KR100440097B1

KR100440097B1 - 나트륨/프로톤 대향수송체, 그 수송체를 코드하는 dna, 그 수송체의 제조방법 및 그 dna를 보유하는 식물체

Info

Publication number: KR100440097B1
Application number: KR10-2001-7007836A
Authority: KR
Inventors: 후쿠다아쯔노리; 다나카요시유키
Original assignee: 독립행정법인농업생물자원연구소
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2004-07-14
Also published as: CN1342203A; AU751977C; CA2369590C; EP1143002A1; JP3955938B2; US6861574B2; EP1143002B1; US20050032112A1; AU751977B2; WO2000037644A1; EP1143002A4; US7326827B2; AU1798500A; CA2369590A1; US20020083487A1; KR20010104316A; CN1309832C

Abstract

벼의 Na⁺/H⁺대향수송체 유전자를 클로닝하는 것에 성공했다. 단리한 유전자나 이것과 기능적으로 동등한 유전자를 이용하여, 내염성 식물의 작출을 행하는 것이 가능하다.

Description

나트륨/프로톤 대향수송체, 그 수송체를 코드하는 DNA, 그 수송체의 제조방법 및 그 DNA를 보유하는 식물체{Sodium/proton countertransporters, DNAs encoding the same, methods for preparing thereof and transformant plants having the DNAs}

식물의 내염성은 농업 및 환경보전상 중요한 문제이다. 현재, 지구상의 약 3분의 1은 건조지에 속해 있다고 말하여지고, 현재도 경지나 녹지의 사막화가 진행되고 있는 것으로부터, 그 비율은 장차 증가될 것으로 예상된다. 2050년에는 세계인구가 현재의 1.5배 이상이 된다고 말하여져, 식량문제는 점점 심각화될 것을 고려하면, 경작 부적지, 특히 건조지에서도 자라는 작물품종이나 재배기술의 개발은 긴급을 요하는 과제이다. 그런데, 건조지의 농업에 있어서 문제가 되고 있는 것은, 토양에 있어서의 염분집적의 문제이다. 건조기후하에서는, 증발산량이 강수량을 상회하기 때문에, 배수가 불완전한 상태에서 관개를 계속한 경우, 염분을 함유한 지하수위의 상승이 촉진되어 염분이 지표로 석출되기 때문에, 토양에 있어서의 다량의 염분집적으로 연결된다. 그 결과 경작이 불가능해지는 예는, 티그리스-유프라테스문명의 멸망을 대표로 아주 오래전부터 알려져 있고, 현재에도 아직 문제가 되는 것이 많다. 이상의 것으로부터, 작물의 내염성을 높이는 것은, 건조지나 염분집적지의 농업을 발전시키는데 중요한 과제로 되어 있다(다다노도시아키(1983) 화학과 생물 21, 439-445 작물의 내염성과 그의 구조; 우치야마히로다카(1988) 화학과 생물 26, 650-659 염성 환경의 농업이용).

식물에 대한 염스트레스를 생각할 경우, 2종류의 스트레스, 즉 침투압 스트레스와 이온 스트레스가 문제가 된다. 침투압 스트레스란, 식물을 둘러싸는 환경이 높은 농도의 염분 때문에 고침투압으로 되어, 식물의 수분흡수의 방해가 됨과 동시에 식물체로부터 물을 빼앗는 결과과 되는 것으로부터, 건조 스트레스와 동일한 작용을 하는 스트레스이다. 식물에는 이 침투압 스트레스를 회피하는 구조가 존재하는 것이 알려져 있고, 그 중심적 작용을 하는 것이 이온(K⁺, Na⁺, Cl^-, 유기산 등)이나 적합용질이라 불리는 물질이다. 적합용질이란, 세포내에 고농도로 축적되어도 여러 대사계를 어지럽히지 않고 효소활성을 저해하지 않는 당, 아미노산의 일종 프롤린, 4급 암모늄화합물의 글리신베타인 등의 것을 가리키고, 식물은 이들을 세포내에 축적하여 외계와의 침투압 균형을 잡고 있다(이시타니마나부, 아라가와케이타, 다카베테츠코(1990) 식물의 화학조절 25, 149-162 식물 내염성의 분자기구).

이온 스트레스에 대해서는, 식물의 회피기구에 대해 전혀 연구가 진행되고 있지 않다. 과잉 Na⁺가 식물의 세포내에 흡수되면, 세포내의 효소반응이 저해되어 대사장애가 일어난다(마토도오루(1997) 식물의 화학조절 32, 198-206 식물의 내염성 메커니즘). 그 때문에, 세포내에 축적된 Na⁺를 세포외에 배출하거나, 액포 등의 세포내 기관에 격리할 필요가 있다. 그 중심적인 작용을 하는 것으로 생각되고 있는 것이 Na⁺/H⁺대향수송체(나트륨/프로톤 대향수송체)이다. 식물의 Na⁺/H⁺대향수송체는, 세포질막이나 액포막에 존재하는 것으로 생각되고, H⁺를 수송하는 H⁺펌프(H⁺-ATPase나 H⁺-PPase)에 의해 형성되는 생체막을 사이에 둔 pH 구배를 에너지원으로서 이용하여, 세포질에 존재하는 Na⁺를 세포외나 액포내에 수송한다. 또한, 고염처리를 받은 식물은, 세포질내의 K⁺/Na⁺비율을 높게 유지해야만 하기 때문에, Na⁺/H⁺대향수송체에 의해 액포에 Na⁺를 축적함으로써, 외계와의 침투압 균형을 잡는다고도 생각되고 있다.

세포질막에 국재하는 Na⁺/H⁺대향수송체에 대해서는, 동물, 효모, 세균 등에서 자주 조사되고 있다. 동물세포의 세포질막에서는, 세포내의 H⁺균형을 잡기 위해, Na⁺/K⁺-ATPase에 의해 형성된 막 내외의 Na⁺농도구배를 이용하여 Na⁺/H⁺대향수송체가 H⁺를 수송한다. 이 때문에, 이 대향수송체는, 세포내의 pH 조정, 세포용량의 컨트롤, 세포질막을 사이에 둔 Na⁺수송 등에 강하게 관여하고 있는 것으로 생각되고 있다(Orlowski, J. and Grinstein, S. (1997) J. Biol. Chem. 272, 22373-22376; Aronson, P. S. (1985) Ann. Rev. Physiol. 47, 545-560). 동물에서는, Na⁺/H⁺대향수송체는 여러 세포에 존재하여, 6종류의 동형(isoforms)(NHE1-6)이 보고되어 있다(Orlowski, J. and Grinstein, S. (1997) J. Biol. Chem. 272, 22373-22376). 효모에서는, 먼저 분열효모(Schizosaccharomyces pombe)에서 Na⁺수송과 내염성에 관련한 유전자로서 클로닝되어(sod2) (Jia, Z.P., McCullough, N., Martel, R., Hemmingsen, S. and Young, P.G. (1992) EMBO J. 11: 1631-1640), 이것과 높은 상동성을 갖는 유전자가 출아효모(Saccharomyces cerevisiae)나Zygosaccharomyces rouxii에서 발견되고 있다(각각 NHA1, ZSOD2라 이름붙여져 있다) (Prior, C. et al.(1996) FEBS Letter 387, 89-93; Watanabe, Y. et al. (1995) Yeast 11, 829-838). 대장균에서는, 다른 2종류의 Na⁺/H⁺대향수송체 유전자(nhaA, nhaB)가 단리되어 있어(Karpel, R. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263, 10408-10410; Pinner, E. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 26274-26279), 각각 Na⁺수송과 내염성에 강하게 관여하고 있다. 식물에서는, 조류(藻類) 등에서 활성이 조사되고 있다(Katz, A. et al. (1989) Biochim. Biophys. Acta 983: 9-14).

