼユニットの測定（ＭＯＵ）“の小冊子内に見つけられるべきである。

上記のガラクタナーゼ単独によりまたは上記のＡ、　ａ、　ｅ、　ｐ、との組み合わせにより得られたＴＬＰの数値を表３に示す。

また、図１３にも引用する。表３及び図１３の両方は、上記のβ−１，４−ガラクタナーゼ及び上記のＡ、　ａ、　ｅ、　ｐ、との著しい相乗作用を示している。したがって、ガラクタナーゼ単独は、その粘度に関しては、より高い投与量で、全く効果を示さない。より低い投与量においては、粘度における増加だけが観察され得る。しかし、驚（べきことに、上記のＡ、　ａ、　ｅ、　ｐ、との組み合わせにおいては、非常に有意な相乗作用の効果を観察することができる。上記のＡ、　ａ、　ｅ、　ｐ、における上記のガラクタナーゼユニット単独の約３０％（２６０％）の増加は、６０％（１００％）のＴＬＰの増加という結果となる。このことは、上記のβ−１，４−ガラクタナーゼが、植物細胞壁の液化工程のための主要な活動であメタノール４で洗浄し、そして濾過し、そして再び圧縮する。

得られたＡＩＳを６０℃で１時間乾燥する。

このＡＩＳから、スターチの量を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｌｌａｎｎｈｅｉｍ（注文番号２０７７４８）からのテストキットにより測定した。

得られたペクチンの量を、上記の圧搾物からの上記乾燥物質から得られた％におけるＡＩＳの量の決定することにより、そしてそのＡＩＳ中の上記スターチの量を差し引くことにより計算した。

ペクチンの酵素的抽出圧搾物１にｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（０，０２％ＮａＮ　ｓを伴う）１９を加える。３０°Ｃで、この混合液を、本発明に記載の精製された β−１，４−ガラクタナーゼの溶液により２０時間処理する。その後、この混合液を濾過し、そして圧搾物の残分を蒸留水ｌＯで洗浄する。

このＡＩＳを、先に記載の方法により得る。

結果化学的抽出により１７．５％のペクチンを得たが、一方酵素的抽出により、使用したβ−１，４−ガラクタナーゼの量に依存して１１．５と１４．５％の間のペクチンを得た。

これらの結果は、上記のβ−１，４−ガラクタナーゼが、植物原料からのペクチンの酵素的抽出のための主要な酵素の１つであることを証明している。また、化学的手段によりそして全てのそれに付随する欠点を伴って、抽出することができるペクチンの６０−８０％が、環境的に妥当な方法で酵素的に抽出され得ることも上記から明らかである。

