CN1195700A - 烟酰胺转氨酶及其基因 - Google Patents

烟酰胺转氨酶及其基因 Download PDF

Info

Publication number
CN1195700A
CN1195700A CN98107070A CN98107070A CN1195700A CN 1195700 A CN1195700 A CN 1195700A CN 98107070 A CN98107070 A CN 98107070A CN 98107070 A CN98107070 A CN 98107070A CN 1195700 A CN1195700 A CN 1195700A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
niacinamide
host cell
definition
aminotransferase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN98107070A
Other languages
English (en)
Inventor
森敏
中西启仁
高桥美智子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Co Ltd filed Critical Sumitomo Chemical Co Ltd
Publication of CN1195700A publication Critical patent/CN1195700A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

提供了一种蛋白,其具有由SEQIDNO:1或2所代表的氨基酸序列或含有具有单个或多个氨基酸缺失、替代或添加的所述氨基酸序列并具有烟酰胺转氨酶活性的氨基酸序列,一种编码所述蛋白的基因以及其用于增强吸收土壤中不溶性铁的能力和用于提高对铁缺乏的抗性。

Description

烟酰胺转氨酶及其基因
本发明涉及烟酰胺(nicotianamine)转氨酶、其基因及其利用。
在干燥地面的钙化土壤、盐沉积土壤约占世界土壤的30％，包括中国、中东及近东国家、中部及北部非洲、中部及西部美洲等。在该土壤中，由于高PH值，土壤中的铁是不溶解的。植物不能在该土壤中生长，由于缺铁而形成缺绿病，除非其可通过任何方法从根部吸收可溶形式的铁。当需要农业及环境绿化时，对付土壤中可溶性铁的缺乏的措施将是一个重要的问题。
作为通过农业技术解决植物缺铁的措施，可考虑(1)通过加入硫而校正碱性土壤的PH至中性或微酸性，(2)应用含有螯合铁的物质或(3)通过增强土壤微生物活性而增加土壤中可溶性铁，例如，通过应用无机物质的方法，因而增加微生物的含铁细胞(铁运输体)。
然而，用于通过土壤处理而提供铁的这些方法不总是令人满意的，因为存在这样的问题，例如，需要大量的应用材料，其效果依据应用的方法很不稳定，该方法包括应用时间、应用地点、浓度、扩散剂(spreader)种类等以及天气条件。因此，已要求开发新的技术。
在这些条件下，本发明者进行了深入的研究并发现了一种新基因，其适用于增强对土壤中不溶性铁的吸收能力并提高对铁缺乏的抗性且因此完成了本发明。
因此，本发明提供：
(1)一种蛋白，其包括由SEQ ID NO：1或2所代表的氨基酸序列或具有单个或多个氨基酸缺失、替代或添加的氨基酸序列并具有烟酰胺转氨酶活性的氨基酸序列(以下称为本发明蛋白)，
(2)编码在前面第1项中定义蛋白的基因(以下称为本发明基因)，
(3)具有编码SEQ ID NO：1或2所代表的氨基酸序列的核苷酸序列根据前面第2项的基因，
(4)具有由SEQ ID NO：3或4所代表的核苷酸序列根据前面第3项的基因，
(5)包括根据前面第2项基因的质粒(以下称为本发明质粒)，
(6)一种表达质粒，包括(1)能够在宿主细胞中起作用的启动子，(2)根据前面第2项的基因和(3)能够在宿主细胞中起作用的终止子，以上述的顺序可操作地(operably)连接(以下称为本发明表达质粒)，
(7)用于构建表达质粒的方法，其包括结合(1)能够在宿主细胞中起作用的启动子，(2)根据前面第2项的基因和(3)能够在宿主细胞中起作用的终止子，以上述顺序可操作地连接(以下称为本发明构建方法)，
(8)包括带有在前面第5项或第6项中定义质粒的宿主细胞的转化子，
