JPS6344947A - 金属キレ−ト樹脂 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は金属キレートクロマトグラフィーに適した新規
樹脂及びそれらの製造方法並びに蛋白質、特に近接する
ヒスチジン残基を含む蛋白質の精製のためのこれらの金
属キレート樹脂の使用に関するものである。

蛋白質の新しい精製方法として、金属キレートアフィニ
ティークロマトグラフィーはポーラス（Ｐｏｒａｔｈ）
等（Ｎａｔｕｒｅ　２５８，５９８〜５９９（１．９７
５）　）により１９７５年に紹介された。この新技術は
多くの所で首尾よく使われ、そして総説論文に〔レエネ
ルダアル．ベー．とキーン．ツェー．エル、　＋　（Ｌ
ｏｎｎｅｒｄａ　Ｉ　。

Ｂ．ａｎｄ　Ｋｅｅｎ　Ｃ．１．、、）Ｊ．Ａｐｐｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．４，　２ｆ）３〜２０８（１９Ｂ２）
　：　スルヨウスキイー。イー＋ｌ　（Ｓｕｌｋｏｗｓ
ｋｉ。

ｌＥ．、）Ｔｒｅｎｄｓ　　ｉｎ　　１１ｉｏＬｃｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ．３．１　　〜７（１９８５））すでに論
じられている。

金属キレ−トアソイニティーク口マトグラフィー６４１
、キレート結合でりｌ」マドグラフィーゲルに結合され
た（固定化された）Ｃｕ”及びＺｎ２“の如き金属イオ
ンが蛋白質の表面、特にヒスチジンのイミタゾール側鎖
に位置する電子供与性基との可逆的に相互作用に貢献し
得るという発見に基づいている。電子供与性基が少なく
とも部分的に非プロＩ・ン化した形で存在するｐＨ値で
、蛋白質はクロマｉ・グラフィーゲル（例えばアガロー
ス）に結合し、次いで、電子供与性基がプロトン化され
る低いｐ　Ｈ値の緩衝液で溶離される。例えば、いわゆ
るスペーサーを介して樹脂のキャリアーマトリックス（
ｃａｒｒｉｅｒ　ｍａｔｒｉｘ）に結合しているイミノ
ジ酸Ｉ’ｌｌ　ｉｌｌキレート形成体として非常に信頼
されてい六二　。

従って、生体高分子精製用の理想的な樹脂としては、−
・方では金属イオンと強く結合しなければならず、他方
においては、金属イオンと蛋白質の間での可逆的相互作
用が可能でなければならない。

固定化したイミノジ酢酸はＣｕ目イオンに対してこれら
の必要条件を十分に満たすが、Ｎｊ■イオンに対しては
前記必要条件を限られた範囲でしが満たさない。これは
後者は単に弱く結合し、蛋白質混合液を導通してすらし
ばしば洗い出されてしまう為である。一方、Ｎ１１キレ
ート樹脂はＮ１２゛イオンが高配位数を有する、即ち　
ＮｊＩ＋イオンは６配位子と３１（体を作り、Ｃ，Ｉ＋
イオンはむしろ４配位子と錯体を作るので生体物質の精
製には特に興味深い。

ニッケル錯体において、４原子価は樹脂中で金属イオン
を結びつけるのに利用でき、そして、２原子価は金属イ
オンと生体高分子間の交換に利用できる。

これまで、金属イオンに出来る限り大きい親和力を持つ
キレート樹脂製造の試みがなされていた。

錯体形成成分としては、例えば、Ｎ、Ｎ、Ｎ’−エチレ
ンジアミン三酢酸〔バーナー、エム、　（ｌｌａｎｅｒ
、　Ｍ、）ら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３８．２
２９〜２３４（１９８４）　）及び１．３−ジアミノプ
ロパンＮ、Ｎ、Ｎ’、　Ｎ　’−四酢酸〔モイヤス、イ
ー、エム、（Ｍｏｙｅｒｓ、ＲｏＭ、）とジエイ、ニス
、フリソ゛ン（Ｊ、Ｓ、Ｆｒ１ｔｚ）、へｎａ１．ｃｈ
ｅｍ、４９．旧８〜４２３（１，９７７）　）が使われ
ていた。しかし、これらの樹脂は金属イオンと生体高分
子間の交換が最適でない欠点があった。

