JP2001029783A - 親和性固定化金属樹脂 - Google Patents
親和性固定化金属樹脂Info
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- JP2001029783A JP2001029783A JP19961299A JP19961299A JP2001029783A JP 2001029783 A JP2001029783 A JP 2001029783A JP 19961299 A JP19961299 A JP 19961299A JP 19961299 A JP19961299 A JP 19961299A JP 2001029783 A JP2001029783 A JP 2001029783A
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- metal
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 金属キレート・アフィニティー・クロマトグ
ラフィーに好適な新規キレート形成剤の提供。 【解決手段】 アフィニティー・クロマトグラフィーに
５化学基金属キレート形成剤（ＰＤＣ）樹脂が使用され
る。この樹脂は、５つの配位点を占有することによって
Ｃｕ２＋，Ｎｉ２＋，Ｚｎ２＋及びＣｏ２＋などの多価
金属イオンと八面体形状の錯体を形成することができ
る。従って、この樹脂からは、極めて安定な錯体が得ら
れ、１つの配位点が隣接のシステイン／ヒスチジン、特
に、タンパク質やペプチドなどのような生体分子を含む
ヒスチジンとの相互作用及び選択結合のために残され
る。Ｃｕ−ＰＤＣは、タンパク質溶液の体積を減少させ
る濃縮用樹脂として利用できる。また、水溶性カルボジ
イミドを使用して、すべてのタンパク質を共有固定化す
る万能支持体としても利用できる。
ラフィーに好適な新規キレート形成剤の提供。 【解決手段】 アフィニティー・クロマトグラフィーに
５化学基金属キレート形成剤（ＰＤＣ）樹脂が使用され
る。この樹脂は、５つの配位点を占有することによって
Ｃｕ２＋，Ｎｉ２＋，Ｚｎ２＋及びＣｏ２＋などの多価
金属イオンと八面体形状の錯体を形成することができ
る。従って、この樹脂からは、極めて安定な錯体が得ら
れ、１つの配位点が隣接のシステイン／ヒスチジン、特
に、タンパク質やペプチドなどのような生体分子を含む
ヒスチジンとの相互作用及び選択結合のために残され
る。Ｃｕ−ＰＤＣは、タンパク質溶液の体積を減少させ
る濃縮用樹脂として利用できる。また、水溶性カルボジ
イミドを使用して、すべてのタンパク質を共有固定化す
る万能支持体としても利用できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、新規の金属キレ
ート形成樹脂とその製法に係わる。
ート形成樹脂とその製法に係わる。
【０００２】
【従来の技術】Ｐｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．が提案した
親和性固定化金属樹脂（Ｎａｔｕｒｅ，２５８，５８９
（１９７５））を使用し、隣接ヒスチジン残基を含むタ
ンパク質の精製に利用される金属キレート・アフィニテ
ィー・クロマトグラフィー（Ｍｅｔａｌ Ｃｈｅｌａｔ
ｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ，ＭＣＡＣ）（固定化金属イオン・アフィニティー・
クロマトグラフィー（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｅｔ
ａｌ ｉｏｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ，ＩＭＡＣ）とも呼称される）は、今や天然
及び組換え６ｘヒスチジン標識（または無標識）タンパ
ク質及びペプチドを精製するための強力かつフレキシブ
ルな手段となっている。
親和性固定化金属樹脂（Ｎａｔｕｒｅ，２５８，５８９
（１９７５））を使用し、隣接ヒスチジン残基を含むタ
ンパク質の精製に利用される金属キレート・アフィニテ
ィー・クロマトグラフィー（Ｍｅｔａｌ Ｃｈｅｌａｔ
ｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ，ＭＣＡＣ）（固定化金属イオン・アフィニティー・
クロマトグラフィー（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｅｔ
ａｌ ｉｏｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ，ＩＭＡＣ）とも呼称される）は、今や天然
及び組換え６ｘヒスチジン標識（または無標識）タンパ
ク質及びペプチドを精製するための強力かつフレキシブ
ルな手段となっている。
【０００３】Ｐｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．が使用したリ
ガンドは、イミノジ酢酸（Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ
Ａｃｉｄ，ＩＤＡ）であった。電子常磁性共鳴及び吸
収スペクトルによる分析の結果、ＩＤＡは金属イオンに
配位される３個の化学基を有するリガンドであり、錯体
ＩＤＡ−Ｍ２＋（１：１）（ただしＭ２＋＝２価金属イ
オン）の形状は、正四面体または四面体であることが判
明している（Ｒ．Ｄａｌｌｏｃｃｈｉｏ ｅｔ ａ
ｌ．；Ｊ．Ｃｏｏｒｄ．Ｃｈｅｍ．，２５，２６５（１
９９２））。このことは、固定化ＩＤＡがイオンＣｕ
２＋及びＺｎ２＋とは安定的錯体を形成できるが、安定
的な形状として八面体であることを必要とする他の重金
属イオンとは安定的錯体を形成できない理由を示唆して
いる。
ガンドは、イミノジ酢酸（Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ
Ａｃｉｄ，ＩＤＡ）であった。電子常磁性共鳴及び吸
収スペクトルによる分析の結果、ＩＤＡは金属イオンに
配位される３個の化学基を有するリガンドであり、錯体
ＩＤＡ−Ｍ２＋（１：１）（ただしＭ２＋＝２価金属イ
オン）の形状は、正四面体または四面体であることが判
明している（Ｒ．Ｄａｌｌｏｃｃｈｉｏ ｅｔ ａ
ｌ．；Ｊ．Ｃｏｏｒｄ．Ｃｈｅｍ．，２５，２６５（１
９９２））。このことは、固定化ＩＤＡがイオンＣｕ
２＋及びＺｎ２＋とは安定的錯体を形成できるが、安定
的な形状として八面体であることを必要とする他の重金
属イオンとは安定的錯体を形成できない理由を示唆して
