DE69825510T2

DE69825510T2 - Nicotianamine Aminotransferase und dafür kodierendes Gen

Info

Publication number: DE69825510T2
Application number: DE69825510T
Authority: DE
Inventors: Satoshi Narashino-shi Mori; Hiromi Bunkyo-ku Nakanishi; Michiko Utsunomiya-shi Takahashi
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1997-02-21
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2018-02-20
Also published as: US20050095689A1; EP0860499A2; DE69825510D1; CA2224130A1; EP0860499A3; US7288397B2; EP0860499B1; CA2224130C; CN1195700A; US6897300B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nicotianaminaminotransferase, ein Gen dafür und dessen Verwendung.
Beschreibung des Standes der Technik
Kalkhaltiger Boden, ein salzhaltiger Auswaschungsboden auf trockenem Grund, bedeckt etwa 30% des Bodens der Welt, einschließlich China, der Länder des Mittleren und des Nahen Ostens, Zentral- und Nordafrika, Zentral- und Westamerika usw. In diesem Boden ist das Eisen im Boden aufgrund des hohen pH-Werts unlöslich gemacht. Eine Pflanze kann in diesem Boden nicht wachsen und entwickelt Bleichsucht durch Eisenmangel, es sei denn, sie kann Eisen in löslicher Form durch die Wurzel auf irgendeine Art und Weise absorbieren. Wenn landwirtschaftliche und umweltbedingte Aufforstung erwünscht sind, sind Maßnahmen gegen den Mangel an löslichem Eisen im Boden ein wichtiges Problem.
Als Maßnahmen, um den Eisenmangel der Pflanze durch landwirtschaftliche Techniken zu lösen, kann in Erwägung gezogen werden: (1) Korrigieren des pH-Werts des alkalischen Bodens auf einen neutralen oder leicht azidischen pH-Wert durch Hinzufügung von Schwefel, (2) Anwenden einer Substanz, die ein Eisen als Chelat enthält, oder (3) Erhöhen des löslichen Eisen im Boden durch Verstärken der Mikroorganismusaktivität im Boden, beispielsweise durch Anwendung einer organischen Substanz, wodurch die Siderophorproduktion (ein Eisentransporter) durch den Mikroorganismus erhöht wird.
Diese Mittel zum Zur-Verfügung-Stellen von Eisen durch Bodenbehandlung sind jedoch nicht immer befriedigend, da es Probleme beispielsweise dadurch gibt, daß eine große Menge von Anwendungsmaterial erforderlich ist, daß die Wirkung abhängig von dem Verfahren der Anwendung, einschließlich der Zeit der Anwendung, des Orts der Anwendung, der Konzentration, der Art des Ausbreitungsmittels oder ähnlichem sowie den Wetterbedingungen sehr unstabil ist. Daher bestand ein Bedarf für die Entwicklung von neuen Techniken.
K. Kanazawa et al., J. Exp. Botany, Bd. 46, Nr. 290, 1995 offenbaren auf den Seiten 1241–1244 zwei Isoenzyme der Nicotianaminaminotransferase, die bei der Biosynthese von Phytosiderophoren eine Rolle spielen und die in Gerstenwurzeln gefunden wurden, welche einen Eisenmangel aufwiesen. Eines der Isoenzyme wurde durch eine Eisenmangelbehandlung stark induziert, während das andere nicht stark induziert wurde.
S. Mori, Soil Sci. Plant Nutr., Bd. 43, 1997 offenbart auf den Seiten 975–980 die Arbeit über das Klonieren von Genen, die für Enzyme codieren, die in dem biosynthetischen Weg der Familie der mugineischen Säure von Phytosiderophoren eine Rolle spielen, oder den Versuch des Klonierens des Fe(III)-MAs-Transporters. Ein Eisenmangel-induziertes Gen, welches unter anderem in Gerstenwurzeln kloniert wurde, ist Nicotinaminaminotransferase.
M. Takahashi et al., T. Ando, Hrsg., Kluwer Academic Press, Doordrecht 1997, offenbaren auf den Seiten 279–280 die partielle Aufreinigung von Nicotinaminaminotransferase aus Gerste.
Unter diesen Umständen haben die vorliegenden Erfinder ausführliche Studien durchgeführt und ein neues Gen entdeckt, welches zum Verstärken der Absorptionsfähigkeit von unlöslichem Eisen im Boden und zum Verbessern der Resistenz gegenüber Eisenmangel geeignet ist, und haben somit die vorliegende Erfindung abgeschlossen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung zur Verfügung:

(1) Ein Protein, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist (hiernach das Protein der vorliegenden Erfindung genannt);
(2) ein Gen, das für das Protein, wie definiert in dem vorangehenden Gegenstand 1, codiert (hiernach das Gen der vorliegenden Erfindung genannt);
(3) das Gen in Übereinstimmung mit dem vorangehenden Gegenstand 2 mit einer Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz codiert, welche durch SEQ ID NO: 1 angegeben ist;
(4) das Gen in Übereinstimmung mit dem vorangehenden Gegenstand 3 mit einer Nukleotidsequenz, die durch SEQ ID NO: 3 angegeben ist;
(5) ein Plasmid, welches das Gen in Übereinstimmung mit dem vorangehenden Gegenstand 2 umfaßt (hiernach das Plasmid der vorliegenden Erfindung genannt);
(6) ein Expressionsplasmid, umfassend (1) einen Promotor, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, (2) das Gen in Übereinstimmung mit dem vorangehenden Gegenstand 2 und (3) einen Terminator, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, operabel verbunden in der oben beschriebenen Reihenfolge (hiernach das Expressionsplasmid der vorliegenden Erfindung genannt);
(7) ein Verfahren zum Herstellen eines Expressionsplasmids, umfassend das Kombinieren (1) eines Promotors, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, (2) des Gens in Übereinstimmung mit dem vorangehenden Gegenstand 2 und (3) eines Terminators, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, operabel verbunden in der oben beschriebenen Reihenfolge (hiernach das Verfahren für die Konstruktion der vorliegenden Erfindung genannt);
(8) einen Transformant, der eine Wirtszelle umfaßt, welche das Plasmid, wie definiert im vorangehenden Gegenstand 5 oder 6, enthält;
(9) den Transformant in Übereinstimmung mit dem vorangehenden Gegenstand 8, wobei der Wirt ein Mikroorganismus ist;
(10) den Transformant in Übereinstimmung mit dem vorangehenden Gegenstand 8, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist;
(11) ein Verfahren zum Verstärken der Eisenabsorptionsfähigkeit einer Wirtszelle, welches das Einführen eines Expressionsplasmids, das gebildet wird durch Kombinieren (1) eines Promotors, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, (2) eines Nicotianaminaminotransferase-Gens und (3) eines Terminators, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, operabel verbunden in der oben beschriebenen Reihenfolge, in eine Wirtszelle und Transformieren der Wirtszelle umfaßt;