二トリロトり酢酸ば４配位キレー１〜形成体である。固
定化した二トリロトり酢酸ば、２原子価が斗一体高分子
に可逆的結合のために利用されるので、配位数６を持つ
金属イオンに適したキレート樹脂である。この様な金属
キレート樹脂はその表面に２個の近接するヒスチジンを
持つ蛋白質の結合に特に適している。

しかしながら、二１−リロトり酢酸はそのキレート形成
能力を木質的に減少させることなく、イミノジ１ｌｌｉ
１酸と同様に世体に結合できない。この問題は式 ％式％（１） （式中、Ｘは２，３又は４を示ず） で表わされる新規ニトリロ１−り酢酸を製造することに
よって並びに、スペーサーを経たキャリアーマトリック
スにそれらを固定化することによって解決することがで
きた。

従って、本発明は上記式のニトリロｉ・り酢酸誘導体及
びその塩並びにそれらの製造方法に関するものである。

本発明において、特に好ましいニトリロトリ酢酸誘導体
はＮ−〔３−アミノ−１−カルボキシプロピルツーイミ
ノジ酢酸及びＮ−〔５−アミノ−１−カルボキシペンチ
ル〕−イミノジ酢酸である。

本発明は、更にまた、それらの金属キレート基に基づい
て、蛋白質の精製、特に近接するヒスチジン残基を含む
蛋白質の精製に適している金属キレート樹脂及びそれら
の製造方法に関するものである。

本発明の金属キレート樹脂は一般式 ％式％） で定義される。（式中、χは２，３又は４を示ず）キャ
リアーマトリックスとしては、アフィニティー及びゲル
クロマトグラフィーに使われる物質、例えば架橋したデ
キストラン、アガロース　（特に、商品名セファロース
（登録商標）で知られているもの）或いはポリアクリル
アミＩ・が考えられる。

スペー勺−としては、アフィニティークし】マＩ・グラ
フィーで既に知られているスペーザー基が考えられ、特
４；Ｚ　−０−Ｃ１１２−ＣＩｌ（Ｏｌｌ）−ｆ’：Ｉ
ｈ−４ｉ９及び０−Ｃ０基が好ましい。

本発明において、特に好ましいキレート樹脂は、式［ア
ガロース又はセファロース［有］ＣＬ、−６Ｂ　）−０
−Ｃ１１２Ｃ１１（Ｏｌｌ）　Ｃ１１２−Ｎ１＋−（Ｃ
１１２）４−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ（Ｃ１１２ＣＯＯ）
２Ｎｉ”及びアゴ１：１１−ス−０−Ｃｏ−ＮＨ−（Ｃ
ｔｔ□）ｚ−Ｃｔｌ（Ｃ０Ｏ１＋）　−Ｎ　（ＣＩｌ□
Ｃｏｏ　）Ｊｉ２“で表わされるキレート樹脂である。

本発明の二ｌ−ＩＪ　ＩＪ　ｌ・り酢酸誘導体の製造は
弐１ｌ−ＩＮ−（ＣＨ２）Ｘ−Ｃ１１（Ｎ１１□）−Ｃ
ＯＯＩ＋（式中、Ｒはアミノ保３１古を示し、Ｘは２，
３又は４を示ず）で表されるＮ−末端保護化合物をアル
カリ性媒質中フロノ、酢酸と共に反応さ−け、次いで、
保護基を脱離させるごと乙こよるそれ自体は公知の方法
で行うことができる。好ましいアミノ保護基はヘンシル
オキシカルボニル残基（Ｚ）で、これは接触水素添加、
好ましくはパラジウム／炭素とともに接触水素添加する
ことにより除去することができる。この方法で、Ｎ７″
−Ｚ−２，４−ジアミノ酪酸及びＮｅ−Ｚ−１、−リジ
ンは先に述べた特に好ましいニトリロトり酢酸誘導体に
変換することができる。

本発明においてキレート樹脂の製造はそれ自体公知の方
法で行うことができ、それにより、最初にキャリアーマ
トリックスは機能化され（スペーサーの導入）、そして
所望のニトリロトリ酢酸誘導体がスペーサーに共有結合
する。