いる。
【０００４】ヒスチジンが例えばヒスチジン−Ｍ２＋−
ヒスチジンのように、種々の多価金属イオンと八面体錯
体を形成できる唯一のα−アミノ酸であることも公知で
ある（Ｂ．Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｎ
ｕｃｌ．Ｃｈｅｍ．；３３，８０９（１９７１）；Ｍ．
Ｍ．Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．；Ａｃｔａ Ｃｒｙ
ｓｔ．，１６，６４３（１９６３））： −それぞれのヒスチジンは、Ｍ２＋に対して３つの配位
結合を与える。即ち、イミダゾール環の３−Ｎ基と、ア
ミノ酸のＮＨ２ 及びＣＯＯＨ基である；イミダゾール
環の１−ＮＨ基は、錯体形成に関与しない（Ｃ．Ｃ．Ｍ
ｃ．Ｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．；ＪＡＣＳ，８５，３
７３６（１９６３））。 −錯体形成は、立体選択性である（Ｊ．Ｈ．Ｒｉｔｓｍ
ａ ｅｔ ａｌ．；Ｒｅｃｕｅｉｌ，８８，４１１（１
９６９））。 −ヒスタミン及びイミダゾールの錯体化学は、すでに論
述されている（Ｗ．Ｒ．Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．；
Ｊ．Ｃｏｏｒｄ．Ｃｈｅｍ．，３，７７（１９７３）；
Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２３，１９７３（１９７
０））。
ヒスチジンのように、種々の多価金属イオンと八面体錯
体を形成できる唯一のα−アミノ酸であることも公知で
ある（Ｂ．Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｎ
ｕｃｌ．Ｃｈｅｍ．；３３，８０９（１９７１）；Ｍ．
Ｍ．Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．；Ａｃｔａ Ｃｒｙ
ｓｔ．，１６，６４３（１９６３））： −それぞれのヒスチジンは、Ｍ２＋に対して３つの配位
結合を与える。即ち、イミダゾール環の３−Ｎ基と、ア
ミノ酸のＮＨ２ 及びＣＯＯＨ基である；イミダゾール
環の１−ＮＨ基は、錯体形成に関与しない（Ｃ．Ｃ．Ｍ
ｃ．Ｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．；ＪＡＣＳ，８５，３
７３６（１９６３））。 −錯体形成は、立体選択性である（Ｊ．Ｈ．Ｒｉｔｓｍ
ａ ｅｔ ａｌ．；Ｒｅｃｕｅｉｌ，８８，４１１（１
９６９））。 −ヒスタミン及びイミダゾールの錯体化学は、すでに論
述されている（Ｗ．Ｒ．Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．；
Ｊ．Ｃｏｏｒｄ．Ｃｈｅｍ．，３，７７（１９７３）；
Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２３，１９７３（１９７
０））。
【０００５】さらに、単結晶Ｘ−線分析（Ｓｉｍｏｎ
Ｈ．Ｗｈｉｔｌｏｗ；Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１２，
２２８６（１９７３））及び赤外線スペクトル分析
（Ｙ．Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．；ＪＡＣＳ，３６，
１０６９（１９６３）及びＪ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，
６９，４０４（１９６５））の結果、ニトリロトリ酢酸
三ナトリウム（Ｎａ３ＮＴＡ）が種々の多価金属イオン
Ｍ２＋に対して４個の錯体形成化学基を有するリガンド
であり、対応の錯体ＮＴＡ−Ｍ２＋が八面体形状を有す
ることが判明している。 −ＮＴＡは、ｐＨ５．５〜１０．０の、ＨＮ＋（ＣＨ２
−ＣＯＯ−）３ とＮ（ＣＨ２ −ＣＯＯ− ）３ の混
合物であればよい。 −カルボン酸塩と非荷電Ｎ基だけが配位結合に関与す
る。カルボキシル及び荷電Ｎ基は結合に関与しない。
Ｈ．Ｗｈｉｔｌｏｗ；Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１２，
２２８６（１９７３））及び赤外線スペクトル分析
（Ｙ．Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．；ＪＡＣＳ，３６，
１０６９（１９６３）及びＪ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，
６９，４０４（１９６５））の結果、ニトリロトリ酢酸
三ナトリウム（Ｎａ３ＮＴＡ）が種々の多価金属イオン
Ｍ２＋に対して４個の錯体形成化学基を有するリガンド
であり、対応の錯体ＮＴＡ−Ｍ２＋が八面体形状を有す
ることが判明している。 −ＮＴＡは、ｐＨ５．５〜１０．０の、ＨＮ＋（ＣＨ２
−ＣＯＯ−）３ とＮ（ＣＨ２ −ＣＯＯ− ）３ の混
合物であればよい。 −カルボン酸塩と非荷電Ｎ基だけが配位結合に関与す
る。カルボキシル及び荷電Ｎ基は結合に関与しない。
【０００６】従って、Ｅ．Ｈｏｃｈｕｌｉ ｅｔ ａ
ｌ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，４１１，１７７
（１９８７））及び米国特許第４，８７７，８３０号
（１９８９）が提案しているアガロースに固定したＮＴ
Ａ誘導体は、タンパク質を含むヒスチジンの精製方法と
して興味深い方法と云える。そのリガンドはＨ２Ｎ−
（ＣＨ ２）ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ（ＣＨ２−ＣＯＯ
Ｈ）２（ただし、ｎ＝２，４）であり、得られる樹脂
は：樹脂−ＮＨ−（ＣＨ２ ）ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−
Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＨ）２（ただし、ｎ＝２，４）であ
る。
ｌ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，４１１，１７７
（１９８７））及び米国特許第４，８７７，８３０号
（１９８９）が提案しているアガロースに固定したＮＴ
Ａ誘導体は、タンパク質を含むヒスチジンの精製方法と
して興味深い方法と云える。そのリガンドはＨ２Ｎ−
（ＣＨ ２）ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ（ＣＨ２−ＣＯＯ