(12) das Verfahren in Übereinstimmung mit dem vorangehenden Gegenstand 11, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist;
(13) das Verfahren in Übereinstimmung mit dem vorangehenden Gegenstand 12, wobei das Nicotianaminaminotransferase-Gen das Gen ist, wie in dem vorangehenden Gegenstand 2 definiert;
(14) ein Genfragment mit einer Partialsequenz des Gens in Übereinstimmung mit dem vorangehenden Gegenstand 2, 3 oder 4 (hiernach das Genfragment der vorliegenden Erfindung genannt);
(15) das Genfragment in Übereinstimmung mit dem vorangehenden Gegenstand 14, wobei die Anzahl der Basen 15 oder mehr und 50 oder weniger ist;
(16) das Genfragment in Übereinstimmung mit dem vorangehenden Gegenstand 14 mit der Nukleotidsequenz, die durch SEQ ID NO: 5 angegeben ist;
(17) ein Verfahren zum Detektieren eines Nicotianaminaminotransferase-Gens, welches das Detektieren eines Nicotianaminaminotransferase-Gens mit einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz eines Enzyms mit der Nicotianaminaminotransferase-Aktivität codiert, oder eines Genfragments davon aus Pflanzenfragmenten umfaßt, durch Anwenden des Hybridisierungsverfahrens unter Verwendung des Genfragments in Übereinstimmung mit dem vorangehenden Gegenstand 14, 15 oder 16 (hiernach das Verfahren zur Detektion der vorliegenden Erfindung genannt);
(18) ein Verfahren zum Amplifizieren eines Nicotianaminaminotransferase-Gens, welches das Amplifizieren eines Nicotianaminaminotransferase-Gens mit einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz eines Enzyms mit der Nicotianaminaminotransferase-Aktivität codiert, oder eines Genfragments davon umfaßt, durch Anwenden von PCR (Polymerase-Kettenreaktion) auf ein Pflanzengenfragment unter Verwendung des Genfragments, wie im vorangehenden Gegenstand 14, 15 oder 16 als Primer definiert (hiernach das Amplifizierungs-Verfahren der vorliegenden Erfindung genannt);
(19) ein Verfahren zum Erhalten eines Nicotianaminaminotransferase-Gens, welches das Identifizieren eines Nicotianaminaminotransferase-Gens oder eines Genfragments davon, durch das Verfahren, wie im vorangehenden Gegenstand 17 oder 18 definiert, und Isolieren und Aufreinigen des identifizierten Gens oder des Genfragments davon umfaßt; und
(20) ein Nicotianaminaminotransferase-Gen, welches durch das Verfahren erhalten wird, wie in dem vorangehenden Gegenstand 19 definiert.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird hierunter detaillierter beschrieben werden.
Das Protein der vorliegenden Erfindung umfaßt die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
Solch ein Protein kann aus Gramineae-Pflanzen, zum Beispiel Gerste (Hordeum vulgare) oder ähnlichem, durch ein Verfahren hergestellt werden, beispielsweise ein solches Verfahren, wie hierunter beschrieben.
Beispiele des Proteins der vorliegenden Erfindung beinhalten eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder eine Aminosäuresequenz mit einem Molekulargewicht von 47 kDa, die 429 Aminosäuren umfaßt, beginnend mit der Aminosäure Nr. 33 in SEQ ID NO: 1.
Die Nicotianaminaminotransferase-Aktivität hiernach betrifft eine Fähigkeit zum Transferieren einer Aminogruppe von Nicotianamin zu 2-Oxoglutarat.
Die Nicotianaminaminotransferase-Aktivität kann beispielsweise durch ein Verfahren gemessen werden, das in Kanazawa, K. et al., Journal of Experimental Botany, 45, 1903–1906 (1994) und anderswo beschrieben ist. Genauer gesagt werden die Subrate Nicotianamin, 2-Oxoglutarsäure und Pyridoxalphosphat als ein Coenzym zu einer Enzymlösung hinzugegeben, und die Mischung wird bei 25°C 30 Minuten lang umgesetzt. Nach der Umsetzung wird das Reaktionsprodukt durch die Hinzufügung von NaBH₃ reduziert, und deoxymugineische Säure wird durch HPLC bestimmt.
Um das Protein der vorliegenden Erfindung aus einer Gramineae-Pflanze, so wie Gerste (Hordeum vulgare) oder ähnlichem, herzustellen, wird beispielsweise die gesamte Wurzel einer Gramineae-Pflanze, so wie Gerste oder ähnliches, die wegen Eisenmangel behandelt wurde, zerrieben, und das Protein der vorliegenden Erfindung wird teilweise aufgereinigt durch Aussetzen des erhaltenen Extrakts gegenüber einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographie, Adsorptionschromatographie, Anionaustauschchromatographie, Gelfiltration und einer zweiten Adsorptionschromatographie in dieser Reihenfolge unter Verwendung der Aktivität als Indikator. Die individuelle Proteinfraktion, die aus der zweiten Adsorptionschraomatographie erhalten wird, wird einer zweidimensionalen Elektrophorese ausgesetzt, und Proteinspots werden detektiert, welche proportional zur Intensität der Nicotianaminaminotransferase-Aktivität jeder Fraktion ansteigen oder abfallen. Die detektierten Spots zeigen das Protein der vorliegenden Erfindung an. Das Protein der vorliegenden Erfindung kann durch Isolieren aus dem zweidimensionalen Elektrophoresegel aufgereinigt werden.
Analoga der mugineischen Säure, so wie deoxymugineische Säure, welche durch eine Umsetzung hergestellt wird, die durch das Protein der vorliegenden Erfindung katalysiert wird mit einer anschließenden Reduktionsreaktion, mugineische Säure und 3'-hydroxymugineische Säure, die durch eine weitere anschließende Hydroxylierungsreaktion hergestellt werden, oder ähnliche, lösen Eisen durch das Bilden eines Chelatkomplexes mit unlöslichem Eisen im Boden. Einige Arten von Pflanzen können diese Analoga der mugineischen Säure biosynthetisieren, welche aus deren Wurzel in den Boden in der Wurzelzone ausgeschieden werden, wodurch unlösliches Eisen in Form eines Komplexes der mugineischen Säure gelöst und der Eisenkomplex direkt durch die Wurzel absorbiert wird. Daher ist es möglich, die Produktion der Analoga der mugineischen Säure zu verstärken und die Absorptionsfähigkeit von unlöslichem Eisen durch entsprechendes Exprimieren einer großen Menge des Proteins der vorliegenden Erfindung in diesen Pflanzen zu erhöhen.