配列表（１）一般情報（ｉ）出願者：ノボ　ノルディスクＡ／５（ｉｉ）発明の名称：ベータ−１，４ −ガラクタナーゼ及びＤＮＡ配列（ｉｉｉ）配列数：１２（ｉｖ）連絡先：（Ａ）宛て先：ノボ　ノルディスクＡ／Ｓ、特許部（Ｂ）番地二ノボ　アレ（Ｎｏｖｏ　Ａｌｌυ（Ｃ）市：バグスバード（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ）（Ｅ）ｆｆｌ：デンマーク（Ｄｅｒｕｎａｒｋ）ＣＦ）郵便番号：　ＤＫ−２８８０（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報：（Ａ）氏名：バッハニール（ＢＡＣＨ，Ｎ１ｅｌｓ）（Ｂ）　Ｊｌ録番号＝（ε ＰＯ）　ＧＡ　２４３０７（ｉｘ）遠距離通信情報：（Ａ）　を話：　＋４５　４４４４　８８８８（Ｂ）ファックス：　＋４５４４４９３２５６（Ｃ）テレックス：　３７３０４（２）配列番号１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ゛：３１アミノ酸（Ｂ）形二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ＮＤハイボセティカル配列：否（ｉｖ）アンチセンス・否（ｖｉ）起源：（Ｂ）株名：　ＣＢＳ　１０１．４３（ｘｉ）配列：配列番号ｌ：（２）配列番号２に関する情報＝（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ＝３１アミノ酸（Ｂ）形二アミノ酸（Ｃ）鎖の数；−重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｆ）配列の種類：ペプチド（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：否（ｉｖ）アンチセンスエ否（ｖｌ）起源：（Ｂ）株名：　ＣＢＳ　１０１．４３（ｘｉ）配列：配列番号２：（２）配列番号３に関する清報コ（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２８アミノ酸（Ｂ）形二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：否（ｉｖ）アンチセンス：否（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：アスペルギルスニガ−（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｊｇｅｒ）（ｘｉ）配列：配列番号３：（２）配列番号４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ二８４塩基対（Ｂ）形；核酸ＣＣ）＃Ａの数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ｒＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号４：ＧＣＧＣ丁ＣＡＣＣＴ　ＡＴＣＧＣＧＧＣＧＣＡＧＡＣＡＴＣＴＣＴ　ＴＣＴＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴｒＧＡＡＧＡ　ＴＧＡＧＧＧＣＴＡＴ@６０＾ＧＣＴＡＴＭＧＡ　ＡＴＣＴＣＡＡＴＧＧ　ＣＣＡＡ　８４（２）配列番号５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さニア２塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）配列の種類：　ｒＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号５：（２）配列番号６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）長さ：６０塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ｒＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号６：ＧＣＡＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＡ　ＣＴＡＣＭＴｒＴＧ　ＧＡＧＣＴＧＧＣＣＡ　ＡＧＧＣＧＧＴＣＡＡ　ＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡ@６０（２）配列番号７に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：３９塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ｒＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号７：ＴＣＴＧＡＡＴＴＧＴ　ＧＧＧＡＧＧε＾ＧＧ　ＧＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＣＣＧＴＣＡＧＣ３９（２）配列番号８に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ＝６７塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（０）トポロジー：直鎖状（ｉｆ）配列の種類：　ｒＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号Ｐ：（２）配列番号９に関する情報：（ｉ）配列の特徴二（Ａ）長さ：４０塩基対ＣＢ）形：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ｒＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号９：ＧＡＣＧＡＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＡＴＡＡＡ　ＣＣＡＫＣＣＡＧＧ　ＧＴＣＴＣＴＡＡＡＡ　４０（２）配列番号１０に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ、）長さニア８塩基対ＣＢ）形：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号ｌＯ：（２）配列番号１１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１８塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号１１：ＧＣＧＣＴＣＡＣＣＴ　ＡＴＣＧＣＧＧＣ１Ｂ（２）配列番号１２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ＝２１塩基対ＣＢ）形：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎮（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号１２：ＧＧＧＣ（ｉＴａＡＡＴ　ＧＴＡＡＧＣＧＴＧＡ　Ｃ２１ＦＩＧ、　３ＦＩＧ、　４ＦＩＧ、　７ＦＩＧ、８ＵＲＡ３ＦＩＧ、　１１ＦＩＧ、１２ＦＩＧ、　１３補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年８月　９日