Ｈ）２（ただし、ｎ＝２，４）であり、得られる樹脂
は：樹脂−ＮＨ−（ＣＨ２ ）ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−
Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＨ）２（ただし、ｎ＝２，４）であ
る。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】この発明の課題は、公
知化合物よりもすぐれた特性を有し、金属キレート・ア
フィニティー・クロマトグラフィーに好適な新規のキレ
ート形成剤を提供することにある。
知化合物よりもすぐれた特性を有し、金属キレート・ア
フィニティー・クロマトグラフィーに好適な新規のキレ
ート形成剤を提供することにある。
【０００８】この発明は、このような樹脂の製法にも係
わる。
わる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この発明は、ＩＭＡＣ用
の新規の樹脂を容易に、迅速に、かつ低コストで製造す
る方法、及び以下の説明において８化学基キレート形成
剤（Ｐｅｎｔａｄｅｎｔａｔｅ ｃｈｅｌａｔｏｒ，Ｐ
ＤＣ）樹脂と呼称する前記樹脂に係わり、前記樹脂はＭ
２＋イオンに対して５つの配位結合を与えることができ
る。前記配位結合は、得られる八面体形状の錯体の安定
性を高める効果を有し、１つの配位点が、隣接のシステ
イン／ヒスチジン、特に、タンパク質またはペプチドか
ら成るグループから選択されることが好ましい生体分子
を含むヒスチジンとの相互作用及び選択結合のために残
される。
の新規の樹脂を容易に、迅速に、かつ低コストで製造す
る方法、及び以下の説明において８化学基キレート形成
剤（Ｐｅｎｔａｄｅｎｔａｔｅ ｃｈｅｌａｔｏｒ，Ｐ
ＤＣ）樹脂と呼称する前記樹脂に係わり、前記樹脂はＭ
２＋イオンに対して５つの配位結合を与えることができ
る。前記配位結合は、得られる八面体形状の錯体の安定
性を高める効果を有し、１つの配位点が、隣接のシステ
イン／ヒスチジン、特に、タンパク質またはペプチドか
ら成るグループから選択されることが好ましい生体分子
を含むヒスチジンとの相互作用及び選択結合のために残
される。
【００１０】前記ＰＤＣ樹脂は、Ｃｕ２＋，Ｎｉ２＋，
Ｚｎ２＋，Ｃｏ２＋など種々の多価金属イオンとキレー
ト形成することにより、以下の説明においてＣｕ−ＰＤ
Ｃ，Ｎｉ−ＰＤＣ，Ｚｎ−ＰＤＣ及びＣｏ−ＰＤＣと呼
称するそれぞれ対応の金属キレート樹脂を提供すること
ができる。これら４種類の樹脂は、天然及び組換えタン
パク質またはペプチドを含むヒスチジンの精製に使用さ
れる。
Ｚｎ２＋，Ｃｏ２＋など種々の多価金属イオンとキレー
ト形成することにより、以下の説明においてＣｕ−ＰＤ
Ｃ，Ｎｉ−ＰＤＣ，Ｚｎ−ＰＤＣ及びＣｏ−ＰＤＣと呼
称するそれぞれ対応の金属キレート樹脂を提供すること
ができる。これら４種類の樹脂は、天然及び組換えタン
パク質またはペプチドを含むヒスチジンの精製に使用さ
れる。
【００１１】この発明は、前記ＰＤＣ樹脂にも係わり、
この樹脂の細孔へはタンパク質が進入できない（定義に
よれば、タンパク質の分子量は５０００ダルトン以
上）。前記樹脂としては、（スウェーデン、ウプサラ
市、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＳｅｐｈａｄｅｘ（商品
名）Ｇ−２５から得られる）ＰＤＣ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５が好ましい。
この樹脂の細孔へはタンパク質が進入できない（定義に
よれば、タンパク質の分子量は５０００ダルトン以
上）。前記樹脂としては、（スウェーデン、ウプサラ
市、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＳｅｐｈａｄｅｘ（商品
名）Ｇ−２５から得られる）ＰＤＣ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５が好ましい。
【００１２】また、タンパク質を含むヒスチジンと金属
キレートとの結合は、錯体である金属−ＰＤＣと、ヒス
チジン残基の接近度とによって左右され、前記接近度
は、問題のタンパク質の形状に左右される。従って、生
体分子を含むヒスチジンとＣｕ ２＋，Ｎｉ２＋，Ｚｎ
２＋及びＣｏ２＋との結合度を予示する普遍法則は存在
しない。
キレートとの結合は、錯体である金属−ＰＤＣと、ヒス
チジン残基の接近度とによって左右され、前記接近度
は、問題のタンパク質の形状に左右される。従って、生
体分子を含むヒスチジンとＣｕ ２＋，Ｎｉ２＋，Ｚｎ
２＋及びＣｏ２＋との結合度を予示する普遍法則は存在
しない。
【００１３】この発明は、好ましくはタンパク質または
ペプチドから成るグループから選択される天然及び組換
え生体分子の精製に最も好適な金属キレートを決定する
４つの別々のカラムＣｕ−ＰＤＣ，Ｎｉ−ＰＤＣ，Ｚｎ
−ＰＤＣ及びＣｏ−ＰＤＣから成るＰＤＣキットにも係
わる。
ペプチドから成るグループから選択される天然及び組換
え生体分子の精製に最も好適な金属キレートを決定する
４つの別々のカラムＣｕ−ＰＤＣ，Ｎｉ−ＰＤＣ，Ｚｎ
−ＰＤＣ及びＣｏ−ＰＤＣから成るＰＤＣキットにも係
わる。
【００１４】この発明のＣｕ−ＰＤＣ樹脂は、水溶性カ
ルボジイミドを使用してタンパク質を共有固定する際の
万能支持体として利用され、タンパク質溶液の体積を減
少させるための濃縮用樹脂としても利用される。
ルボジイミドを使用してタンパク質を共有固定する際の
万能支持体として利用され、タンパク質溶液の体積を減
少させるための濃縮用樹脂としても利用される。
【００１５】この発明は、多価金属イオンを含まない水
及び緩衝液を得ることを目的とする金属イオンに配位す
る５個の化学基を有するキレート形成剤（ＰＤＣ）樹
脂、特に、ＰＤＣ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５に係わ
る。具体的には、この発明のＰＤＣ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５は、重金属イオンを含まない金属タンパク質
または重金属イオンを含まないタンパク質を固定化金属
イオン・アフィニティー・クロマトグラフィーによっ
て、調製するのに有用である。
及び緩衝液を得ることを目的とする金属イオンに配位す
る５個の化学基を有するキレート形成剤（ＰＤＣ）樹