Das Gen der vorliegenden Erfindung codiert für ein Protein, welches die Aminosäuresequenz umfaßt, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
Solch ein Gen kann aus Gramineae-Pflanzen hergestellt werden, zum Beispiel Gerste (Hordeum vulgare) oder ähnlichem, durch ein Verfahren, beispielsweise ein Verfahren, wie hierunter beschrieben.
Weiterhin beinhaltet das Gen der vorliegenden Erfindung ein Gen, welches für ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, umfaßt, und schließt beispielsweise ein Gen ein, welches mit dieser Gensequenz unter strengen Bedingungen hybridisiert. Die strengen Bedingungen hierin beziehen sich auf Bedingungen, die beispielsweise beim Screenen der cDNA-Bibliothek verwendet werden, die in Beispiel 4 beschrieben ist.
Spezifische Beispiele der Nukleotidsequenz des Gens beinhalten die Nukleotidsequenz, die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt ist (wobei die Loci der CDS 62-1444 sind).
Es ist möglich, die Absorptionsfähigkeit von unlöslichem Eisen im Boden in der Wurzelzone zu erhöhen und die Resistenz gegenüber Eisenmangel durch Einführen des Gens der vorliegenden Erfindung in eine Pflanze, welche Eisen unter Verwendung von Verbindungen der mugineischen Säure absorbiert, wodurch die Fähigkeit zur Biosynthese von Verbindungen der mugineischen Säure in der erhaltenen transformierten Pflanze verstärkt wird, zu verbessern.
Um das Gen der vorliegenden Erfindung zu präparieren, werden beispielsweise die Aminosäuresequenz von Peptidfragmenten, die durch partielles Hydrolysieren des Proteins der vorliegenden Erfindung erhalten werden, und die N-terminale Aminosäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung durch einen Proteinsequenzierer bestimmt. Zwei oder mehrere Primer, welche die DNA-Sequenzen umfassen, die von diesen Aminosäuresequenzen erwartet werden, werden synthetisiert. Durch das Ausführen einer PCR unter Verwendung einer cDNA, die aus mRNA synthetisiert ist, welche aus der Wurzel einer Gramineae-Pflanze, so wie Gerste, die wegen Eisenmangel behandelt wurde, präpariert worden ist, als Template mittels einer reversen Transkriptase wird ein cDNA-Fragment des Gens der vorliegenden Erfindung amplifiziert. Unter Verwendung des amplifizierten cDNA-Fragments als Sonde wird das Screenen der cDNA-Bibliothek, die hierunter beschrieben ist, ausgeführt. Eine cDNA wird aus mRNA, die aus der Wurzel einer Gramineae-Pflanze, so wie Gerste, welche wegen Eisenmangel behandelt worden ist, präpariert wurde, mittels einer reversen Transkriptase synthetisiert, und diese wird in einen Phagenvektor, so wie lambda-ZAPII oder ähnliches, oder einen Plasmidvektor, so wie pUC oder ähnliches, integriert, um eine cDNA-Bibliothek zu präparieren. Diese Bibliothek wird unter Verwendung der oben erwähnten Sonde gescreent, und eine cDNA für das Nicotianaminaminotransferase-Gen wird ausgewählt. Durch Bestimmen der Sequenz der ausgewählten cDNA kann bestätigt werden, daß die ausgewählte cDNA die des Nicotianaminaminotransferase-Gens (cDNA des Gens der vorliegenden Erfindung) ist.
Um genomische DNA unter Verwendung der cDNA, die auf diese Art und Weise ausgewählt wurde, zu erhalten und um deren Sequenz zu bestimmen, wird beispielsweise Pflanzengewebe, so wie ein Blatt, ein Stamm, eine Wurzel oder ähnliches, schockgefroren und ausreichend mit einem Mörser und einem Stößel oder einem Waring-Mixer zermahlen. Die genomische DNA wird aus dem erhaltenen zermahlenen Produkt extrahiert entsprechend dem gewöhnlichen Verfahren, wie beschrieben in Itaru Watanabe (Aufsichtsführender), Masahiro Sugiura (Herausgeber), "Cloning and Sequencing (a manual for experiment of plant biotechnology)", Nosonbunka-sha, Tokyo (1989) oder ähnlichem. Die erhaltene genomische DNA wird mit einem entsprechenden Restriktionsenzym verdaut, und die erhaltenen genomischen DNA-Fragmente werden durch ein bekanntes Verfahren, so wie Sucrosedichtegradientzentrifugation oder Cäsiumchloridgleichgewichtszentrifugation oder ähnliches, fraktioniert. Jede der genomischen DNA-Fragmentfraktionen wird einer normalen Southern-Hybridisierung unter Verwendung der ausgewählten cDNA (cDNA des Gens der vorliegenden Erfindung) als eine Sonde ausgesetzt, um zu entscheiden, ob eine genomische DNA-Fragmentfraktion das gewünschte Gen enthält.
Eine genomische DNA-Bibliothek wird hergestellt durch Ligieren der genomischen DNA-Fragmentfraktion in einen kommerziell erhältlichen Vektor, so wie ein Plasmid, einen Phagen, ein Cosmid oder ähnliches. Die Bibliothek wird einem normalen Screenen durch Hybridisierung unter Verwendung der cDNA des Gens der vorliegenden Erfindung als eine Sonde ausgesetzt, um einen Klon aus genomischer DNA zu erhalten, der eine Nukleotidsequenz enthält, die für die Aminosäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung codiert. Die erhaltene DNA allein kann in einen Vektor subkloniert werden, beispielsweise ein Plasmid oder ähnliches, der zur Gensequenzanalyse geeignet ist, und die Sequenz wird gemäß einem Routineverfahren analysiert, um die Sequenz der genomischen DNA zu bestimmen, welche eine Sequenz enthält, die für die Aminosäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung codiert.
Der Transkriptionsinitiierungsort der genomischen DNA des Gens der vorliegenden Erfindung kann bestimmt werden durch das Primerextensionsverfahren, welches in Bina-Stem, Met et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 731 (1979), Sollner-Webb und Reeder, R. H., Cell, 18, 485 (1979) oder ähnlichen beschrieben ist, oder durch das S1-Mappingverfahren, welches in Berk, A. J. und Sharp, P. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1274 (1978) beschrieben ist. Eine TATA-Sequenz, die für die Transkriptionsinitiierung erforderlich ist, ist stromaufwärts des Transkriptionsinitiierungsorts angeordnet, der auf diese Art und Weise bestimmt wurde.