(9)根据前面第8次的转化子，其中的宿主是微生物。
(10)根据前面第8项的转化子，其中的宿主细胞是植物细胞，
(11)用于增强宿主细胞铁吸收能力的方法，其包括向宿主细胞中导入通过结合以下内容而形成的表达质粒(1)能够在宿主细胞中起作用的启动子，(2)烟酰胺转氨酶基因和(3)能够在宿主细胞中起作用的终止子，以上述顺序可操作地连接和转化和所述的宿主细胞，
(12)根据前面第11项的方法，其中的宿主细胞为植物细胞；
(13)根据前面第12项的方法，其中的烟酰转氨酶基因为前面第2项中定义的基因。
(14)具有根据前面第2、3或4项基因部分序列的基因片段(以下称为本发明基因片段)，
(15)根据前面第14项的基因片段，其中的碱基数目为15或更多和50或更少，
(16)根据前面第14项的基因片段，具有由SEQ ID NO：5所代表的核苷酸序列。
(17)用于检测烟酰胺转氨酶基因的方法，其包括用根据前面第14、15或16项的基因片段通过应用杂交方法从植物基因片段中检测烟酰胺转氨酶基因，其具有编码有烟酰胺转氨酶活性酶氨基酸序列的核苷酸序列，或者该转氨酶的基因片段(以下称为用于本发明的检测方法)，
(18)用于扩增烟酰胺转氨酶基因的方法，其包括用在前面第14、15或16项中定义的基因片段作为引物从植物基因片段中通过应用PCR(聚合酶链式反应)扩增具有编码有烟酰胺转氨酶活性酶氨基酸序列的核苷酸序列的烟酰胺转氨酶基因或其基因片段(以下称为用于本发明的扩增方法)，
(19)用于获得烟酰胺转氨酶基因的方法，其包括通过在前面第17项或18项中定义的方法鉴定烟酰胺转氨酶基因或其基因片段，并且分离和纯化鉴定的基因或其基因片段，和
(20)通过在前面第19项中定义的方法而获得的烟酰胺转氨酶基因。发明详述
本发明将在下面加以更为详细的描述。
本发明蛋白包括由SEQ ID NO：1或2所代表的氨基酸序列或这样的氨基酸序列，即含有具有单个或多个氨基酸缺失、替代或添加的氨基酸序列并具有烟酰胺转氨酶活性。
这样蛋白可通过例如，下述的方法从禾本科(Gramineae)植物，例如，大麦(Hordeum vulgare)中制备。
本发明蛋白的实例包括SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列或具有47KDa分子量包括从SEQ ID NO：1的NO：33氨基酸开始的429个氨基酸的氨基酸序列。
烟酰胺转氨酶活性以下指从烟酰胺转移氨基至2-酮戊二酸(2-oxoglutarate)上的能力。
烟酰胺转氨酶活性可通过，例如，在kanazawa，K等，实验植物学杂志，45，1903-1906(1994)及其文献中描述的方法加以测定。具体地，将底物烟酰胺、2-酮戊二酸(2-oxoglutaric acid)和作为辅酶的磷酸吡哆醛加入到酶溶液中且混和物在250℃反应30分钟。反应以后，通过加入NaBH3还原反应产物且通过HPLC测定deoxymugineic acid。
为了从禾本科(Gramineae)植物如大麦(Hordeum Vulgare)等制备本发明蛋白，例如，将被处理用于铁缺乏的禾本科(Gramineae)植物如大麦的整个根进行粉碎并且通过将获得的提取物进行疏水相互作用层析、吸附层析、阴离子交换层析、凝胶过滤及第二次吸附层以该顺序用活性作为指标部分纯化本发明蛋白。将从第二次吸收层析获得的单个蛋白馏份进行双向电泳并且按每个馏份的烟酰胺转氨酶活性的强度进行取舍而检测出蛋白点。该检测出的蛋白点表示本发明的蛋白。本发明蛋白可通过从双向电泳胶中分离加以纯化。
通过由本发明蛋白催化的反应及随后的反应制备的mugineic acid类似物如deoxymugineic acid，通过进一步随后的羟化反应等而制备3’-hydroxymugineic acid通过与土壤中不溶性铁形成螯合复合物而溶解铁。有些种类的植物可生物合成所述的mugineic acid类似物，它们从根部分泌至生根区(rooting zone)的土壤中，从而以mugineic acid复合物的形式溶解不溶性铁并经根部直接吸收铁复合物。因此，通过在所述植物中适当表达大量本发明的蛋白增强mugineic acid类似物产量并增加吸收不溶性铁的能力是可能的。
本发明的基因编码包括由SEQ ID NO：1或2所代表的氨基酸序列或含有具单个或多个氨基酸缺失、替代或添加并具有烟酰胺转氨酶活性所述氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白。