脂、特に、ＰＤＣ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５に係わ
る。具体的には、この発明のＰＤＣ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５は、重金属イオンを含まない金属タンパク質
または重金属イオンを含まないタンパク質を固定化金属
イオン・アフィニティー・クロマトグラフィーによっ
て、調製するのに有用である。
【００１６】
【発明の実施形態】Ｙ．Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．が
論述しているように（ＪＡＣＳ，３６，ｐ．１０６９
（１９６３）及びＪ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．６９０，４
０４（１９６５））、生理的ｐＨにおいて、ＮＴＡ（ニ
トリロトリ酢酸，ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔａｔ
ｅ）及び場合によっては固定化ＮＴＡ誘導体は、金属イ
オンＭ２ ＋に対する３化学基及び４化学基リガンドの混
合物である。従って、八面体形状錯体ＮＴＡ−Ｍ２＋の
濃度は、生理的ｐＨの全ＮＴＡの濃度よりもはるかに低
い。
論述しているように（ＪＡＣＳ，３６，ｐ．１０６９
（１９６３）及びＪ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．６９０，４
０４（１９６５））、生理的ｐＨにおいて、ＮＴＡ（ニ
トリロトリ酢酸，ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔａｔ
ｅ）及び場合によっては固定化ＮＴＡ誘導体は、金属イ
オンＭ２ ＋に対する３化学基及び４化学基リガンドの混
合物である。従って、八面体形状錯体ＮＴＡ−Ｍ２＋の
濃度は、生理的ｐＨの全ＮＴＡの濃度よりもはるかに低
い。
【００１７】この発明の５化学基キレート形成剤（ＰＤ
Ｃ）樹脂、特に、下記式で表わされるキレート形成剤樹
脂は、この問題を解決する上で理想的である：樹脂−Ｎ
（ＣＨ ２ −ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２ ）４ −ＣＨ（ＣＯ
ＯＨ）−Ｎ（ＣＨ２ −ＣＯＯＨ）２ 。生理的ｐＨにお
いて、前記樹脂は、金属イオンＭ２＋に対する４化学基
及び５化学基リガンドの混合物である。従って、八面体
形状錯体ＰＤＣ−Ｍ２＋の濃度も、タンパク質を含むヒ
スチジンに対する作用も理想的である。
Ｃ）樹脂、特に、下記式で表わされるキレート形成剤樹
脂は、この問題を解決する上で理想的である：樹脂−Ｎ
（ＣＨ ２ −ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２ ）４ −ＣＨ（ＣＯ
ＯＨ）−Ｎ（ＣＨ２ −ＣＯＯＨ）２ 。生理的ｐＨにお
いて、前記樹脂は、金属イオンＭ２＋に対する４化学基
及び５化学基リガンドの混合物である。従って、八面体
形状錯体ＰＤＣ−Ｍ２＋の濃度も、タンパク質を含むヒ
スチジンに対する作用も理想的である。
【００１８】この発明は、ビス−リジン−Ｍ２＋、特
に、ビス−リジン−Ｃｕ２＋と式：樹脂−Ｏ−ＣＨ２
−エチレンエポキシドで表わされる活性化樹脂または有
機化合物を含む−ＮＨ２ と反応可能なその他の活性化
マトリックスとを反応させることによって合成される
式：樹脂−ω−Ｎ−リジンの製法にも係わる。上記製法
に使用されるキャリヤー・マトリックスは、親和樹脂の
製造に使用される官能化または活性化樹脂であることが
好ましく、特に、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商品名）ＣＬ−
４Ｂ，ＣＬ−６Ｂ，Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，及びＳｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−２５樹脂（スウェーデン、ウプサラ市、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、セルロース及び／またはコッ
トンから成るグループから選択された樹脂が好ましい。
に、ビス−リジン−Ｃｕ２＋と式：樹脂−Ｏ−ＣＨ２
−エチレンエポキシドで表わされる活性化樹脂または有
機化合物を含む−ＮＨ２ と反応可能なその他の活性化
マトリックスとを反応させることによって合成される
式：樹脂−ω−Ｎ−リジンの製法にも係わる。上記製法
に使用されるキャリヤー・マトリックスは、親和樹脂の
製造に使用される官能化または活性化樹脂であることが
好ましく、特に、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商品名）ＣＬ−
４Ｂ，ＣＬ−６Ｂ，Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，及びＳｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−２５樹脂（スウェーデン、ウプサラ市、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、セルロース及び／またはコッ
トンから成るグループから選択された樹脂が好ましい。
【００１９】この発明は、塩基性媒質中における前記樹
脂−ω−Ｎ−リジンと過剰量のハロゲン酢酸、好ましく
はブロモ酢酸との反応プロセスにも係わり、この反応プ
ロセスによって、この発明の５化学基樹脂の形成を可能
にする：即ち、塩基性媒質中における樹脂−ω−Ｎ−リ
ジン＋Ｂｒ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ→樹脂−Ｎ（ＣＨ２−Ｃ
ＯＯＨ）−（ＣＨ２）４−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ（ＣＨ
２−ＣＯＯＨ）２。
脂−ω−Ｎ−リジンと過剰量のハロゲン酢酸、好ましく
はブロモ酢酸との反応プロセスにも係わり、この反応プ
ロセスによって、この発明の５化学基樹脂の形成を可能
にする：即ち、塩基性媒質中における樹脂−ω−Ｎ−リ
ジン＋Ｂｒ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ→樹脂−Ｎ（ＣＨ２−Ｃ
ＯＯＨ）−（ＣＨ２）４−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ（ＣＨ