Eine Promotorsequenz, die die Genexpression kontrolliert, ist normalerweise ungefähr 1 kb bis etwa 10 kb stromaufwärts dieses Transkriptionsinitiierungsortes angeordnet. Die Promotorregion des Gens der vorliegenden Erfindung kann abschließend bestimmt werden, beispielsweise durch Verbinden von Genfragmenten mit Promotorregionen verschiedener Länge mit einem Reportergen, so wie GUS oder ähnlichen, Herstellen von transgenen Pflanzen, in welche die verbundenen Produkte eingeführt werden, und Studieren der Expressionsgegenwart oder -abwesenheit des Reportergens in verschiedenen Geweben der hergestellten Pflanzen.
Andererseits ist eine Terminatorsequenz in der genomischen DNA-Region vorhanden, die einer Poly-A-Sequenz entspricht, welche normalerweise stromabwärts eines poly(A)-Additionssignals (von dem die Konsenssequenz AATAAA ist) angeordnet ist, welches in einer terminalen 3'-nichttranslatierten Region stromabwärts des Terminierungscodons vorhanden ist, und hat eine wirksame translationsterminierende Funktion.
Das Plasmid der vorliegenden Erfindung enthält ein Gen, das für ein Protein codiert, welches die Aminosäuresequenz umfaßt, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
Bevorzugte spezifische Beispiele des Plasmids beinhalten ein Plasmid, das hergestellt wird durch Klonieren eines Nicotianaminaminotransferase-Gens mit einer Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz codiert, welche durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, in pSK- (Stratagene). Dies hat eine Eigenschaft, daß dessen Vektorteil klein ist, es hat eine große Anzahl an Kopien in Escherichia coli und ist daher geeignet für die Präparation von DNA oder für die Analyse der DNA-Struktur.
Das Expressionsplasmid der vorliegenden Erfindung kann konstruiert werden durch Kombinieren (1) eines Promotors, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, (2) des Gens, das für ein Protein codiert, welches die Aminosäuresequenz umfaßt, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist und (3) eines Terminators, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, operabel verbunden in der oben angegebenen Reihenfolge.
Der Ausdruck "operabel verbunden", der hiernach verwendet wird, bedeutet, daß, wenn das konstruierte Plasmid in eine Wirtszelle eingeführt wird, um sie zu transformieren, das Gen der vorliegenden Erfindung unter der Kontrolle eines Promotors integriert wird, so daß das Gen die Funktion des Exprimierens des Proteins der vorliegenden Erfindung in der Wirtszelle hat.
Der Promotor, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, beinhaltet beispielsweise den Escherichia coli Lactose-Operonpromotor, den Hefealkoholdehydrogenase (ADH)-Promotor, den Adenovirus-Major-Late (Ad. ML)-Promotor, den SV40-Frühpromotor, den Baculovirus-Promotor und ähnliche. Wenn die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist, beinhaltet der Promotor beispielsweise T-DNA-abgeleitete konstitutive Promotoren, so wie den Nopalinsynthasegen (NOS)-Promotor, den Octopinsynthasegen (OCS)-Promotor und ähnliche, Pflanzenvirus-abgeleitete Promotoren, so wie Blumenkohlmosaikvirus (CaMV)-abgeleitete 19S- und 35S-Promotoren und ähnliche, und induzierbare Promotoren, so wie den Phenylalaninammonialyase (PAL)-Genpromotor, den Chalconsynthase (CHS)-Genpromotor, den pathogenverwandten (PR) Genpromotor und ähnliche. Weiterhin sind bekannte Pflanzenpromotoren beinhaltet, aber die Erfindung ist nicht auf diese limitiert.
Der Terminator, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, beinhaltet beispielsweise eine Hefe-HIS-Terminatorsequenz, einen ADH1-Terminator, eine SV40-Frühspliceregion und ähnliches. Wenn die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist, beinhaltet der Terminator beispielsweise T-DNA-abgeleitete konstitutive Terminatoren, so wie den Nopalinsynthasegen (NOS)-Terminator und ähnliche, Pflanzenvirus-abgeleitete Terminatoren, so wie Knoblauchvirus GV1-, GV2-Terminatoren und ähnliche. Weiterhin sind bekannte Pflanzenterminatoren beinhaltet, aber die Erfindung ist nicht auf diese limitiert.
Eine Wirtszelle wird transformiert durch Einführen solch eines Plasmids ((Expressions-) Plasmid der vorliegenden Erfindung) in die Wirtszelle. Wenn die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist, wird das (Expressions-) Plasmid der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle eingeführt durch irgendein konventionelles Mittel, so wie das Agrobacterium-Infektionsverfahren (JP-B-2-58917 und JP-A-60-70080), das Elektroporationsverfahren in Protoplasten (JP-A-60-251887 und JP-A-5-68575), das Partikelbeschußverfahren (JP-A-508316 und JP-A-63-258525) und ähnliche, und eine transformierte Pflanzenzelle kann erhalten werden durch Auswählen einer Pflanzenzelle, in die das Gen der vorliegenden Erfindung eingeführt wird. Der transformierte Pflanzenkörper wird erhalten durch Regenerieren eines Pflanzenkörpers gemäß einem konventionellen Pflanzenzellkulturverfahren, beispielsweise beschrieben in Hirohumi Utimiya, Manual for Plant Gene Manipulation (Method for Producing Transgenic Plants), publiziert durch Kodansha Scientific (ISBN 4-06-153515-7 C3045), 1990, Seiten 27–55.
Durch Einführen des Plasmids der vorliegenden Erfindung in Wirtszellen, welche jede Art von Mikroorganismen sind, so wie Escherichia coli oder ähnliche, und durch Erlauben einer starken Expression in den Wirtszellen kann eine große Menge des Proteins der vorliegenden Erfindung leicht aus den Wirtszellen isoliert werden. Ein Screeningsystem für Inhibitoren für Nicotianaminaminotransferase-Aktivität, konstruiert durch Verwenden der Mengen des produzierten Proteins der vorliegenden Erfindung, gehört ebenso zum Umfang der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise werden gemäß dem oben beschriebenen Verfahren zum Messen der Nicotianaminaminotransferase-Aktivität die Substrate Nicotianamin, 2-Oxoglutarsäure und Pyridoxalphosphat als Coenzym ebenso wie ein Kandidat für eine Inhibitorverbindung zu der hergestellten Enzymlösung hinzugegeben, und die Mischung wird bei 25°C 30 Minuten lang umgesetzt. Nach der Umsetzung werden Verbindungen, die keine Nicotianaminaminotransferase-Aktivität zeigen, ausgewählt durch Reduzieren des Reaktionsprodukts unter Hinzufügung von NaBH₃ und deoxymugineischer Säure durch HPLC.