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下の部分的アミノ酸配列：【配列があります】又は上記部分的アミノ酸配列との少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性をもつ部分的アミノ酸配列をもつ β−１，４−ガラクタナーゼ、。
２．上記のβ−１，４−ガラクタナーゼが、３．０−５．０の、好ましくは３．５−４．０の最適ｐＨを、２．０−３．５の、好ましくは２．５−３．１の等電点を、３０，０００と５０，０００との間の、好ましくは３７，０００と４５，０００との間の分子量を、及び１０と５０℃との間の、好ましくは２５と４０℃ との間の最適温度を示す請求項１に記載のβ−１，４−ガラクタナーゼ。
３．請求項１又は２に記載の上記β−１，４−ガラクタナーゼをコードすることを特徴とする組み換えＤＮＡ配列。
４．以下の部分的ＤＮＡ配列：１）【配列があります】２）【配列があります】３）【配列があります】４）【配列があります】５）【配列があります】６）【配列があります】の少なくとも１つを含んで成る請求項３に記載の組み換えＤＮＡ配列。
５．ａ）アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）のβ−１，４−ガラクタナーゼのＤＮＡ挿入物ｐＨＤ４３８ｂ）ａ）を含んで成る成熟β−１，４−ガラクタナーゼＤＮＡのためのコード領域にハイブリダイズし、そして、β−１，４−ガラクタナーゼ活性をもつポリペプチドのための構造遺伝子、並びに場合によってはプロモーター、シグナルまたはリーダーペプチドのためのコード領域、及び／または転写ターミネーターを含んで成るＤＮＡ挿入物をさらに含んで成るＤＮＡ配列ｃ）Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨ）から引用する比較的ストリンジェントな条件下（１．０ΧＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃）で、請求項３に示す配列の中の１つとハイブリダイズするに十分な相同性をもつＤＮＡ配列ｄ）ａ）、ｂ）、もしくはｃ）に定義したＤＮＡ配列の微生物、または、ｅ）成熟β−１，４−ガラクタナーゼまたはそれらのシグナルペプチドもしくはリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列並びにａ）、ｂ）、もしくはｃ）に定義したＤＮＡ配列に関してその遺伝子コードの意味の範囲内で縮重しているＤＮＡ配列から選ばれたＤＮＡ配列を含んで成る請求項３又は４に記載の組み換えＤＮＡ配列。
６．請求項３〜５に記載の上記の組み換えＤＮＡ配列を含んで成るベクター。
７．上記のプロモーターが、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｉｚａｅ）のタカアミラーゼのプロモーター、好ましくはｐＨＤ４３８である請求項６に記載のベクター。
８．請求項６または７に記載の上記ベクターを含んで成る形質転換された宿主。
９．上記の形質転換された宿主が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株である請求項８に記載の形質転換された宿主。
１０．上記の形質転換された宿主が、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｒｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇａｅｒ）、アスペルギルス・オリザェ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｉｚａｅ）、またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒ１）の種に属する株である請求項９に記載の形質転換された宿主。
１１．上記の形質転換された宿主が、形質転換されない条件においてはβ−１，４−ガラクタナーゼを生産しない又は有意でない量のβ−１，４−ガラクタナーゼのみを生産する微生物、好ましくはバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくはパン酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項８に記載の形質転換された宿主。
１２．請求項８〜１１に記載の形質転換された宿主の使用によるβ−１，４−ガラクタナーゼの生産方法。
１３．請求項１２に記載の方法により生産されたβ−１，４−ガラクタナーゼ。
１４．請求項１〜２に記載の上記β−１，４−ガラクタナーゼにより、好ましくは少なくとも１．１の濃縮率により濃縮された、植物細胞壁の分解または修飾のために使用することができるペクチナーゼ調製物を、酵素調製物が含んでいるという事実により特徴ずけされる酵素調製物。
１５．上記のペクチナーゼ調製物が、アスペルギルス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））属に属する微生物、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇａｅｒ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｒｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）またはアスペルギルス・オリザェ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｉｚａｅ）により生産することができる請求項１４に記載の酵素調製物。
１６．上記のβ−１，４−ガラクタナーゼが、請求項１３に記載の上記β−１，４−ガラクタナーゼである請求項１４または１５に記載の酵素調製物。
１７．ガラクタンの分解または修飾のための剤としての、請求項１〜２または１３に記載のβ−１，４−ガラクタナーゼの使用。
１８．植物細胞壁の分解または修飾のための剤としての、請求項１７に記載の使用。
１９．ガラクタンの分解または修飾のための剤としての、請求項１４〜１６に記載の酵素調製物の使用。
２０．植物細胞壁の分解または修飾のための剤としての、請求項１９に記載の使用。