这种基因可以禾本科(Gramineae)植物，例如，大麦(Hordeum vulgare)等通过，例如，下述的方法加以制备。
此外，本发明基因包括编码包括由SEQ ID NO：1或2所代表的氨基酸序列或含有具有单个或多个氨基酸缺失、替代或添加并具有烟酰胺转氨酶活性所述氨基酸序列的氨基酸序列蛋白的基因并且包括，例如，在严格条件下与所述基因序列杂交的基因。这里严格的条件指，例如，在筛选实施例4中所述的cDNA文库中所用的条件。
该基因核苷酸序列的具体实施包括由SEQ ID NO：3(CDS位置为62-1444)或SEQ ID NO：4(CDS位置为76-1731)所代表的核苷酸序列。
通过将本发明基因导入利用mugineic acid化合物吸收铁的植物中而增强获得的转化子植物中mugineic acid化合物的生物合成能力从而增加吸收生根区土壤中不溶性铁的能力并增强对缺铁的抵抗力是可能的。
为了制备本发明基因，例如，通过蛋白测序仪测定通过部分水解本发明蛋白而获得肽段的氨基酸序列和本发明蛋白的N-末端氨基酸序列。合成包括从这些氨基酸序列中推断的DNA序列的两条或更多条引物。用从被处理用于铁缺乏的禾本科(Gramineae)植物如大麦的根部制备的mRNA通过反转录酶方法而合成的cDNA作为模板进行PCR，扩增出本发明基因的cDNA片段。用扩增的该cDNA片段作为探针，完成下述cDNA文库的筛选。从被处理用于铁缺乏的禾本科(Gramineae)植物如大麦的根部制备的mRNA通过反转录酶方法合成cDNA且将其整合到噬菌体载体如λZAPII等或质粒载体如pUC等中以制备cDNA文库。用上面提到的探针筛选该文库且筛选出烟酰胺转氨酶基因的cDNA。可通过测定筛选出cDNA的序列来证实该筛选出的cDNA就是烟酰胺转氨酶基因的cDNA(本发明基因的cDNA)。
为了用筛选出的cDNA用这种方式获得基因组DNA并测定其序列，例如，将植物组织如叶、茎、根等立即冰冻并以杵臼或Waring混合器充分粉碎。根据Itaru Watanase(主持(supervisor))、Masahiro Sugiura(编)，在“克隆和测序(植物生物技术实验手册)”，Nosonbunka-sha，东京(1989)等中描述的常规方法从获得的粉碎产物中提取基因组DNA。将获得的基因组DNA以适当的限制酶消化并将获得的基因组DNA片段通过已知的方法如蔗糖密度梯度离心或氯化铯平衡离心等进行分离。将每种基因组DNA片段部分用筛选出的cDNA(本发明基因的cDNA)作为探针进行常规的southern杂交以测定含有所需基因的基因组DNA片段部分。
通过将该基因组DNA片段部分连接到商业上可得到的载体如质粒、噬菌体、粘粒等上而制备基因组DNA文库。用本发明基因的cDNA作为探针通过杂交将文库进行常规的筛选以获得含有编码本发明蛋白氨基酸序列核苷酸序列的基因组DNA克隆。可将获得的DNA克隆亚克隆到适于用于基因序列分析的载体，例如，质粒等上并根据常规方法分析该序列以测定含有编码本发明蛋白氨基酸序列的序列的基因组DNA序列。
可通过在Bina-Stem，Met等.，美国自然科学院院报，76，731(1979)，Sollner-Webb和Reader，R.H.，细胞，18，485(1979)，等中描述的引物延伸方法或在Berk，A.J.和sharp，P.A.，美国自然科学院院报，75，1274(1978)中描述的S1作图法测定本发明基因的基因组DNA转录起始位点。用该方式测定出转录起始所必需的TATA序列位于转录起始位点的上游。控制基因表达的启动子序列存在于通常该转录起始位点上游的1kb到约10kb处。本发明基因启动子区域可最终通过，例如，以下方法加以测定，包括将具有不同长度启动子区域的基因片段与报告基因如GUS等连接，制备将连接产物导入其中的转基因植物，并研究在制备植物的不同组织中报告基因的表达与否。
另一方面，终止子序列存在于相应于polyA序列的基因组DNA区域，通常位于poly(A)额外信号(连续序列为AATAAA)的下游，存在于终止子下游的末端3’-非翻译区，且具有有效的翻译终止功能。
本发明的质粒含有编码包括以下氨基酸序列蛋白的基因，即由SEQ IDNO：1或2所代表的氨基酸序列或含有具有单个或多个氨基酸缺失、替代或添加的氨基酸序列并具有烟酰胺转氨酶活性的氨基酸序列。
