DE19824307A1 - Nicotianamin-Synthase-Gene, ihre Isolierung und ihre Verwendung - Google Patents

Nicotianamin-Synthase-Gene, ihre Isolierung und ihre Verwendung

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Nicotianamin-Synthase-Gene, ihre Isolierung und ihre Verwendung. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Landwirtschaft und der Umweltschutz. DOLLAR A Erfindungsgemäß werden Nicotianamin-Synthasen und die für sie kodierenden Gene isoliert und sequenziert. Spezielle Ausführungsbeispiele gehen von der Isolierung aus Gerste bzw. aus Tomate aus.

Description

Die Erfindung betrifft die Nicotianamin-Synthase-Gene, ihre Isolierung und ihre Verwendung. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Landwirtschaft und der Umweltschutz.
Die nichtproteinogene Aminosäure Nicotianamin wurde zuerst aus Blättern von Tabak (Nicotiana tabacurn; Tetrahedron Lett. 22, 2017-2020 [1971]) und Luzerne (Medicago sativa; Phytochemistry 19, 2295-2297 [1980]) isoliert. Sie kommt in allen untersuchten mehrzelligen Pflanzen vor (Biochem. Physiol. Pflanzen 180, 557-563 [1985]). Nicotianamin ist eine entscheidende Komponente bei der Regulierung der pflanzlichen Eisen- und Schwermetallassimilation (J. Plant Nutr. 15, 1647-­ 1665 [1992]; Physiol. Plant. 88, 522-529 [1993]). Nicotianamin ist in der Lage, die auxotrophe Tomatenmutante chloronerva phänotypisch zu normalisieren (Plant Sci. Lett. 32, 327-332 [1983]).
Die gezielte Kontrolle der Nicotianamin-Konzentration bietet vielfältige und aussichtsreiche Möglichkeiten für die Beeinflussung des pflanzlichen Mineralstoffwechsels. Nicotianamin wird in Pflanzen aus S-Adenosyl-Methionin (SAM) synthetisiert, die Reaktion wird durch das Enzym Nicotianamin-Synthase katalysiert.
Die Erfindung hat das Ziel, die Nicotianamin-Konzentration in Pflanzen zu beeinflussen und damit positive Effekte auf auf den Mineralstoffwechsel hervorzurufen. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, die Struktur der Nicotianamin-Synthase sowie der für sie kodierenden Gene zu ermitteln, Konstrukte für den Transfer der Gene aufzubauen und schließlich transgene Pflanzen mit veränderter Nicotianamin-Produktion herzustellen.
Ein weiteres Ziel besteht darin, das chemosynthetisch schwer zugängliche Nicotianamin auf biotechnologischem Wege zu gewinnen.
Die Aufgabe der Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1-14 gelöst.
Ausgangspunkt der Erfindung ist die Isolierung und Sequenzierung der Nicotianamin-Synthasen sowie der für sie kodierenden Gene. Diese Sequenzen werden in Rahmen der vorliegenden Erfindung beansprucht.
Die Aminosäuresequenz der Nicotianamin-Synthase aus Gerste umfaßt Aminosäuren folgender Sequenz:
Die Aminosäuresequenz der Nicotianamin-Synthase aus Tomate umfaßt Aminosäuren folgender Sequenz:
Die sie kodierenden DNA-Sequenzen haben folgende Basenfolgen:
a) in Gerste
b) in Tomate
Neben den angegebenen Aminosäure- und DNA-Sequenzen gehören auch deren Fragmente, Varianten und Mutanten zum Umfang der vorliegenden Erfindung.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen eröffnen eine grundlegend neue Möglichkeit, den pflanzlichen Mineralstoffwechsel zu beeinflussen. Sie können mittels geeigneter Vektoren in das Genom von Pflanzen übertragen werden. Das führt zu transgenen Pflanzen mit Überproduktion von Nicotianamin und gesteigerter Spurenelement-Effizienz (vor allem Eisen, Kupfer, Zink).
Grundsätzlich sind die neuen DNA-Sequenzen für einen Transfer in sämtliche Pflanzen geeignet. Bevorzugt ist jedoch der Einsatz der Nicotianamin-Synthase-DNA aus dikotylen Pflanzen für die gleichen oder für weitere dikotyle Pflanzen, beispielsweise der DNA aus der Tomate für Tomaten, Kartoffeln, Zuckerrüben, Soja usw.
Der Einsatz von aus monokotylen Pflanzen erhaltener DNA ist demzufolge für die gleichen oder weitere monokotyle Pflanzen bevorzugt, beispielsweise der DNA aus Gerste für Gerste und für weitere Getreidearten.
Die Übertragung zusätzlicher Nicotianamin-Synthase-Genkopien in das Genom von Pflanzen und ihre Organ- und Ontogenese­ spezifische Expression führt durch Erhöhung der Nicotianamin- Konzentration zu einer Optimierung der Verteilung der o. g. Spurenelemente und damit zu verstärkter Vitalität, höherer Biomasseproduktion und somit letztlich zu besseren Erträgen. Kultursorten von z. B. Getreiden können so mit höherer Effizienz in Gebieten mit Mangelböden angebaut werden.
Eine weitere Möglichkeit besteht im Absenken der Nicotianamin-Konzentration in den Pflanzen, was vorzugsweise durch den Aufbau von Nicotianamin-Synthase-antisense- Konstruktionen zur Phytoremediation erfolgt (Suppression der Nicotianamin-Synthase-Aktivität).
Mit Hilfe solcher Konstrukte und deren Transfer in die Pflanzen können die Wildtyp-gemäßen Nicotianamin- Konzentrationen stufenweise abgesenkt werden, um die Aufnahmereaktionen der Wurzel für solche Schwermetalle zu aktivieren, mit denen Nicotianamin Komplexe zu bilden vermag, also Cu, Ni, Co, Zn, Fe, Mn und andere. Die daraus folgendende Überaufnahme aus dem Boden kann zur Sanierung von Schwermetall-belasteten Böden genutzt werden.
Das Absenken der Nicotianamin-Konzentration in Pflanzen kann auch durch homologe Rekombination der Nicotianamin-Synthase erfolgen.
Die mit der Erfindung zur Verfügung gestellten Aminosäuresequenzen gemäß Anspruch 4-6 sind ferner als Ausgangspunkt für ein Herbizidtargeting geeignet. Potentielle Herbizide werden getestet, ob sie die Enzym-Aktivität der Nicotianamin-Synthase hemmen. Der Ausfall der Enzymaktivität führt durch Disorganisation des Mineralstoffwechsels zu semiletalen Pflanzen, die unter Feldbedingungen keine Entwicklungschancen gegenüber den mit einer entsprechenden Herbizidresistenz ausgestatteten Kulturpflanzen haben.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit der Erfindung besteht darin, daß das chemosynthetisch bisher höchstens im mg- Bereich zugängliche Nicotianamin jetzt auf biotechnologischem Wege gewonnen werden kann. Notwendig ist dazu der Transfer des Nicotianamin-Synthase-Gens in einen für die Produktion geeigneten Mikroorganismus, z. B. E. coli oder Bac. subtilis. Das damit in ausreichenden Mengen herstellbare Nicotianamin wird in der Medizin (u. a. als Angiotensin I-Konversionsenzym- Inhibitor, d. h. als Blutdrucksenker) und als Leitstruktur für weitere Synthesen eingesetzt. Diese neue Möglichkeit erlaubt auch erstmals die gezielte Produktion von speziellen Stereoisomeren des Nicotianamins, wie sie für die volle biologische Aktivität notwendig sind.
Gegenstand der Erfindung sind auch transgene Pflanzen, die DNA-Sequenzen enthalten, welche die Nicotianamin-Synthase kodieren, ebenso wie Pflanzen, die Antisense-Sequenzen gegen die in den Pflanzen vorhandenen Nicotianamin-Synthase-Gene beinhalten.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
Beispiel 1 Nicotianamin-Synthase aus Gerste
Wurzelgewebe von Gerstenpflanzen, die unter Eisenmangel kultiviert wurden, wird unter flüssigem Stickstoff homogenisiert. Die Extraktion der Proteine mit einem speziellen Extraktionspuffer, dem verschiedene Protease- Inhibitoren zugesetzt sind, und alle anschließenden Isolierungsschritte geschehen bei 0°C. Mittels Hydrophober Interaktions-Chromatographie, Anionenaustausch-Chromato­ graphie (DEAE-Sephacel), Hydrophober Interaktions-Re- Chromatographie, Anionenaustausch-Chromatographie (Res™Q), Hydroxylapatit-Chromatographie und Gelfiltration wird ein Enzymextrakt mit etwa 140-facher Aufreinigung erhalten.
Die Proteinfraktion mit Nicotianamin-Synthase-Aktivität enthält das SAM-bindende 'Polypeptid B'. Dessen Reindarstellung und die Bestimmung partieller Aminosäuresequenzen führt zur Ableitung sequenzspezifischer Oligonukleotide. Mit Hilfe der RACE (rapid a mplification of cDNA ends)-Technik wurde ein Teil der Nicotianamin-Synthase- Gensequenz aus Gerste isoliert. Eine Datenbanksuche findet kein bereits beschriebenes ähnlichens Gen, mit Ausnahme zweier anonymer, aus dem Genomprojekt resultierender Arabidopsis-Sequenzen. Die gefundene Nicotianamin-Synthase- Sequenz repräsentiert demnach ein neues Pflanzengen.
Beispiel 2 Aktivitätsbestimmung der Nicotianamin-Synthase
Zur Aktivitätsbestimmung der Nicotianamin-Synthase, besonders zur Kontrolle der Reinigungsschritte bei Isolierung des Enzyms, wurde folgender Assay entwickelt:
Nach Homogenisieren von 3 g Pflanzenmaterial (Frischgewicht) unter flüssigem Stickstoff wurde das pulverisierte Material in 5 ml Extraktionspuffer (100 mM HEPES, 5 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM EDTA, 30 mM Dithiothreitol, 1.4 µl Leupeptin, 1% (w/v) Polyvinylpyrolidon 360, 0.2% (w/v) Rinderserumalbumin, 0.2% (w/v) Casein, 200 µM S-Adenosyl-Methionin und 10 µM E64 pH 8.2) aufgenommen. 2.5 ml des Überstandes wurden nach der Zentrifugation (13 000 g, 3 min. 4°C) auf eine PD10-Säule (Pharmacia) geladen, die vorher mit 12 ml Inkubationspuffer (50 mM Tris, 1mM EDTA, 3 mM Dithiothreitol, 50 µM Methionin, 200 µM S-Adenosyl-Methionin, 500 µM ATP und 10µM E64, pH 8.7) äquilibriert wurde. Nach der Elution mit 3.5 ml Inkubationspuffer wurde der Proteinextrakt mittels Ultrafiltration konzentriert und für den Enzymtest eingesetzt. Die Bestimmung der Nicotianamin-Synthase- Aktivität erfolgte bei Tomate genauso wie bei Gerste. Ausgetauscht wurde lediglich der Proteasehemmstoff E64 gegen 0.1 mM 4-Amidinophenylmethansulfonylfluorid und 20 µg/ml Antipain.
Die Enzymaktivität der Nicotianamin-Synthase wurde jeweils über die Produktmenge des aus 3 Molekülen S-Adenosyl-L- [carboxyl-14C]methionin synthetisierten 14C-Nicotianamins quantifiziert. Unter Standardbedingungen erfolgte eine Inkubation von 50 µl Extrakt mit 20 µM 14C-S-Adenosyl- Methionin bei 30°C, pH 8.7, für 5 oder 10 min. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 99%-igem Methanol in einem Verhältnis von 1 : 1 (v/v) abgestoppt und die Proben bis zur Quantifizierung bei -80°C gelagert. Unmittelbar vor der Dünnschichtchromatographie wurden die Proben aufgetaut und für 10 min bei 15 000 g und 4°C zentrifugiert.
Die Trennung von S-Adenosyl-L-[carboxyl-14C]methionin und 14C-Nicotianamin erfolgte dünnschichtchromatographisch. Zur Identifizierung des 14C-Nicotianamins wurde unmarkiertes Nicotianamin als Referenzsubstanz aufgetragen, das sich mit Ninhydrin anfärben läßt. Die Entwicklung der Chromatogramme auf Kieselgelplatten erfolgte entweder mit 1-Propanol/Wasser (7/8, v/v) oder mit Phenol/Butanol/Ameisensäure/Wasser (12/3/2/3 v/v). Die Quantifizierung des Reaktionsproduktes wurde mit einem Bio-Imaging Analyser Fuji BAS 2000 vorgenommen.
Beispiel 3 Nicotianamin-Synthase aus Tomate
Die Tomatenmutante chloronerva besitzt kein Nicotianamin und hat auch keine Nicotianamin-Synthase-Aktivität. Durch die Zugabe von externem Nicotianamin kann der Phänotyp der Mutante normalisiert werden. Das Fehlen des Nicotianamins bewirkt einen semilethalen Phänotyp und eine konstruktive Aktivierung der Strategie I-Eisenaufnahmemechanismen. Chloronerva-Pflanzen akkumulieren große Mengen an Eisen und anderen Metallen. Das chloronerva-Gen kartiert auf Chromosom 1 der Tomate (Ling et al. Mol. Gen. Genet 1996).
Die molekulare Isolation des chloronerva-Gens erfolgte über einen markergestützten Klonierungsansatz (Tanksley et al. Trends in Genet. 1995). Hierzu wurden ausgehend von zwei flankierenden genetischen Markern (CT67 und CT267) künstliche Hefechromosomen (YACs) mit Tomaten-DNS isoliert. Die Kartierung der Enden dieser Hefechromosomen zeigte, daß zwei YAC-Enden das chloronerva-Gen jeweils durch ein Rekom­ binationsereignis getrennt, flankieren. Ausgehend von diesen flankierenden YAC-Enden wurde ein Kosmidkontig in einem pflanzlichen Transformationsvektor erstellt, welcher die Region zwischen diesen beiden YAC-Enden und damit auch das chloronerva-Gen enthält. Die einzelnen Kosmide wurden in die chloronerva-Mutante transformiert und es konnten Kosmidklone identifiziert werden, welche die Mutante komplementieren. Die komplementierten Pflanzen zeichnen sich durch einen Wildtyp- Phänotyp und eine regulierte Eisenaufnahme aus. Mit den komplementierenden Kosmiden wurde eine cDNS-Bank aus Tomatenblättern gescreent und es konnte ein Transkript identifiziert werden, welches mit dem chloronerva-Gen kosegregiert. Daß es sich bei diesem Gen um das chloronerva- Gen handelt, zeigt die Detektion eines Aminosäureaustausches in der Mutante (In Aminosäureposition 238, Phenylalanin in Serin) im Vergleich zum Wildtyp. Die vollständige Sequenzanalyse des Genes hat gezeigt, daß das Gen keine Introns enthält und es sich bei dem Gen um das Homolog der Nicotianamin-Synthase der Gerste handelt, wie sie in dieser Patentanmeldung enthalten ist.

Claims (14)

1. DNA-Sequenzen, kodierend Nicotianamin-Synthasen.
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, kodierend Nicotianamin- Synthase aus Gerste, gekennzeichnet durch folgende Sequenz:
sowie Fragmente, Mutanten und Varianten dieser Sequenz.
3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, kodierend Nicotianamin- Synthase aus Tomate, gekennzeichnet durch folgende Sequenz:
sowie Fragmente, Mutanten und Varianten dieser Sequenz.
4. Nicotianamin-Synthasen.
5. Nicotianamin-Synthase nach Anspruch 4 aus Gerste, gekennzeichnet durch folgende Aminosäuresequenz:
sowie Fragmente, Varianten und Mutanten dieser Sequenz.
6. Nicotianamin-Synthase nach Anspruch 4 aus Tomate, gekennzeichnet durch folgende Aminosäuresequenz:
sowie Fragmente, Varianten und Mutanten dieser Sequenz.
7. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1-3 oder gegen diese gerichteter Antisense-Oligonukleotide zur Beeinflussung des Nicotianamin-Synthase-Gehalts in Pflanzen.
8. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 und 2 oder gegen diese gerichteter Antisense-Oligonukleotide zur Beeinflussung des Nicotianamin-Synthase-Gehalts in monokotylen Pflanzen.
9. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 und 3 oder gegen diese gerichteter Antisense-Oligonukleotide zur Beeinflussung des Nicotianamin-Synthase-Gehalts in dikotylen Pflanzen.
10. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1-3 zum Aufbau von Vektoren zur Transfektion von Pflanzen.
11. Verwendung der Aminosäure-Sequenzen nach Anspruch 4-6 zum Herbizidtargeting.
12. Transgene Pflanzen, enthaltend DNA-Sequenzen, die Nicotianamin-Synthase kodieren.
13. Transgene Pflanzen, enthaltend DNA-Sequenzen, die Antisense-Sequenzen gegen die Sequenzen nach Anspruch 1-3 enthalten.
14. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1-3 zur mikrobiellen Nicotianamin-Produktion, dadurch gekennzeichnet, daß Vektoren aufgebaut werden, die diese Sequenzen enthalten, ein Transfer in Mikroorganismen wie E. coli erfolgt und diese Mikroorganismen nachfolgend kultiviert werden.
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