アガロースをキャリアーマトリックスとして使うとき、
これを、例えば、エビブロムヒドリンとアルカリ媒質中
で反応させることにより、−アガ「１−スは、本発明の
ニトリロトり酢酸誘導体、好ましくＮ−［５−アミノ−
１−カルボキシプロピル〕　−イミノジ酢酸又はＮ−〔
５−アミノ−１−カルボキシペンチルウ−イミノジ酢酸
とアルカリ性媒質中で反応させ、次いでニッケル塩溶液
、例えば硫酸ニッケルで洗浄することによるそれ自体は
公知の方法で所望の本発明キレート樹脂に変換すること
ができる。特別な場合、菫なる金属イオン（例えば、Ｃ
ｏ、　Ｃｄ）の使用は好都合であり、樹脂を適当な金属
塩と共に反応させることにより、相当する金属ギレーロ
ｂ１脂を容易に得ることができる。また、エビし）クロ
ルヒドリンをエビブ１：ＩＪ、ヒドリンの代りに使用す
ることも出来る。

アガロースとしては、標定化した製品、好ましく８Ｊス
ウェーデン、アブサラ（ｌｐｐｓａｌａ）　＋ファルマ
シア社のセファロース（登録商標）が有利に使える。

セファロース（登録商標）ＣＬ−６Ｂは特に好ましい。

同様の方法により、遊離の水酸基を含むポリアクリルア
ミド樹脂を先に示した如く本発明のキレート樹脂に変換
することができる６陽イオン交換＋６１脂をマトリック
ス（ｍａｔｒｉｘ）として使用する場合、ニトリロトり
酢酸誘導体のカップリングはアミ１結合の形成により直
接行わせることができる。

本発明のキレート樹脂の製造には、市販のすでに機能化
したキャリアーマトリックスも使用することができる。

本発明において、特に好ましい機スで、これは米国イリ
ノイ、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）　、ピアー
ス社（Ｐｉｅｒｃｅ）の商品名リアクチゲルＴＭ（Ｒｅ
ａｃｔｉｇｅｌ”）として販売されテイル。

本発明のキレート樹脂は近接するヒスチジン残基を含む
ペプチドと蛋白質に対する特に高い特異性によって区別
される。従って、近接するヒスチジン残基、とりわけ２
個の近接するヒスチジン残基を含有する蛋白質の精製に
特に適している。

“近接するヒスチジン残基”の用語は、特定のペプチド
と蛋白質の三次元空間、即ち化合物の表面上のヒスチジ
ン残基の配列を意味している。ヒスチジン残基の近接は
一次構造に基づいてすでに定められるか、或いは二次及
び／又は三次構造によってのみ実現される。従って、本
発明のキレート樹脂は数個、特に近接する、好ましくは
すぐ隣接するしスチジン残基を有する自然及び変性蛋白
質の精製に適している。

本発明のキレート樹脂はハツチ式あるいは連続的カラム
操作に使用することができる。蛋白質のｉｉ通に先きた
ち、本発明のキレート樹脂をそれ自体はニッケルによっ
”Ｃキレート形成しない緩衝液、好ましくはｐＨ８のリ
ン酸緩衝液で都合よく平衡化させる。・１乙衡化緩衝液
（並びに溶出緩衝液）は変性囚了或いはブタ−ジエン１
〜、例えばグアニジン塩酸、尿素或いはトリトン（ｔｒ
ｉｔｏｎ）を含む。この、１、うな変性因子又はデター
ジェントを加えても、例えば膜蛋白質の如く水に極めて
難溶な蛋白質についてすら操作になんら問題はない。蛋
白質の溶菌は一定のｐ　Ｈ値、或いは直線又は不連続的
１−降Ｉ］　Ｉ−１勾配で行うことができる。至適溶出
条件は存在する不純物の量と種類、精製する物質の量、
カラＪ、の大きさ等に依存するので、場合毎に適宜法め
ればよい。

以下の実施例は本発明の二１〜リロトり酢酸誘導体の製
造、本発明の金属キレート樹脂の製造並びに近接するヒ
スチジン残基を持つ蛋白質の精製におけるそれらの使用
を示すものである。