质粒优选的具体实例包括通过将具有编码由SEQ ID NO：1所代表的氨基酸序列核苷酸序列的烟酰胺转氨酶基因克隆λpSK-(strategene)而制备的质粒。该质粒具有其载体部分小的特征，在大肠杆菌中有很多拷贝，因此其适于用于DNA制备或DNA结构分析。
本发明表达质粒可通过结合以下部分加以构建，包括(1)能够在宿主细胞中起作用的启动子，(2)编码包括由SEQ ID NO：1或2所代表的氨基酸序列或含有具有单个或多个氨基酸缺失、替代或添加的所述氨基酸序列，并具有烟酰胺转氨酶活性的氨基酸序列蛋白的基因和(3)能够在宿主细胞中起作用的终止子，以上述的顺序可操作地连接。
这里以下所用的术语“可操作地连接”意思为，当将构建的质粒导入宿主细胞以将其转化时，本发明的基因在启动子的控制下加以整合从而使该基因在所述的宿主细胞中具有表达本发明蛋白的功能。
能够在宿主细胞中起作用的启动子包括，例如，大肠杆菌乳糖操纵子启动子、酵母乙醇脱氢酶(ADH)启动子、腺病毒主要晚期(Ad.ML)启动子、SV40早期启动子、杆状病毒启动子等。当宿主细胞是植物细胞时，启动子包括，例如，源自T-DNA的组成型启动子如胭脂氨酸(nopaline)合酶基因(NOS)启动了、章鱼碱合酶基因(OCS)启动子等，源自植物病毒的启动子如源自花椰菜花叶病毒(CaMV)的19S和35S启动子等，以及可诱导型启动子如苯丙氨酸脱氨酶(ammonialyas)(PAL)基因启动子、查耳酮合酶(CHS)基因启动子，病原体相关(PR)基因启动子等。此外，还包括不限于它们当中的已知植物启动子。
能够在宿主细胞中起作用的终止子包括，例如，酵母HIS终止子序列、ADH1终止子、SV40早期剪切区等。当宿主细胞为植物细胞时，终止子包括，例如，源自T-DNA的组成型启动子如胭脂氨酸合酶基因(NOS)终止子等，源自植物病毒的终止子如大蒜病毒GV1、GV2终止子等。此外，还包括不限于它们当中的已知植物终止子。
通过将这种质粒(本发明(表达)质粒)导入所述的宿主细胞而转化宿主细胞。当宿主细胞为植物细胞时，通过任何一种常规方法如农杆菌(Agrobacterium)感染方法(JP-B-2-58917和JP-A-60-70080)、向原生质球的电穿孔方法(JP-A-60-251887和JP-A-5-68575)、粒子枪方法(JP-A-508316和JP-A-63-258525)等将本发明的(表达)质粒导入植物细胞，并且转化的植物细胞可筛选其中导入有本发明基因的植物细胞而获得。根据常规的植物细胞培养方法，例如，在Hirohumi Utimiya，植物基因操作手册(制备转基因植物方法)，Kodansha Scientific出版(ISBN4-06-153515-7C3045)，1990，27-55页中描述的方法，通过再生植物体而获得转化的植物体。
通过将本发明质粒导入是任何一种如大肠杆菌等微生物的宿主细胞并允许在所述的宿主细胞中高度表达，大量本发明的蛋白可容易地从宿主细胞中得到分离。通过利用大批量制备的本发明蛋白而建立烟酰胺转氨酶抑制剂的筛选系统。例如，根据上述的用于测定烟酰胺转氨酶活性的方法，加入底物烟酰胺、2-酮戊二酸和作为辅酶的磷酸吡哆醛以及该选抑制剂化合物以制备酶溶液，并将混合物在25℃反应30分钟。反应后，通过以加入NaBH3和deoxymugineic acid的还原反应应用HPLC筛选出没有表现出烟酰转氨酶活性的化合物。
在利用mugineic acid化合物吸收铁的植物中，烟酰胺转氨酶基因的表达在铁缺乏条件下被强烈诱导。由于普通的土壤(地表土壤)处于氧化的条件下且土壤溶液中的铁浓度仅为高度低于植物所需104-10-8M的水平，烟酰胺转氯酶基因和mugineic acid生物合成基因总是被强烈地诱导。换句话说，植物通过常规地生物合成muginerc acid化合物并从根部将它们分泌至生根区中的土壤里而主动地吸收不溶性铁。
通过筛选系统筛选出的烟酰胺转氨酶活性抑制剂可以是用作抗通过利用类似于mugineic acid的化物吸收铁植物选择性除草剂的化合物。
此外，本发明提供了用于增强铁吸收能力的方法，包括将通过结合以下内容而形成的表达质粒导入宿主细胞，包括(1)能够在宿主细胞中起作用的启动子，(2)烟酰胺转氨酶基因和(3)能够在宿主细胞中起作用的终止子，以上述的顺序可操作地连接并转化所述的宿主细胞。能够在宿主细胞中起作用的启动子包括上述的启动子。
烟酰胺转氨酶基因包括，例如，源自植物的烟酰胺转氨酶基因和优选为本发明基因。
能够在宿主细胞中起作用的终止子包括上述的终止子。
