CN1446915A - 适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白及其生产方法，该重组甜蛋白的DNA序列由丝状真菌偏爱的密码子组成，尤其是灵芝喜好的密码子，其中，丝状真菌可以是灵芝、平菇、双孢菇或曲霉等。本发明中所述的的重组甜蛋白的生产方法包括以下步骤：①基于monellin甜蛋白的氨基酸序列，合成由丝状真菌偏好密码子组成的monellin甜蛋白的DNA序列；②将步骤①中所述的DNA序列与丝状真菌表达载体pCALZ相连，得到能在丝状真菌中表达Monellin蛋白的重组表达载体；③将步骤②中所得的重组表达载体转化丝状菌株，得到重组菌株；④将步骤③中所得的重组菌株，进行工业化发酵生产。本发明所述的重组甜蛋白不仅食用安全，而且含有多糖等多种增强免疫力的成分。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种重组甜蛋白及其生产方法，尤其是涉及一种适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白及其生产方法。
背景技术
甜蛋白(monellin)基因是从西非植物(Dioscoreophyllum Comminisii)的果实中克隆的，它编码的蛋白质(monellin)具有很高的甜度，其甜度是同等重量蔗糖的3000-4000倍、等摩尔蔗糖的10万倍。天然monellin甜蛋白的分子量是10700道尔顿，由A、B两条链组成，A链有44个氨基酸、B链有50个氨基酸，分子内无二硫键，主要靠氢键结合。空间结构由一个β折叠片及位于β折叠片内的α螺旋构成，由两条链之间的氢键和疏水键稳定分子的结构。
甜味剂是常用的食品添加剂，其中包括糖类甜味剂，如蔗糖、果糖等能被人体代谢利用，多余的糖会转化为脂肪，不利于糖尿病、肥胖病、齿病和心血管病人食用。人工合成的如阿斯巴甜、甜味素等又有一定的副作用。甜蛋白比人工合成的甜味剂更易为公众接受，而且其甜度极高，相同分子数的甜蛋白比蔗糖的甜度高十万倍，特别适用于糖尿病、肥胖病、齿病和心血管病人食用。因此，甜蛋白在食品、医药等产业有很高的价值。目前，甜蛋白主要是从植物中提取，但由于原材料价格高，导致其生产成本过高，进而限制其在工业上的应用。此外，采用固相合成蛋白质的方法合成甜蛋白，其成本也很高，难以实现工业化生产。
利用基因工程技术生产蛋白质不仅可以提高甜蛋白的产量、降低成本，而且可以对基因进行改造，扩大其在工业上应用的范围，目前人们已在大肠杆菌、酵母中表达了Monellin甜蛋白，但其表达效率和食用安全性还不令人满意。
发明内容
本发明的目的是提供一种适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白及其生产方法。
同一种氨基酸由一个以上的密码子编码，生物对其中一种具有使用的偏好性。根据丝状真菌的密码子偏好性，尤其是灵芝的密码子的偏好性，本发明对天然的monellin基因进行改造，提高甜蛋白在灵芝中的表达量。人工合成的重组monellin基因插入灵芝表达载体pCALZ，通过基因工程技术将monellin基因整合到灵芝的基因组中，使灵芝表达monellin蛋白，通过发酵方法大量生产甜蛋白。
为了实现上述目的，本发明所设计的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白的DNA序列为：atgggcgagt gggagatcat cgacatcggc cccttcaccc agaacctcgg caagttcgcc 60gtcgacgagg agaacaagat cggccagtac ggccgcctca ccttcaacaa ggtcatccgc 120ccctgcatga agaagaccat ctacgaggcg aacggcttcc gcgagatcaa gggctacgag 180taccagctct acgtctacgc ctccgacaag ctcttccgcg ccgacatctc cgaggactac 240aagacccgcg gccgcaagct cctccgcttc aacggccccg tccccccgcc ctaa 294
本发明中所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白的DNA序列由丝状真菌偏爱的密码子组成，尤其是灵芝喜好的密码子。
本发明所述的丝状真菌可以是灵芝、平菇、双孢菇或曲霉等。
本发明采用基因工程技术，根据已知的monellin蛋白的氨基酸序列，选用丝状真菌，尤其是灵芝偏好的密码子，人工合成monellin甜蛋白基因，将其插入表达载体中，并使之整合到宿主基因组中，获得能表达monellin蛋白的重组菌株。
本发明中所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白的生产方法包括以下步骤：
①基于monellin甜蛋白的氨基酸序列，合成由丝状真菌偏好密码子组成的monellin甜蛋白的DNA序列。
②将步骤①中所述的DNA序列与丝状真菌表达载体pCALZ相连，得到能在丝状真菌中表达Monellin蛋白的重组表达载体。
③将步骤②中所得的重组表达载体转化丝状菌株，得到重组菌株。