２−ＣＯＯＨ）２。
【００２０】
【実施例】この発明の詳細を実験例に基づいて以下に説
明する。
明する。
【００２１】（実験例１）水酸化ナトリウム３３ｇ及び
蒸留水３３０ｍｌから成る溶液にモノクロル水化リジン
７５ｇを溶解させた。この溶液に、ＣｕＳＯ４ ５１．
６ｇを蒸留水１５０ｍｌに溶解させた溶液を加えた（完
全に溶解するまで３０℃に加熱した）。以後のステップ
には、精製せずに対応の錯体を使用した。（ただし、混
和不能な相が形成されるまでエタノールを添加すること
によって精製できる。）
蒸留水３３０ｍｌから成る溶液にモノクロル水化リジン
７５ｇを溶解させた。この溶液に、ＣｕＳＯ４ ５１．
６ｇを蒸留水１５０ｍｌに溶解させた溶液を加えた（完
全に溶解するまで３０℃に加熱した）。以後のステップ
には、精製せずに対応の錯体を使用した。（ただし、混
和不能な相が形成されるまでエタノールを添加すること
によって精製できる。）
【００２２】（実験例２）蒸留水で充分洗浄したＳｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ ３００ｍｌを、蒸留水４５
０ｍｌ及びエピクロロヒドリン７５ｍｌで希釈したＮａ
ＯＨの２Ｍ溶液１９５ｍｌで２時間にわたって４０℃で
活性化した。中性ｐＨとなるまで、対応の活性化樹脂を
蒸留水で洗浄した。この活性化樹脂に対して、ＮａＯＨ
の２Ｍ溶液及び実験例１で得た溶液１５０ｍｌを加え
た。この混合物を、３時間にわたって４０℃で、さらに
１晩５０℃でゆっくり撹拌した。
ｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ ３００ｍｌを、蒸留水４５
０ｍｌ及びエピクロロヒドリン７５ｍｌで希釈したＮａ
ＯＨの２Ｍ溶液１９５ｍｌで２時間にわたって４０℃で
活性化した。中性ｐＨとなるまで、対応の活性化樹脂を
蒸留水で洗浄した。この活性化樹脂に対して、ＮａＯＨ
の２Ｍ溶液及び実験例１で得た溶液１５０ｍｌを加え
た。この混合物を、３時間にわたって４０℃で、さらに
１晩５０℃でゆっくり撹拌した。
【００２３】得られた樹脂を、廃水のｐＨが７．０に達
するまで蒸留水で充分洗浄し、次いで、水性希釈酸溶液
で充分洗浄し、最後に、樹脂が完全に脱色されるまで余
剰の蒸留水で洗浄した。この樹脂は、そのまま以後のス
テップに使用できる程度に純粋であった。
するまで蒸留水で充分洗浄し、次いで、水性希釈酸溶液
で充分洗浄し、最後に、樹脂が完全に脱色されるまで余
剰の蒸留水で洗浄した。この樹脂は、そのまま以後のス
テップに使用できる程度に純粋であった。
【００２４】（実験例３）ＮａＯＨの２Ｍ溶液及びブロ
モ酢酸７５ｇの溶液４０５ｍｌとＮａＯＨの２Ｍ溶液２
７０ｍｌを実験例２で得た樹脂３００ｍｌに加えた。こ
の混合物を４℃で３時間にわたって、次いで室温で１晩
撹拌した。次いで樹脂を、廃水のｐＨが７．０に達する
まで蒸留水で充分洗浄し、ＮａＮ３０．０２％（ｗ／
ｖ）の存在においてＮａＣｌの０．５Ｍ溶液中に貯蔵し
た。
モ酢酸７５ｇの溶液４０５ｍｌとＮａＯＨの２Ｍ溶液２
７０ｍｌを実験例２で得た樹脂３００ｍｌに加えた。こ
の混合物を４℃で３時間にわたって、次いで室温で１晩
撹拌した。次いで樹脂を、廃水のｐＨが７．０に達する
まで蒸留水で充分洗浄し、ＮａＮ３０．０２％（ｗ／
ｖ）の存在においてＮａＣｌの０．５Ｍ溶液中に貯蔵し
た。
【００２５】（実験例４）蒸留水８００ｍｌにＭＣｌ２
またはＭＳＯ４ （Ｍ＝ＣｕまたはＺｎまたはＮｉまた
はＣｏ）１０ｇを溶解させた溶液に、実験例３で得た樹
脂３００ｍｌを加えた。この混合物を５分間ゆっくりと
撹拌した。金属キレート樹脂を濾過し、蒸留水５００ｍ
ｌで３回、ｐＨ４．０の０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４５０
０ｍｌで３回、ｐＨ８．０の０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４
５００ｍｌで３回、最後に、ｐＨ７．５の０．１Ｍ Ｎ
ａＨ２ＰＯ４５００ｍｌで１回洗浄した。ＮａＮ３０．
０５％（ｗ／ｖ）の存在において、ｐＨ７．５のＮａＨ
２ＰＯ４の０．１Ｍ溶液中に樹脂を貯蔵した。このよう
にして得られた樹脂をそれぞれＣｕ−ＰＤＣ，Ｎｉ−Ｐ
ＤＣ，Ｚｎ−ＰＤＣ及びＣｏ−ＰＤＣと命名した。
またはＭＳＯ４ （Ｍ＝ＣｕまたはＺｎまたはＮｉまた
はＣｏ）１０ｇを溶解させた溶液に、実験例３で得た樹
脂３００ｍｌを加えた。この混合物を５分間ゆっくりと
撹拌した。金属キレート樹脂を濾過し、蒸留水５００ｍ
ｌで３回、ｐＨ４．０の０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４５０
０ｍｌで３回、ｐＨ８．０の０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４
５００ｍｌで３回、最後に、ｐＨ７．５の０．１Ｍ Ｎ
ａＨ２ＰＯ４５００ｍｌで１回洗浄した。ＮａＮ３０．
０５％（ｗ／ｖ）の存在において、ｐＨ７．５のＮａＨ
２ＰＯ４の０．１Ｍ溶液中に樹脂を貯蔵した。このよう
にして得られた樹脂をそれぞれＣｕ−ＰＤＣ，Ｎｉ−Ｐ
ＤＣ，Ｚｎ−ＰＤＣ及びＣｏ−ＰＤＣと命名した。
【００２６】（実験例５）実験例４で得た４種類の樹
脂、即ち、Ｃｕ−ＰＤＣ，Ｎｉ−ＰＤＣ，Ｚｎ−ＰＤＣ
及びＣｏ−ＰＤＣをそれぞれ４本の小さいポリエチレン
・カラムに１ｍｌずつ充填した。これら４本のカラムか
ら成るセットをＰＤＣキットと命名した。下記実験例
６，７，８，９，１０において、このＰＤＣキットを利
用し、以下に述べるようにして問題のタンパク質を精製
した。 −リン酸緩衝液に食塩を加えたＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、即ち、Ｎａ
Ｈ２ＰＯ４５０ｍＭとＮａＣｌ ３００ｍＭの混合液
（ｐＨ７．５）にＮａＮ３０．１％（ｗ／ｖ）を添加し
た緩衝液Ａで各カラムを平衡させた。 −緩衝液Ａ中に問題のタンパク質を含む粗清澄ライゼー
トを、実験例に指摘した量だけ各カラムに送入した。 −各カラムを緩衝液Ａ ２ｍｌで３回、緩衝液Ｂ（緩衝
液Ａ＋ｐＨ７．５の尿素の４Ｍ溶液）２ｍｌで３回、緩
衝液Ｃ（緩衝液Ａ＋ｐＨ７．５の尿素の８Ｍ溶液）で３
回、緩衝液Ｄ ２ｍｌ（ｐＨ６．０に調整された緩衝液
Ａ）で１回、最後に緩衝液Ａ ２ｍｌで１回洗浄した。 −緩衝液Ｅ（緩衝液Ａ＋ｐＨ７．５のイミダゾール１０
０ｍＭ溶液）２ｍｌで３回、緩衝液Ｆ（緩衝液Ａ＋ｐＨ
７．５のイミダゾールの２００ｍＭ溶液）２ｍｌで３
回、各カラムを溶離した。 −各精製ステップから得た画分を、最適のシステム、例