한편, 액포막에 국재하고 있는 것에 대해서는 식물에서만 활성에 대한 보고가 있는 것에 지나지 않는다. 액포막의 Na⁺/H⁺대향수송체는, 염농도가 높은 환경에 생육하는 염생식물(Matoh, T. et al. (1989) Plant Physiol. 89: 180-183; Hassidim, M. et al. (1990) 94: 1795-1801; Barkla, B. J. et al. (1995) Plant Physiol. 109: 549-556)이나 보리나 사탕무우 등의 내염성이 높은 중생식물(Hassidim, M. et al. (1990) 94: 1795-1801; Blumwald, E. et al. (1987)Plant Physiol. 85: 30-33; Garbarino, J. and DuPont, F.M. (1988) Plant Physiol. 86: 231-236; Garbarino, J. and DuPont, F.M. (1989) Plant Physiol. 89:1-4; Staal, M. et al. (1991) Physiol. Plant. 82: 179-184)에 있어서 내염성과 연관지어 현재까지 조사되고 있다. 이상의 것은, Na⁺/H⁺대향수송체와 식물의 내염성이 밀접한 관계에 있는 것을 나타내고 있다. 액포막의 Na⁺/H⁺대향수송체의 성질에 대해서는 몇 가지 보고가 있다. 그 수송체 활성의 Na⁺에 대한 Km 값은 약 10 mM으로, 포유류의 세포질막의 값과 비슷하다(Blumwald, E. et al. (1987) Plant Physiol. 85: 30-33; Garbarino, J. and DuPont, F.M. (1988) Plant Physiol. 86: 231-236; Orlowski, J. (1993) J. Biol. Chem. 268: 16369-16377). 또한, Na⁺수송체의 특이적 저해제인 아밀로라이드(amiloride)나 아밀로라이드유도체는, 그들의 대향수송체 양방을 경합적으로 저해하는 것이 알려져 있다(Blumwald, E. et al. (1987) Plant Physiol. 85: 30-33; Orlowski, J. (1993) J. Biol. Chem. 268: 16369-16377; Tse, C.M. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 11917-11924; Fukuda, A. et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39: 196-201). 이들 것은, 식물의 액포막의 Na⁺/H⁺대향수송체의 성질이 포유류의 세포질막의 성질과 유사한 것을 시사하고 있다. 이상과 같이, 식물의 Na⁺/H⁺대향수송체의 활성에 대해서는 여러 보고가 있지만, 그 본체, 즉 유전자나 단백질에 대해서는, 지금까지 여러 시도가 행해져 왔지만, 그 해석은 늦어지고 있었다(Katz, A. et al. (1989) Biochim. Biophys. Acta 983: 9-14; Barkla, B. and Blumwald, E. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11177-11181; Katz, A., Kleyman, T. R., and Pick, U. (1994) Biochemistry 33: 2389-2393).

최근들어, 아라비도프시스(Arabidopsis)에 있어서 기지의 Na⁺/H⁺대향수송체의 아미노산서열과 상동성을 갖는 단백질을 코드하는 것으로 예상되는 유전자가 클로닝되었지만, 그 기능에 대해서는 해명되어 있지 않다(M.P. Apse et al., (1998) Final Programme and Book of Abstracts"11th International Workshop on Plant Membrane Biology", Springer; C.P. Darley et al., (1998) Final Programme and Book of Abstracts"11th International Workshop on Plant Membrane Biology", Springer).

식물에 있어서 단리된 Na⁺/H⁺대향수송체 유전자는, 상기의 쌍자엽식물인 아라비도프시스의 예에 그치고, 산업상 이용 가능한 농작물인 벼나 옥수수 등을 포함하는 단자엽식물에 대해서는, 아직까지 유전자의 단리는 보고되어 있지 않다.

본 발명은, 식물 유래의 신규한 Na⁺/H⁺대향수송체, 상기 수송체에 의해 코드되는 DNA 및 그들의 제조 및 용도에 관한 것이다.

발명의 개시

중요한 농작물 중에서도, 특히 벼는 내염성이 낮은 작물로, 내염성이 높은 작물인 보리가 250 mM의 NaCl로 성장이 반으로 억제되는데 비해, 벼는 150 mM로 동일한 저해를 받는다. Garbarino등은, 보리에서는 뿌리의 액포에 Na⁺를 축적함으로써경엽(莖葉)으로의 Na⁺의 흐름을 억제하여 내염성을 높이고 있는 것은 아닌가 보고하고 있다(Garbarino, J. and DuPont, F.M. (1988) Plant Physiol. 86: 231-236). 이를 뒷받침하는 결과로서, 보리 뿌리의 액포막의 Na⁺/H⁺대향수송 활성은 염처리에 의해 상승하여, 벼 보다는 훨씬 높은 활성을 갖는 것을 알았다(Garbarino, J. and DuPont, F.M. (1988) Plant Physiol. 86: 231-236; Fukuda, A., Yazaki, Y., Ishikawa, T., Koike, S., and Tanaka, Y. (1998) Plant Cell Physiol. 39: 196-201).

한편, 벼에 있어서는 염처리에 의해 활성은 상승하지 않는다(Fukuda, A., Yazaki, Y., Ishikawa, T., Koike, S., and Tanaka, Y. (1998) Plant Cell Physiol. 39: 196-201). 또한, 벼에 있어서의 뿌리로부터 경엽으로의 Na⁺수송은, 동일한 벼과 식물(Gramineae family)인 내염성이 높은 갈대 보다 높은 것을 알고 있기 때문에(Matsushita, N. and Matoh, T. (1991) Physiol. Plant. 83: 170-176), 뿌리의 액포막의 Na⁺/H⁺대향수송 활성의 강함이 벼의 내염성에 강하게 관여하고 있을 가능성이 있다. 이들 보고는, 벼 뿌리의 Na⁺/H⁺대향수송 활성을 높이는 것이, 벼의 내염성을 높일 수 있는 가능성을 시사하고 있다. 이 때문에 벼의 Na⁺/H⁺대향수송체 활성을 높일 수 있는 유전자의 단리가 강하게 요망되고 있었다.

본 발명은, 이러한 상황에 비추어 이루어진 것으로, 그 목적은 단자엽식물,바람직하게는 벼 유래의 Na⁺/H⁺대향수송체 및 상기 수송체를 코드하는 DNA 및 그들의 제조 및 용도를 제공하는 것에 있다. 본 발명은, 본 발명의 DNA의 바람직한 용도로서, 내염성 식물체의 작출을 위한 상기 유전자의 이용을 제공한다.

본 발명자등은, 출아효모의 Na⁺/H⁺대향수송체(NHX1) 유전자와 상동성이 있는 염기서열을 GeneBank의 고등식물의 데이터 베이스로부터 해석하여, 벼의 화서(花序) 유래의 cDNA 클론을 동정했다. 이 서열을 프로브로서 사용하여, 벼 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여, 벼의 Na⁺/H⁺대향수송체를 코드하는 것으로 예상되는, 「OsNHX1」이라 명명된 신규 유전자의 전장을 클로닝하는 것에 성공했다.

단리된 OsNHX1 cDNA는 약 2.3 kb로, 535 아미노산으로 된 단백질을 코드하고 있는 것으로 예상된다(도1). 아미노산의 소수성 해석결과, 상기 단백질에는 12의 막관통영역이 검출되었다(도2).

OsNHX1으로부터 예상되는 아미노산서열은, NHX1이나 포유류의 Na⁺/H⁺대향수송체(NHE)의 아미노산서열과 유의한 상동성이 검출되었다(표1). 특히, 이온수송에 관여하고 있는 것으로 생각되는 막관통영역에서 높은 상동성이 보였다(도3).