④将步骤③中所得的重组菌株，进行工业化发酵生产。
本发明中的宿主为丝状真菌，它可以是灵芝、平菇、双孢菇或曲霉等。
上述步骤②中所述的载体是pCALZ，适于在灵芝、平菇、双孢菇、曲霉等宿主中表达，具有以下几个特征：①具有在丝状真菌中表达能力强的强启动子，有纤维素酶的cbh1、葡糖淀粉酶的glaA、3-磷酸甘油醛脱氢酶的gpdA等启动子。②具有使重组monellin基因整合入宿主基因组的序列。③具有选择标记，一般有营养缺陷型和抗药性等选择标记，通过选择压力来筛选重组菌株。
上述步骤②中所述的重组表达载体除包含编码Monellin甜蛋白的DNA序列外，还包含在丝状真菌中表达Monellin甜蛋白所需的调控元件。
上述步骤③中可采用PEG法、电激法、农杆菌介导法或基因枪法，将重组表达载体导入宿主细胞中，表达monellin甜蛋白。
上述方法步骤③中所述的重组菌株是整合有丝状真菌monellin蛋白DNA序列的重组菌株。
本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明所述的的重组甜蛋白适于在丝状真菌中表达，该丝状真菌选用灵芝时，不仅食用安全，而且含有多糖等多种增强免疫力的成分。灵芝的发酵工艺已经成熟，灵芝转基因技术也开发成功，因此灵芝是一种较为理想的外源蛋白表达系统。本发明设计、合成的重组Monellin蛋白可在灵芝中高效表达。
具体实施方式1.monellin甜蛋白基因的人工合成：
人工合成以下四条单链DNA片段，各片段的碱基序列如下：1#5’-CCCTCGAGAAGCGCAAGCGCGGCGAGTGGGAGATCATCGACATCGGCCCCTTCACCCAGAACCTCGGCAAGTTCGCCGTCGACGAGGAG-3’2#5’-TCCTCGTAGATGGTCTTCTTCATGCAGGGGCGGATGACCTTGTTGAAGGTGAGGCGGCCGTACTGGCCGATCTTGTTCTCCTCGTCGAC-3’3#5’-GACCATCTACGAGGAGAACGGCTTCCGCGAGATCAAGGGCTACGAGTACCAGCTCTACGTCTACGCCTCCGACAAGCTCTTCCGCGCCGACATC-3’4#5’-CGGATCCTTAGGGCGGGGGGACGGGGCCGTTGAAGCGHGAGGAGCTTGCGGCCGCGGGTCTTGTAGTCCTCGGAGATGTCGGCGCG-3’
在STRATAGENE公司的RoboCycler GRADIENT96型PCR扩增仪上扩增。具体操作程序如下：反应物 体积 终浓度10×缓冲液 5μl 1×缓冲液4×dNTP 4μl 200μM/每种脱氧核苷酸引物1# 0.5μl 25pmol/每个反应引物2# 0.05μl 2.5pmol/每个反应引物3# 0.05μl 2.5pmol/每个反应引物4# 0.5μl 25pmol/每个反应Taq DNA聚合酶 0.5μl 3Unit/每个反应无菌水 38μl混匀样品，加Taq DNA聚合酶，混匀离心后，加30μl石蜡油。之后即可开始循环。循环参数为：94℃变性反应 30s
58℃退火反应 30s
72℃延伸反应 1min
经过30个循环，其中最后一个循环中的72℃延伸反应再增加5mins。反应结束后，取出反应管，使之冷却到室温，然后用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行分析，由此获得monellin甜蛋白基因。2.合成的monellin基因的克隆在紫外分析仪中切下目的DNA条带，装入1.5ml Eppendorf管，然后用德国QIAGEN公司的Gel Extration Kit试剂盒回收目的DNA。该DNA经XhoI和BamHI酶切后，与表达载体pCALZ相连接。将载体DNA转移到无菌的微量离心管中，加入等摩尔量的外源DNA。加入17μl ddH2O，于45℃水浴5mins以使重新退火的DNA末端解链，将混合液冷却到0℃。加入2μl连接缓冲液，1μl T4 DNA连接酶。置于16℃循环水浴中过夜。所得的连接产物转化大肠杆菌。从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，冰上使其融化。加入一定量的连接产物，轻轻摇匀，冰上放置0.5～1h。42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3～5mins。向管中加入1ml LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。将上述菌液摇匀后取200μl涂布于含相应抗生素、X-gal和IPTG的筛选平板上，正面向上放置0.5h，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24hrs，至挑出单菌落为止。挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，于37℃振荡培养过夜。12000rpm，离心3～5mins收集菌体于1.5ml Eppendorf管，弃上清。将菌体充分重悬于100μl预冷的溶液I(溶液I为：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)，灭菌后贮存于4℃)，剧烈振荡混匀，室温放置5mins。