えば、２８０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）、ドデ
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ−Ｐ
ｏｌｙａｃｒｅｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ,ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などを利用し
て分析した。
脂、即ち、Ｃｕ−ＰＤＣ，Ｎｉ−ＰＤＣ，Ｚｎ−ＰＤＣ
及びＣｏ−ＰＤＣをそれぞれ４本の小さいポリエチレン
・カラムに１ｍｌずつ充填した。これら４本のカラムか
ら成るセットをＰＤＣキットと命名した。下記実験例
６，７，８，９，１０において、このＰＤＣキットを利
用し、以下に述べるようにして問題のタンパク質を精製
した。 −リン酸緩衝液に食塩を加えたＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、即ち、Ｎａ
Ｈ２ＰＯ４５０ｍＭとＮａＣｌ ３００ｍＭの混合液
（ｐＨ７．５）にＮａＮ３０．１％（ｗ／ｖ）を添加し
た緩衝液Ａで各カラムを平衡させた。 −緩衝液Ａ中に問題のタンパク質を含む粗清澄ライゼー
トを、実験例に指摘した量だけ各カラムに送入した。 −各カラムを緩衝液Ａ ２ｍｌで３回、緩衝液Ｂ（緩衝
液Ａ＋ｐＨ７．５の尿素の４Ｍ溶液）２ｍｌで３回、緩
衝液Ｃ（緩衝液Ａ＋ｐＨ７．５の尿素の８Ｍ溶液）で３
回、緩衝液Ｄ ２ｍｌ（ｐＨ６．０に調整された緩衝液
Ａ）で１回、最後に緩衝液Ａ ２ｍｌで１回洗浄した。 −緩衝液Ｅ（緩衝液Ａ＋ｐＨ７．５のイミダゾール１０
０ｍＭ溶液）２ｍｌで３回、緩衝液Ｆ（緩衝液Ａ＋ｐＨ
７．５のイミダゾールの２００ｍＭ溶液）２ｍｌで３
回、各カラムを溶離した。 −各精製ステップから得た画分を、最適のシステム、例
えば、２８０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）、ドデ
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ−Ｐ
ｏｌｙａｃｒｅｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ,ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などを利用し
て分析した。
【００２７】（実験例６：ＰＤＣキット（実験例５参
照）によるタンパク質の精製） −大腸菌に発現させたヘリコピロリ菌から得た６ｘヒス
チジン標識ＨＳＰ６０（熱ショック・タンパク質）の粗
清澄ライゼート（ＨＳＰ６０の濃度：約５ｍｇ／ｍｌ） −ＰＤＣキットの各カラムに送入したサンプル量：５０
０μｌ（図１参照）。
照）によるタンパク質の精製） −大腸菌に発現させたヘリコピロリ菌から得た６ｘヒス
チジン標識ＨＳＰ６０（熱ショック・タンパク質）の粗
清澄ライゼート（ＨＳＰ６０の濃度：約５ｍｇ／ｍｌ） −ＰＤＣキットの各カラムに送入したサンプル量：５０
０μｌ（図１参照）。
【００２８】（実験例７：ＰＤＣキット（実験例５参
照）によるタンパク質の精製） −大腸菌に発現させたヘリコピロリ菌から得た６ｘヒス
チジン標識ウレアーゼの粗清澄ライゼート（ウレアーゼ
の濃度：約１ｍｇ／ｍｌ） −ＰＤＣキットの各カラムに送入したサンプル量：２ｍ
ｌ
照）によるタンパク質の精製） −大腸菌に発現させたヘリコピロリ菌から得た６ｘヒス
チジン標識ウレアーゼの粗清澄ライゼート（ウレアーゼ
の濃度：約１ｍｇ／ｍｌ） −ＰＤＣキットの各カラムに送入したサンプル量：２ｍ
ｌ
【００２９】（結果）：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、
天然ウレアーゼを精製するにはＮｉ−ＰＤＣを使用すれ
ばよく、ウレアーゼのα−鎖（ＭＷ６０，０００ダルト
ン）及びβ−鎖（ＭＷ３０，０００ダルトン）を得るに
はＺｎ−ＰＤＣを使用すればよいことが立証された。
天然ウレアーゼを精製するにはＮｉ−ＰＤＣを使用すれ
ばよく、ウレアーゼのα−鎖（ＭＷ６０，０００ダルト
ン）及びβ−鎖（ＭＷ３０，０００ダルトン）を得るに
はＺｎ−ＰＤＣを使用すればよいことが立証された。
【００３０】（実験例８：ＰＤＣキット（実験例５参
照）によるタンパク質の精製） −大腸菌から得た６ｘヒスチジン標識ペニシリン結合タ
ンパク質５（ＭＷ＝７０，０００ダルトン）の粗清澄ラ
イゼート（ペニシリン結合タンパク質５の濃度：約０．
１ｍｇ／ｍｌ） −ＰＤＣキットの各カラムに送入したサンプル量：２ｍ
ｌ
照）によるタンパク質の精製） −大腸菌から得た６ｘヒスチジン標識ペニシリン結合タ
ンパク質５（ＭＷ＝７０，０００ダルトン）の粗清澄ラ
イゼート（ペニシリン結合タンパク質５の濃度：約０．
１ｍｇ／ｍｌ） −ＰＤＣキットの各カラムに送入したサンプル量：２ｍ
ｌ
【００３１】（結果）：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、
この精製にはＮｉ−ＰＤＣが最適であることが立証され
た。
この精製にはＮｉ−ＰＤＣが最適であることが立証され
た。
【００３２】（実験例９：ＰＤＣキット（実験例５参
照）によるタンパク質の精製） −プソイドモナス・アエルギノーサＩＦＯ（大阪発酵研
究所）３４５５から得たＭＷ５０，０００ダルトンの中
温アルカリ性プロテアーゼ（Ｚｎタンパク質）を含む粗
抽出物（再溶解硫酸アンモニウム沈殿物）（アルカリ性
プロテアーゼの濃度：約１ｍｇ／ｍｌ） −ＰＤＣキットの各カラムに送入したサンプル量：１ｍ
ｌ（図２参照）。
照）によるタンパク質の精製） −プソイドモナス・アエルギノーサＩＦＯ（大阪発酵研
究所）３４５５から得たＭＷ５０，０００ダルトンの中
温アルカリ性プロテアーゼ（Ｚｎタンパク質）を含む粗
抽出物（再溶解硫酸アンモニウム沈殿物）（アルカリ性
プロテアーゼの濃度：約１ｍｇ／ｍｌ） −ＰＤＣキットの各カラムに送入したサンプル量：１ｍ
ｌ（図２参照）。
【００３３】（実験例１０：ＰＤＣキット（実験例５参
照）によるタンパク質の精製）大腸菌から得た突然変異
トリオース・リン酸イソメラーゼの粗清澄ライゼート１
０ｍｌをカラムに充填した。このサンプルは８個のヒス
チジン残基を含むものであった（８個のうち、アクセス
可能な残基は５個）。
照）によるタンパク質の精製）大腸菌から得た突然変異
トリオース・リン酸イソメラーゼの粗清澄ライゼート１
０ｍｌをカラムに充填した。このサンプルは８個のヒス