현재까지 보고되어 있는 여러 Na⁺/H⁺대향수송체에 대해 계통수를 작성하면, 출아효모의 NHX1, 포유류의 NHE6, OsNHX1의 3개가 클러스터를 만드는 것이 판명되었다(도4). NHX1은 후기 엔도솜에서 발현하고 있다고 하는 보고가 있고(Nass, R. and Rao, R. (1998) J. Biol. Chem. 273: 21054-21060), 또한, NHE6도 세포내에서발현하고 있는 것이 시사되어 있는(Numata, M., Petrecca, K., Lake, N., and Orlowski(1998) J., J. Biol. Chem. 273: 6951-6959) 것으로부터, 본 발명의 OsNHX1은, 액포 등의 세포내 기관에서 발현하여, 액포막으로의 Na⁺수송에 중요한 작용을 하고 있는 것으로 생각된다.

본 발명자등은, 또한, 아그로박테리움법(Agrobacterium method)을 이용하여, 단리한 OsNHX1 유전자를 벼 칼루스(callus)에 도입하고, 이를 재분화시켜 트랜스제닉 식물체를 얻는 것에도 성공했다.

본 발명은, 단자엽식물 유래의 신규한 Na⁺/H⁺대향수송체 및 상기 수송체를 코드하는 DNA 및 그들의 제조 및 용도, 특히 내염성 식물의 작출을 위한 용도에 관한 것이고, 보다 구체적으로는,

1. 하기 (a) 또는 (b)에 기재의 DNA,

(a) 서열번호: 2에 기재의 아미노산서열로 된 단백질을 코드하는 DNA.

(b) 서열번호: 1에 기재의 염기서열의 코드영역을 포함하는 DNA.

2. 단자엽식물 유래의 Na⁺/H⁺대향수송체를 코드하는 하기 (a) 또는 (b)에 기재의 DNA,

(a) 서열번호: 2에 기재의 아미노산서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산서열로 된 단백질을 코드하는 DNA.

(b) 서열번호: 1에 기재의 염기서열로 된 DNA와 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA.

3. 제2에 있어서, 단자엽식물이 벼과 식물인 DNA,

4. 제1 또는 제2의 DNA를 포함하는 벡터,

5. 제1 또는 제2의 DNA 또는 제4의 벡터를 보유하는 형질전환 세포,

6. 제5에 있어서, 식물세포인 형질전환 세포,

7. 제1 또는 제2의 DNA에 의해 코드되는 단백질,

8. 제7에 있어서, 제5의 형질전환 세포를 배양하여, 상기 세포 또는 그 배양상청으로부터 발현시킨 단백질을 회수하는 공정을 포함하는 단백질의 제조방법,

9. 제6의 형질전환 세포를 포함하는 형질전환 식물체,

10. 제9에 있어서, 단자엽식물인 형질전환 식물체,

11. 제10에 있어서, 벼과 식물인 형질전환 식물체,

12. 제11에 있어서, 벼인 형질전환 식물체,

13. 제9의 형질전환 식물체의 자손 또는 클론인 형질전환 식물체,

14. 제9 내지 제13 중 어느 하나의 형질전환 식물체의 번식재료,

15. 제7의 단백질에 결합하는 항체,

16. 서열번호: 1에 기재의 DNA와 하이브리다이즈하는, 적어도 15 뉴클레오티드의 사슬길이를 갖는 핵산분자, 를 제공하는 것이다.

본 발명은, 단자엽식물 유래의 신규한 Na⁺/H⁺대향수송체 및 상기 수송체를 코드하는 DNA를 제공한다. 본 발명자등에 의해 단리된 벼 유래의 Na⁺/H⁺대향수송체「OsNHX1」을 코드하는 cDNA의 염기서열을 서열번호: 1에, 상기 cDNA가 코드하는 단백질의 아미노산서열을 서열번호: 2에 나타낸다.

「OsNHX1」유전자는, 기지의 복수 Na⁺/H⁺대향수송체의 아미노산서열과 유의한 상동성을 가지고 있고, 특히 이온수송에 관련하는 부분에 있어서 높은 상동성이 인정되었다. 이 사실은, 「OsNHX1」단백질이, 벼에 있어서의 Na⁺수송에 중요한 역할을 하고 있는 것을 시사한다. 식물의 Na⁺/H⁺대향수송체는, 고염 스트레스하에 있어서는, 식물체내의 침투압의 균형확보에 관여하고 있는 것이 생각되고 있다. 따라서, 「OsNHX1」유전자는, 특히, 식물의 내염성 품종의 작출 등으로의 응용이 가능한 것으로 생각된다.

본 발명에는, 「OsNHX1」단백질 뿐만 아니라, 이것과 동등한 기능을 갖는 단백질도 포함된다. 본 발명에 있어서 「「OsNHX1」단백질과 동등한 기능을 갖는다」라는 것은, 대상이 되는 단백질이 Na⁺/H⁺대향수송체로서 기능하는 것을 가리킨다. Na⁺/H⁺대향수송체 활성은, 예를 들면, 단리한 생체막 소포내외에 H⁺-ATPase에 의해 형성시킨 H⁺농도구배를 아크리딘 오렌지의 형광소광에 의해 모니터하여, Na⁺첨가에 의한 생체막 소포내로부터의 H⁺의 배출을 형광의 회복으로서 측정할 수 있다(Fukuda, A., Yazaki, Y., Ishikawa, T., Koike, S., and Tanaka, Y. (1998) Plant Cell Physiol. 39: 196-201.).

「OsNHX1」단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질의 하나의 태양은, 「OsNHX1」단백질의 아미노산서열(서열번호: 2)에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산서열을 가져, 「OsNHX1」단백질과 동등한 기능을 갖는 변이 단백질이다. 이러한 단백질은, 예를 들면, 아래의 방법에 의해 조제하는 것이 가능하다. 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는, 예를 들면, 「OsNHX1」단백질의 아미노산에 변이를 도입하는 방법을 들 수 있다. 즉, 당업자라면, 예를 들면, 단백질의 활성을 높이는 등의 목적으로, 부위 특이적 변이도입법(site-directed mutagenesis법) (Kramer, W.& Fritz, H.-J. Oligonucleotide-directed construcyion of mutagenesis via gapped duplex DNA. Methods in Enzymology, 154: 350-367, 1987) 등을 이용하여, 「OsNHX1」단백질(서열번호: 2)중의 아미노산서열을 개변하여, 「OsNHX1」단백질과 동등한 기능을 갖는 개변 단백질을 조제하는 것이 가능하다. 또한, 아미노산의 변이는 자연계에 있어서 생기는 경우도 있다. 본 발명의 단백질에는, 이와 같이 인공적인 것과 천연 유래인 것에 상관 없이, 천연형 「OsNHX1」단백질의 아미노산서열(서열번호: 2)에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 부가된 아미노산서열을 가져, 상기 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질이 포함된다. 단백질에 있어서의 아미노산의 개변부위 및 개변개수는, 개변 후의 단백질이 천연형 「OsNHX1」단백질과 동등한 기능을 갖는 한, 특별히 제한은 없다. 아미노산의 개변은, 일반적으로는, 100 아미노산 이내이고, 바람직하게는 50 아미노산 이내이며, 더욱 바람직하게는 20 아미노산 이내이고, 특히 바람직하게는 5 아미노산 이내이다.