加入200μl新配的溶液II(溶液II为：0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)，1％SDS，现用现配)，缓慢颠倒离心管数次以充分混匀内容物，冰上放置5mins，裂解至溶液透明。加入150μl预冷的溶液III(溶液III为：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，无菌水28.5ml，pH4.8)，颠倒离心管数次，混匀后冰浴放置10mins。12000rpm，离心10mins，取出上清，加入5～10μl RNase酶，在37℃下放置0.5～1h。等倍体积的酚∶氯仿(24∶1)抽提，12000g下离心10mins，直至无蛋白质界面。取水相，加入2倍无水乙醇，在-20℃下沉淀20mins。10000g下离心10mins。室温下12000rpm离心10mins，弃上清，沉淀溶于20μl ddH2O中。加入1/2至1/3体积的7.5M NH4Ac，混匀，冰浴5mins。12000rpm，离心8mins。取上清，加入2倍无水乙醇于上清，混匀，10000rpm，离心5mins。弃上清，70％乙醇漂洗沉淀，12000rpm，离心3mins。沉淀溶于适量的TE溶液中。取新的经灭菌处理的0.5ml Eppendorf管，加入20μl ddH2O，然后取0.5～1.0μg DNA溶于其中。加入相应酶的10x Buffer 3μl，最后加入相应的限制性内切酶1μl，混匀酶切反应物后，酶切1-4hrs。用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行分析。3.携带monellin基因的表达载体pCALZ转化农杆菌
从平板接一环农杆菌LBA4404与5ml含Rif(50mg/L)的YEB液体培养基中，28℃180rpm培养过夜。按1％接种量接种于100ml含Rif(50mg/L)的YEB液体培养基中，28℃250rpm培养4hrs。4℃，4000rpm离心10mins。沉淀用预冷的TE(PH7.5)洗一次。加入10ml YEB液体培养基重新悬浮，分装成小管，直接用于转化或液氮速冻，-70℃保存。取100μl的感受态细胞于冰上融化，加入适量的pCALZ质粒DNA，混匀。依次置于冰上、液氮、37℃水浴各5mins。加入500μl YEB液体培养基，28℃ 100rpm培养3hrs涂布于含有相应筛选因子的固体YEB培养基平板。挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的YEB培养基中，于28℃振荡培养过夜。12000rpm，离心3～5mins收集菌体于1.5ml Eppendorf管，弃上清。将菌体充分重悬于100μl预冷的溶液I，并加入溶菌酶至2mg/ml剧烈振荡，室温放置5mins。加入200μl新配的溶液II，缓慢颠倒离心管数次以充分混匀内容物，冰上放置5mins，裂解至溶液透明。加入30μl用2倍体积溶液II平衡酚。加入150μl预冷的溶液III，颠倒离心管数次，混匀后冰浴放置10mins。12000rpm，离心10mins，取出上清，加入5～10μlRNase酶，在37℃下放置0.5～1h。等倍体积的酚∶氯仿(24∶1)抽提，12000g下离心10mins，直至无蛋白质界面。取水相，加入2倍无水乙醇，在-20℃下沉淀20mins。10000g下离心10mins。室温下12000rpm离心10mins，弃上清，沉淀溶于20μl ddH2O中。加入1/2至1/3体积的7.5M NH4Ac，混匀，冰浴5mins。12000rpm，离心8mins。取上清，加入2倍无水乙醇于上清，混匀，10000rpm，离心5mins。弃上清，70％乙醇漂洗沉淀，12000rpm，离心3mins。沉淀溶于适量的TE溶液中。取新的经灭菌处理的0.5ml Eppendorf管，加入20μl ddH2O，然后取0.5～1.0μg DNA溶于其中。加入相应酶的10x Buffer 3μl，最后加入相应的限制性内切酶1μl，混匀酶切反应物后，酶切1～4hrs。用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行分析。4.农杆菌介导monellin基因整合到灵芝基因组中
称取1克灵芝湿菌丝，加3ml酶液(1g溶壁酶，0.5g崩溃酶，溶于100ml0.6mol/L的硫酸镁溶液中)，35℃酶解2小时。将酶解液用灭过菌的G3砂芯漏斗过滤，3000r/min离心10分钟，去上清液，用0.5mol/L甘露醇洗涤两次，得到纯化的原生质体。
pCALZ(携带monellin基因)质粒的LBA4404按1％的接种量接种于基本培养基(含50mg/Lrif、50mg/L卡那霉素)中，培养过夜，用液体诱导培养基稀释至OD660达到0.15，28℃下200rpm培养3小时。
取精制(纯化)后的200μl灵芝原生质体(1×108个/ml)与200μl上述制备的LBA4404混匀。涂布于固体诱导培养基上，35℃下培养2天。转移至含有50μg/ml HmB的纤维二糖再生培养基平板，在同样温度下倒置培养5天后得到HmB抗性转化株。转化频率约为100个转化子/107个原生质体。5工业发酵方法生产甜蛋白