本发明的基因片段指具有SEQ ID NO’3或4所代表的本发明基因部分序列的基因片段并且包括具有编码包括由SEQ ID NO：1或2所代表的氨基酸序列或含有具有单个或多个氨基酸缺失、替代或添加的所述氨基酸序列，并具有烟酰胺转氨酶活性的氨基酸序列蛋白基因部分序列的基因片段，具体地，例如，由SEQ ID NO：5所代表的基因片段。
这些基因片段用作杂交中的探针或PCR中的引物。特别地，作为用于PCR中的引物，具有15个或更多和50个或更少核苷酸的基因片段是优选的。
本发明的检测方法为这样的一种方法，即用本发明基因片段作为探针通过应用杂交方法从植物基因片段中检测具有编码具有烟酰胺转氨酶活性酶氨基酸序列核苷酸序列的烟酰胺转氨酶基因或其基因片段。
具体地，例如，该方法可根据在“分子克隆：实验指南，第2版”(1989)，冷泉港实验室出版社或“当前分子生物学方法”(1987)，John wiley & Sons，公司.，ISBN471-50338-X中描述的方法加以完成。用于这里的基因片段可包括，例如，靶植物的cDNA文库、基因组DNA文库等。所述的植物基因片段可以是源自植物的那些商业上可得到的文库，或也可以是根据在“分子克隆：实验指南，第2版”(1989)，冷泉港实验室出版社或在“当前分子生物学方法”(1987)，John Wiley & Sons，公司，ISBNO-471-50338-X中描述的制备文库的常规方法而制备的文库。
通过根据本发明检测方法鉴定烟酰胺转氨酶基因或其基因片段并且分离/纯化鉴定的基因或基因片段来获得烟酰胺转氨酶基因也是可能的。
本发明检测方法可用于植物分析中。具体地，根据在Itaru Watanabe(主编)，Masahiro Sugiura(编)，“克隆和测序(植物生物技术实验指南)”，Nosonbunka-sha，东京(1989)等中描述的常规方法而用于本发明的检测方法从特异植物种类的不同栽培品种中制备植物基因组DNA。然后以至少几种合适的限制酶将其切割，电泳并通过常规方法通过印迹而用于制备滤膜。
用通过常规方法制备的探针且利用基于DNA片段长度差异的不同栽培品种之间伴随以mugineic acid生物合成的表型特征差异在滤膜上进行杂交。此外，当特定的植物与非重组植物相比时如果该植物较非重组基因植物具有更多检测到的杂交带，则判定该植物为重组基因植物。此方法优选根据在koshimamoto和Takuji sasaki(主编)，“植物PCR实验方法，”shujunsha，东京(1995)，ISBN4-87962-144-7，90-94页中描述的PFLP(限制性片段长度多态性)方法完成。
用于本发明的扩增方法为这样的方法，即用本发明基因片段作为引物通过应用PCR(聚合酶链式反应)从植物基因片段中扩增具有编码具有烟酰胺转氨酶活性酶氨基酸序列的核苷酸序列的烟酰胺转氨酶基因或其基因片段。具体地，例如，该方法可根据在ko shimamoto和Takuji sasaki(主编)，“植物PCR实验方法”，shujunsha，东京(1995)，ISBN4-87962-144-7等中描述的方法加以完成。
通过根据用于本发明的扩增方法鉴定烟酰胺转氨酶基因或其基因片段并且分离/纯化鉴定出的基因或基因片段来获得烟酰胺转氨酶基因也是可能的。
此外，用于本发明的扩增方法可用于植物分析中。具体地，例如，用从特定植物中制备的植物基因组DNA作为模板且用本发明的基因片段作为引物通过进行PCR而扩增本发明部分或全部的基因。将获得的PCR产物与甲醛溶液混合并通过于850℃加热5分钟将混合物变性，接着于冰上迅速冷却。将此样品于，例如，含0％或10％浓度甘油的6％丙烯酰胺凝上电泳。电泳用用于SSCP(单链构象多态性)的商业上可得到的电泳仪上进行，维持凝胶温度在，例如，5℃，25℃，37℃等。将迁移的凝胶用商业上可得到的试剂进行溴化乙锭染色等以检测DNA。
根据检测到DNA片段迁移的差异分析基于本发明基因突变不同栽培品种(cultivars)之间伴随muginelc acid生物合成的表型特征差异。此方法优选根据在ko shimamoto和Takuji sasaki(主编)，“植物PCR实验方法”，shujunsha，东京(1995)，ISBN4-87962-144-7，141-146页中所述的方法完成。
实施例
本发明现将根据实施例加以更为详细的描述，这些实施例不应该成为对本发明范围的限制。
实施例1(分离本发明蛋白的方法)