In Pflanzen, die Eisen unter Verwendung von Verbindungen der mugineischen Säure absorbieren, wird die Expression des Nicotianaminaminotransferase-Gens stark induziert unter Bedingungen des Eisenmangels. Da der gewöhnliche Boden (Hochlandboden) sich unter oxidativen Bedingungen befindet und die Eisen(III)-Konzentration in einer Bodenlösung sich nur auf einem Niveau befindet, das extrem geringer ist als 10^–4 bis 10^–8 M, welches für Pflanzen erforderlich ist, sind das Nicotianaminaminotransferase-Gen und das Gen für die Biosynthese der mugineischen Säure immer stark induziert. In anderen Worten absorbieren die Pflanzen positiv unlösliches Eisen durch routinemäßiges Biosynthetisieren von Verbindungen der mugineischen Säure und durch deren Ausscheidung aus der Wurzel in den Boden im Wurzelbereich.
Die Inhibitoren für Nicotianaminaminotransferase-Aktivität, die durch das Screeningsystem ausgewählt wurden, können Verbindungen sein, die als selektive Herbizide gegen Pflanzen nützlich sind, welche Eisen unter Verwendung von Verbindungen, die zur mugineischen Säure analog sind, absorbieren.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verstärken der Eisenabsorptionsfähigkeit zur Verfügung, welches das Einführen eines Expressionsplasmids, das gebildet wird durch Kombinieren (1) eines Promotors, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, (2) eines Nicotianaminaminotransferase-Gens und (3) eines Terminators, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, operabel verbunden in der oben angegebenen Reihenfolge, in eine Wirtszelle und Transformieren der Wirtszelle umfaßt. Der Promotor, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, beinhaltet die Promotoren, die oben beschrieben sind.
Das Nicotianaminaminotransferase-Gen beinhaltet beispielsweise ein von Pflanzen abgeleitetes Nicotianaminaminotransferase-Gen und vorzugsweise das Gen der vorliegenden Erfindung.
Der Terminator, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, beinhaltet die Terminatoren, die oben beschrieben sind.
Das Genfragment der vorliegenden Erfindung betrifft ein Genfragment mit einer Partialsequenz des Gens der vorliegenden Erfindung, dargestellt durch SEQ ID NO: 3, und beinhaltet ein Genfragment mit einer Partialsequenz des Gens, das für ein Protein codiert, welches die Aminosäuresequenz umfaßt, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, insbesondere beispielsweise ein Genfragment, dargestellt durch SEQ ID NO: 5.
Diese Genfragmente sind nützlich als Sonden bei der Hybridisierung oder als Primer bei der PCR. Insbesondere sind als Primer, die bei der PCR verwendet werden, ein Genfragment mit 15 oder mehr und 50 oder weniger Nukleotiden bevorzugt.
Das Verfahren für die Detektion der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, in welchem ein Nicotianaminaminotransferase-Gen mit einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz eines Enzyms mit der Nicotianaminaminotransferase-Aktivität codiert, oder ein Genfragment davon aus Pflanzengenfragmenten detektiert wird durch Anwenden des Hybridisierungsverfahrens unter Verwendung des Genfragments der vorliegenden Erfindung als eine Sonde.
Insbesondere kann das Verfahren beispielsweise gemäß dem Verfahren ausgeführt werden, das in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press oder in "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc., ISBNO-471-50338-X beschrieben wird. Die Genfragmente, die hier verwendet werden, können beispielsweise eine cDNA-Bibliothek, eine genomische DNA-Bibliothek oder ähnliches der Zielpflanze beinhalten. Diese Pflanzengenfragmente können eine kommerziell erhältliche Bibliothek sein, die als solche von einer Pflanze abgeleitet ist, oder können ebenso eine Bibliothek sein, die gemäß dem konventionellen Verfahren zum Herstellen einer Bibliothek hergestellt wurde, das in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press oder in "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc., ISBNO-471-50338-X beschrieben ist.
Es kann ebenso möglich sein, das Nicotianaminaminotransferase-Gen zu erhalten durch Identifizieren des Nicotianaminaminotransferase-Gens oder eines Fragments davon gemäß dem Verfahren für die Detektion der vorliegenden Erfindung und durch Isolieren/Aufreinigen des identifizierten Gens oder Genfragments.
Das Verfahren für die Detektion der vorliegenden Erfindung kann bei der Analyse von Pflanzen verwendet werden. Insbesondere wird eine genomische Pflanzen-DNA hergestellt aus unterschiedlichen Sorten einer spezifischen Pflanzenspezies gemäß dem Verfahren zur Detektion der vorliegenden Erfindung, dem gewöhnlichen Verfahren, das in Itaru Watanabe (Aufsichtsführender), Masahiro Sugiura (Herausgeber), "Cloning and Sequencing (a manual for experiment of plant biotechnology)", Nosonbunka-sha, Tokyo (1989) oder ähnlichem beschrieben ist. Sie wird dann mit wenigstens verschiedenen Sorten von geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten, elektrophoretisch behandelt und für die Herstellung eines Filters durch Blotten gemäß dem gewöhnlichen Verfahren verwendet.
Die Hybridisierung wird auf dem Filter unter Verwendung einer Sonde ausgeführt, die durch das gewöhnliche Verfahren hergestellt wurde, und von Unterschieden im phänotypischen Charakter zwischen den Sorten, basierend auf einer unterschiedlichen Länge der DNA-Fragmente, die durch die Biosynthese der mugineischen Säure begleitet sind. Weiterhin wird entschieden, daß eine Pflanze eine rekombinante Genpflanze ist, wenn die Pflanze eine größere Anzahl von detektierten Hybridisierungsbanden aufweist als eine nichtrekombinante Genpflanze, wenn die spezifische Pflanze mit der nichtrekombinanten Pflanze verglichen wird. Dieses Verfahren wird vorzugsweise gemäß dem RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)-Verfahren ausgeführt, das in Ko Shimamoto und Takuji Sasaki (Aufsichtsführende), "Protocols for PCR Experiment on Plants", Shujunsha, Tokyo (1995), ISBN4-87962-144-7, S. 90–94 beschrieben ist.