또한, 「OsNHX1」단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질의 그 밖의 태양은, 「OsNHX1」단백질을 코드하는 DNA(서열변호: 1)와 하이브리다이즈하는 단자엽식물 유래의 DNA가 코드하는 단백질로서, 「OsNHX1」단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질이다. 이와 같은 단백질을 조제하기 위해, 당업자에게 잘 알려진 다른 방법으로서는, 하이브리다이제이션기술(Southern, E.M. : Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975.)이나 폴리메라제 연쇄반응(PCR)기술(Saiki, R. K. et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol. 239, 487-491, 1988)을 들 수 있다. 즉, 당업자에게 있어서는, 「OsNHX1」유전자의 염기서열(서열번호: 1) 또는 그 일부를 프로브로서, 또한 「OsNHX1」유전자의 염기서열(서열번호: 1)에 특이적으로 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서, 벼 또는 그 밖의 단자엽식물로부터 「OsNHX1」유전자와 높은 상동성을 갖는 DNA를 단리하고, 상기 DNA로부터 「OsNHX1」단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 얻는 것은 통상 행할 수 있는 것이다. 이와 같이 하이브리다이즈기술이나 PCR기술에 의해 단리할 수 있는 「OsNHX1」단백질과 동등한 기능을 갖는 단자엽식물 유래의 단백질도 또한 본 발명의 단백질에 포함된다.

하이브리다이즈기술이나 PCR기술에 의해 유전자를 단리하기 위한 식물로서는, 단자엽식물, 바람직하게는 벼과 식물을 들 수 있다. 벼과 식물로서는, 예를 들면, 벼 이외에 보리(Hordeum vulgare), 밀(Triticum aestivum), 옥수수(Zea mays) 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다.

상기의 기술을 이용하여, 「OsNHX1」단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 단리하는 방법으로서는, 예를 들면, 아래와 같은 방법을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 예를 들면,³²P 등으로 라벨한 프로브(예를 들면, 서열번호: 1에 기재의 염기서열로 된 DNA 또는 그의 일부)를 사용하여, 단자엽식물로부터 조제한 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 사용한 하이브리다이제이션을 행한다.³²P로 라벨한 프로브를 사용한 하이브리다이제이션의 조건은, 하이브리다이제이션용액(50% 포름아미드(formamide), 5x SSPE, 2x 덴하드 용액(Denhard's solution), 0.1%(w/v) SDS 및 청어 정자 DNA(herring sperm DNA) 100 ㎍/ml (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T(1989) Molecular cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY), 2nd Ed.))을 사용하여 완만한 조건에서는 25℃(formamide를 포함하지 않는다), 통상의 조건에서는 42℃에서 행한다. 프레하이브리다이제이션은 적어도 1시간 이상 행하고, 하이브리다이제이션의 시간을 24시간으로 행한다. 하이브리다이제이션을 행한 필터의 세정은, 완만한 조건(저스트린젠트 조건)에서는 25℃(세정용 용액: 2x SSC, 0.1% SDS), 통상의 조건에서는 42℃(세정용 용액: 2x SSC, 0.1% SDS), 엄격한 조건(고스트린젠트 조건)에서는 56℃(세정용 용액: 0.1x SSC, 0.1% SDS)에서 행한다.

이것에 의해 단리된 DNA가 코드하는 단백질이 「OsNHX1」단백질과 동등한 기능을 갖는 경우, 통상, 「OsNHX1」단백질과 아미노산서열에 있어서 높은 상동성을 갖는다. 높은 상동성이란, 적어도 60% 이상의 상동성, 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 85% 이상의 상동성, 특히 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가리킨다. 아미노산서열의 상동성은, 예를 들면, GENETYX 소프트웨어(소프트웨어 개발주식회사)의 상동성 해석 프로그램(Lipman, D. J. and Pearson, W. R. (1985) Science 227, 1435-1441)에 의해 산출할 수 있다.

본 발명의 단백질은, 당업자에게 공지의 방법에 의해, 재조합 단백질로서, 또한 천연 단백질로서 조제할 수 있다. 재조합 단백질은, 후술하지만, 예를 들면, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA를 적당한 발현벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 적당한 세포에 도입하여, 상기 형질전환 세포로부터 정제함으로써 조제하는 것이 가능하다. 또한, 천연 단백질은, 예를 들면, 조제한 재조합 단백질 또는 그 부분펩티드를 적당한 면역동물에 면역함으로써 조제한 항체를 결합한 친화성 컬럼에, 본 발명의 단백질을 발현하고 있는 세포(예를 들면, 벼 세포) 등으로부터 조제한 추출액을 접촉시켜, 상기 컬럼에 결합하는 단백질을 정제함으로써 조제할 수 있다.

또한, 본 발명은, 상기 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA를 제공한다. 본 발명의 DNA는, 본 발명의 단백질을 코드할 수 있는 것이라면 특별히 제한은 없고, 게놈 DNA, cDNA 및 화학합성 DNA 등이 포함된다. 본 발명의 DNA에 포함되는 「OsNHX1」cDNA의 염기서열을 서열번호: 1에 나타낸다.

게놈 DNA 및 cDNA의 조제는, 당업자에게 있어서 통상적인 수단을 이용하여 행하는 것이 가능하다. 예를 들면, 게놈 DNA는, 본 발명의 유전자의 염기서열 정보로부터 적당한 프라이머대를 설계하여 PCR을 행하고, 얻어지는 증폭 DNA 단편을 프로브로서 사용하여 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리할 수 있다. 또한, 예를 들면, 동일하게 하여 cDNA 라이브러리로부터 cDNA를 단리할 수 있다.

본 발명의 DNA는, 예를 들면, 재조합 단백질의 조제나 내염성 형질전환 식물체의 작출 등에 이용하는 것이 가능하다. 재조합 단백질을 조제하는 경우에는, 통상, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA를 적당한 발현벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 적당한 세포에 도입하여, 형질전환 세포를 배양하여 발현시킨 단백질을 정제한다.

재조합 단백질은, 예를 들면, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터를, 전기천공법(electroporation method)이나 인산칼슘법 등의 공지의 유전자 도입법을 이용하여, 대장균 등의 박테리아, 효모, 곤충세포, 포유동물세포 등에 도입하여, 이들 세포내에서 재조합 단백질을 발현시켜 조제할 수 있다. 숙주세포내에서 발현시킨 재조합 단백질은, 당업자에게 공지의 방법에 의해 정제하는 것이 가능하다. 예를 들면, 대장균에서는 pGEX(Pharmacia) 등의 발현벡터를 사용하여 글루타티온 S-전이효소(GST)와의 융합단백질로서 발현시켜, 글루타티온컬럼을 사용하여 정제할 수 있다(오오노시게오, 니시무라요시부미(1997) 세포공학별책 단백실험 프로트콜, 슈쥰샤).

또한, 본 발명의 DNA를 이용하여 형질전환 식물체를 제작하는 경우에는, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA를 적당한 벡터에 삽입하고, 이를 식물세포에 도입하여, 이것에 의해 얻어진 형질전환 식물세포를 재생시킨다. 식물세포로의 식물발현벡터의 도입에는, 식물세포의 종류에 따라, 예를 들면, 아그로박테리움을 매개로 하는 방법이나 직접 세포에 도입하는 방법을 사용하는 것이 가능하다. 아그로박테리움을 매개로 하는 방법으로서는, 예를 들면, Nagel등의 방법(Microbiol. Lett. 67, 325(1990)이나 벼의 경우 Raineri등의 방법(BIO/TECHNOLOGY 8, 33-38(1990))이사용된다. 이들 방법은, 식물발현벡터(pUC계의 벡터 등. 예를 들면, pCAMBIA벡터(Medical Research Council)등)를 사용하여 아그로박테리움을 형질전환하여, 형질전환된 아그로박테리움을 리프디스크법(leefdisk method)이나 칼루스법 등에 의해 식물세포에 도입하는 방법이다. 식물발현벡터를 직접 세포에 도입하는 방법으로서는, 전기천공법, 입자총법(particle gun method), 인산칼슘법 및 폴리에틸렌글리콜법 등을 들 수 있다.