実施例１ ブロム酢酸４１．７　ｇを１５０ｍ１の２Ｎ水酸化ナト
リウムに溶解し、０°Ｃに冷却した。これに、４２ｇの
と Ｎ　　−Ｚ−１、−リジンを２２５ｍ１の２Ｎ水酸化す
ｌ・リウムに溶解した溶液を攪拌しなから０℃でゆっく
り滴下した。２時間後冷却を止め、この混合液を一夜攪
拌した。この反応混合液は５０℃に２時間保ち、綺、い
て、４５０ｍ１のＩＮ塩酸を加えた。混合液を冷却した
後、析出した結晶を濾別した。この生成物をＩＮ水酸化
ナトリウム溶液に溶解し、同量のＩＮ塩酸で再沈澱させ
、濾別した。白色結晶、ｍ、ｐ、１７２〜１７４°Ｃ（
分解）、〔α）　ｎ　＝　＋９．９（ｃｍ　１　：　０
．ＩＮ　Ｎａ０Ｈ）のＮ−〔５−ヘンシルオキシカルボ
ニルアミノ−１−カルボキシペンチル〕−イミノジ酢酸
４０ｇが得られた。

得られたリジン誘導体１．９ｇを４９ｍ１の１Ｎ水酸化
ナトリウムに溶解し、スパーチルの先一杯分の５％パラ
ジウム／炭素を添加後、室温、常圧ｆで水素添加させた
。触媒を濾別し、そして濾液を蒸発させた。かくして、
６．２ハのＮ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル
〕　−イミノジ酢酸が得られた。その構造式 ％式％） をＮ　Ｍ　Ｒスペクトルにより確認した。

１００−のセファロース　ＣＬ−６１３（ファルマシア
製）をガラス吸引濾過器↓−で、約５００−の水で２回
洗浄し、次いで５００ｍ１丸フラスコ中１６−の４Ｎ水
酸化すトリウ去と）１．２２ｔｕのエビブロムヒドリン
き共に３０℃で、４時間反応させた。反応混合液の全量
は２００＋Ｊであった。次いで、活性化さ・ヒたセファ
ロースを°濾別し、水で中性に洗浄して、そして反応容
器にもどした。６，５［のＮ−（５−アミノ−１−カル
ボキシペンチル〕−イミノジ酢酸を５Ｏｍｔ！の水に溶
解し、１０．６　ｇの固体炭酸すＩ−ＩＪウムと共に活
性化させたセファロースに加えた。

この混合物を６０℃で一夜ゆっくりと攪拌した。得られ
た式 ％式％ （ＮＴＡ樹脂）のキレート樹脂をクロマトグラフィーカ
ラム中で連続的に、５００＋ｎｌの水、１００艷／のＮ
１５Ｏ，・６１１□０（２重量％）水溶液、２００ｍ１
の水、２００　ｍｆの０．２Ｍ酢酸（０，２Ｍ塩化す１
〜リウノ、と０．１重量／容量％ツイーン２０含有）及
び２００　ｍｌの水で洗浄した。得られた弐 （セフ　ｙ　ロース０ＣＬ−６８）　−０−ＣＨ２−Ｃ
Ｉ（Ｏ１＋）−ＣＩ＋２−Ｎ１１−（ＣＨｚ）４−ＣＨ
（Ｃ００ｔｌ）−Ｎ（ＣＨｚＣＯＯ−）Ｊｉ２４のキレ
ート樹脂のニッケルイオン濃度は約７．１μＨ／ｍｔに
なった。

実施例２ 同定化したイミノジ酢酸（ＩＭＡ）と固定化したニトリ
ロトリ酢酸（ＮＴＡ）のニッケル錯体の安定性の定量的
比較のため、この２種のニッケルキレート樹脂をイミノ
ジ酢酸の水溶液で溶離し、ニッケルイオンの流失を追跡
した。

５０−の式 ％式％） （調製方法：ヨソロソバ特許出願番号８４１０１Ｂ１４
．６゜］７ 公開番号１１８８０８参照）のＩＭＡ樹脂をりｌ］マＦ
・グラフィーカラム（ｄ　　１．６　ｃｍ　）に入れ、
水で十分に洗浄しまた。そして、１０１１１／の０．０
１２門ＮｉＳＯ４・５＋１゜０水溶液を１００艷／時間
の流速で導入し、続いて７〇−の水で洗浄した。それを
０．１Ｍイミノジ酢酸水溶液、ｐ　１１７．０で溶出し
た。１０−の分画を集めた。

ニッケルイオンしよ両分１０〜１９に検出（ＬＩＶ３９
０ｎｍ）された。

同様の方法で、５０ｍ１の式 ％式％（２ のＮＴＡ樹脂をクロマトグラフィーカラム（ｄ＝］、　
（ｉ　ｃｍ　）に入れ、洗浄して、その後、１０艷の０
．０１２Ｍ　Ｎ１５（＋、　　・５１１□０水溶液を充
填し、再び水洗し、そし’ＣＯ，］門イミノジ酢酸水溶
液、ｐｆｌ　７．　Ｏで？容器した。ニッケルイオンは
両分３０〜３４にのみ検出（ＩＩｔ１３９０ｎｍ）され
、このことから、ニッケルイオンが既知１Ｍ八へ脂より
も新規なＮＴＡ樹脂中でより強く結合していることは明
らかである。

実施例３ ６．５ｇのブロム酢酸を８．１ｍｌの４Ｎ水酸化ナトリ
ウムに溶解し、０．Ｃに冷却した。それに、４．１ｇの
Ｎ″′−ヘンシルオキカルボニル−１，−２，４−ジア
ミノ酪酸を２４．４Ｉｎｌの２Ｎ水酸化ナトリウム溶液
に溶解した溶液を攪拌しながら滴下した。２時間後、冷
却を止め、混合物を一夜攪拌した。次に、この反応混合
物を５０℃２時間保持し、そして１２．２ｍ１．の４Ｎ
塩酸を加えた。この混合物を冷却した後、分離した結晶
を濾別した。生成物は２Ｎ水酸化ナトリウム溶液に溶解
し、６．１艷の４Ｎ塩酸で再沈澱し、濾別した。白色結
晶、ｍ、ｐ、　１３６〜１３８℃　（分解）のＮ−〔３
−ベンジルオキシカルボニルアミノ−１−カルボキシプ
ロピル〕−イミノジ酢酸５ｇを得た。

得られた酪酸誘導体２．９ｇを１６−のＩＮ水酸化ナト
リウム溶液に溶解し、スパーチルの先一杯分の５％パラ
ジウム／炭素を添加後、室温、常圧下で水素添加させた
。触媒を濾別し、濾液を茅発させた。かくして、２．２
ｇのＮ−Ｃ３−アミノ−１−カルポキシプロビル〕−イ
ミノジ酪酸が得られた。その構造 Ｎｌｌ□（Ｃ１１□’）　２−ＣＩｌ　（ＣＣＯＩ＋）
　−Ｎ　（Ｃ）１２ｃＯＯＨ）　２をＮ　Ｍ　Ｒスペク
トル ５Ｑ＋ｎ／の水に得られたＮ−（３　　アミノ−１−カ
ルボキシプロピル〕ーイミノジ酢酸１．９ｇを溶解した
溶液を２．　６　１ｒの固体炭酸すトリウムで処理した
。？ｎ合物を０°Ｃに冷却し、これにイミダゾールカル
ハメイ１〜　（ピアース社製のりアクチーゲル７Ｎ）で
活性化さｕ″たアガロース５０＋ｎｌを加えた。０℃、
１５時間インキュヘーシコン後□、得られた、式７式％
） のキレート樹脂を濾別し、水洗して、実施例１で記載し
た如（ＨＨＩ＋イオンを導通した。得られた、式 ％式％） のキレ−Ｉ・樹脂のニッケルイオン濃度は３．１ｇＭ／
ｉｅになった。

実施例４ カラＪ、（直径−］、　ｃｍ、長さ−４．８ｃｍ）に式
７式％） （ＮＴＡ樹脂）の金属を含まないキレート樹脂を満たし
、カラム二倍容量の０．１Ｍ　Ｎ＋ＳＯ＜・５１ｈＯで
洗い、次いで、カラム二倍容量の０．２　Ｍ酢酸で洗浄
することによりニッケル型とした。次に０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＴ（８．０）と０．５Ｍ塩化ナト
リウムの溶液で（それぞれの流速：　１３．２ｍｆ／時
間）で平衡化させた。

１曙の式 ％式％ のモデルペプチドを１ｍｌの平衡緩衝液に溶解し、カラ
ムに付した。このモデルペプチドは０．２Ｍイミダゾー
ル、０．１Ｍリン酸すｌ・リウム、ｐ１４８．０と０．
５Ｍ塩化ナトリウムの溶液で溶離できた。溶離液の検出
はムーレ．ニス、及びステエイン．ダブリュ（Ｍｏｏｒ
ｅ，Ｓ．ａｎｄ　Ｓｔｅｉｎ．Ｗ．）　　（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ。

１７６、　３６７〜３８８（１９４Ｂ）　）に従いニン
ヒドリンで行った。

実施例５ 実施例４と同様の方法で、カラム（直径＝１ｃｍ。

長さ４．８ｃｍ）にＮＴＡ樹脂を満たし、ニッケル型と
した。０．２Ｍ酢酸で洗浄後、このカラムを７Ｍグアニ
ジン塩酸、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液の溶液（ｐ
Ｈ８．０）で平衡化させた。

神々の量（１２．７曙まで）の式 ％式％ のモデルペプチドを１４１の７Ｍグアニジン塩酸、０、
　１リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）の溶液に溶解し、
このカラムに付した。このペプチドは７Ｍグアニジン塩
酸に易溶であるが、０．１Ｍリン酸ナトリウムと０．５
４塩化ナトリウムには難を容である。９容出は段階的に
ｐＨを下げることによって行った。ペプチドはλ−２８
０ｎｍのＬＪＶスペクトロメトリーにより検出された。

牛膵臓由来ｌ・リブシンと馬心臓由来チトクロームＣを
比較物質として使用した。２種の蛋白質ともＮ　ｉ’　
Ａ樹脂にｐＨ８で結合しない。明らかにヒスチジンの配
列が決定的な役割をばたしている。

トリプシンの場合、３個のヒスチジンは２９．４６及び
７９位に位置しているが、それば７Ｍグアニジンで構造
をこわしても安定な錯体を形成する位置ではない。チト
クロームＣの場合では、２個のヒスチジンが空間的に近
接（１８と２６位）しているが、１個のヒスチジンがヘ
ムー鉄（ｈａｅｍ−１ｒｏｎ）に結合しているので、そ
れは２配位子を形成する位置ではない。

実施例６ 乳酸脱水素酵素イソ酵素は分子量１４０，０００の４量
体蛋白質である。豚由来のこのイソ酵素はアミノ末端領
域を除いてほとんど相同である。これば、この蛋白質表
面上に位置している。心臓型イソ酵素はこの領域にヒス
チジンを持たないが、筋肉型は３個持ち、その中には旧
５−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−旧Ｓの配列がある〔エル、リー（
Ｌ、Ｌｉ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８゜７０
２９〜１０３２　（１９８３）　〕。

実施例４に記載した如く、カラム（直径−１ｃｍ。

長さ−４，８ｃｍ）にＮＴＡ樹脂を満たし、ニッケル型
とし、そして０．１Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐ８
７．５）と０．５Ｍ塩化すトリウムの溶液で平衡化さ・
ｌた。２■の豚心臓（＋１．−１．０１１）又は豚筋肉
団、−１、ＯＨ）由来の乳酸脱水素酵素を１．５−の平
衡緩衝液に溶解し、Ｌ記カラムに付した。１１．−１．
ＯＨはその２８個のヒスチジン残ノ、（にもかかわらず
吸着しないが、？１４−Ｌｏｌｌはｐ　Ｈ７，５で吸着
し、ｐＨ６に下げることでン容因］させた。

本実験ばＮＴＡ樹脂が構造要素として蛋白質表１頂にに
隣接するしスチジン残基を持つ蛋白質にきわめて選択的
であることを示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 キャリアーマトリックス−スペーサー−ＮＨ−（ＣＨ＿
   ２）＿ｘ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ（ＣＨ＿２ＣＯＯ＾−
   ）＿２Ｎｉ＾２＋（ I ） （式中、ｘは２，３又は４を示す） で表わされる金属キレート樹脂。 ２、キャリアーマトリックスがアガロースである特許請
   求の範囲第１項に記載の金属キレート樹脂。 ３、キャリアーマトリックスがセフアロース（登録商標
   ）ＣＬ−６Ｂである特許請求の範囲第１項に記載の金属
   キレート樹脂。 ４、スペーサーが−Ｏ−ＣＯ−又は−Ｏ−ＣＨ＿２−Ｃ
   Ｈ（ＯＨ）−ＣＨ＿２−である特許請求の範囲第１項〜
   第３項のいずれかに記載の金属キレート樹脂。 ５、式 Ｈ＿２Ｎ−（ＣＨ＿２）＿ｘ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ（
   ＣＨ＿２ＣＯＯＨ）＿２ （式中、ｘは２、３又は４を示す） で表わされる化合物及びその塩。 ６、Ｎ−〔３−アミノ−１−カルボキシプロピル］−イ
   ミノジ酢酸。 ７、Ｎ−〔５−アミノ−１−カルボキシペンチル〕−イ
   ミノジ酢酸。 ８、特許請求の範囲第５項〜第７項のいずれかに記載の
   化合物をスペーサー基を付して機能化したキャリアーマ
   トリックスと反応させ、次いで、ニッケル塩溶液で洗浄
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第４項の
   いずれかに記載の金属キレート樹脂の製造方法。 ９、機能化したキャリアーマトリックスが▲数式、化学
   式、表等があります▼基を含むオキシラン−アガロース
   である特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １０、機能化したキャリアーマトリックスが▲数式、化
   学式、表等があります▼基を含むイミダゾールカルバメ
   イト−アガロースである特許請求の範囲第８項に記載の
   方法。 １１、式 Ｒ−ＨＮ−（ＣＨ＿２）＿ｘ−ＣＨ（ＮＨ＿２）−ＣＯ
   ＯＨ （式中、Ｒはアミノ保護基を示し、ｘは２、３または４
   を示す） で表されるＮ−末端保護化合物を少なくとも２当量のブ
   ロム酢酸と反応させ、生じた生成物から保護基を脱離さ
   せることを特徴とする式 Ｈ＿２Ｎ−（ＣＨ＿２）＿ｘ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ（
   ＣＨ＿２ＣＯＯＨ）＿２ （式中、ｘは２、３又は４を示す） で表わされる化合物の製造方法。 １２、保護基がベンジルオキシカルボニル（Ｚ）で、そ
   の脱離をパラジウム／炭素の存在下、水素添加によって
   行なわせる特許請求の範囲第１１項に記載の方法。 １３、Ｎ＾γ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−２，４
   −ジアミノ酪酸をブロム酢酸と反応させ、生じた反応生
   成物をパラジウム／炭素の存在下、水素添加させること
   を特徴とする〔３−アミノ−ｌ−カルボキシプロピル〕
   −イミノジ酢酸の製造方法。 １４、Ｎ＾ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン
   をブロム酢酸と反応させ、生じた反応生成物をパラジウ
   ム／炭素の存在下、水素添加させることを特徴とするＮ
   −〔５−アミノ−１−カルボキシペンチル〕−イミノジ
   酢酸の製造方法。 １５、蛋白質を特許請求の範囲第１項〜第４項に記載の
   金属キレート樹脂上でアフィニティークロマトグラフィ
   ーに付することを特徴とする数個の近接するヒスチジン
   残基を含む蛋白質の精製方法。 １６、特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載
   のキレート樹脂の金属キレートクロマトグラフィーへの
   使用。 １７、特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載
   のキレート樹脂の、数個のヒスチジン残基を含む蛋白質
   の精製への使用。 １８、特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載
   のキレート樹脂の、２個の直ぐ隣接するヒスチジン残基
   を含む蛋白質の精製への使用。 １９、特許請求の範囲第８項〜第１０項のいずれかに記
   載の方法、又はその自明の化学的均等方法によって製造
   される特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載
   の金属キレート樹脂。 ２０、特許請求の範囲第１１項〜第１４項のいずれかに
   記載の方法、又はその自明の化学的均等方法によって製
   造される特許請求の範囲第５項〜第７項のいずれかに記
   載の化合物。