Das Verfahren zur Amplifizierung der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, in welchem ein Nicotianaminaminotransferase-Gen mit einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz eines Enzyms mit der Nicotianaminaminotransferase-Aktivität codiert, oder ein Genfragment davon durch Anwenden von PCR (Polymerase-Kettenreaktion) auf einem Pflanzengenfragment unter Verwendung des Genfragments der vorliegenden Erfindung als Primer amplifiziert wird. Insbesondere kann das Verfahren beispielsweise gemäß dem Verfahren ausgeführt werden, das in Ko Shimamoto und Takuji Sasaki (Aufsichtsführende), "Protocols for PCR Experiment on Plants", Shujunsha, Tokyo (1995), ISBN4-87962-144-7 oder ähnlichen beschrieben ist.
Es kann ebenso möglich sein, das Nicotianaminaminotransferase-Gen durch Identifizieren des Nicotianaminaminotransferase-Gens oder eines Fragments davon gemäß dem Verfahren zur Amplifizierung der vorliegenden Erfindung und durch Isolieren/Aufreinigen des identifizierten Gens oder Genfragments zu erhalten.
Weiterhin kann das Verfahren zur Amplifizierung der vorliegenden Erfindung bei der Analyse von Pflanzen verwendet werden.
Insbesondere wird beispielsweise ein Teil oder die Gesamtheit des Gens der vorliegenden Erfindung durch Ausführen einer PCR unter Verwendung einer genomischen Pflanzen-DNA amplifiziert, die aus einer spezifischen Pflanzenart als ein Template und dem Genfragment der vorliegenden Erfindung als ein Primer hergestellt wird. Das erhaltene PCR-Produkt wird mit einer Formaldehydlösung vermischt, und die Mischung wird durch Erhitzen auf 85°C für 5 Minuten denaturiert, gefolgt durch schnelles Abkühlen auf Eis. Die Probe wird beispielsweise auf einem 6%igen Acrylamidgel elektrophoretisch behandelt, welches Glycerin in einer Konzentration von 0% oder 10% enthält. Die Elektrophorese wird mit einem kommerziell erhältlichen Elektrophoresegerät für SSCP (einzelsträngiger Konformationspolymorphismus) ausgeführt, wobei die Geltemperatur bei beispielsweise 5°C, 25°C, 37°C usw. gehalten wird. Das Gel, das fertig laufen gelassen wurde, wird mit Ethidiumbromid oder ähnlichem unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Reagens gefärbt, um DNA zu detektieren.
Unterschiede im phänotypischen Charakter, begleitet durch die Biosynthese der mugineischen Säure, zwischen den Sorten, basierend auf einer Mutation in dem Gen der vorliegenden Erfindung, wird aus den Unterschieden der Migration der DNA-Fragmente, die detektiert wurden, analysiert. Dieses Verfahren wird vorzugsweise gemäß dem Verfahren ausgeführt, das in Ko Shimamoto und Takuji Sasaki (Aufsichtsführende), "Protocols for PCR Experiment on Plants", Shujunsha, Tokyo (1995), ISBN4-87962-144-7, S. 141–146 beschrieben wurde.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun detaillierter auf der Basis von Beispielen beschrieben werden, welche für den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht limitierend ausgelegt werden sollen.
Beispiel 1 (Verfahren zum Isolieren des Proteins der vorliegenden Erfindung)
In einer Extraktionspufferlösung (0,2 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0,1 mM p-APMSF, 10 mM DTT, 5% Glycerin, 5% Polyvinylpyrrolidon, pH 8) wurden 150 g Gerstenwurzel, die wegen Eisenmangel behandelt wurde, zerrieben. Das Zerreibungsprodukt wurde bei 8000 × g für 30 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde abgetrennt. Ammoniumsulfat wurde zu dem erhaltenen Überstand hinzugefügt, bis eine 30%ige Sättigung erreicht wurde. Die hergestellte Probe wurde auf Butyl Toyopearl (hergestellt durch Toso) angewendet, mit 30% gesättigtem Ammoniumsulfatpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA, 10 mM DTT) äquilibriert und mit 15% gesättigtem Ammoniumsulfatpuffer nach dem Waschen mit dem ersteren Puffer eluiert. Zu den eluierten Fraktionen wurde p-APMSF in einer Endkonzentration von 0,1 mM hinzugefügt, und die Mischung wurde über Nacht gegen 0,1 mM KCl, 50 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄ (pH 6,8), 10 mM DTT dialysiert, gefolgt durch eine Anwendung auf Hydroxylapatit (100–350 mesh), hergestellt durch Nakarai), äquilibriert mit diesem Puffer. Dann wurde sie mit demselben Puffer gewaschen und mit 0,5 M KH₂PO₄/K₂HPO₄ (pH 6,8), 10 mM DTT eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden mit Molecut (Millipore, Differentialmolekulargewicht 10.000) behandelt, um den Puffer mit 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM KCl, 10 mM DTT auszutauschen, und auf DEAE-Sephasel (hergestellt durch Pharmacia), äquilibriert mit demselben Puffer, angewendet. Nach dem Waschen mit demselben Puffer wurde sie mit einem 10–500 mM KCl Konzentrationsgradienten eluiert. Nichtabsorbierte Fraktionen aus DEAE Sephasel wurden mit Molecut behandelt, um den Puffer durch 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM KCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT auszutauschen, und auf NA-Sepharose 4B, welche EAH-Sepharose 4B war (hergestellt durch Pharmacia), an die Nicotianamin (NA) gebunden war, angewendet. Nach dem Waschen mit demselben Puffer wurde sie mit 1 mM NA, 10 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH 6,0) eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden einer zweidimensionalen Elektrophorese ausgesetzt, welche einen sehr konzentrierten Spot ergab, verglichen mit der Probe vor dem Anwenden auf die NA-Sepharose 4B-Säule. Der Spot zeigte das Protein der vorliegenden Erfindung an, welches durch Abtrennen dieses Spots isoliert wurde.
Die N-terminale Aminosäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung, wie abgetrennt, wurde durch einen Proteinsequenzierer analysiert (hergestellt durch Applied Biosystems). Das gezeigte Resultat ergab eine Aminosäuresequenz, die durch die Aminosäuren der Nrn. 33 bis 47 in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist. Weiterhin wurden N-terminale Aminosäuresequenzen für 3 Peptidfragmente, die durch deren Behandlung mit 70% Ameisensäurelösung, welche 1% Bromcyan enthielt, gebildet wurden, auf dieselbe Art und Weise analysiert.