벡터를 삽입하는 식물세포로서는, 특별히 제한은 없지만, 단자엽식물, 바람직하게는 벼과 식물의 세포이다. 벼과 식물로서는, 벼 이외에, 예를 들면 옥수수 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 「식물세포」에는, 여러 형태의 식물세포, 예를 들면, 현탁배양세포, 프로토플라스트, 잎의 조각, 칼루스 등이 포함된다.

벡터를 삽입한 트랜스제닉 식물세포로부터 트랜스제닉 식물체의 재생에는, 식물의 종류에 따라, 예를 들면, 칼루스의 재분화법(Kyozuka, J. and Shimamoto, K. (1991) Plant Tissue Culture Manual. Kluwer Academic Publishers, pp B1, 1-16, Toki, S. (1997) Plant Molecular Biology Reporter 15, 16-21)이나 프로토플라스트를 사용한 재분화법(Shimamoto, K. et al. (1989) Nature 338, 274-276; Kyozuka, J. et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 206, 408-413) 등이 사용될 수 있다.

이것에 의해 작출된 트랜스제닉 식물체는, 야생형 식물체와 비교하여 높은 Na⁺/H⁺대향수송체 활성을 나타내고, 이것에 의해 내염성이 부여되는 것으로 생각된다. 또한, 일단, 게놈내에 본 발명의 DNA가 도입된 형질전환 식물체가 얻어지면,상기 식물체로부터 유성 생식 또는 무성 생식에 의해 자손을 얻는 것이 가능하다. 또한, 상기 식물체나 그 자손 또는 클론으로부터 번식재료(예를 들면, 종자, 과실, 절수(ears), 괴경(tubers), 괴근(tubercles), 포기(stubs), 칼루스(callus), 프로토플라스트(protoplast) 등)를 얻어, 그들을 토대로 상기 식물체를 양산하는 것도 가능하다. 본 발명에는, 본 발명의 DNA가 도입된 식물세포, 상기 세포를 포함하는 식물체, 상기 식물체의 자손 및 클론, 및 상기 식물체, 그 자손 및 클론의 번식재료가 포함된다.

이와 같은 야생형 식물체와 비교한 높은 Na⁺/H⁺대향수송체 활성은, Na⁺/H⁺대향수송체의 고발현(양적 변화)에 의해 달성하더라도 좋고, 보다 높은 활성을 갖는 Na⁺/H⁺대향수송체의 발현(질적 변화)에 의해 달성하더라도 좋다.

또한, 본 발명은, 상기 본 발명의 단백질에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체에는, 다중클론항체 및 단일클론항체가 포함된다. 항체의 제작은, 당업자에게 공지의 방법, 예를 들면, Harlow등의 방법(Harlow, E. and Lane, D. (1988) Antibodies : A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)을 사용할 수 있다. 다중클론항체는, 토끼에 대장균 등으로 합성시킨 융합단백질이나 합성펩티드를 항원으로서 주사하고, 얻어진 항혈청을 친화성 컬럼에 걸어 항체를 정제함으로써 얻어진다. 단일클론항체는, 마우스나 래트에 항원을 주사하고, 하이브리도마를 조제하여 클로닝을 행하여, 얻어진 항체를 친화성 컬럼에 걸어 얻어진다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA와 하이브리다이즈하는, 적어도 15 뉴클레오티드의 사슬길이를 갖는 핵산분자를 제공한다. 이와 같은 핵산분자는, 예를 들면, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA를 검출 또는 단리하기 위한 프로브로서, 또 증폭하기 위한 프라이머로서 이용하는 것이 가능하다. 이와 같은 핵산분자는, 바람직하게는 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA와 특이적으로 하이브리다이즈한다. 여기에서 「특이적으로 하이브리다이즈한다」라는 것은, 통상의 하이브리다이제이션 조건하, 바람직하게는 스트린젠트 하이브리다이제이션 조건하에서, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA와 하이브리다이즈하고, 그 밖의 단백질을 코드하는 DNA와 하이브리다이즈하지 않는 것을 가리킨다.

또한, 이와 같은 핵산분자는 본 발명의 단백질의 발현을 억제하는 안티센스올리고뉴클레오티드, 리보자임 등으로서 이용하는 것도 가능하다. 안티센스올리고뉴클레오티드로서는, 그들의 유도체나 수식체를 사용할 수 있다. 안티센스올리고뉴클레오티드는, 단백질의 발현을 억제할 수 있는 한, DNA 또는 mRNA의 소정의 영역을 구성하는 뉴클레오티드에 대해 완전하게 상보적일 필요는 없고, 1 또는 복수개의 뉴클레오티드의 미스매치가 존재해 있더라도 좋다. 본 발명의 단백질의 발현을 억제하는 안티센스올리고뉴클레오티드나 리보자임은, 본 발명의 단백질의 기능을 해석하기 위한 매우 유용한 도구가 된다.

도면의 간단한 설명

도1은, 벼의 Na⁺/H⁺대향수송체(OsNHX1) cDNA의 염기서열 및 예상되는 아미노산서열을 나타내는 도이다. 아미노산서열은 1문자표기(one letter lotation)로 나타냈다.

도2는, OsNHX1 단백질의 아미노산의 소수성 플롯을 나타내는 도이다. 가로축은 아미노산잔기, 세로축은 소수도를 나타낸다. 예상되는 막관통영역을 박스내의 숫자로 나타냈다.

도3은, OsNHX1과 그 밖의 Na⁺/H⁺대향수송체와의 아미노산서열의 비교를 나타내는 도이다. 막관통영역(M3~M6)을 서열의 상부에 나타냈다. 모든 아미노산이 동일한 경우는 「＊」를, 유사한 아미노산의 경우는, 유사도가 높은 순으로 「:」또는 「. 」을 아미노산의 하부에 나타냈다. A의 박스는 Na⁺수송체의 특이적 저해제 아밀로라이드의 결합부위를 나타내고, B의 박스는 포유류의 Na⁺/H⁺대향수송체에 있어서 상동성이 높은 부위를 나타낸다.

도4는, ClustalX(Thompson, J. D. et al., (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680)(최근 인(NJ)법)을 사용한 Na⁺/H⁺대향수송체의 계통발생학적 해석의 결과를 나타내는 도이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만 본 발명은 이들 실시예에 제한되지는 않는다.

[실시예 1] 벼 Na⁺/H⁺대향수송체 유전자의 클로닝

출아효모에서 얻어진 Na⁺/H⁺대향수송체(NHX1)와 상동성이 있는 시퀀스를 GeneBank의 고등식물의 데이터 베이스로부터 해석하여, 벼의 화서 유래의 cDNA 클론을 동정했다. 그 클론으로부터 예상되는 아미노산서열은, NHX1과 37%의 상동성이 있었다. 얻어진 cDNA 클론은 전장의 염기서열이 삽입되어 있지 않은 것이 예상되었기 때문에, 그 cDNA 클론을 프로브로서, 벼(Oryza sativaL.cv Nipponbare)유식물의 뿌리로부터 조제한 mRNA를 주형으로 하여 합성한 cDNA 라이브러리로부터, 전장이 삽입된 cDNA 클론의 선발을 시도했다.