在提取缓冲液(0.2M Tris-HCl，10mM EDTA，0.1mM p-APMSF，10mMDTT，5％甘油，5％聚乙烯吡咯烷酮PH8)中有150g被处理用于铁缺乏的粉碎大麦根。将粉碎产物于8,000×g离心30分钟并且分离上清。向获得的上清中加入硫酸铵直至达到30％的饱和度。将制备的样品应用于以30％饱和硫酸铵缓冲液(50mM Tris-HCl(PH8.0)，5mM EDTA，10mM DTT)平衡的ButylToyopearl(TOSO生产)，并且经前面的缓冲液冲洗后以15％饱和度的硫酸铵缓冲液洗脱。向洗脱的馏份中加入p-APMSF至终浓度0.1mM并将混合物于0.1mM KCl，50mM KH2PO4/K2HPO4(PH6.8)，10mM DTT中透析过夜，接着应用于以所述缓冲液平衡的羟磷灰石(100-350网眼，Nakarai生产)。然后将其以相同的缓冲液冲洗并以0.5M KH2PO4/K2HPO4(PH6.8)，10mM DTT洗脱。为了以20mM Tris-HCl(PH8.0)10mM KCl，10mM DTT交换缓冲液将洗脱馏份以Molecut(Miuipore，区别分子量10,000)处理并应用于以相同缓冲液平衡的DEAE Sephasel(发玛西亚生产)。以相同的缓冲液冲洗以后，将其以10mM-500mMKCl的浓度梯度洗脱。为了以20mM Tris-HCl(PH8.0)、10mMKCl、5mME DTA、1mM DTT改变缓冲液，将未被DEAE Sephasel吸附的馏份以Molcut处理并应用于NA-Sepharose 4B，它是具有结合烟酰胺(NA)的EAH-Sepharose 4B(发玛西亚生产)。以相同的缓冲液冲洗后，将其以1mM NA、10mM KCl、20mM Tris-HCl(PH6.0)洗脱。将洗脱的馏份进行双向电泳，与应用于NA-Sepharose 4B柱之前的样品相比得到了很浓的位点。该位点表示通过分离所述位点而分离的本发明蛋白。
通过蛋白测序仪(应用生物系统生产)分析这样分离的本发明蛋白的N-末端氨基酸序列。显示的结果表示由SEQ ID NO：1中NO：33到47氨基酸所示的氨基酸序列。此外，用相同的方式分析通过以含1％溴化氰(bromocyan)的70％甲酸溶液处理而形成的3肽段N-末端氨基酸序列。
实施例2(用于克隆本发明蛋白cDNA探针的制备)
根据在Itaru Watanabe(主编)、Masahiro Sugiura(编)、“克隆和测序(植物生物技术实验手册)”，Nosonbunka-sha，东京(1989)，34-40页中描述的SDS-酚方法从6g被处理用于铁缺乏的大麦根中回收255μg总RNA。从回收的总RNA中，取出75μg部分并且用于用Dynabeads mRNA纯化试剂盒(由Dynal生产)制备poly(A)+RNA。用dT17衔接子引物(5’-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)反转录制备的poly(A)+RNA以制备cDNA。将部分制备的cDNA用于通过两步PCR扩增本发明基因的cDNA片段。在第一步反应中，用根据本发明蛋白的N-末端氨基酸序列合成的引物1(5’GCIGTIGARTGGAAYTTYGCIMG-3’)和上述的dT17衔接子引物且用获得的cDNA为模板于94℃(40秒)、40℃(1分钟)、及72℃(2分钟)重复25个循环，并且在94℃(40秒)、45℃(1分钟)及72℃(2分钟)重复25个循环进行PCR。用此PCR反应溶液作为模板，用根据通过以上述的含1％溴化氰(bromocyan)的70％甲酸(formic acid)溶液处理形成的肽段N-末端氨基酸而合成的引物2(5’-GCDATRTGICCRAAIACICC-3’)和引物1于94℃(40秒)、45℃(1分钟)、及72℃(2分钟)重复40个循环进行第二步PCR。通过从0.8％的琼脂糖电泳凝胶中切除而纯化通过第二步PCR而扩增的约600bp的DNA片段并用作筛选cDNA文库的探针。
实施例3(从被处理用于铁缺乏的大麦根中制备cDNA文库)
用商业上可得到的cDNA合成试剂盒(由Gibco BRL生产的用于cDNA合成和质粒克隆的Super Script(商标)质粒系统)，从5μg从实施例2中描述的被处理用于铁缺乏的大麦根中制备的poly(A)+RNA中合成cDNA。将该产物与SalI衔接子连接并以NOtI切割以回收cDNA.