Beispiel 2 (Herstellung einer Sonde zum Klonieren der cDNA des Proteins der vorliegenden Erfindung)
Aus 6 g Gerstenwurzel, die wegen Eisenmangel behandelt wurde, wurden 255 μg Gesamt-RNA gemäß dem SDS- Phenolverfahren, das in Itaru Watanabe (Aufsichtsführender), Masahiro Sugiura (Herausgeber), "Cloning and Sequencing (a manual for experiment of plant biotechnology)", Nosonbunka-sha, Tokyo (1989), S. 34–40, beschrieben ist, zurückgewonnen. Aus der zurückgewonnenen Gesamt-RNA wurde ein 75 μg-Anteil entnommen und verwendet, um poly(A)+RNA unter Verwendung des Dynabeads mRNA-Aufreinigungskits (hergestellt durch Dynal) zu präparieren. Die präparierte poly(A)+RNA wurde mit einem dT17-Adapterprimer (5'-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3') revers transkribiert, um cDNA herzustellen. Ein Teil der hergestellten cDNA wurde für die Amplifizierung eines cDNA-Fragments des Gens der vorliegenden Erfindung durch eine Zweistufen-PCR verwendet. Bei der ersten Reaktion wurde die PCR mit einem Primer 1 (5'-GCIGTIGARTGGAAYTTYGCIMG-3') ausgeführt, synthetisiert auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung und des oben beschriebenen dT17-Adapterprimers, und unter Verwendung der erhaltenen cDNA als ein Template bei 94°C (40 Sekunden), 40°C (1 Minute) und 72°C (2 Minuten), wiederholt durch 25 Zyklen, und bei 94°C (40 Sekunden), 45°C (1 Minute) und 72°C (2 Minuten), wiederholt durch 25 Zyklen. Unter Verwendung dieser PCR-Umsetzungslösung als ein Template wurde die zweite PCR ausgeführt mit einem Primer 2 (5'-GCDATRTGICCRAAIACICC-3'), synthetisiert auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz des Peptidfragments, gebildet durch Behandeln mit 70%iger Ameisensäurelösung, die 1% Bromcyan enthielt, wie oben beschrieben, und dem Primer 1 bei 94°C (40 Sekunden), 45°C (1 Minute) und 72°C (2 Minuten), wiederholt durch 40 Zyklen. Das DNA-Fragment von ungefähr 600 bp, amplifiziert durch die zweite PCR, wurde aufgereinigt durch Ausschneiden aus einem 0,8%igen Agaroseelektrophoresegel und als eine Sonde verwendet, um die cDNA-Bibliothek zu screenen.
Beispiel 3 (Herstellung einer cDNA-Bibliothek aus der Gerstenwurzel, behandelt wegen Eisenmangels)
Unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen cDNA-Synthesekits (Super Script (Handelsname) Plasmid System für die cDNA-Synthese und Plasmid Cloning, hergestellt durch Gibco BRL), wurde cDNA aus 5 μg poly(A)+RNA, die aus der wegen Eisenmangel behandelten Gerstenwurzel hergestellt wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, synthetisiert. Das Produkt wurde mit einem SalI-Adapter ligiert und mit NotI geschnitten, um die cDNA zurückzugewinnen.
Ein Vektor für die cDNA-Bibliothek (hiernach pYH23 genannt) wurde hergestellt durch Hinzufügen einiger Modifikationen zu dem Hefe-Multi-Copy-Plasmid YEplac181, das in R. Daniel Gietz und Akio Sugino, Gene, 74 (1988), S. 527–534 beschrieben ist. Insbesondere wurden die HindIII- und BamHI- bis EcoRI-Orte in dem Multi-Cloning-Ort von YEplac181 eliminiert. Weiterhin wurden Promotor- und Terminatorsequenzen der Alkoholdehydrogenase, abgeleitet von pTV-100, in dem SphI-Ort subkloniert, und ein NotI-Linker wurde an dem BamHI-Ort dieses Fragments inseriert.
pYH23, hergestellt auf diese Art und Weise, wurde mit NotI und XhoI verdaut; nach dem Einfügen der wie oben präparierten cDNA wurde ein Escherichia coli XL1-Blue-Stamm transformiert, um eine cDNA-Bibliothek, abgeleitet von 300.000 unabhängigen Kolonien, zur Verfügung zu stellen.
Beispiel 4 (Screenen der cDNA-Klone der vorliegenden Erfindung)
Eine DNA-Sonde für das cDNA-Klonieren des Proteins der vorliegenden Erfindung wurde hergestellt durch radioaktives Markieren der in Beispiel 3 hergestellten Sonde mit einem kommerziell erhältlichen Radioaktivitätsmarkierungskit (Random Primer DNA Markierungskit Ver. 2, TaKaRa). Escherichia coli mit einer Plasmid-DNA aus einer cDNA-Bibliothek, abgeleitet von der wegen Eisenmangel behandelten Gerstenwurzel, wie hergestellt in Beispiel 3, wurde in LB-Medium inokuliert, bei 37°C für 10 Stunden inkubiert und dann auf eine kommerziell erhältliche Nylon-Membran transferiert (Hybond (Handelsname)-N+, Amersham Life Science). Die Membran wurde mit 10% SDS für 3 Minuten, mit einer alkalischen Denaturierungslösung (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) für 5 Minuten, mit einer Neutralisierungslösung (0,5 M Tris-HCl (pH 7,0), 1,5 M NaCl) für 3 Minuten, mit 2 × SSPE (20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), 0,3 M NaCl, 5 mM EDTA) zweimal 3 Minuten lang behandelt, getrocknet und mit Ultraviolettstrahlen 3 Minuten lang bestrahlt, um die DNA irreversibel auf der Membran zu fixieren. Die Prähybridisierung wurde bei 65°C für 1 Stunde ausgeführt unter Verwendung einer Prähybridisierungslösung (5 × Denhart's Lösung, 5 × SSPe, 0,1% SDS, 100 μg/ml denaturierte Lachshoden-DNA). Dann wurde die Hybridisierung in einer Lösung mit der radioaktiv markierten Sonde ausgeführt, die zu einer Hybridisierungslösung (5 × Denhart's Lösung, 5 × SSPE, 0,1% SDS) bei 65°C für 12 Stunden hinzugefügt wurde. Danach wurde die Membran einmal mit 6 × SSP bei 65°C für 10 Minuten, zweimal mit 2 × SSP, 0,1% SDS bei 42°C für 10 Minuten gewaschen und einem Fuji Medical-Röntgenfilm ausgesetzt, um positive Kolonien zu detektieren. Zweite und dritte Screenings wurden auf dieselbe Art und Weise ausgeführt, und der cDNA-Klon des Proteins der vorliegenden Erfindung wurde isoliert.
Beispiel 5 (Bestimmung der Nukleotidsequenz von cDNA, die für das Protein der vorliegenden Erfindung codiert)
Der cDNA-Klon des Proteins der vorliegenden Erfindung, der in Beispiel 4 isoliert wurde, wurde in einen Plasmidvektor pBluescript SK(–) gemäß dem konventionellen Verfahren, das in J. Sambrook, E. F. Fritsh, T. Maniatis, "Melocular Cloning, Second Edition", Cold Spring Harbor Press (1989) beschrieben wurde, subkloniert, um einen Plasmid-cDNA-Klon zu ergeben. Die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 3) des Inserts in dem cDNA-Klon wurde (1) durch einen 373A DNA-Sequenzierer, hergestellt durch Applied Biosystems, unter Verwendung des Tag Dye Primer Cycle Sequenzierkits (hergestellt durch Applied Biosystems), (2) durch einen DSQ-1000L DNA-Sequenzierer (hergestellt durch Shimadzu) unter Verwendung des Thermo Sequence Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequenzierkits (hergestellt durch Amersham Life Science) oder (3) durch BAS-2000 (hergestellt durch Fuji Film) unter Verwendung des BcaBEST (Handelsname) Dideoxy Sequenzierkits (hergestellt durch TaKaRa) bestimmt. Die gesamten Aminosäuresequenzen des Proteins (siehe SEQ ID NO: 1) wurden aus der Sequenz (siehe SEQ ID NO: 3) bestimmt. Das Protein von SEQ ID NO: 1 hatte 461 Aminosäuren und dessen Molekulargewicht wurde auf 49564.15 berechnet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung könnte es möglich sein, eine neue Nicotianaminaminotransferase, ein Gen dafür usw. zur Verfügung zu stellen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein isoliertes Protein, das eine Aminosäuresequenz, umfaßt, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
Ein isoliertes Gen, das für ein Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, oder ein isoliertes Gen, das für ein Protein mit Nicotianaminaminotransferase-Aktivität codiert und mit einem isolierten Gen unter strengen Bedingungen hybridisiert, welches für ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, wobei eine Membran mit 10% SDS für 3 Minuten, einer alkalischen Denaturierungslösung, 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl für 5 Minuten, einer Neutralisierungslösung, 0,5 M Tris-HCl, pH, 7,0, 1,5 M NaCl für 3 Minuten, 2 × SSPE, 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, 0,3 M NaCl, 5 mM EDTA, zweimal 3 Minuten lang behandelt, getrocknet und mit Ultraviolettstrahlung 3 Minuten lang bestrahlt wird, um die DNA auf der Membran irreversibel zu fixieren, und die Prähybridisierung wird bei 65°C für 1 Stunde unter Verwendung einer Prähybridisierungslösung, 5 × Denhart's Lösung, 5 × SSPe, 0,1% SDS, 100 μg/ml denaturierter Lachshoden-DNA ausgeführt, und dann wird die Hybridisierung in einer Lösung, wobei die radioaktiv markierte Probe zu einer Hybridisierungslösung hinzugefügt wurde, 5 × Denhart's Lösung, 5 × SSPE, 0,1% SDS bei 65°C für 12 Stunden ausgeführt, und danach wird die Membran einmal mit 6 × SSP bei 65°C für 10 Minuten, zweimal mit 2 × SSP, 0,1% SDS bei 42°C für 10 Minuten gewaschen.
Das Gen gemäß Anspruch 2, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die für die Aminosäuresequenz codiert, welche durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
Das Gen gemäß Anspruch 3, welches eine Nukleotidsequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt ist.
Ein Plasmid, welches das Gen, wie definiert in Anspruch 2, umfaßt.
Ein Expressionsplasmid, umfassend: (1) einen Promotor, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, (2) das Gen, wie definiert in Anspruch 2, und (3) einen Terminator, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, operabel verbunden in der oben beschriebenen Reihenfolge.
Ein Verfahren zum Konstruieren eines Expressionsplasmids, umfassend das Kombinieren: (1) eines Promotors, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, (2) des Gens, wie definiert in Anspruch 2, und (3) eines Terminators, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, operabel verbunden in der oben beschriebenen Reihenfolge.
Ein Transformant, der eine Wirtszelle umfaßt, die das Plasmid, wie definiert in Anspruch 5 oder 6, enthält.
Der Transformant gemäß Anspruch 8, wobei der Wirt ein Mikroorganismus ist.
Der Transformant gemäß Anspruch 8, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
Ein Verfahren zum Verstärken der Eisenabsorptionsfähigkeit einer Wirtszelle, welches das Einführen eines Expressionsplasmids, das gebildet wird durch Kombinieren (1) eines Promotors, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, (2) eines Nicotianaminaminotransferase-Gens, wie definiert in Anspruch 2, und (3) eines Terminators, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu funktionieren, operabel verbunden in der oben beschriebenen Reihenfolge, in eine Wirtszelle und Transformieren der Wirtszelle umfaßt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das Gen der Nicotianaminaminotransferase das Gen ist, wie definiert in Anspruch 3.
Ein isoliertes Genfragment mit einer Partialsequenz des Gens, wie definiert in Anspruch 4, umfassend zwischen 15 und 50 Nukleotiden.
Das Genfragment gemäß Anspruch 14, welches die Nukleotidsequenz hat, die durch SEQ ID NO: 5 angegeben ist.
Ein Verfahren zum Detektieren eines Nicotianaminaminotransferase-Gens mit einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz eines Enzyms mit der Nicotianaminaminotransferase-Aktivität codiert, oder eines Genfragments davon durch Anwenden des Hybridisierungsverfahrens unter Verwendung des Genfragments, wie definiert in Anspruch 14 oder 15.
Ein Verfahren zum Amplifizieren eines Nicotianaminaminotransferase-Gens mit einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz eines Enzyms mit der Nicotianaminaminotransferase-Aktivität codiert, oder eines Genfragments davon durch Anwenden von PCR (Polymerase-Kettenreaktion) auf ein Pflanzengenfragment unter Verwendung des Genfragments, wie definiert in Anspruch 14 oder 15 als ein Primer.
Ein Verfahren zum Erhalten eines Nicotianaminaminotransferase-Gens, welches das Identifizieren eines Nicotianaminaminotransferase-Gens oder eines Genfragments davon umfaßt, durch das Verfahren, wie definiert in Anspruch 16 oder 17, und Isolieren und Aufreinigen des identifizierten Gens oder des Genfragments davon.
Ein isoliertes Nicotianaminaminotransferase-Gen, welches das isolierte Genfragment gemäß Anspruch 14 umfaßt.