将新鲜的灵芝斜面菌种接入十个500ml(装液量为100ml)三角瓶中，26℃摇床培养144小时。然后把两个500ml摇瓶种转接入2000ml三角瓶中(装液量为1000ml)，26℃摇床培养96小时。将5瓶2000ml摇瓶中的种转接入一个装有100L发酵培养基的总容积为150L的一级种子罐，保持罐温26℃，罐压30kPa，搅拌速率100r/min，通气量1∶0.2，发酵72小时。将种子罐菌种转接到一个装有1吨发酵培养基的1.5吨二级种子罐中，保持罐温27℃，罐压罐压0.5～1.0kg/cm2，搅拌速率110r/min，通气量1∶0.4，发酵70小时。将二级种子罐中菌种转接到一个装有10吨发酵培养基的15吨发酵罐中，保持罐温26℃，罐压0.8～1.2kg/cm2，搅拌速率120r/min，通气量为1∶0.7，发酵100小时，然后放罐将发酵液用板框压滤机压滤，得到含有甜蛋白湿菌丝体。
Claims (7)
1.适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白，其DNA序列为：
atgggcgagt gggagatcat cgacatcggc cccttcaccc agaacctcgg caagttcgcc 60
gtcgacgagg agaacaagat cggccagtac ggccgcctca ccttcaacaa ggtcatccgc 120
ccctgcatga agaagaccat ctacgaggcg aacggcttcc gcgagatcaa gggctacgag 180
taccagctct acgtctacgc ctccgacaag ctcttccgcg ccgacatctc cgaggactac 240
aagacccgcg gccgcaagct cctccgcttc aacggccccg tccccccgcc ctaa 294
2.根据权利要求1所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白，其特征是：所述的DNA序列由丝状真菌偏爱的密码子组成。
3.根据权利要求2所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白，其特征是：所述的丝状真菌是灵芝、平菇、双孢菇或曲霉。
4.如权利要求1所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白的生产方法，依次包括以下步骤：
①基于monellin甜蛋白的氨基酸序列，合成由丝状真菌偏好密码子组成的monellin甜蛋白的DNA序列；
②将步骤①中所述的DNA序列与丝状真菌表达载体pCALZ相连，得到能在丝状真菌中表达Monellin蛋白的重组表达载体；
③将步骤②中所得的重组表达载体转化丝状菌株，得到重组菌株；
④将步骤③中所得的重组菌株，进行工业化发酵生产。
5.根据权利要求4所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白的生产方法，其特征是：步骤②中所述的载体pCALZ适于在灵芝、平菇、双孢菇、曲霉等宿主中表达，具有以下几个特征：①具有在丝状真菌中表达能力强的强启动子，有纤维素酶的cbh1、葡糖淀粉酶的glaA、3-磷酸甘油醛脱氢酶的gpdA等启动子；②具有使重组monellin基因整合入宿主基因组的序列；③具有选择标记，一般有营养缺陷型和抗药性等选择标记，通过选择压力来筛选重组菌株。
6.根据权利要求5所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白的生产方法，其特征是：步骤②中所述的载体pCALZ还包含在丝状真菌中表达Monellin甜蛋白所需的调控元件。
7.根据权利要求4所述的适于在丝状真菌中表达的重组甜蛋白的生产方法，其特征是：步骤③中采用PEG法、电激法、农杆菌介导法或基因枪法，将重组表达载体导入宿主细胞中，表达monellin甜蛋白。
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|---|---|---|---|---|
| CN107574173A (zh) * | 2017-11-02 | 2018-01-12 | 江西科技师范大学 | 一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法 |
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2002
- 2002-03-22 CN CN02114997A patent/CN1446915A/zh active Pending
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| CN107574173B (zh) * | 2017-11-02 | 2021-07-13 | 江西科技师范大学 | 一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法 |
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