벼는, 하룻밤 침수시키고, 영양염류용액(0.5 mM NH₄H₂PO₄, 1 mM KNO₃, 0.5 mM MgSO₄, 12.5 μM Fe-EDTA, 1 mM CaCl₂, micronutrients)을 사용하여 수경재배했다. 낮(광도 40 μmol m^-2s^-1)14시간 30℃, 밤 10시간 25℃, 습도 75%의 재배조건에서 7일간 재배했다.

cDNA 라이브러리는, 벼 유식물의 뿌리로부터 폴리(A⁺) RNA를 조제하고, 5~25%의 수크로오스밀도 구배원심에 의해 사이즈분획을 행하여, 비교적 큰 폴리(A⁺) RNA를 포함하는 분획으로부터 구축했다(Tanaka, Y. et al. (1989) Plant Physiol.90, 1403-1407). 사이즈분획을 행한 폴리(A⁺) RNA는, Gubler와 Hoffman의 방법(Gubler, U. and Hoffman, B.J. (1983) Gene 25, 263-269)에 의해 올리고dT를 프라이머로서 두가닥 사슬 cDNA를 합성하고, Asahipack GS710컬럼(Asahi Chemical Industry Co. Ltd., Tokyo; 2.5X50 cm)을 사용하여 고속액체 크로마토그래피(Tosoh, Tokyo, model CCPD)에 의해 사이즈분획을 행했다. 2 kb 이상의 cDNA를 λgt11의 Eco RI 사이트에 삽입했다.

구축한 cDNA 라이브러리를 갖는 λ파지를 사용하여, NHX1과 상동성이 있는 cDNA 클론을 프로브로서 용융반점하이브리드(plaque hybridaization)를 행했다. 시그날이 있었던 플라크 속으로부터, 벡터에 삽입된 cDNA가 가장 긴 것을 선택하여, 잘라낸 cDNA를 pBluescript(KS+)벡터(Stratagene사)에 삽입하여 클로닝을 행했다. 얻어진 cDNA 클론이 전장인 것의 확인은, 그 클론을 프로브로서, 벼 식물체로부터 추출한 RNA를 사용한 노던하이브리다이제이션에 의해 얻어진 시그날의 사이즈로 확인했다. 단리된 유전자(OsNHX1이라 칭한다)전장이 삽입된 cDNA 클론의 전체 염기서열을 결정했다(도1).

[실시예 2] OsNHX1 유전자의 염기서열 및 아미노산서열의 해석

전장은 2330 염기대, 5'비번역영역은 296 염기대, 번역영역은 1608 염기대, 3'비번역영역은 426 염기대였다. OsNHX1이 코드하고 있는 단백질은 535 아미노산으로 예상되고, 분자량의 계산값은 59,070이었다. 예상되는 아미노산서열은, 59%의 소수성, 22%의 중성, 19%의 친수성 아미노산으로 되어, 소수성이 높은 단백질인 것으로 생각되었다. Kyte와 Doolittle의 방법(Kyte, J. and Doolittle, R. F. (1982) J. Mol. Biol. 157, 105-132)에 의한 소수성 해석의 결과를 도2에 나타낸다. TMpred program(Hofmann, K. and Stoffel, W. (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374, 166)에 의한 해석에 의해, 12회 막관통영역을 검출했다.

OsNHX1으로부터 예상되는 아미노산서열은, NHX1이나 포유류의 Na⁺/H⁺대향수송체(NHE)의 아미노산서열과 유의한 상동성이 검출되었다(표1; 표중, NHX1은 효모[S.cerevisiae] 유래, NHE6은 인간 유래, NHE1~4는 래트 유래이다. 또한, 표중 수치의 산출에는, GENETYX(ver.10)소프트웨어(소프트웨어 개발주식회사)의 상동성 해석 프로그램을 사용했다(Lipman, D.J. and Pearson, W. R. (1985) Science 227, 1435-1441). 특히, 이온수송에 관계하고 있는 것으로 생각되는 막관통영역에서 높은 상동성이 보였다(도3). OsNHX1의 아미노산 부분서열인⁸³LFFIYLLPPI⁹²의 영역은, NHX1이나 NHE에서도 매우 잘 보존되어 있어, 진핵생물의 Na⁺/H⁺대향수송체를 저해하는 아밀로라이드의 결합부위로 생각되고 있다(Counillon, L. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4508-4512)(도3A). 또한, 진핵생물의 Na⁺/H⁺대향수송체에서는, 6번째와 7번째의 막관통영역이 잘 보존되어 있어, Na⁺와 H⁺의 수송에 중요한 작용을 하고 있는 것으로 생각되고 있지만(Orlowski, J. and Grinstein, S. (1997) J. Biol. Chem. 272, 22373-22376), OsNHX1의 5번째와 6번째의 막관통영역은 이들 영역과 상동성이 높았다(도3B). 이상의 것은, OsNHX1이 코드하는 단백질이Na⁺/H⁺대향수송 활성을 갖는 것을 시사하고 있다.

현재까지 보고되어 있는 여러 Na⁺/H⁺대향수송체, 즉, 포유류의 NHE, 출아효모(S. cerevisiae)의 NHX1 및 NHA1, 분열효모(S. pombe)의 세포질막에서 발현하고 있는 것으로 생각되는 Sod2, 효모(Zygosaccharomyces rouxii)의 ZSod2, 대장균(E. coli)의 NhaA 및 NhaB 및 OsNHX1(도중 「OsNHX1」으로 표기)에 대해 NJ법에 의해 계통수를 작성하면, NHX1, NHX6, OsNHX1의 3개가 클러스터를 만드는 것이 판명되었다(도4). NHX1이 후기 엔도솜에서 발현하고 있다고 하는 보고가 있고(Nass, R. and Rao, R. (1998) J. Biol. Chem. 273: 21054-21060), 또한, NHE6도 세포내에서 발현하고 있는 것이 시사되어 있다(Numata, M., Petrecca, K., Lake, N., andOrlowski, J., J. Biol. Chem. 273: 6951-6959). 이들 것으로부터, OsNHX1이 액포 등의 세포내 기관에서 발현하고, 이들 기관에 있어서 Na⁺수송에 중요한 작용을 하고 있는 것으로 생각된다.

[실시예 3] 벼 Na⁺/H⁺대향수송체 유전자를 발현하는 형질전환 벼의 작출

pBluescript KS+(STRATAGENE사)의 BamHI사이트에 삽입한 OsNHX1을 KpnI와 NotI에 의해 잘라내, Ti-plasmid 유래에서 카나마이신과 하이그로마이신 내성유전자를 도입한 pMSH1(고발현용) 및 pMSH2(발현억제용)벡터(pMSH1)에 대해서는, Kawasaki, T. et al., (1999) Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 96, 10922-10926. pMSH2는 pMSH1의 멀티클로닝사이트가 반대방향으로 된 것)의 컬리플라워모자이크바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터 하류에 삽입했다. 구축한 벡터를 사용하여 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)에 의해 벼 칼루스를 형질전환했다. 칼루스는 종자로부터 유도하여, 아그로박테리움 감염 후의 선발을 하이그로마이신으로 행했다. 선발한 칼루스를 재분화시켜, 형질전환 식물체를 얻었다. 또한, 형질전환 및 재분화는 기본적으로 도키의 방법(Toki, S. (1997) Plant Molecular Biology Reporter 15, 16-21)에 따라 행했다.

본 발명에 있어서, 단리된 Na⁺/H⁺대향수송체 유전자는, 식물체내에서 발현시킴으로써, 상기 식물체에 내염성을 부여할 수 있는 것으로 생각된다. 이 때문에, 예를 들면 벼 등 유용 농작물에 도입함으로써 내염성을 향상시켜, 건조지 등에 있어서도 염해를 받지 않고, 농작물의 수확량을 증대시키는데 크게 공헌할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> National Research Institute of Agrobiological Resources <120> Sodium/proton exchanger genes <130> MOA-006PCT <150> JP 1998-365604 <151> 1998-12-22 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2330 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (297)..(1901) <400> 1 gagaagagag ttttgtagcg agctcgcgcg aatgcgaagc caaccgagag aggtctcgat 60 accaaatccc gatttctcaa cctgaatccc ccccccacgt tcctcgtttc aatctgttcg 120 tctgcgaatc gaattctttg tttttttttc tctaatttta ccgggaattg tcgaattagg 180 cattcaccaa cgagcaagag gggagtggat tggttggtta aagctccgca tcttgcggcg 240 gaaatctcgc tctcttctct gcggtgggtg gccggagaag tcgccgccgg tgaggc atg 299 Met 1 ggg atg gag gtg gcg gcg gcg cgg ctg ggg gct ctg tac acg acc tcc 347 Gly Met Glu Val Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Leu Tyr Thr Thr Ser 5 10 15 gac tac gcg tcg gtg gtg tcc atc aac ctg ttc gtc gcg ctg ctc tgc 395 Asp Tyr Ala Ser Val Val Ser Ile Asn Leu Phe Val Ala Leu Leu Cys 20 25 30 gcc tgc atc gtc ctc ggc cac ctc ctc gag gag aat cgc tgg gtc aat 443 Ala Cys Ile Val Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg Trp Val Asn 35 40 45 gag tcc atc acc gcg ctc atc atc ggg ctc tgc acc ggc gtg gtg atc 491 Glu Ser Ile Thr Ala Leu Ile Ile Gly Leu Cys Thr Gly Val Val Ile 50 55 60 65 ttg ctg atg acc aaa ggg aag agc tcg cac tta ttc gtc ttc agt gag 539 Leu Leu Met Thr Lys Gly Lys Ser Ser His Leu Phe Val Phe Ser Glu 70 75 80 gat ctc ttc ttc atc tac ctc ctc cct ccg atc atc ttc aat gca ggt 587 Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn Ala Gly 85 90 95 ttt cag gta aag aaa aag caa ttc ttc cgg aat ttc atg acg atc aca 635 Phe Gln Val Lys Lys Lys Gln Phe Phe Arg Asn Phe Met Thr Ile Thr 100 105 110 tta ttt gga gcc gtc ggg aca atg ata tcc ttt ttc aca ata tct att 683 Leu Phe Gly Ala Val Gly Thr Met Ile Ser Phe Phe Thr Ile Ser Ile 115 120 125 gct gcc att gca ata ttc agc aga atg aac att gga acg ctg gat gta 731 Ala Ala Ile Ala Ile Phe Ser Arg Met Asn Ile Gly Thr Leu Asp Val 130 135 140 145 gga gat ttt ctt gca att gga gcc atc ttt tct gcg aca gat tct gtc 779 Gly Asp Phe Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ser Ala Thr Asp Ser Val 150 155 160 tgc aca ttg cag gtc ctc aat cag gat gag aca ccc ttt ttg tac agt 827 Cys Thr Leu Gln Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Phe Leu Tyr Ser 165 170 175 ctg gta ttc ggt gaa ggt gtt gtg aac gat gct aca tca att gtg ctt 875 Leu Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Ile Val Leu 180 185 190 ttc aac gca cta cag aac ttt gat ctt gtc cac ata gat gcg gct gtc 923 Phe Asn Ala Leu Gln Asn Phe Asp Leu Val His Ile Asp Ala Ala Val 195 200 205 gtt ctg aaa ttc ttg ggg aac ttc ttt tat tta ttt ttg tcg agc acc 971 Val Leu Lys Phe Leu Gly Asn Phe Phe Tyr Leu Phe Leu Ser Ser Thr 210 215 220 225 ttc ctt gga gta ttt gct gga ttg ctc agt gca tac ata atc aag aag 1019 Phe Leu Gly Val Phe Ala Gly Leu Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Lys Lys 230 235 240 cta tac att gga agg cat tct act gac cgt gag gtt gcc ctt atg atg 1067 Leu Tyr Ile Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val Ala Leu Met Met 245 250 255 ctc atg gct tac ctt tca tat atg ctg gct gag ttg cta gat ttg agc 1115 Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu Leu Leu Asp Leu Ser 260 265 270 ggc att ctc acc gta ttc ttc tgt ggt att gta atg tca cat tac act 1163 Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser His Tyr Thr 275 280 285 tgg cat aac gtc aca gag agt tca aga gtt aca aca aag cac gca ttt 1211 Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Val Thr Thr Lys His Ala Phe 290 295 300 305 gca act ctg tcc ttc att gct gag act ttt ctc ttc ctg tat gtt ggg 1259 Ala Thr Leu Ser Phe Ile Ala Glu Thr Phe Leu Phe Leu Tyr Val Gly 310 315 320 atg gat gca ttg gat att gaa aaa tgg gag ttt gcc agt gac aga cct 1307 Met Asp Ala Leu Asp Ile Glu Lys Trp Glu Phe Ala Ser Asp Arg Pro 325 330 335 ggc aaa tcc att ggg ata agc tca att ttg cta gga ttg gtt ctg att 1355 Gly Lys Ser Ile Gly Ile Ser Ser Ile Leu Leu Gly Leu Val Leu Ile 340 345 350 gga aga gct gct ttt gta ttc ccg ctg tcg ttc ttg tcg aac cta aca 1403 Gly Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu Thr 355 360 365 aag aag gca ccg aat gaa aaa ata acc tgg aga cag caa gtt gta ata 1451 Lys Lys Ala Pro Asn Glu Lys Ile Thr Trp Arg Gln Gln Val Val Ile 370 375 380 385 tgg tgg gct ggg ctg atg aga gga gct gtg tcg att gct ctt gct tac 1499 Trp Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Ile Ala Leu Ala Tyr 390 395 400 aat aag ttt aca aga tct ggc cat act cag ctg cac ggc aat gca ata 1547 Asn Lys Phe Thr Arg Ser Gly His Thr Gln Leu His Gly Asn Ala Ile 405 410 415 atg atc acc agc acc atc act gtc gtt ctt ttt agc act atg gta ttt 1595 Met Ile Thr Ser Thr Ile Thr Val Val Leu Phe Ser Thr Met Val Phe 420 425 430 ggg atg atg aca aag cca ttg atc agg ctg ctg cta ccg gcc tca ggc 1643 Gly Met Met Thr Lys Pro Leu Ile Arg Leu Leu Leu Pro Ala Ser Gly 435 440 445 cat cct gtc acc tct gag cct tca tca cca aag tcc ctg cat tct cct 1691 His Pro Val Thr Ser Glu Pro Ser Ser Pro Lys Ser Leu His Ser Pro 450 455 460 465 ctc ctg aca agc atg caa ggt tct gac ctc gag agt aca acc aac att 1739 Leu Leu Thr Ser Met Gln Gly Ser Asp Leu Glu Ser Thr Thr Asn Ile 470 475 480 gtg agg cct tcc agc ctc cgg atg ctc ctc acc aag ccg acc cac act 1787 Val Arg Pro Ser Ser Leu Arg Met Leu Leu Thr Lys Pro Thr His Thr 485 490 495 gtc cac tac tac tgg cgc aag ttc gac gac gcg ctg atg cga ccg atg 1835 Val His Tyr Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Asp Ala Leu Met Arg Pro Met 500 505 510 ttt ggc ggg cgc ggg ttc gtg ccc ttc tcc cct gga tca cca acc gag 1883 Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe Ser Pro Gly Ser Pro Thr Glu 515 520 525 cag agc cat gga gga aga tgaacagtgc aaagaaatga gaatggaatg 1931 Gln Ser His Gly Gly Arg 530 535 gttgatgagg agaatacatg taaaatgtga cagcaaaaga gagaaggcaa gttttgggtt 1991 tgtagagttt ggctgctgct aatgagttgt tgatagtgcc tatattcttc agaacttcag 2051 atggtgcctc accaaggcct aagagccagg aggaccttct gataatggtt cgggatgatt 2111 ggtttgttct gtcaggatga accctagtga gtgacacagg gtgatgtgct ccgacaacct 2171 gtaaattttg tagattaaca gccccatttg tacctgtcta ccatctttag ttggcgggtg 2231 ttctttccta gttgccaccc tgcatgtaaa atgaaattct ccgccaaaat agatttgtgt 2291 gtataataat tttgcttggt tgaaaaaaaa aaaaaaaaa 2330 <210> 2 <211> 535 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Gly Met Glu Val Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Leu Tyr Thr Thr 1 5 10 15 Ser Asp Tyr Ala Ser Val Val Ser Ile Asn Leu Phe Val Ala Leu Leu 20 25 30 Cys Ala Cys Ile Val Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg Trp Val 35 40 45 Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Ile Ile Gly Leu Cys Thr Gly Val Val 50 55 60 Ile Leu Leu Met Thr Lys Gly Lys Ser Ser His Leu Phe Val Phe Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn Ala 85 90 95 Gly Phe Gln Val Lys Lys Lys Gln Phe Phe Arg Asn Phe Met Thr Ile 100 105 110 Thr Leu Phe Gly Ala Val Gly Thr Met Ile Ser Phe Phe Thr Ile Ser 115 120 125 Ile Ala Ala Ile Ala Ile Phe Ser Arg Met Asn Ile Gly Thr Leu Asp 130 135 140 Val Gly Asp Phe Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ser Ala Thr Asp Ser 145 150 155 160 Val Cys Thr Leu Gln Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Phe Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Ile Val 180 185 190 Leu Phe Asn Ala Leu Gln Asn Phe Asp Leu Val His Ile Asp Ala Ala 195 200 205 Val Val Leu Lys Phe Leu Gly Asn Phe Phe Tyr Leu Phe Leu Ser Ser 210 215 220 Thr Phe Leu Gly Val Phe Ala Gly Leu Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Lys 225 230 235 240 Lys Leu Tyr Ile Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val Ala Leu Met 245 250 255 Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu Leu Leu Asp Leu 260 265 270 Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser His Tyr 275 280 285 Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Val Thr Thr Lys His Ala 290 295 300 Phe Ala Thr Leu Ser Phe Ile Ala Glu Thr Phe Leu Phe Leu Tyr Val 305 310 315 320 Gly Met Asp Ala Leu Asp Ile Glu Lys Trp Glu Phe Ala Ser Asp Arg 325 330 335 Pro Gly Lys Ser Ile Gly Ile Ser Ser Ile Leu Leu Gly Leu Val Leu 340 345 350 Ile Gly Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu 355 360 365 Thr Lys Lys Ala Pro Asn Glu Lys Ile Thr Trp Arg Gln Gln Val Val 370 375 380 Ile Trp Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Ile Ala Leu Ala 385 390 395 400 Tyr Asn Lys Phe Thr Arg Ser Gly His Thr Gln Leu His Gly Asn Ala 405 410 415 Ile Met Ile Thr Ser Thr Ile Thr Val Val Leu Phe Ser Thr Met Val 420 425 430 Phe Gly Met Met Thr Lys Pro Leu Ile Arg Leu Leu Leu Pro Ala Ser 435 440 445 Gly His Pro Val Thr Ser Glu Pro Ser Ser Pro Lys Ser Leu His Ser 450 455 460 Pro Leu Leu Thr Ser Met Gln Gly Ser Asp Leu Glu Ser Thr Thr Asn 465 470 475 480 Ile Val Arg Pro Ser Ser Leu Arg Met Leu Leu Thr Lys Pro Thr His 485 490 495 Thr Val His Tyr Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Asp Ala Leu Met Arg Pro 500 505 510 Met Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe Ser Pro Gly Ser Pro Thr 515 520 525 Glu Gln Ser His Gly Gly Arg 530 535

Claims

서열번호: 2 기재의 아미노산서열로 된 단백질을 코드하는 DNA.
서열번호: 1 기재의 염기서열의 코드영역을 포함하는 DNA.
서열번호: 1 기재의 염기서열로 된 DNA와, 5x SSPE, 2x 덴하드 용액, 0.1%(w/v) SDS, 및 청어 정자 DNA 100 ㎍/ml를 포함하는 하이브리다이제이션 용액 중 25℃에서 하이브리다이즈를 행하고, 2x SSC, 0.1% SDS 중에서 25℃에서 세정하는 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA로서, Na⁺/H⁺대향수송체 활성을 갖는 단자엽식물 유래의 단백질을 코드하는 DNA.
서열번호: 1 기재의 염기서열로 된 DNA와, 50% 포름아미드, 5x SSPE, 2x 덴하드 용액, 0.1%(w/v) SDS, 및 청어 정자 DNA 100 ㎍/ml를 포함하는 하이브리다이제이션 용액 중 42℃에서 하이브리다이즈를 행하고, 2x SSC, 0.1% SDS 중에서 42℃에서 세정하는 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA로서, Na⁺/H⁺대향수송체 활성을 갖는 단자엽식물 유래의 단백질을 코드하는 DNA.
서열번호: 1 기재의 염기서열로 된 DNA와, 50% 포름아미드, 5x SSPE, 2x 덴하드 용액, 0.1%(w/v) SDS, 및 청어 정자 DNA 100 ㎍/ml를 포함하는 하이브리다이제이션 용액 중 42℃에서 하이브리다이즈를 행하고, 0.1x SSC, 0.1% SDS 중에서 56℃에서 세정하는 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA로서, Na⁺/H⁺대향수송체 활성을 갖는 단자엽식물 유래의 단백질을 코드하는 DNA.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단자엽식물이 벼과 식물인 DNA.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 DNA를 포함하는 벡터.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 DNA를 보유하는 형질전환 세포.
제7항의 벡터를 보유하는 형질전환 세포.
제8항에 있어서, 식물세포인 형질전환 세포.
제9항에 있어서, 식물세포인 형질전환 세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 DNA에 의해 코드되는 단백질.
제8항의 형질전환 세포를 배양하여, 상기 세포 또는 그 배양상청으로부터 발현시킨 단백질을 회수하는 공정을 포함하는, 상기 DNA가 코드하는 단백질의 제조방법.
제9항의 형질전환 세포를 배양하여, 상기 세포 또는 그 배양상청으로부터 발현시킨 단백질을 회수하는 공정을 포함하는, 상기 DNA가 코드하는 단백질의 제조방법.
제10항의 형질전환 세포를 포함하는 형질전환 식물체로서, 칼루스 재분화를 통한 무성생식이 가능한 식물체.
제11항의 형질전환 세포를 포함하는 형질전환 식물체로서, 칼루스 재분화를 통한 무성생식이 가능한 식물체.
제15항에 있어서, 단자엽식물인 형질전환 식물체.
제16항에 있어서, 단자엽식물인 형질전환 식물체.
제17항에 있어서, 벼과 식물인 형질전환 식물체.
제18항에 있어서, 벼과 식물인 형질전환 식물체.
제19항에 있어서, 벼인 형질전환 식물체.
제20항에 있어서, 벼인 형질전환 식물체.
제15항의 형질전환 식물체의 자손 또는 클론인, 칼루스 재분화를 통한 무성생식이 가능한 형질전환 식물체.
제16항의 형질전환 식물체의 자손 또는 클론인, 칼루스 재분화를 통한 무성생식이 가능한 형질전환 식물체.
제15항의 형질전환 식물체의 번식재료.
제16항의 형질전환 식물체의 번식재료.
제23항의 형질전환 식물체의 번식재료.
제24항의 형질전환 식물체의 번식재료.
제12항의 단백질에 결합하는 항체.
서열번호: 1 기재의 DNA와, 5x SSPE, 2x 덴하드 용액, 0.1%(w/v) SDS, 및 청어 정자 DNA 100 ㎍/ml를 포함하는 하이브리다이제이션 용액 중 25℃에서 하이브리다이즈를 행하고, 2x SSC, 0.1% SDS 중에서 25℃에서 세정하는 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산분자.