通过在R.Daniel Gietz和Akco Sugino，基因，74(1988)，527-534页中描述的酵母多拷贝质粒YEplac181中添加一些修饰制备用于cDNA文库的载体(以后称为pYH23)。具体地，去除了YEplac181多克隆位点中HindIII和BamHI到EcoRI位点。此外，将源自pTV-100乙醇脱氢酶的启动子和终止子序列亚克隆于SphI位点，并将NotI接头插入此片段的BamHI位点。
将以这种方式制备的pYH23以NotI和XhOI消化，插入按上面制备的cDNA以后，转化大肠杆菌XLI-Blue菌株以提供获自300,000个独立菌落的cDNA文库。
实施例4(本发明cDNA克隆的筛选)
以商业上可得到的放射性标记试剂盒(随机引物DNA标记试剂2版，TaKaRa)放射性标记在实施例3中制备的探针而制备用于本发明蛋白cDNA克隆的探针DNA。将具有在实施例3中制备的源自被处理用于铁缺乏大麦根部cDNA文库质粒DNA的大肠杆菌接种于LB培养基，于37℃孵育10小时，且然后转移到商业上可得到的尼龙膜(Hybond(商标)-N+，Amersham生命科学)。将此膜以10％的SDS处理3分钟，碱变性溶性(0.5M NaOH，1.5M NaCl)5分钟，中和溶液(0.5M Tris-HCl(PH7.0)，1.5M NaCl)3分钟，2×SSPE(20mM磷酸缓冲液(PH7.4)，0.3M NaCl，5mM EDTA)2次3分钟，并且以紫外线照射3分钟以不可逆地将DNA固定于膜上。预杂交用预杂交液(5×Denhart’s溶液，5×SSPE，0.1％SDS，100μg/ml变性鲑精DNA)于65℃预杂交1小时。然后，在具有加入到杂交液(5×Denhart’s溶液，5×SSPE，0.1％SDS)中放射性标记的探针的溶液中于65℃杂交12小时。之后，以6×SSP于65℃洗膜10分钟一次，以2×SSP、0.1％SDS于42℃洗膜10分钟二次，且暴露于富士医学X-线胶卷以检测阳性菌落。用相同的方式进行第二轮和第三轮筛选并且分离本发明蛋白的cDNA克隆。
实施例5(编码本发明蛋白cDNA核苷酸序列的测定)
根据在J.Sambrook，E.F.Fritsh，T.Maniatis，“分子克隆，第2版”冷泉港出版社(1989)中描述的常规方法将在实施例4中分离的本发明蛋白的cDNA克隆亚克隆人质粒载体pBluescnrpt SK(-)以得到质粒cDNA克隆。所述cDNA克隆中插入子的核苷酸序列(SEQ ID NO：3和4)通过以下方法加以测定，包括(1)用Tag Dye引物循环测序试剂盒(应用生物系统生产)通过应用系统生产的373A DNA测序仪，(2)用热序列荧光标记引物循环试剂盒(Amersham生命科学生产)通过DSQ-1000L DNA测序仪(shimadzu生产)，或(3)用BcaBEST(标标)双脱氧测序试剂盒(TaKaRa生产)通过BAS-2000(富士胶卷生产)。从该序列(见SEQ ID NO：3和4)测定蛋白的总氨基酸序列(见SEQ ID NO：1和2)。SEQ ID NO：1的蛋白具有461个氨基酸并且其分子量计算为49564.15，并且SEQ ID NO：1的蛋白具有551个氨基酸并且其分子量计算为58148.62。根据本发明，提供新的烟酰胺转氨酶及其基因等是可能的。

Claims (20)

1.一种蛋白质，包括由SEQ ID NO：1或2所代表的氨基酸序列或含有具有单个或多个氨基酸缺失、替代或添加的所述氨基酸序列并具有烟酰胺转氨酶活性的氨基酸序列。
2.一种基因，编码在权利要求1中定义的蛋白质。
3.根据权利要求2的基因，其具有编码由SEQ ID NO：1或2所代表氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根据权利要求3的基因，其具有由SEQ ID NO：3或4所代表的核苷酸序列。
5.一种质粒，包括在权利要求2中定义的基因。
6.一种表达质粒，包括：
(1)能够在宿主细胞中起作用的启动子，
(2)在权利要求2中定义的基因和
(3)能够在宿主细胞中起作用的终止子，以上述的顺序可操作地连接。
7.用于构建表达质粒的方法，其包括结合：
(1)能够在宿主细胞中起作用的启动子，
(2)在权利要求2中定义的基因和
(3)能够在宿主细胞中起作用的终止子，以上述的顺序可操作地连接。
8.一种转化子，包括带有在权利要求5或6中定义的质粒的宿主细胞。
9.根据权利要求8的转化子，其中的宿主是微生物。
10.根据权利要求8的转化子，其中的宿主细胞是植物细胞。
11用于增强宿主细胞铁吸收能力的方法，其包括将通过结合以下成份而形成的表达质粒导入宿主细胞(1)能够在宿主细胞中起作用的启动子，(2)烟酰胺转氨酶基因和(3)能够在宿主细胞中起作用的终止子，按上述的顺序可操作地连接并转化所述的宿主细胞。
12.根据权利要求11的方法，其中的宿主细胞为植物细胞。
13.根据权利要求12的方法，其中的烟酰胺转氨酶基因为在权利要求2中定义的基因。
14.一种基因片段，具有在权利要求2、3或4中定义基因的部分序列的。
15.根据权利要求14的基因片段，其中的碱基数目为15或更多和50或更少。
16.根据权利要求14的基因片段，其具有由SEQ ID NO：5所代表的核苷酸序列。
17.用于检测烟酰胺转氨酶基因的方法，包括从植物基因片段中检测含有编码具有烟胺转氨酶活性酶氨基酸序列核苷酸序列的烟酰胺转氨酶基因或通过用在权利要求14、15或16中定义的基因片段应用杂交方法检测其基因片段。
18.用于扩增烟酰胺转氨酶基因的方法，包括用在权利要求14、15或16中定义的基因片段作为引物，通过PCR(聚合酶链式反应)从植物基因片段中，扩增含有编码具有烟酰胺转氨酶活性酶氨基酸序列核苷酸序列的烟酰胺转氨酶基因或其基因片段。
19.用于获得烟酰胺转氨酶基因的方法，包括通过在权利要求17或18中定义的方法鉴定烟酰胺转氨酶基因或其基因片段，并且分离和纯化鉴定的基因或其基因片段。
20.通过在权利要求19中定义的方法获得的烟酰胺转氨酶基因。
CN98107070A 1997-02-21 1998-02-21 烟酰胺转氨酶及其基因 Pending CN1195700A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP37499/97 1997-02-21
JP3749997 1997-02-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1195700A true CN1195700A (zh) 1998-10-14

Family

ID=12499226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN98107070A Pending CN1195700A (zh) 1997-02-21 1998-02-21 烟酰胺转氨酶及其基因

Country Status (5)

Country Link
US (2) US6897300B1 (zh)
EP (1) EP0860499B1 (zh)
CN (1) CN1195700A (zh)
CA (1) CA2224130C (zh)
DE (1) DE69825510T2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101143011B (zh) * 2007-10-09 2011-06-22 浙江大学 提高食物中铁素生物有效性的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4084502B2 (ja) 1999-07-05 2008-04-30 独立行政法人科学技術振興機構 鉄欠乏耐性イネの創製