チジン残基を含むものであった（８個のうち、アクセス
可能な残基は５個）。
【００３４】（結果）：Ｎｉ−ＰＤＣを使用することで
突然変異トリオース・リン酸イソメラーゼをワンステッ
プで精製することができた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結
果、ウェット・ゲル１ｍｌ当りのタンパク質回収量は１
５ｍｇであることが判明した。
突然変異トリオース・リン酸イソメラーゼをワンステッ
プで精製することができた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結
果、ウェット・ゲル１ｍｌ当りのタンパク質回収量は１
５ｍｇであることが判明した。
【００３５】（実験例１１）緩衝液Ａ（実験例５参照）
５０ｍｌに溶解させたヒトのチロキシン結合グロブリン
（Ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｇｌｏｂｕｌ
ｉｎ,ＴＢＧ）１０ｍｇの溶液を１ｍｌ Ｃｕ−ＰＤＣ
カラムに送入した。フロースルーの２８０ｎｍにおける
光学密度は、ＴＢＧの全量がカラムによって保持された
ことを示唆した。緩衝液Ｅ（実験例５参照）２ｍｌによ
って溶離させたＴＢＧの回収率は、約９５％（９．５ｍ
ｇ）であった。放射線免疫吸着検定（ｒａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙ,ＲＩＡ）の結果、その活性に変化の
ないことが判明した。
５０ｍｌに溶解させたヒトのチロキシン結合グロブリン
（Ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｇｌｏｂｕｌ
ｉｎ,ＴＢＧ）１０ｍｇの溶液を１ｍｌ Ｃｕ−ＰＤＣ
カラムに送入した。フロースルーの２８０ｎｍにおける
光学密度は、ＴＢＧの全量がカラムによって保持された
ことを示唆した。緩衝液Ｅ（実験例５参照）２ｍｌによ
って溶離させたＴＢＧの回収率は、約９５％（９．５ｍ
ｇ）であった。放射線免疫吸着検定（ｒａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙ,ＲＩＡ）の結果、その活性に変化の
ないことが判明した。
【００３６】（実験例１２）５ｍｌの緩衝液Ａ（実験例
５参照）に２０ｍｇのウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎ
ｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｕｂｍｉｎ，ＢＳＡ）を溶解させ
た溶液を、同じ緩衝液であらかじめ平衡させた１ｍｌの
Ｃｕ−ＰＤＣと１５分間にわたって混合した。得られた
懸濁液を濾過し、ｐＨを８．０に調整した５ｍｌの緩衝
液Ａで、次いで、ｐＨを４．０に調整した５ｍｌの緩衝
液Ａで、さらに、ｐＨを５．５に調整した５ｍｌの緩衝
液Ａで洗浄した。
５参照）に２０ｍｇのウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎ
ｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｕｂｍｉｎ，ＢＳＡ）を溶解させ
た溶液を、同じ緩衝液であらかじめ平衡させた１ｍｌの
Ｃｕ−ＰＤＣと１５分間にわたって混合した。得られた
懸濁液を濾過し、ｐＨを８．０に調整した５ｍｌの緩衝
液Ａで、次いで、ｐＨを４．０に調整した５ｍｌの緩衝
液Ａで、さらに、ｐＨを５．５に調整した５ｍｌの緩衝
液Ａで洗浄した。
【００３７】各洗浄ステップにおける濾液の２８０ｎｍ
光学密度から、ＢＳＡのほぼ全量がＣｕ−ＰＤＣによっ
て保持されたことが確認された。
光学密度から、ＢＳＡのほぼ全量がＣｕ−ＰＤＣによっ
て保持されたことが確認された。
【００３８】１ｍｌの蒸留水に１０ｍｇの１−エチル３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ハ
イドロクロライドを溶解させた溶液を、４ｍｌのｐＨ
５．５緩衝液Ａに先に得た１ｍｌの錯体ＢＳＡ−Ｃｕ−
ＰＤＣ樹脂を混入した懸濁液に加えた。この混合液を４
℃で１晩ゆっくりと撹拌した。
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ハ
イドロクロライドを溶解させた溶液を、４ｍｌのｐＨ
５．５緩衝液Ａに先に得た１ｍｌの錯体ＢＳＡ−Ｃｕ−
ＰＤＣ樹脂を混入した懸濁液に加えた。この混合液を４
℃で１晩ゆっくりと撹拌した。
【００３９】樹脂を濾過し、緩衝液Ａで充分に洗浄し
た。ｐＨ７．４のＥＤＴＡ（エチレンジアミノテトラ酢
酸）０．１Ｍ溶液でＣｕ２＋イオンを樹脂から分離させ
た。次いで樹脂を、ｐＨ４．０に調整した２５ｍｌの緩
衝液Ａで、次いで、ｐＨ８．０に調整した２５ｍｌの緩
衝液Ａでそれぞれ洗浄し、ｐＨ７．５の緩衝液Ａ中に貯
蔵した。
た。ｐＨ７．４のＥＤＴＡ（エチレンジアミノテトラ酢
酸）０．１Ｍ溶液でＣｕ２＋イオンを樹脂から分離させ
た。次いで樹脂を、ｐＨ４．０に調整した２５ｍｌの緩
衝液Ａで、次いで、ｐＨ８．０に調整した２５ｍｌの緩
衝液Ａでそれぞれ洗浄し、ｐＨ７．５の緩衝液Ａ中に貯
蔵した。
【００４０】こうして得られた共有固定化ＢＳＡ−ＰＤ
Ｃの回収量は、定量的であった。
Ｃの回収量は、定量的であった。
【００４１】（実験例１３）５ｍｇのＣｕＣｌ２，５ｍ
ｇのＮｉ２ＳＯ４，５ｍｇのＺｎＣｌ２，５ｍｇのＣｏ
Ｃｌ２及び１ｍｇのＣａＣｌ２を含む緩衝液Ａ（実験例
５参照）にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｇを加えた
もの１００ｍｌを、１０ｍｌのＰＤＣ−Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−２５を含む断面の大きいカラムに送入した。こ
うして得られたＢＳＡ溶液は、多価金属イオンを全く含
まなかった。
ｇのＮｉ２ＳＯ４，５ｍｇのＺｎＣｌ２，５ｍｇのＣｏ
Ｃｌ２及び１ｍｇのＣａＣｌ２を含む緩衝液Ａ（実験例
５参照）にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｇを加えた
もの１００ｍｌを、１０ｍｌのＰＤＣ−Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−２５を含む断面の大きいカラムに送入した。こ
うして得られたＢＳＡ溶液は、多価金属イオンを全く含
まなかった。
【図１】実験例６の結果を示す図。
【図２】実験例９の結果を示す図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/765 Ｃ０７Ｋ 14/765 Ｃ０９Ｋ 3/00 １０８ Ｃ０９Ｋ 3/00 １０８Ａ Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｎ 9/52 9/90 9/90 (71)出願人 599098334 Ｒｕｅ ｄｅ ｌ’Ｙｓｅｒ 304，Ｂ− 4430 ＡＮＳ，ＢＥＬＧＩＵＭ Ｆターム(参考） 4B050 DD02 FF14E 4D017 AA09 BA07 CA13 DA03 DB02 EA01 4G066 AB07A AB07B AB10D AB24A AB24B AC27A AC27B AC33A AC33B AD07A AD07B AD15A AD15B AE05A AE05B BA23 CA54 EA02 FA33 4H045 AA50 GA10 GA20 HA03 4J100 AU39P BA16H BA16P BA29P CA01 CA31 DA01 HA61 HC04 HC27 JA17
Claims (11)
- 【請求項１】 式： 樹脂−Ｎ（ＣＨ２−ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）４−ＣＨ
（ＣＯＯＨ）−Ｎ（ＣＨ ２ −ＣＯＯＨ）２ で表わされる５化学基金属キレート形成剤樹脂（Ｐｅｎ
ｔａｄｅｎｔａｔｅ Ｃｈｅｌａｔｏｒ ｒｅｓｉｎ，
ＰＤＣ樹脂）。 - 【請求項２】 分子量が５０００ダルトンより大きいタ
ンパク質の透過を許さない細孔を持つ樹脂を含むことを
特徴とする請求の範囲第１項に記載のＰＤＣ樹脂。 - 【請求項３】 Ｍ２＋がＣｕ２＋，Ｚｎ２＋，Ｎｉ２＋
及びＣｏ２＋から成るグループから選択された多価金属
イオンであることを特徴とする請求の範囲第１項または
第２項に記載の５化学基金属キレート形成剤（Ｍ２＋Ｐ
ＤＣ）樹脂。 - 【請求項４】 ４つの別々の５化学基金属キレート形成
剤（Ｍ２＋ＰＤＣ）樹脂から成る５化学基金属キレート
形成剤キット（ＰＤＣキット）であって、Ｍ２＋がそれ
ぞれ多価金属イオンＣｕ２＋，Ｚｎ２＋，Ｎｉ２＋及び
Ｃｏ２＋であることを特徴とする５化学基金属キレート
形成剤キット（ＰＤＣキット）。 - 【請求項５】 請求の範囲第１項または第２項に記載の
５化学基金属キレート形成剤（ＰＤＣ）樹脂の製法であ
って、樹脂のキャリヤーマトリックスを式：ビス−リジ
ン−Ｃｕ２＋で表わされる金属キレート形成剤と反応さ
せることによって、以後のステップにおいて塩基性媒質
中で余剰のハロゲン酢酸と反応する式：樹脂−ω−Ｎ−
リジンで表わされる化合物を得るステップと、得られた
５化学基金属キレート形成剤（ＰＤＣ）樹脂を回収する
ステップとから成ることを特徴とする前記製法。 - 【請求項６】 ハロゲン酢酸がブロモ酢酸であることを
特徴とする請求の範囲第５項に記載の製法。 - 【請求項７】 式：樹脂−ω−Ｎ−リジンで表わされる
中間生成物。 - 【請求項８】 好ましくはヒスチジン残基を含む天然及
び／または組換えタンパク質またはペプチドの精製を目
的とする請求の範囲第３項に記載の５化学基金属キレー
ト形成剤（Ｍ２＋ＰＤＣ）樹脂および請求の範囲第４項
に記載のＰＤＣキットいずれかの利用。 - 【請求項９】 緩衝液から重金属を含まない水を精製す
ることを目的とする請求の範囲第２項に記載の５化学基
金属キレート形成剤（ＰＤＣ）樹脂の利用。 - 【請求項１０】 固定化金属イオン・アフィニティー・
クロマトグラフィー処理により“金属タンパク質”また
は重金属イオンを含まないタンパク質を調製することを
目的とする請求の範囲第２項に記載の５化学基金属キレ
ート形成剤樹脂の利用。 - 【請求項１１】 Ｍ２＋が多価金属イオンＣｕ２＋であ
る場合の請求の範囲第３項に記載の５化学基金属キレー
ト形成剤（Ｍ２＋ＰＤＣ）樹脂の利用であって、水溶性
カルボジイミドを使用してタンパク質を共有固定化し、
タンパク質溶液を減容することを目的とする前記利用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19961299A JP2001029783A (ja) | 1999-07-13 | 1999-07-13 | 親和性固定化金属樹脂 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19961299A JP2001029783A (ja) | 1999-07-13 | 1999-07-13 | 親和性固定化金属樹脂 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001029783A true JP2001029783A (ja) | 2001-02-06 |
Family
ID=16410763
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19961299A Pending JP2001029783A (ja) | 1999-07-13 | 1999-07-13 | 親和性固定化金属樹脂 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001029783A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023087270A1 (zh) * | 2021-11-19 | 2023-05-25 | 辽宁凯莱英医药化学有限公司 | 酶固定化载体及其制备方法、固定化酶及其制备方法 |
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| JPS6355117A (ja) * | 1986-08-26 | 1988-03-09 | Agency Of Ind Science & Technol | ガリウム及びインジウムの分別回収方法 |
| JPS6356503A (ja) * | 1986-08-26 | 1988-03-11 | Agency Of Ind Science & Technol | アミノポリカルボン酸型キレ−ト樹脂及びその製造方法 |
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-
1999
- 1999-07-13 JP JP19961299A patent/JP2001029783A/ja active Pending
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