KR20030084892A (ko) * 2001-03-23 2003-11-01 과학기술진흥사업단 데옥시뮤기네산 합성효소 및 그의 유전자
JP4998809B2 (ja) * 2007-04-26 2012-08-15 独立行政法人科学技術振興機構 植物の鉄欠乏耐性を向上させるポリペプチドおよびその利用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101143011B (zh) * 2007-10-09 2011-06-22 浙江大学 提高食物中铁素生物有效性的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2224130A1 (en) 1998-08-21
US20050095689A1 (en) 2005-05-05
CA2224130C (en) 2009-05-19
EP0860499A3 (en) 1998-11-04
US6897300B1 (en) 2005-05-24
DE69825510D1 (de) 2004-09-16
EP0860499A2 (en) 1998-08-26
EP0860499B1 (en) 2004-08-11
US7288397B2 (en) 2007-10-30
DE69825510T2 (de) 2005-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kawalleck et al. Induction by fungal elicitor of S-adenosyl-L-methionine synthetase and S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase mRNAs in cultured cells and leaves of Petroselinum crispum.
Logemann et al. Gene activation by UV light, fungal elicitor or fungal infection in Petroselinum crispum is correlated with repression of cell cycle‐related genes
Low et al. Early salt stress effects on the differential expression of vacuolar H+-ATPase genes in roots and leaves of Mesembryanthemum crystallinum
Wang et al. Iron deficiency-mediated stress regulation of four subgroup Ib BHLH genes in Arabidopsis thaliana
Tsai et al. Dark‐induced and organ‐specific expression of two asparagine synthetase genes in Pisum sativum.
Ngernprasirtsiri et al. DNA methylation as a mechanism of transcriptional regulation in nonphotosynthetic plastids in plant cells.
US7695751B2 (en) Detoxifizyme with activity of transforming aflatoxin and the gene encodes thereof
Guo et al. Molecular cloning and expression of alfalfa (Medicago sativa L.) vestitone reductase, the penultimate enzyme in medicarpin biosynthesis
Elmlinger et al. Coaction of blue light and light absorbed by phytochrome in control of glutamine synthetase gene expression in Scots pine (Pinus sylvestris L.) seedlings
CN107119048B (zh) 桑假尾孢菌rDNA及其在桑假尾孢菌分子检测中的应用
JP2000513935A (ja) Ａａｔｔプロモーターエレメントおよび転写因子
CN1195700A (zh) 烟酰胺转氨酶及其基因
Hollung et al. Developmental, stress and ABA modulation of mRNA levels for bZip transcription factors and Vp1 in barley embryos and embryo-derived suspension cultures
US7232940B2 (en) Polynucleotide sequences from rice
Reddy et al. The auxin responsive gene Pp‐C61 is up‐regulated in Pinus pinaster roots following inoculation with ectomycorrhizal fungi
US7973222B1 (en) Method to confer formaldehyde-resistance to a plant, and a method to have a plant absorb enviromental formaldehyde
Redkar et al. Altered gene expression in Aspergillus nidulans in response to salt stress
CA2370132A1 (en) Auxin transport proteins
JP4055233B2 (ja) ニコチアナミンアミノ基転移酵素、その遺伝子およびその利用
US7094950B2 (en) Poly ADP-ribose polymerase gene and it uses
EP1051498A1 (en) Poly adp-ribose polymerase gene and its uses
Chye et al. A cDNA clone encoding Brassica calmodulin
de Lajudie et al. Plant gene expression during effective and ineffective nodule development of the tropical stem-nodulated legume Sesbania rostrata
Jarvis et al. Molecular Changes Associated with Dormancy-breakage in Douglas Fir Tree Seeds
CN114045294A (zh) 一种脂质转运蛋白基因及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication