CN113164915A

CN113164915A - 固相螯合剂材料，其制备方法及其用于纯化蛋白质的用途

Info

Publication number: CN113164915A
Application number: CN201980078337.5A
Authority: CN
Inventors: R·法比斯
Original assignee: Coobe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Coobe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2021-07-23
Also published as: WO2020109162A1; US20220023851A1; CA3121103A1; JP2022509239A; CA3121103C; EP3887033A1

Abstract

本发明涉及一种固相螯合剂材料，可用于蛋白质纯化等方面。该固相螯合剂材料包括一个固相、结合至所述固相的多胺基团和结合至所述多胺基团的螯合基团。对于每个多胺基团，至少一部分的多胺基团与至少两个螯合基团连接。每个螯合基团包含一个或多个氨基聚羧酸基团(APA基团)，条件是每个与至少两个螯合基团连接的多胺基团的APA基团的数目为至少三个。几个APA可以形成线性螯合链或支化螯合链，其中APA基团通过双功能或三功能连接子相互连接。本发明的负载金属离子固相螯合剂材料展示强大的金属结合能力、对螯合剂、还原剂和碱性溶液的高稳定性、对蛋白质的高亲和力，以及极高的结合能力。此外，本发明涉及一种制备所述固相螯合剂材料的方法和一种以负载金属离子的固相螯合剂材料纯化组氨酸标记重组多肽和蛋白质、磷蛋白和金属配位蛋白质的方法。

Description

固相螯合剂材料，其制备方法及其用于纯化蛋白质的用途

技术领域

本发明涉及固相螯合剂材料的领域和这种固相螯合剂材料的制备方法。此外，本发明涉及一种用负载金属的固相螯合剂材料以纯化多肽和蛋白质的方法，以及负载金属的固相螯合剂材料包括用于固定化蛋白质的金属亲和纯化的用途。

技术背景

由Porath(《自然》258：598，1975)开发的固定化金属亲和色谱法(IMAC)已成为用作纯化重组蛋白的标准方法；当需要对大量重组蛋白进行纯化时，它仍是最受欢迎的方法之一。

该方法的原理是基于在蛋白质的氨基酸侧链上引入多个组氨酸基团，这使它们对固定的金属离子具有更高的亲和力。这些所谓的“组氨酸标记”由连续的组氨酸残基以及组氨酸与其他氨基酸结合而成，通常包括六至十个组氨酸。这些“组氨酸标记”显示出比天然蛋白质高得多的对固定化金属离子的亲和力，因此可以进行高度纯化，尤其是在将低浓度的咪唑添加到结合和洗涤缓冲液中时，可减少没有组氨酸标记的蛋白质的非特异性相互作用。

或者，IMAC可用于纯化磷蛋白，其中金属离子直接与磷酸基团结合。通过这种方法，可以将磷蛋白与不具有磷酸基团的蛋白分离；不具有磷酸基团的蛋白与金属离子之间没有结合或只有近似弱的结合。

IMAC树脂可与金属(例如Zn和Cu)结合使用，以可逆方式结合金属结合蛋白(例如锌指蛋白)和铜相互作用蛋白(例如铜氧还蛋白或血蓝蛋白)。

用于IMAC的配位体可以基于配位体可以在金属离子上占据的配位体位置数进行分类。因此，获得三个金属离子结合基团(例如胺、羧基、磷酸盐等)的螯合剂被称为三配位基螯合剂。四配位基螯合剂可以在金属离子上配位到四个位置，而五配位基螯合剂可以占据五个位置。

二十多年来，作为三配位基螯合剂的固相固定化亚氨基二乙酸(IDA)和作为四配位基螯合剂的氨基三乙酸(NTA)被确立为IMAC的标准材料。四配位基“Talon”配位体以及五配位基螯合剂，例如三羧甲基乙二胺(TED)，是也可以从市场上买得到的替代螯合剂。近年来，一些基于五配位基螯合剂的树脂，例如完整的His Tag树脂(罗氏诊断有限责任公司)和Ni Sepharose Excel(通用电气医疗)已进入市场。

对于IMAC，已经成功地应用了许多不同金属，因此已研究了例如Ni、Co、Cu、Fe、Ca、Zn、Al、Eu、Ga和Sc。为了纯化磷蛋白，广泛使用了AI与IDA结合使用，以及与Fe、Ga和Eu与NTA结合使用。

应当指出的是，特别是可以非常容易获得且成本低的亚氨基二乙酸具有以下缺点：仅通过三个功能化就能将金属离子固定在固相上；因此众所周知，金属离子被浸出到缓冲液中，蛋白质结合能力从而降低，且该洗脱缓冲液中可能含有痕量的金属离子。并且，在金属离子上该蛋白质具有几乎三个自由配位位点，一些没有组氨酸标记的蛋白质也与树脂结合，因此纯化后获得了污染的洗脱液。

四配位基螯合剂(例如NTA)在金属浸出方面要稳定得多，但是当裂解缓冲液中存在其他螯合剂(例如EDTA)或还原剂(例如DTT)时，金属离子会在纯化过程中散乱。EDTA是一种更强的螯合剂，可去除膜稳定的镁离子，并且是抑制裂解缓冲液中金属蛋白酶所必需的；当浓度高于2mM时，它几乎可将所有金属离子从NTA树脂中去除。添加DTT(二硫苏糖醇)有助于稳定蛋白质SH基团以抗氧化成二硫键和蛋白质二聚化，这将金属离子(如镍)还原到不带电荷的金属上，从而大大降低了蛋白质结合亲和力。

这些缺点可以通过使用稳定的五价螯合剂来改善，它们牢固地与金属离子结合，从而使金属离子不能被含EDTA的缓冲液去除。除此之外，具有例如五配位基螯合剂的镍的络合物对还原剂(例如DTT)非常稳定。

现有技术

Porath等人引入了用于纯化重组组氨酸标记蛋白的金属亲和色层分析法。(《自然》

258，598-599，1975)。这项新技术利用了这样的发现：金属离子(例如Cu²⁺和Zn²⁺)通过螯合剂与固相结合，与蛋白质侧链的组氨酸氨基酸的供体基团相互作用。在pH值较高时(组氨酸保持未质子化)，这种相互作用是显著的，而在pH值较低时(组氨酸被质子化)，可以从金属离子改性的固相洗脱蛋白质。用于固定金属离子的配位体是亚氨基二乙酸；但是，如果使用镍作为金属，IDA会通过三个配位基团来结合镍，因此镍螯合剂络合物的稳定性相对于pH值变化而言太低，螯合剂和还原剂在溶液中，可观察到金属从表面浸出。

Hochuli等人的EP0253303A2涉及基于取代的氨基三乙酸的四配位基配位体，该配位体是通过z-ε-赖氨酸的羧甲基化、脱保护、偶联到环氧活化的琼脂糖上并加镍而制备的。使用这种材料，可以实现与亚氨基二乙酸相比的改进，可以大大减少金属的浸出，同时对螯合剂(如EDTA)和还原剂的稳定性保持受限。

在EP1276716中，Kappel等人描述了结合硫醚的NTA配位体。这些限制与氨基偶联的氨基三乙酸相同。

在US6441146中，Minh描述了通过环氧功能化、赖氨酸偶联同时封闭氮并随后进行羧甲基化来合成五价螯合剂树脂。该物质可以通过使用例如碳二亚胺化学作用而被使用为用于共价固定的材料。

在《Talanta》1989年第36卷第341–346页，McCurley等人通过将乙二胺与产物的羧甲基化偶联，开发了一种基于固定化三(羧甲基)乙二胺(TED)的IMAC树脂。但是，根据该文章提供的证据，只能获得TED和乙二胺-N,N'-二乙酸的混合物。

Haner等人使用钴五配位基螯合剂去除钙离子，该钙离子是通过碳二亚胺化学作用激活EDTA并偶联到胺基功能化的琼脂糖上而合成的。

在EP2022561中，Goerlich等人描述了一种在过量的缩合剂[例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)]的存在下将多元羧酸(如EDTA或DTPA)与胺改性的固相结合的方法。除此之外，要求保护仅通过一个羧基偶联到聚羧酸酯上。

Goerlich等人的EP2183049描述了具有至少六个配位基团的螯合剂。所述螯合剂由单个羧基通过羧酰胺键被固定，用于固定金属亲和层析(IMAC)，以纯化具有多个组氨酸残基的重组蛋白。

在WO 2009/008802中，Andersson等人描述了通过将羧酸酐由酸酐偶联到酰胺功能化的琼脂糖上以合成五配位基螯合剂，使得该产物适合于重组蛋白的检测和纯化。

有一些将EDTA和DTPA偶联到双功能连接子上的例子。在US 5281704所描述的实施例6中，通过在用二环己基碳二亚胺活化后将DTPA四甲酯与乙二胺偶联，然后在氢氧化钠溶液中水解，来制备由两个通过酰胺键连接的DTPA分子组成的化合物。除此之外，还提到了其他螯合剂(如DOTA、EDTA和TTHA)作为连接连接子的二聚螯合剂的一部分，并通过酯或酰胺功能与连接子连接。

在《反应性和功能性聚合物》，29(1996)29–39中，Brosse等人将EDTA和DTPA酸酐与乙二醇、N-甲基二乙醇胺、乙二胺和许多其他二醇和二胺偶联。Tuelue和Geckeler通过螯合酸酐与二醇的一步反应制备了EDTA和DTPA与聚乙二醇的缩聚物。

在Macromol.Rapid Commun.2001，22，855±858，Geckeler等人公开了具有可生物降解和金属络合的具有侧羧基的水溶性糖共聚物的合成。但是，仅通过一种羧酸而被固定到固相并形成固相结合的螯合剂链的连接子连接的螯合剂直到现在才被公开。

在Algotsson等人的US 2013/0072638中描述了二聚体的五配位基螯合剂的制备，该通过支架连接并通过与支架相连的基团与碳水化合物物质偶联，从而使金属离子牢固结合。与单体五价螯合剂相比，此处的二聚螯合剂由于两个相邻的固定化金属离子的结合而提供了协同的结合作用，从而使蛋白质更牢固地结合。但是，由于具有两个螯合剂功能的支化连接子的空间需求，因此根据该发明的材料仅具有有限的螯合基团密度和具有蛋白质结合能力。

WO 2017/046625 A1描述了具有螯合链的螯合剂的合成，该螯合剂链对带有组氨酸标记的蛋白具有高结合能力。

本发明的目的是提供一种性能改善了的已改进固相螯合剂材料，其可用于包括重组蛋白的亲和纯化，特别是当螯合剂材料负载金属时。

发明内容

本发明提供了固相螯合剂材料和负载金属的固相螯合剂材料，其显示包括对碱性溶液的高稳定性。

此外，本发明提供了一种用于制备这种固相材料的简单而方便的方法。

此外，本发明提供了用于纯化蛋白质的方法以及固相螯合剂材料用于纯化蛋白质，特别是重组蛋白质的用途。

根据第一方面，本发明提供了一种固相螯合剂材料，其包括一个固相的、结合至固相的多胺基和结合至多胺基的螯合基团，其中多胺基的至少一部分与每个多胺基团的至少两个螯合基团连接，并且其中每个螯合基团包含一个或多个氨基聚羧酸基团(APA基团)，条件是与至少两个螯合基团连接的每个多胺基团的APA基团的数目为至少三个。

就本发明而言，多胺基团是指从多胺基衍生的基团。多胺基是包含几个伯或仲氨基团，

优选至少三个，更优选至少四个伯和/或仲氨基团的有机分子。这些氨基团的至少一部分或者，在优选的实施方案中，所有这些氨基团在固相螯合剂材料的合成过程中与固相上的反应性基团和/或与螯合基团前驱体的反应性基团反应。这些氨基团的反应可导致仲或叔氨基团或酰胺基团的形成。多胺可包含其他功能团，例如羟基团，其可用于将多胺共价结合到固相上。

就本发明而言，螯合基团是指从螯合基团前驱体衍生的基团。螯合基团前驱体可以是单一的螯合剂分子或螯合剂，例如EDTA分子，或至少两个或三个螯合剂分子的组合，它们彼此共价连接，优选地通过连接子部分彼此共价连接。螯合基团前驱体可以是未活化的，或者，例如借助于有机酸酐基团，可以是活化的。

如上所使用的术语“这些氨基团的至少一部分”必须被理解为，对于每个多胺基团，所有的多胺基团都与至少两个螯合基团连接，或者，对于每个多胺基团，只有一部分的多胺基团与至少两个螯合基团连接。具有至少两个螯合基团的多胺基团的量可以包括在本发明的固相螯合剂材料的合成过程中通过不同反应参与物的量来控制。优选地，大多数或全部多胺基团与至少两个螯合基团连接。

优选地，所述螯合基团选自由以下组成的组：单独的APA基团、由两个或更多个经由双功能连接子部分K彼此连接的APA基团形成的线性螯合链、由三个或更多经由三功能连接子L彼此连接的APA基团形成的支化螯合链，以及由四个或更多经由至少一个双功能连接子部分K和至少一个三功能连接子部分L彼此连接的APA基团形成的混合螯合链。与多胺基团结合的螯合基团的数目优选为至少三个，更优选为至少四个。

与连接有至少两个螯合基团的多胺基团偶联的APA基团的数目优选地在3至20个的范围内，更优选地在4至15个的范围内。所述至少三个APA基团可以是至少三个单体APA基团或螯合剂基团，其分别与多胺基团结合，或者它们可以以线性和/或支化的螯合剂链被组织，从而形成二聚体、三聚体、四聚体......等多聚螯合剂基团。

根据IUPAC的定义，“螯合剂”是指可以参与由至少两个配位键的形成的多配位基配位体。

在本发明中，螯合剂是氨基聚羧酸(APA)。优选使用的APA选自EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、TTHA(三亚乙基四胺六乙酸)、EDDS(乙二胺-N,N'-二琥珀酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-三乙酸)。

第一螯合剂的一个羧基团通过酰胺键与固相偶联。第一螯合剂的另一个羧基通过酰胺与连接子偶联，并且该连接子与第二或甚至第三螯合剂共价偶联，使得该螯合剂以直链或支链的形式结合到固相上，并通过每个分子仅一个螯合剂的单个羧基团结合到固相上。因此，每条链上只有一个改性的螯合剂与固相结合，因此螯合剂链的空间需求可与单个螯合剂媲美。与没有组氨酸标记的蛋白相比，这导致了固相上螯合剂的高密度和可媲美相邻螯合基团的作用，也导致了组氨酸标记蛋白的高结合能力以及高亲和力。

在本发明中，羧酸基团以酸形式书写；但当pH为对于重组蛋白的亲和纯化是常见的6至8.5时，大部分羧酸基团以羧酸盐形式存在，并且一些氨基团被质子化。为了使描述简单和清楚，在正文和权利要求书中，这些基团被写成“COOH”和NH₂。

优选地，以一个季戊四醇核心为基础，多胺基团衍生自选自以下的多胺：二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、直链和支链聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚丙烯亚胺、大环多胺(如环烷烃、轮环藤宁和1,4,7-三氮杂环壬烷)、支链多胺如1,1,1-三(氨基甲基)乙烷、三氨基乙基胺、三氨基丙基胺、四-乙基氨基胺、四-乙基氨基胺、四-氨基丙基胺和胺功能化的四功能支链PEG。

更优选地，多胺基团衍生自选自二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺和五亚乙基六胺的多胺。

甚至更优选地，多胺基团衍生自选自三亚乙基四胺、四亚乙基五胺和五亚乙基六胺的多胺。

多胺基团可以包含其他功能团，例如羧酸和羟基团等，只要它们不影响功能度即可。在本发明的优选实施方案中，螯合基团可具有

通式-(APAl-K)_n-APAZ

其中APA1和APA2彼此相同或不同，n为1至50的整数，K为双功能连接子部分；和/或

通式

和/或通式

其中APA1、APA2和APA3是彼此相同或不同的氨基聚羧酸基团，并且L是三功能连接子部分。

因此，在本发明的优选的固相螯合剂材料中，所述螯合基团可以是单独的APA基团、包括至少两个经由双功能连接子部分K连接的APA基团的线性螯合基团、包括至少三个通过三功能连接子部分L连接的APA基团的支链螯合基团，或所述不同类型的螯合基团的组合。

此外，优选的是，APA和连接子部分经由酰胺部分彼此连接和/或螯合基团和多胺基团经由酰胺部分彼此连接。

本发明的固相螯合剂材料的螯合基团可包含一个或多个双功能连接部分K和/或一个或多个三功能连接部分L。

根据本发明，双功能连接子部分K可以选自A-(CH₂)_n-B、A-Q-B和A-(C₂H₄0)_m-(CH₂)_n-B。式A和B表示能够与羧基反应的功能团，即OH、NH₂、NHR、Cl、Br、I、OM、OT和N₃。它们优选地选自NH₂和NHR。R可以是具有式C_nH_2n+1的烃基团，其中n在1至6的范围内。m是在1至12的范围内的整数，而n是在2至12的范围内的整数。Q是具有2至100个原子的直链或支链构型，任选地包含C、H、N、O和S，包括环状化合物，例如碳水化合物。

该双功能连接子K可以特别地是二胺。优选地，该双功能连接子部分K选自乙二胺、1,4-二氨基丁烷、1,6-二氨基己烷、1,8-二氨基辛烷和聚醚胺如a,ω-氨基功能化的聚丙二醇化合物，例如亨斯迈聚醚胺ED 600(美国德克萨斯州伍德兰兹，亨茨曼)。

优选地，该三功能连接子部分L可以具有以下通式之一：

其中A、D和E是能够与羧基团反应的功能团，优选-NH₂或-NHR，B是支链原子，优选C或N，其与至少三个稳定键连接，优选与碳原子结合，并与功能团连接，n、m和o是2到30范围内的整数。优选地，该三功能连接子部分L是三胺。更优选地，该三功能连接子部分L选自二亚乙基三胺、1,1,1-三(2-氨基乙基)胺、三(3-氨基丙基)胺和以一个甘油核心为基础的氨基功能化的三功能支链PEG。

优选地，用于合成多聚氨基聚羧酸树脂的连接子选自乙二胺、1,3-二氨基丙烷三(3-氨基丙基)-胺、三(2-氨基乙基)胺和/或二亚乙基三胺。

本发明的固相螯合剂材料可以具有被插入在固相和多胺基团之间的间隔基部分S。该间隔基部分优选地衍生自选自环氧氯丙烷、表溴醇、1,2-乙二醇二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚和烯丙基溴。该间隔基部分可以通过醚键偶联至固相，并通过酰胺键偶联至相邻的氨基聚羧酸。

优选地，该固相选自琼脂糖、纤维素、琼脂、右旋糖酐、壳聚糖、藻酸盐、结冷胶，优选琼脂糖，这些都是色谱载体。为了优化螯合基团的共价偶联，该固相优选地被多胺基功能化。

或者，该固相可包含多孔或无孔氧化硅、氧化铝、氧化钛、氧化锆、其他金属或半金属氧化物等，优选氧化硅。其他固相包含金层、玻璃、诸如聚苯乙烯的聚合物、甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、乙烯醇等。

该固相可以是但不限于多孔或无孔颗粒、磁性氧化硅、琼脂糖、聚苯乙烯、苯乙烯衍生物、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或聚乙烯醇颗粒。

优选地，该固相可以是传感器表面、膜、无孔色谱载体、多孔色谱载体、涂覆管、涂覆表面，例如Eppendorf或falcon聚丙烯管的涂层塑料表面、涂覆的微量滴定板、阵列板、微阵列表面。

根据本发明，该固相可优选地选自磁性琼脂糖、磁性氧化硅和磁性聚合物。更优选地，它是磁性琼脂糖。

根据本发明，该固相可优选地选自右旋糖酐改性的金芯片和磁珠。

对于本领域技术人员而言，存在许多制备胺改性的琼脂糖的方法，例如与环氧氯丙烷反应以及与多胺的化学反应。或者，通过与多胺基反应，将通过与氯乙酸钠反应获得的羧甲基化琼脂糖改性为胺。氨基团与螯合剂的羧基功能的化学反应可通过用EDC或其他缩合剂进行活化，或通过使螯合剂酐与多胺基直接接触来完成。其三，通过使琼脂糖与烯丙基缩水甘油醚或烯丙基溴反应，可以产生烯丙基功能化。双键的溴化结束后，卤化物可与多胺基反应。

胺改性的氧化硅、玻璃和其他金属氧化物可通过例如用3-缩水甘油基三乙氧基硅烷进行涂层并与多胺基反应来进行制备。金表面可以通过涂覆长的、硫羟功能化的线性分子(即所谓的“自组装单层”)进行改性，该分子可以被多胺基功能化。

根据本发明的固相螯合剂材料优选地是具有氨基聚羧酸分子的材料，该氨基聚羧酸分子由共价键合至固相的螯合剂链或支化的螯合剂分子组成。螯合剂链是通过将螯合剂与连接子分子偶联而形成的，其中链长可以调节。

根据第二方面，本发明涉及负载金属离子的固相螯合剂材料。该金属离子螯合剂材料包括上述固相螯合剂材料中的一种并且负载选自Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Eu³⁺、Ga³⁺、Mn²⁺和Ca²⁺的金属离子。

根据第三方面，本发明涉及一种制备上述定义之固相螯合剂材料的方法。

本发明方法的第一变体包括在形成具有至少三个经由酰胺基团键合至其上的单体APA基团的多胺基团的情况下，将至少三个单体APA共价键合至具有键合至其上的多胺基团的固相上。

本发明方法的第二种变型包括在固相材料形成具有酰胺基团的至少两个APA基团通过酰胺基键合的固相材料的情况下，将至少两个APA共价结合在具有多胺基团的固相上，并添加双功能连接子K或三功能连接子L在所述固相材料上，使所述偶联的连接子与第二APA的羧基反应，从而形成与多胺基团键合的APA基团的固相螯合剂。将多胺基团结合至固相，任选地重复添加连接子的步骤，然后添加另外的APA以延长线性螯合剂链或支化螯合剂链的长度。以这种方式产生的螯合基团以线性螯合链或支链螯合链的形式存在。

本发明方法的第三变体包括在形成包含线性螯合剂链或支化螯合剂链的多聚APA螯合剂的情况下，使至少两个单体APA与双功能连接子K反应或至少三个单体APA与三功能连接子L反应，并在形成具有至少两个经由酰胺基团键合至其上的线性和/或支化的螯合剂链的多胺基团的情况下，在具有键合至其上的多胺基团的固相上共价结合至少两个多聚APA螯合剂。

a)优选地，一种具有线性螯合基团的固相螯合剂材料的制备方法，所述线性螯合基团具有通过双功能连接子连接的APA基团，该方法包括以下步骤：提供APA和结合有多胺基团的固相；

b)在缩合剂的存在下将所述APA与所述固相偶联，其中在所述APA与所述固相结合的条件下，所述APA的单个羧基团与所述固相反应；

c)将步骤b)中获得的固相材料与双功能连接子K混合；

d)在缩合剂的存在下将所述双功能连接子K与APA羧基团偶联，其中所述双功能连接子K的单个反应性基团与所述结合的APA反应；

e)将步骤d)中获得的固相材料与另外的APA混合；

f)在缩合剂的存在下，将所述另外的APA与所述双功能连接子偶联，其中所述另外的APA的单个羧基团与结合在所述固相材料上的双功能连接子K的另外的反应性基团反应；

g)任选地至少重复一次步骤c)至f)。

优选地，一种具有线性螯合基团的固相螯合剂材料的制备方法，所述线性螯合基团具有通过双功能连接子连接的APA基团，该方法包括以下步骤：

a)提供APA二酐和结合有多胺基团的固相材料；

b)通过结合的多胺基的氨基团，将所述APA二酐与所述固相材料偶联，其中每个APA二酐中的一个酸酐基团与氨基部分反应，而另一个酸酐基团保持不变；

c)用无水溶剂洗涤步骤b)中获得的固相材料，以除去未偶联的二酐；

d)提供步骤c)中获得的固相材料和双功能连接子K；

e)使双功能连接子K与所述APA酸酐基团偶联，其中所述双功能连接子K的单个酰胺基团与所述APA酸酐基团反应，而所述双功能连接子K的另一个功能基团保持不变；f)用无水溶剂洗涤所述固相，以除去未偶联的连接子分子；

g)提供步骤f)中获得的固相材料和另外的APA二酐；

h)将所述APA二酐与所述双功能连接子K偶联，其中每个APA的单个羧基团与所述双功能连接子K的其余功能团反应；

i)任选地至少重复一次步骤c)至h)。

在本发明的上述方法中，可以在用于水解剩余酸酐基团的最后步骤中加入水或水性缓冲剂。

a)以2:1至1:1，优选2:1至1.25:1的比例提供APA二酐和双功能连接子K；

b)通过所述连接子上的胺或羟基，将所述APA二酐与所述双功能连接子K偶联，其中所述连接子与两种不同的二酐反应，从而形成物质APA1-K-(APA2-K)_n-APA3，其中APA1是具有一个酸酐基团和一个酰胺功能的APA，APA2是具有两个酰胺功能的APA，APA3是具有一个酸酐基团的APA，n的范围为0至50，优选0至10，并且K是双功能连接子部分；

c)提供结合有多胺基团的固相；

d)通过连接至所述固相的多胺基的氨基，将所述连接有连接子的二酐与所述载体偶联，其中每个APA的单个羧基与所述胺部分反应，而另一个酐基保持不变；

e)提供水或水性缓冲剂以水解剩余的酐基团。

优选地，一种具有支化螯合基团的固相螯合剂材料的制备方法，该支化螯合基团具有通过三功能连接子连接的APA基团，该方法包括以下步骤：

a)以3:1至9:4，优选3:1至5:2的比例，将APA二酐和三功能连接子与具有结合的多胺基团的固相混合；

b)通过胺基团将所述APA二酐与固相载体偶联至所述连接子上，其中所述连接子与三种不同的二酐反应，从而形成下式之一的反应产物，

其中APA1是具有一个酸酐基团和一个酰胺基团的APA基团，APA2是具有两个酰胺基团的APA，而L是三功能连接子部分；

c)提供包含多胺基团的固相；

d)通过酰胺基团将所述连接有连接子的APA与所述载体偶联到所述多胺基改性的固相上，其中每个氨基聚羧酸中的单个羧基团与胺部分反应，而其他酸酐基团保持不变；

e)提供水或水性缓冲剂以水解剩余的酸酐基团。

此外，本发明包括一种可用于蛋白质亲和纯化的固相结合材料的制备方法，其中多个氨基聚羧酸分子通过酰胺基团偶联。所述氨基聚羧酸由螯合剂组成，这些螯合剂通过双或三功能连接子与其他螯合剂连接。本发明的实施例可以由下式描述：

其中Z是固相，S是能够结合到固相和螯合剂上的任选的间隔基分子，n是0或1，PA是多胺基，APA是氨基聚羧酸或直链或支链的通过双功能连接子部分K和/或三功能连接子部分L相互连接的APA基团。

在这些式中，三个和四个氨基聚羧酸分子与一个多胺基偶联，但是氨基聚羧酸分子的数目也可以更大，例如五个、六个或甚至更多，这取决于多胺基和每个多胺基分子的现有氨基团数目。

根据第四方面，本发明涉及一种负载金属离子的固相螯合剂材料的制备方法。该方法包括执行上述用于生产固相螯合剂材料的方法之一，然后通过使所述固相螯合剂材料与金属离子溶液接触而固定化金属离子，所述金属离子选自Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Eu³⁺、Ga³⁺⁺、Mn²⁺和Ca²⁺。

根据第五方面，本发明涉及上述固相螯合剂材料或根据上述方法之一获得的固相螯合剂材料在分子生物学领域的用途，用于具有多个组氨酸残基的蛋白质的纯化、具有多个组氨酸残基的膜蛋白的纯化、具有多个组氨酸残基的GPCR的纯化、具有多个组氨酸残基的转运蛋白的纯化和/或用于治疗的蛋白的纯化。

根据第六方面，本发明涉及一种纯化重组蛋白或多肽的方法，包括以下步骤：

a)提供如上所述的或根据上述方法获得的负载金属的固相螯合剂材料；

b)提供包含具有多个组氨酸部分的蛋白质或多肽的样品，

c)使所述样品与所述负载金属的固相螯合剂材料接触；

d)从溶液中分离结合的多肽或蛋白质；

e)从固相中洗脱重组蛋白或多肽。

优选地，在以上方法中，蛋白质选自膜蛋白质、GPCR和抗原。

优选地，在以上方法中，将EDTA和咪唑以至少20mM的浓度添加到结合缓冲液中，并且以至少10mM的浓度添加DTT，而不干扰金属结合和蛋白质收率。

优选地，在上述方法中，根据前述权利要求的固相固定化氨基聚羧酸化合物可以用氢氧化钠溶液洗涤，以去除污染物和粘附蛋白，以再生该材料用于进一步的生物分子纯化，并且仍然具有每毫升至少50毫克的蛋白结合能力。

如上所述，基本上可以通过两种方法来制备根据本发明的物质：

a)首先将第一螯合剂共价偶联到多胺基改性的固相上，然后将双或三功能连接子的一端偶联到螯合剂上，使所述连接子与第二螯合剂的羧基团反应，并且任选地，通过羧酸功能将第二连接子与所述第二螯合剂偶联，添加第三螯合剂，其与所述第二连接子反应，依此类推：

b)通过使至少两个单体螯合剂与双或三功能连接子反应，然后通过一羧酸功能将所述多聚螯合剂偶联到多胺基改性的固相上来制备多聚螯合剂。

结合螯合剂的数量可以通过两种方式的不同途径确定，这对本领域技术人员来说是显而易见的：

a)用于使螯合剂和连接子分子偶联的重复步骤的数量以方式a)调节螯合剂链的长度。因此，通过循序地偶联螯合剂、连接子和螯合剂，得到二聚体螯合剂，而通过循序地偶联螯合剂、连接子、螯合剂、连接子和螯合剂，制备出三聚体螯合剂。

b)连接子与螯合剂的比例影响方式b)下的螯合剂─连接子─链的链长。因此，例如，当将连接子以1:2的比例缓慢添加到螯合剂的溶液中时，会获得具有式Ch-L-Ch的分子，而当将连接子以2:3的比例添加到螯合剂中时，将生成具有式Ch-L-Ch-L-Ch的物质(L表示连接子，而Ch表示螯合剂)。当以1:1的比例向螯合剂中加入连接子时，形成长链(Ch-L)_n，例如，如Brosse等人在《反应性和功能性聚合物》第29卷(1996)，第29至39页中的描述。

将螯合剂偶联到固相或连接子上的一种方法包括通过碳二亚胺化学反应，使用例如EDC或其他缩合剂(例如羰基咪唑、二琥珀酰亚胺基碳酸酯和其他肽键形成剂，如PyBOP和HBTU等)以活化螯合剂，并混合反应物。将连接子添加到活化的螯合剂中，以及将活化的螯合剂添加到连接子中也是可行的。还可通过转化为甲苯磺酰基、三氟甲磺酸酯或甲磺酰基功能等来活化连接子以偶联至羧基团上。关于常见方法的概述,请参阅Hermanson等人的《生物共轭技术》，第三版，ISBN：978-0-12-382239-0。

形成螯合剂链的另一种方式基于向螯合剂二酐的溶液中添加连接子或固相，优选地是在非质子溶剂，例如1,4-二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醚或四氢呋喃中添加。这些酸酐的例子有EDTA酸酐、DTPA酸酐和TTHA酸酐。氨基团与酸酐的偶联导致酰胺键的形成。

在螯合剂链被合成和偶联之后，反应产物可以带有金属离子，该金属离子可以结合所需的靶蛋白。由于Ni、Cu、Co、Zn、Fe、Eu和Sc适合于可逆蛋白结合，因此对于纯化带有组氨酸标记的蛋白，镍和钴是优选的，而铁和氧化铝被优选用于对磷蛋白的分离。例如，关于多组氨酸蛋白的IMAC，金属的亲和力的顺序为Cu>Ni>Zn>Co，而纯化的特异性的顺序为Cu<Ni<Zn<Co。

多组氨酸标记在分子生物学中很常见，可用于分离在细菌(如大肠杆菌、酵母和哺乳纲)中表达的重组蛋白。因此，带有组氨酸标记的蛋白质在pH值下与负载金属离子的螯合剂结合，其中组氨酸基团是非质子化的，而其余的大多数蛋白质则不与金属离子相互作用。当pH值降低并且组氨酸质子化时，蛋白质与金属离子的相互作用被清除，蛋白质可以从色谱柱上洗脱下来。或者，也可以通过应用高浓度的咪唑进行洗脱，该咪唑结合到金属离子上并替换组氨酸标记，从而洗脱蛋白质。对于该应用，通常使用100至300mM的咪唑浓度。

如前所述，例如Cu-IDA和Ni-NTA与色谱材料一起使用，以从生物化合物的混合物中纯化重组组氨酸标记的蛋白。根据本发明的固相固定的氨基聚羧酸化合物也可以用于组氨酸标记的蛋白的金属亲和纯化。由于这一事实，螯合剂仅通过一个到固相的连接就能与连接子连接到链状分子上，其空间需求量可与单EDTA相媲美，而固定化的螯合剂的数量要高得多。因此，由Cu²⁺确定的金属结合能力值非常高，可以达到50至80μmol/ml。除此之外，可以用根据本发明的材料来纯化非常大量的带有组氨酸标记的蛋白质。因此，在以下实施例中，可以获得每毫升高达80毫克蛋白质的能力。

而且，由于螯合剂和相邻金属离子之间的距离很短，它们能够以协同作用结合带组氨酸标记的蛋白质，这比单体螯合剂具有更高的亲和力。尽管使用了四配位基(六配位基，如具有两个酰胺功能而不是羧酸的EDTA)和五配位基(六配位基，如具有一个酰胺功能而不是羧酸的EDTA)螯合剂，但由于其亲和力强，所以根据本发明的这种材料对基于溶液的螯合剂和还原剂显示出极好的抗性。因此，即使在极端条件下(例如，当将20mM咪唑、20mMEDTA和10mM DTT添加到结合缓冲液中时)，也能保持这些极高的蛋白质结合能力。

由于对螯合剂和还原剂具有高抗性，根据本发明的材料特别适合于膜蛋白尤其是GPCR的纯化。对于膜蛋白的纯化，在许多情况下，使用诸如十二烷基麦芽糖苷或正十四烷基磷酸胆碱(FOS-14)的去污剂来稳定水溶液中的蛋白质，以防止沉淀和变性。在实验中，已经测试了将根据本发明的材料用于膜蛋白的纯化，该材料显示出高结合能力和对去污剂的良好耐受性。

为了配合经济的纯化程序，尤其是当使用填充柱时，希望开发一种纯化树脂，该树脂可以用溶液再生，可以从进一步的纯化中除去污染物，并允许将该树脂用于其他纯化操作而不产生污染。通常，本领域技术人员使用浓度为100mM至500mM的氢氧化钠溶液，该溶液可从亲和柱中有效去除沉淀的和非特异性地结合的蛋白质。在根据本发明的材料的合成过程中，一个出人意外的发现是，即使在进行蛋白质纯化和氢氧化物溶液处理之后，该树脂的结合能力仍然非常高并且明显高于其他可比材料。因此，即使在用0.5M NaOH重复处理5分钟之后，仍可以保持每毫升树脂至少50pm的蛋白质结合能力。氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的特异性磷酸化是调节细胞蛋白质活性的最常见机制。在激酶的催化下，磷酸部分被添加到相应氨基酸的羟基团上。蛋白激酶的活性由各种细胞内关键信号(例如，环状AMP或Ca²⁺的浓度)来调节。磷酸酶催化蛋白质的特异性去磷酸化，使酶在磷酸化和去磷酸化状态之间切换。

多年以来，已知可逆蛋白磷酸化可控制广泛的细胞过程和活动，例如跨膜信号传导、信号的细胞内扩增和细胞周期控制。对此类磷酸化残基的分析是信号转导研究的核心。对于负载有铝、铁、镓或铕离子的材料，将磷酸化与未磷酸化的细胞蛋白部分完全分离是可行的。亲和色谱法可以将磷酸化的蛋白质结合到色谱柱上，而未磷酸化的蛋白质可以在流通级分中回收，从而降低了复杂性并极大地推进了磷酸化谱研究。两种级分均保留完整的生物学活性，如果需要，可以进一步纯化。

在任何氨基酸上带有磷酸基的蛋白质都以高特异性结合到固相上，而没有磷酸基的蛋白质则不结合到树脂上，因此可以在流通级分中找到。

为了纯化，在pH 6.0的25mM MES缓冲液中进行温和的裂解程序，该缓冲液包含CHAPS、两性离子去污剂、蛋白酶抑制剂以及(可选地)苯并酶或另一种DNase或RNase，以去除蛋白质-核酸络合物。用裂解缓冲液进行洗涤步骤，

然后用pH 7.5的磷酸钾缓冲液洗脱纯化的磷蛋白。通过这程序，即使存在强螯合剂和还原剂时，根据本发明的材料也可以进行有效纯化。

如果固定了合适的金属阳离子，金属结合蛋白也对IMAC树脂表现出亲和力。因此，在蛋白质Expr Purif.2011,79(1):88-95中检查了不同的固定化金属离子对锌指结构域的亲和力，其结果是，可以监视不同的亲和力，具体取决于有关元素。铜结合蛋白可以使用Cu和Zn IMAC色谱柱进行纯化，如Proteomics,2006,May；6(9):2746-2758中所述。由于高配位体密度以及与金属阳离子的牢固结合，使将根据本发明的材料用于该应用很有潜力。

此外，负载金属离子的螯合剂树脂适用于核酸纯化。在Biotechnol.Prog.2005,21,1472-1477中提出了一种分离单链和双链核酸的方法。该方法的原理是基于将咪唑基部分可逆吸附到固定的金属离子上。因此，部分变性的基因组DNA可以与IMAC树脂结合，而没有嘌呤碱基的可及咪唑基团的双链质粒DNA无法被固定。使用这种方法，使用Cu IDA琼脂糖可以达到1.000.000倍的清除率。如Plos ONE,2011,6,1,e15412中所述，其他应用还包括删除PCR错误产物。根据本发明的材料的极高稳定性和亲和性使得该材料适合于该应用。

本发明材料的另一应用是从溶液中去除金属离子。EDTA形成稳定性常数为约14至25的金属络合物(Martell A.E.&Smith R.M.(1982)，临界稳定性常数，Vol.5：第一增刊，Plenum出版社，纽约)，因此氨基聚羧酸链改性的固相可以有效地用于结合金属离子，例如Ni²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Cr³⁺和Pb²⁺，并通过简单地使螯合剂结合的树脂与液体接触来大大降低其在溶液中的浓度。一个例子是使用螯合剂改性的琼脂糖颗粒，可以将其填充到小柱中，并在液体通过色谱柱时降低液体中重金属的浓度。除此之外，螯合链还可以与磁性琼脂糖颗粒偶联，然后将其添加到溶液中，混合并在与金属离子结合后通过磁性分离器除去。

根据本发明的另一方面，固相固定的氨基聚羧酸化合物由固相、间隔基分子、结合至间隔基分子的多胺和共价偶联至多胺基的多种氨基聚羧酸组成。

优选地，在所述氨基聚羧酸化合物中，间隔基通过醚键与固相偶联，并通过酰胺与相邻的氨基聚羧酸偶联。

优选地，在所述氨基聚羧酸化合物中，相邻的氨基聚羧酸通过酰胺键固定在固相上。优选地，在所述氨基聚羧酸化合物中，与多胺基偶联的氨基聚羧酸的数目为3至20。优选地，在所述氨基聚羧酸化合物中，与多胺基偶联的氨基聚羧酸的数目为4至15。优选地，在所述氨基聚羧酸化合物中，间隔基是通过在琼脂糖上偶联环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、1-2-乙二醇二缩水甘油醚和1,4-丁二醇二缩水甘油醚而制备的。

优选地，在所述氨基聚羧酸化合物中，间隔基是通过在琼脂糖上偶联烯丙基缩水甘油醚或烯丙基溴并随后进行溴化而制备的。

优选地，在所述氨基聚羧酸化合物中，氨基聚羧酸具有通式：

(APA1-L)_n-APA2

其中APA1是通过两个酰胺功能偶联的六配位基螯合剂，APA2是六配位基螯合剂，L是通过酰胺功能偶联到APA1和APA2的连接子分子，n为1至50。

优选地，在所述氨基聚羧酸化合物中，连接子分子是二胺。

优选地，在所述氨基聚羧酸化合物中，连接子分子选自乙二胺、1,4-二氨基丁烷、1,6-二氨基己烷、1,8-二氨基辛烷和亨斯迈聚醚胺ED-600。

其中APA1是六配位基螯合剂，通过两个酰胺功能偶联到固相和连接子上，APA2和APA3是六配位基螯合剂，通过酰胺功能偶联到连接子上，而L是连接子分子。

其中APA1是六配位基螯合剂，通过两个酰胺功能偶联到固相和连接子上，APA2是六配位基螯合剂，通过两个酰胺功能偶联到连接子上，APA3是六配位基螯合剂，通过酰胺功能偶联到连接子上，而L是连接子分子。

优选地，在所述氨基聚羧酸化合物中，连接子分子是三胺。

优选地，在所述氨基聚羧酸化合物中，以为一个甘油核心为基础，连接子分子选自二亚乙基三胺、三(2-氨基乙基)胺、三(2-氨基丙基)胺或氨基功能化的三功能支链PEG。优选地，在所述氨基聚羧酸化合物中，氨基聚羧酸具有通式：

(APA1-L)_n-APA2

其中氨基聚羧酸APA1和APA2选自EDTA、DTPA、TTHA、EDDS、EGTA、DOTA和NOTA，它们通过酰胺基团与固相或连接子偶联，并且L是双功能连接子分子；

其中APA1、APA2和APA3选自EDTA、DTPA、TTHA、EDDS、EGTA、DOTA和NOTA，它们通过酰胺基团与固相或连接子偶联，并且L是连接子分子。

优选地，在所述氨基聚羧酸化合物中，以一个季戊四醇核心为基础，多胺基选自二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、直链和支链聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚丙烯亚胺、大环多胺如环烷烃、轮环藤宁和1,4,7-三氮杂环壬烷、支链多胺如1，1，1-三(氨基甲基)乙烷、三氨基乙基胺、三氨基丙基胺、四-乙基氨基胺、四-乙基氨基胺、四-氨基丙基胺和胺功能化的四功能支链PEG。

优选地，在所述氨基聚羧酸化合物中，多胺基选自三亚乙基四胺、四亚乙基五胺和五亚乙基六胺。

优选地，在所述固相固定的氨基聚羧酸化合物中，固相选自琼脂糖、纤维素、琼脂、右旋糖酐、壳聚糖、藻酸盐、结冷胶，更优选琼脂糖。

优选地，在所述固相固定的氨基聚羧酸化合物中，固相选自氧化硅、二氧化钛、二氧化锆、二氧化铝、其他金属或半金属氧化物、金、玻璃或选自丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、苯乙烯衍生物、乙烯基酯、乙烯基酰胺或乙烯醇的聚合物。

优选地，在所述固相固定的氨基聚羧酸化合物中，固相是多孔或无孔色谱载体、膜、涂覆的表面、涂覆的管、传感器表面、微阵列表面和涂覆的微量滴定板。

优选地，在所述固相固定的氨基聚羧酸化合物中，固相是磁性琼脂糖、磁性氧化硅或磁性聚合物，优选磁性琼脂糖。

优选地，在所述固相固定的氨基聚羧酸化合物中，使氨基聚羧酸与选自Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Eu³⁺、Ga³⁺、Mn²⁺和Ca²⁺的金属离子接触；

根据本发明的另一方面，由固相、间隔基分子、结合至间隔基分子的多胺基和共价偶联至多胺基的多种氨基聚羧酸组成的所述固相固定的氨基聚羧酸化合物的合成包括以下步骤：

a)提供EDTA和包含多胺基分子的固相；

b)在缩合剂的存在下将EDTA与固相偶联，其中单个EDTA基团与固相反应；

c)提供步骤b)中获得的固相固定的EDTA和双功能连接子；

d)在缩合剂的存在下使连接子与EDTA羧基团偶联，其中连接子的单个基团与EDTA反应；

e)提供步骤d)中获得的具有共价连接的连接子的固相固定化EDTA和第二EDTA分子；

f)在缩合剂的存在下将第二EDTA与连接子偶联，其中第二EDTA的单个基团与固相反应；

g)任选地至少重复一次步骤c)至f)。

h)通过使固相固定的氨基聚羧酸化合物与选自Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Eu³ ⁺、Ga³⁺、Mn²⁺和Ca²⁺的金属离子溶液接触来固定金属离子。

a)提供EDTA二酐和包含多胺基分子的固相；

b)通过胺基团将所述二酐与所述载体偶联到固相上，其中每个EDTA的单个酸酐基团与胺部分反应，而另一个酸酐基团保持不变；

c)用无水溶剂洗涤固相以除去未偶联的二酐；

d)从步骤c)提供固相固定的EDTA化合物和双功能连接子分子；

e)使连接子与EDTA酸酐基团偶联，其中连接子的单个胺基团与EDTA酸酐反应，而另一个功能团保持不变；

f)用无水溶剂洗涤所述固相，以除去未偶联的连接子分子；

g)从步骤f)提供具有共价连接的连接子的固相固定化EDTA和另外的EDTA二酐；

h)将所述二酐与所述连接子偶联，其中每个氨基聚羧酸的单个羧基团与胺部分反应；

i)任选地至少重复一次步骤c)至h)。

j)通过使固相固定的氨基聚羧酸化合物与选自Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Eu³ ⁺、Ga³⁺⁺、Mn²⁺和Ca²⁺的金属离子溶液接触来固定金属离子。

根据本发明的另一方面，由固相、间隔基分子、结合至间隔基分子的多胺基以及与多胺基共价偶联的多种氨基聚羧酸组成的所述固相固定的氨基-多元羧酸化合物的合成包括以下步骤：

a)以2:1至1:1，优选2:1至1.25:1的比例提供EDTA二酐和双功能连接子；

b)通过胺或羟基团将所述二酐与所述载体偶联到所述连接子上，其中所述连接子与两种不同的二酐反应，从而形成物质APA1-L-(APA2-L)n-APA3，其中APA1是具有1个酸酐基团和1个酰胺功能的EDTA，APA2为具有2个酰胺功能的EDTA，APA3为具有1个酸酐基团的EDTA，而n为0至50，优选0至10。

c)提供包含多胺基团的固相；

d)通过胺基团将所述连接有连接子的二酐与所述载体偶联到固相上，其中每个氨基聚羧酸中的一个羧基团与胺基部分反应，而另一个酸酐基团保持不变；

e)提供水或水性缓冲剂以水解剩余的酸酐基团。

f)通过使固相固定的氨基聚羧酸化合物与选自Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Eu³ ⁺、Ga³⁺⁺、Mn²⁺和Ca²⁺的金属离子溶液接触来固定金属离子。

根据本发明的另一方面，由固相、间隔基分子、结合至间隔基分子的多胺基以及共价偶联至多胺基的多种氨基聚羧酸组成的所述固相固定的氨基聚羧酸化合物的合成包括以下步骤：

a)以3:1至9:4，优选3:1至5:2的比例提供EDTA二酐和三功能连接子；

b)通过胺基团将所述二酐与所述载体偶联到所述连接子上，其中所述连接子与三种不同的二酐反应，从而形成下式之一的反应产物，

c)其中APA1是具有一个酸酐基团和一个酰胺基团的EDTA，而APA2是具有两个酰胺基团的EDTA；

d)提供包含多胺基团的固相；

e)经由酰胺基团将所述连接有连接的EDTA与所述载体偶联到多胺基改性的固相上，其中每个氨基聚羧酸的单个羧基团与胺部分反应，而其他酸酐基团保持不变；

f)提供水或水性缓冲剂以水解剩余的酸酐基团。

g)通过使固相固定的氨基聚羧酸化合物与选自Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Eu³ ⁺、Ga³⁺⁺、Mn²⁺Ca²⁺的金属离子溶液接触来固定金属离子。

优选地，在所述固相固定的氨基聚羧酸化合物的合成中，氨基聚羧酸APA1、APA2和APA3选自EDTA、DTPA、TTHA、EDDS、EGTA、DOTA和NOTA，它们通过酰胺基团与固相或连接子偶联。

优选地，在所述固相固定化氨基聚羧酸的合成中，双功能连接子是具有下式之一的双功能分子：

A-(CH₂)_n-B或A-L-B或A-(C₂H₄O)n-(CH₂)_m-B

其中A和B是能够与羧酸基团反应的功能团，并且选自-NH₂和NHR，m和n为2至20，L为具有2至100个原子的直链或支链构型，可以包含C、H、N、O和S，包括环状化合物，例如碳水合物。

优选地，在所述固相固定的氨基聚羧酸化合物的合成中，双功能连接子分子选自乙二胺、1,4-二氨基丁烷、1,6-二氨基己烷、1,8-二氨基辛烷和亨斯迈聚醚胺ED-600。

优选地，在所述固相固定的氨基聚羧酸化合物的合成中，以一个甘油核心为基础，三功能连接子分子选自二亚乙基三胺、三(2-氨基乙基)胺、三(2-氨基丙基)胺或氨基功能化的三功能支链PEG。

根据另一方面，本发明涉及所述固相固定的氨基聚羧酸化合物在分子生物学领域中的用途。

根据另一方面，本发明涉及所述固相固定的氨基聚羧酸化合物在纯化具有多个组氨酸残基的蛋白质中的用途。

根据另一方面，本发明涉及所述固相固定的氨基聚羧酸化合物在纯化具有多个组氨酸残基的膜蛋白中的用途。

根据另一方面，本发明涉及所述固相固定的氨基聚羧酸化合物在纯化具有多个组氨酸残基的GPCR中的用途。

根据另一方面，本发明涉及所述固相固定的氨基聚羧酸化合物在纯化具有多个组氨酸残基的转运蛋白中的用途。

根据另一方面，本发明涉及所述固相固定的氨基聚羧酸化合物在纯化用于治疗用途的蛋白质中的用途。

根据另一方面，本发明涉及一种纯化重组蛋白或多肽的方法，其包括以下步骤：

a)提供前述权利要求中任一项的固相固定的氨基聚羧酸，其已负载有选自Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Eu³⁺、Ga³⁺⁺和Mn²⁺的金属离子，

b)提供包含具有多个组氨酸部分的蛋白质或多肽的样品，

c)使样品与固相固定的氨基聚羧酸接触，

d)从溶液中分离结合的多肽或蛋白质；

e)从固相中洗脱重组蛋白或多肽。

优选地，在上述方法中，蛋白质是膜蛋白质。

优选地，在上述方法中，蛋白质是GPCR。

优选地，在上述方法中，蛋白质是抗原。

优选地，在以上述方法中，可以以至少20mM的浓度将EDTA和咪唑添加至结合缓冲液，并且可以以至少10mM的浓度添加DTT，而不干扰金属结合和蛋白质收率。

根据另一方面，本发明涉及如上所定义的负载金属的固相固定化氨基聚羧酸在固定化金属亲和色谱法(IMAC)中用于纯化具有多个组氨酸部分的重组蛋白或多肽中的用途。

根据另一方面，本发明涉及如上进一步定义的固相固定的氨基聚羧酸化合物在纯化磷蛋白中的用途。

根据另一方面，本发明涉及如上进一步定义的固相固定的氨基聚羧酸化合物在纯化金属蛋白中的用途。

根据另一方面，本发明涉及如上进一步定义的固相固定的氨基聚羧酸化合物在纯化核酸中的用途。

优选地，在纯化如上定义的生物分子的方法中，可以用氢氧化钠溶液洗涤如上定义的固相固定化的氨基聚羧酸化合物，以除去污染物和粘附蛋白，从而再生用于进一步生物分子纯化的材料，但仍然具有至少50mg/ml的蛋白质结合能力。

以下将描述本发明的优选实施例。实施例1至6包括完整说明用于生产优选的固相螯合剂材料的合成。比较例涉及现有技术的螯合剂材料的合成。此外，还描述了树脂的金属负载以及在氢氧化钠处理后用氨基聚羧酸树脂纯化6xhis-GFP的方法。

附图1显示了用根据实施例1和对比例的固相螯合剂在亲和纯化实验中获得的洗脱液的凝胶图。

附图2显示了本发明的螯合剂改性的芯片的利用表面等离子激元共振的亲和力测量的结果。

附图3显示了针对Ni-NTA的利用表面等离子激元共振的亲和力测量的结果(比较例2)。

实施例

固相结合的螯合链的合成的实施例

实施例1：通过制备二亚乙基三胺琼脂糖、EDTA与乙二胺的反应以及EDTA-EDA-EDTA与琼脂糖的共价偶联来合成新的螯合剂

二亚乙基三胺琼脂糖的合成

将10ml琼脂糖颗粒(WorkBeads 40SEC,BioWorks Sweden AB,Uppsala)重悬于10ml 1M苛性钠溶液中，并在热振荡器上培养2小时。然后加入5ml环氧氯丙烷，并将悬浮液在30℃下加热4小时。将该悬浮液通过抽滤过滤，并用dd水洗涤六次。然后将琼脂糖重悬于20ml的5％二亚乙基三胺溶液(pH 10.5)中，并在65℃培养20小时。将琼脂糖抽干，用dd水洗涤四次，用磷酸盐缓冲盐水洗涤四次，然后储存在无水二甲基甲酰胺中。EDTA-EDA-EDTA的合成

将853mg EDTA二酐(3.33mmol)溶解在15ml二甲基甲酰胺中，并在剧烈混合下分批少量添加混合了100mg乙二胺(1.67mmol)和5ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在环境温度下搅拌一小时，然后在60℃下搅拌四小时。所得产物可以不经进一步纯化而直接添加到琼脂糖中。

偶联到三胺琼脂糖上

将10ml三胺琼脂糖重悬于10ml二甲基甲酰胺中，然后加入混合了600mg EDTA-EDA-EDTA和10ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在60℃下培养六小时，然后抽干。过滤后，产物用二甲基甲酰胺洗涤六次。

实施例2：通过制备五亚乙基六胺琼脂糖、EDTA与乙二胺反应以及将EDTA-EDA-EDTA共价偶联到琼脂糖上来合成新型螯合剂

五亚乙基六胺琼脂糖的合成

将10ml琼脂糖颗粒(WorkBeads 40SEC,BioWorks Sweden AB,Uppsala)重悬于10ml 1M苛性钠溶液中，并在热振荡器上培养2小时。然后加入5ml环氧氯丙烷，并将悬浮液在30℃下加热4小时。将该悬浮液通过抽滤过滤，并用dd水洗涤六次。然后将琼脂糖重悬于20ml的5％五亚乙基六胺(pH 10.5)中，并在65℃培养20小时。将琼脂糖抽干，用dd水洗涤四次，用磷酸盐缓冲盐水洗涤四次，然后储存在无水二甲基甲酰胺中。EDTA-EDA-EDTA的合成

偶联到六胺琼脂糖上。

将10ml的六胺琼脂糖重悬于10ml的二甲基甲酰胺中，然后添加混合了600mgEDTA-EDA-EDTA和10ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在60℃下培养六小时，然后抽干。过滤后，产物用二甲基甲酰胺洗涤六次。

实施例3：通过依次偶联EDTA、乙二胺和EDTA来形成二聚EDTA链

二亚乙基三胺琼脂糖的合成

将10ml琼脂糖颗粒(WorkBeads 40SEC,BioWorks Sweden AB,Uppsala)重悬于10ml 1M苛性钠溶液中，并在热振荡器上培养2小时。然后加入5ml环氧氯丙烷，并将悬浮液在30℃下加热4小时。将该悬浮液通过抽滤过滤，并用dd水洗涤六次。然后将琼脂糖重悬于20ml的5％N-二亚乙基三胺溶液(pH 10.5)中，并在65℃培养20小时。将琼脂糖抽干，用dd水洗涤四次，用磷酸盐缓冲盐水洗涤四次，然后储存在无水二甲基甲酰胺中。

EDTA-琼脂糖(NH₂)的合成

将10ml氨基琼脂糖重悬于10ml二甲基甲酰胺中，并加入混合了1500mg 4,4'-亚乙基双(2,6-吗啉二酮)和10ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在60℃下培养六小时，然后抽干。过滤后，产物用干燥的二甲基甲酰胺洗涤六次。

用乙二胺对EDTA琼脂糖进行改性

将10ml EDTA琼脂糖重悬于10ml二甲基甲酰胺中，并加入混合了2ml乙二胺和10ml二甲基甲酰胺的溶液。在热振荡器上有效混合后，使悬浮液在65℃下反应6小时。然后将反应产物抽滤，用干燥的二甲基甲酰胺洗涤六次，然后重新悬浮在二甲基甲酰胺中。

与EDTA酸酐反应

将10ml EDTA-EDA琼脂糖重悬于10ml二甲基甲酰胺中，并加入混合了500mg 4,4'-亚乙基双(2,6-吗啉二酮)和10ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在60℃下培养六小时，然后抽干。过滤后，将产物用二甲基甲酰胺洗涤三次，用dd水洗涤三次，用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，再用dd水洗涤一次。

实施例4：通过合成亨斯迈聚醚胺桥联的EDTA来形成二聚EDTA链，并偶联到固相上EDTA-亨斯迈聚醚胺-EDTA的合成将853mg EDTA二酐(3.33mmol)溶于15ml二甲基甲酰胺，然后在剧烈混合下，分批少量加入混合了1000mg亨斯迈聚醚胺-ED 600(O,O-双(2-氨基丙基)聚丙二醇嵌段-聚乙二醇-嵌段-聚丙二醇，1.67mmol)和10ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在环境温度下搅拌一小时，然后在60℃下搅拌四小时。所得产物可以不经进一步纯化而直接添加到琼脂糖中。偶联到胺琼脂糖上。

将10ml氨基三胺琼脂糖(实施例1)重悬浮在10ml二甲基甲酰胺中，然后加入混合600mg EDTA-EDA-EDTA和10ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在60℃下培养六小时，然后抽干。过滤后，产物用二甲基甲酰胺洗涤六次。

实施例5：通过合成乙二胺桥联的EDTA来形成三聚体EDTA链，并偶联到固相上EDTA-EDA-EDTA-EDA-EDTA的合成

将853mg EDTA二酐(3.33mmol)溶解在15ml二甲基甲酰胺中，并在剧烈混合下分批少量添加混合了133mg乙二胺(2.22mmol)和5ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在环境温度下搅拌一小时，然后在60℃下搅拌四小时。所得产物可以不经进一步纯化而直接添加到琼脂糖中。

偶联到胺琼脂糖上。

将10ml三胺琼脂糖(实施例1)重悬浮在10ml二甲基甲酰胺中，并加入混合了600mgEDTA-EDA-EDTA-EDA-EDTA和10ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在60℃下培养六小时，然后抽干。过滤后，产物用二甲基甲酰胺洗涤六次。

实施例6：通过依次偶联DTPA、乙二胺和DTPA来形成二聚DTPA链

DTPA-琼脂糖的合成

将10ml三胺琼脂糖(实施例1)重悬浮在10ml二甲基甲酰胺中，并加入混合了1500mg DTPA二酐和15ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在60℃下培养六小时，然后抽干。过滤后，产物用二甲基甲酰胺洗涤六次。

用乙二胺对DTPA琼脂糖进行改性

将10ml DTPA琼脂糖重悬浮在10ml二甲基甲酰胺中，然后添加混合了2ml乙二胺和10ml二甲基甲酰胺的溶液。有效混合后，使悬浮液在65℃的热振荡器上反应六个小时。然后将反应产物抽滤，用二甲基甲酰胺洗涤六次，然后重悬于二甲基甲酰胺中。

与DTPA酸酐反应

将10ml DTPA-EDA琼脂糖重悬于10ml二甲基甲酰胺中，然后添加混合了500mgDTPA二酐和10ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在60℃下培养六小时，然后抽干。过滤后，将产物用二甲基甲酰胺洗涤三次，用dd水洗涤三次，用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，再用dd水洗涤一次。

比较例1：通过制备氨基琼脂糖、EDTA与氨的反应以及将EDTA-EDA-EDTA共价偶联到琼脂糖上来合成新的螯合剂

氨基琼脂糖的合成

将10ml琼脂糖颗粒(WorkBeads 40SEC,BioWorks Sweden AB,Uppsala)重悬于10ml 1M苛性钠溶液中，并在热振荡器上培养2小时。然后加入5ml环氧氯丙烷，并将悬浮液在30℃下加热4小时。将该悬浮液通过抽滤过滤，并用dd水洗涤六次。然后将琼脂糖重悬于20ml的5％氨溶液(pH 10.5)中，并在65℃培养20小时。将琼脂糖抽干，用dd水洗涤四次，用磷酸盐缓冲盐水洗涤四次，然后储存在无水二甲基甲酰胺中。

EDTA-EDA-EDTA的合成

偶联到氨基琼脂糖上。

将10ml氨基琼脂糖重悬于10ml二甲基甲酰胺中，并加入混合了600mg EDTA-EDA-EDTA和10ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在60℃下培养六小时，然后抽干。过滤后，产物用二甲基甲酰胺洗涤六次。

树脂的金属负载

吸干10ml的螯合树脂，并用0.1M醋酸盐(pH 6.0)洗涤3次，然后用dd水洗涤一次。将残余物加入3％的硫酸镍溶液中，并在搅拌下培养3小时。然后将混合物抽干，用dd水洗涤五次，可以将其存储在加入30％乙醇、pH值为6.0至7.0的低盐缓冲液中，以防止微生物生长。

另外，可通过简单地将硫酸镍与硫酸钴、硫酸铁、氯化铝、氯化锌、硫酸铜、硫酸铕等交换来向树脂加载钴、铁、铝、锌、铜和其他过渡金属或镧系元素。

氢氧化钠处理后，用氨基聚羧酸树脂纯化6xhis-GFP

在柱中提供作为50％浆液的100μl树脂，并除去上清液。然后将每个样品用4ml的0.5M氢氧化钠洗涤两次，培养5分钟后，除去上清液。

每个柱用4ml结合缓冲液NPI-10(50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑，pH

7.4)洗涤两次，并培养5分钟。

将10mg带有组氨酸标记的GFP(绿色荧光蛋白)添加到裂解缓冲液NPI-10(50mMNaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑、10mM EDTA、10mM DTT，pH 7.4)中，然后用100μl树脂作为50％浆料培养30分钟。

培养后，将树脂用2.5ml NPI-20(50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、20mM咪唑，pH

7.4)洗涤两次，然后用1ml NPI-250(50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、250mM咪唑，pH8.0)洗脱三次。合并洗脱液级分，在488nm下测量，并计算收率，然后总结在表1中。洗脱液的凝胶图片如图1所示。将螯合添加剂(20mM EDTA和10mM DTT)添加到NPI-10中，以证明被测树脂对螯合剂、还原剂和碱性溶液的抗性。

表1：蛋白质纯化的结果

材料	蛋白质结合能力
		实施例1	58毫克/毫升
比较例1	17毫克/毫升

结果：

根据本发明的材料的结合能力比对比例中的材料的结合能力高三倍以上。可见，螯合剂EDTA和还原剂DTT对根据本发明的材料的高容量没有影响，并且即使在用0.5M氢氧化钠溶液进行处理后，该树脂仍显示出高的蛋白质结合能力。

实施例7：通过制备五亚乙基六胺琼脂糖、EDTA与乙二胺的反应以及EDTA-EDA-EDTA共价偶联到右旋糖酐芯片上来合成新型螯合剂

五亚乙基六胺右旋糖酐芯片的合成

将基于右旋糖酐改性金的芯片(SCR D200M-5，Xantec Bioanalytics公司，德国杜塞尔多夫)重悬于10ml 0.5M苛性钠溶液中，并在热振荡器上培养2小时。然后加入5ml环氧氯丙烷，并将悬浮液在30℃下加热4小时。通过倾析除去上清液，并用dd水将样品洗涤六次。然后将芯片重悬于20ml的5％五亚乙基六胺溶液(pH 10.5)中，并在45℃下培养20小时。通过倾析除去上清液，用dd水洗涤四次，用磷酸盐缓冲盐水洗涤四次，然后储存在无水二甲基甲酰胺中。

EDTA-EDA-EDTA螯合剂的合成

将853mg EDTA二酐(3.33mmol)溶解在15ml二甲基甲酰胺中，并在剧烈混合下分批少量添加混合了100mg乙二胺(1.67mmol)和5ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在环境温度下搅拌一小时，并在60℃下搅拌四小时。所得产物可以不经进一步纯化而直接添加至固相，例如右旋糖酐芯片。

螯合剂偶联到六胺右旋糖酐芯片上

将六胺改性的芯片重悬于10ml二甲基甲酰胺中，然后添加混合了600mg EDTA-EDA-EDTA和10ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在60℃下培养六小时，并通过倾析除去上清液。过滤后，将产物用二甲基甲酰胺洗涤六次，用dd水洗涤四次，然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次。

金属负载

将芯片在2％硫酸镍溶液中培养，然后在热振荡器上培养2小时。然后通过倾析除去上清液，并用dd水洗涤芯片六次，用pH 6.0的20mM乙酸盐缓冲液洗涤三次，然后储存在pH6.5的10mM乙酸盐和20％乙醇中。

实施例8：通过制备五亚乙基六胺琼脂糖、EDTA与乙二胺的反应以及EDTA-EDA-EDTA与磁性琼脂糖的共价偶联，用新型螯合剂合成磁性颗粒

五亚乙基六胺磁珠的合成

将10ml磁性琼脂糖颗粒(Cube Biotech，德国蒙海姆)重悬于10ml 1M苛性钠溶液中，并在热振荡器上培养2小时。然后加入5ml环氧氯丙烷，并将悬浮液在30℃下加热4小时。通过磁分离除去上清液，并用dd水将磁珠洗涤六次。然后将磁性琼脂糖重悬于20ml pH值为10.5的5％五亚乙基六胺溶液中，并在65℃下培养20小时。通过磁分离除去上清液，并将磁珠用dd水洗涤四次，用磷酸盐缓冲盐水洗涤四次，然后储存在无水二甲基甲酰胺中。

EDTA-EDA-EDTA螯合剂的合成

将853mg EDTA二酐(3.33mmol)溶于15ml无水二甲基甲酰胺中，并在剧烈混合下分批少量添加混合了100mg乙二胺(1.67mmol)和5ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在环境温度下搅拌一小时，然后在60℃下搅拌四小时。所得产物可以不经进一步纯化而直接添加到磁性琼脂糖中。

螯合剂偶联到六胺磁性琼脂糖上

将10ml六胺磁珠重悬于10ml二甲基甲酰胺中，并加入混合了600mg EDTA-EDA-EDTA和10ml二甲基甲酰胺的溶液。将反应混合物在60℃下培养六小时，并通过磁分离除去上清液。然后将产物用二甲基甲酰胺洗涤六次，再用dd水洗涤四次。

金属负载

将10ml螯合剂功能化的磁珠重悬于20ml的2％硫酸镍溶液中，并在热振荡器上培养2小时。然后通过磁分离除去上清液，并将芯片用dd水洗涤六次，用pH 6.0的20mM乙酸盐缓冲液洗涤三次，然后在pH 6.5的10mM乙酸盐和20％乙醇中保存。

实施例9：通过制备五亚乙基六胺琼脂糖、EDTA与乙二胺的反应以及EDTA-EDA-EDTA在磁性琼脂糖上的共价偶联来合成涂覆有新型螯合剂的膜使用蠕动泵用dd水将CIM环氧色谱柱(Bia Separations，

斯洛文尼亚)吹扫十分钟。然后将20ml混合在80ml的1M NaOH中的溶液加热至35℃，并通过色谱柱吹扫三小时。

之后，将所述柱用dd水洗涤20分钟，并将5％五亚乙基六胺在pH 10.5的dd水中的溶液在60℃下吹扫通过所述柱十小时。

在用dd水洗涤20分钟并用DMF洗涤10分钟后，将EDTA-EDA-EDTA溶液(按照上述说明制备)在50℃下泵送通过色谱柱八小时。在接下来的步骤中，依次每次十分钟分别将dd水、pH 7.0的磷酸盐缓冲液和dd水泵送通过色谱柱。

然后将柱在1％硫酸镍溶液中培养一小时，然后将dd水洗重复20分钟。该柱的蛋白质结合能力是2mg至5mg(由his-GFP确定)，并且该柱对碱性溶液和EDTA稳定。

实施例10：通过制备五亚乙基六胺琼脂糖、EDTA与乙二胺的反应以及EDTA-EDA-EDTA在磁性琼脂糖上的共价偶联来合成涂覆有新型螯合剂的表面基于右旋糖酐改性的金(SCR Pierce^TM马来酸酐活化板，透明，8孔板，目录号15100，美国洛克福德皮尔斯)，以马来酸酐活化的8孔试纸的每一个用200μl来洗涤。然后加入100μl的5％五亚乙基六胺在dd水中的pH 10.5的溶液，并将板在振荡器上在37℃下培养三小时。

除去胺溶液，并用dd水将孔洗涤六次，然后用乙醚洗涤四次。然后加入混合了5mgEDTA-EDA-EDTA和150μl乙醚的悬浮液，并将板在室温下在振荡器上振荡。

将该板用dd水洗涤三次，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤三次，再用dd水洗涤一次。在下一步中，添加125μl 2％的硫酸镍溶液，并将板在振荡器上于室温下振荡2小时。用dd水洗涤五次后，可将板用于蛋白纯化。

结果：

使用表面等离子激元共振的亲和力测量已使用2SPR表面等离子激元共振系统(Reichert，美国布法罗)对螯合剂改性的芯片进行了研究。

对于该实验，运行缓冲液和空白缓冲液为50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸酸、150mMNaCl、1mM EDTA，pH 7.6，以及咪唑缓冲液50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸酸、150mM NaCl、600mM咪唑，pH 7.6。使用的蛋白质是SMOX(62,64kDa，N端组氨酸标记)，浓度为3mg/ml。

使用运行缓冲液，将蛋白质浓度调整为25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.56μM、0.78μM、0.390μM和0.195μM。

所使用的流速为15μl/min，并使用以下溶液：

以8分钟的缔合时间使用具有蛋白质的运行缓冲液，然后以20分钟的解离时间使用纯运行缓冲液。然后以4分钟的缔合时间和2分钟的解离时间施加咪唑缓冲液。

记录并绘制显示信号强度随时间变化的曲线。

作为比较例2，使用相同的蛋白质和缓冲液处理NiHC 1000M芯片(XantecBioanalytics公司，德国杜塞尔多夫)。

结果显示，由于亲和力低，蛋白质在与运行缓冲液的解离时间内开始从Ni-NTA芯片解离。根据该专利申请的螯合功能化的芯片显示出一条水平线，由于该螯合剂具有更高的亲和力，运行缓冲液没有显示出明显的蛋白质损失。

Claims

1.一种固相螯合剂材料，包括一个固相、结合至所述固相的多胺基团和结合至所述多胺基的螯合基团，其中所述多胺基团的至少一部分与每个多胺基团连接到至少两个螯合基团，并且其中每个螯合基团包含一个或多个氨基聚羧酸基团(APA基团)，条件是每个与至少两个螯合基团连接的多胺基团的APA基团的数目为至少三个。

2.根据权利要求1所述的固相螯合剂材料，其中所述螯合基团选自由以下组成的组：单独的APA基团、由两个或更多个经由双功能连接子部分K彼此连接的APA基团形成的线性螯合链、由三个或更多经由三功能连接子部分L彼此连接的APA基团形成的支化螯合链、以及由四个或更多经由至少一个双功能连接子部分K和至少一个三功能连接子部分L彼此连接的APA基团形成的混合螯合链。

3.根据前述权利要求中任一项所述的固相螯合剂材料，其中与多胺基团结合的螯合基团的数目为至少三个，优选至少四个，和/或与其中与至少两个螯合基团连接的多胺基偶联的APA的数目在3至20的范围内，优选在4至15的范围内。

4.根据前述权利要求中任一项的固相螯合剂材料，其中所述多胺基团衍生自选自二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、直链和支化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚丙烯亚胺、大环多胺(如环烷烃、轮环藤宁和1,4,7-三氮杂环壬烷)、支链多胺[基于季戊四醇核，如1,1,1-三(氨基甲基)乙烷、三氨基乙基胺、三氨基丙胺、四-乙基氨基胺、四-乙基氨基胺、四-氨基丙基胺和胺功能化的四功能支链PEG]组成的多胺，优选选自由二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺和五亚乙基六胺组成的组，更优选选自由三亚乙基四胺、四亚乙基五胺和五亚乙基六胺组成的组。

5.根据前述权利要求中任一项所述的固相螯合剂材料，其中所述APA基团衍生自选自以下的APA：选自由乙二胺四胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、三亚乙基四胺六乙酸、乙二胺-N,N'-二琥珀酸、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸和1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸组成的组。

6.根据前述权利要求中任一项的固相螯合剂材料，其中至少一部分或全部螯合基团具有通式-(APA1-K)_n-APA2，其中APA1和APA2彼此相同或不同，n是1至50范围内的整数，并且K是双功能连接子部分。

7.根据前述权利要求中任一项的固相螯合剂材料，其中所述螯合基团的至少一部分或全部

具有通式

和/或通式

8.根据前述权利要求中任一项的固相螯合剂材料，其中所述APA和所述连接子部分和/或所述螯合基团和所述多胺基团经由酰胺部分彼此连接。

9.根据前述权利要求中任一项的固相螯合剂材料，其中

-所述双功能连接子部分K选自A-(CH₂)_n-B、A-Q-B和A-(C₂H₄O)m-(CH₂)_o-B，其中A和B是能够与羧基团反应的功能团，即OH、NH₂、NHR、Cl、Br、I、OM、OT、N₃，其中R为具有式C_nH_2n+1的烃基团，其中n为在1至6的范围内的整数，m为在1至12的范围内的整数，o为在2至12的范围内的整数，Q为2至100个原子的直链或支链构型，任选地包含C、H、N、O和S，包括环状化合物，例如碳水化合物，优选二胺NH₂或NHR，其更优选地选自乙二胺、1,4-二氨基丁烷、1,6-二氨基己烷、1,8-二氨基辛烷和亨斯迈聚醚胺ED-600；和

-所述三功能连接子部分L具有以下通式之一：

其中A、D和E是能够与羧基团反应的功能团，优选地，-NH₂或-NHR，B是支链原子，优选C或N，其与至少三个优选地与碳原子连接的稳定键连接，并与功能团连接，n、m和o是在2至30范围内的整数；且优选为三胺，其更优选选自二亚乙基三胺、三(2-氨基乙基)胺、三(2-氨基丙基)胺和基于甘油核心的氨基功能化三功能支链PEG。

10.根据前述权利要求中任一项所述的固相螯合剂材料，其中在所述固相和所述多胺基团之间插入间隔基部分，其优选地衍生自由环氧氯丙烷、表溴醇、1,2-乙二醇二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚和烯丙基溴组成的组。

11.根据前述权利要求中任一项的固相螯合剂材料，其中所述固相选自由以下组成的组：

-琼脂糖、纤维素、琼脂、右旋糖酐、壳聚糖、藻酸盐、结冷胶，优选琼脂糖和/或

-氧化硅、二氧化钛、二氧化锆、二氧化铝、其他金属或半金属氧化物、金、玻璃和/或

-丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、苯乙烯衍生物、乙烯基酯、乙烯基酰胺和乙烯醇，和/或

-多孔色谱载体、无孔色谱载体、膜、涂层表面、涂层管、传感器表面、微阵列表面、涂层微量滴定板，和/或

-磁性琼脂糖、磁性氧化硅和磁性聚合物、优选磁性琼脂糖，和/或

-右旋糖酐改性的金芯片和磁珠。

12.负载金属离子的固相螯合剂材料，其包含根据前述权利要求中任一项的固相螯合剂材料，其负载有选自Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Eu³⁺、Ga³⁺、Mn²⁺和Ca²⁺的金属离子。

13.一种根据权利要求1至11中任一项的固相螯合剂材料的制备方法，包括

-在通过一个酰胺基团形成具有结合有至少三个单体APA的多胺基团的情况下，在结合有多胺基的一个固相上共价结合至少三个单体APA，或

-在形成一个具有至少两个APA基团通过酰胺基团键合至其上的多胺基团的固相材料的情况下，将至少两个APA共价结合在具有多胺基团的固相上，并添加双功能连接子K或三功能连接子L在所述固相材料上，使所述偶联的连接子与第二APA的羧基反应，从而形成固相螯合剂材料，所述固相螯合剂材料具有与和所述固相结合的所述多胺基结合的APA基团的线性螯合链或支链螯合链，任选地，重复添加连接子的步骤，然后添加另外的APA以延长所述线性螯合链或所述支链螯合链的长度；或者

-在形成包含线性螯合剂链或支化螯合剂链的多聚APA螯合剂的情况下，

使至少两个单体APA与双功能连接子K反应或至少三个单体APA与三功能连接子L反应，并在形成具有至少两个经由酰胺基团键合至其上的线性和/或支化螯合剂链的多胺基团的情况下，在具有键合至其上的多胺基团的固相上共价结合至少两个多聚APA螯合剂。

14.一种如权利要求1至11中任一项所述的具有线性螯合基团的固相螯合剂的制备方法，所述线性螯合基团具有通过双功能连接子连接的APA基团，包括以下步骤：

a)提供一个APA和结合有多胺基的一个固相；

b)在缩合剂的存在下将所述APA与所述固相偶联，其中在所述APA与所述固相结合的条件下，所述APA的单个羧基与所述固相反应；

c)将步骤b)中获得的固相材料与双功能连接子K混合；

e)将步骤d)中获得的固相材料与另外的APA混合；

g)任选地至少重复一次步骤c)至f)。

15.一种如权利要求1至11中任一项所述的具有线性螯合基团的固相螯合剂的制备方法，所述线性螯合基团具有通过双功能连接子连接的APA基团，包括以下步骤：

a)提供一个APA二酐和结合有多胺基团的一个固相材料；

b)通过一个结合的多胺的氨基组，将所述APA二酐与所述固相材料偶联，其中每个APA二酐中的一个单个酸酐基团与氨基部分反应，而另一个酸酐基团保持不变；

d)提供步骤c)中获得的固相材料和双功能连接子K；

e)使双功能连接子K与所述APA酸酐基团偶联，其中所述双功能连接子K的单个胺基团与所述APA酸酐基团反应，而所述双功能连接子K的另一个功能基团保持不变；

f)用无水溶剂洗涤所述固相，以除去未偶联的连接子分子；

g)提供步骤f)中获得的固相材料和另外的APA二酐；

i)任选地至少重复一次步骤c)至h)。

16.一种如权利要求1至11中任一项所述的具有线性螯合基团的固相螯合剂的制备方法，所述线性螯合基团具有通过双功能连接子连接的APA基团，包括以下步骤：

c)提供结合有多胺基团的固相；

d)通过连接至所述固相的多胺基团的氨基团，将所述连接有连接子的二酐与所述载体偶联，其中每个APA的单个羧基团与所述胺部分反应，而另一个酸酐基团保持不变；

e)提供水或水性缓冲剂以水解剩余的酸酐基团。

17.一种具有支化螯合基团的固相螯合剂材料的制备方法，所述支化螯合基团包括通过权利要求1至11中任一项所述的通过三功能连接子连接的APA基团，其包括以下步骤：

a)以3:1至9:4，优选3:1至5:2的比例，将APA二酐和三功能连接子L与具有结合的多胺基团的固相混合；

c)提供包含多胺基团的固相；

d)通过酰胺基团将所述连接有连接子的APA与所述载体偶联到所述多胺改性的固相上，其中每个氨基聚羧酸中的单个羧基团与酰胺部分反应，而其他酸酐基团保持不变；

e)提供水或水性缓冲剂以水解剩余的酸酐基团。

18.一种负载金属离子的固相螯合剂材料的制备方法，该方法包括执行根据权利要求13至17中任一项所述的制备固相螯合剂的方法，然后通过使所述固相螯合剂材料与金属离子溶液接触而固定化金属离子，所述金属离子选自Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Eu³⁺、Ga³ ⁺⁺、Mn²⁺和Ca²⁺。

19.根据权利要求1至11中任一项的固相螯合剂或根据权利要求12的负载金属离子的固相螯合剂或

根据权利要求13至17中任一项的方法制备的固相螯合剂材料或根据权利要求18的方法制备的负载金属离子的固相螯合剂材料在分子生物学领域中的用途，用于具有多个组氨酸残基的蛋白质的纯化、具有多个组氨酸残基的膜蛋白的纯化、具有多个组氨酸残基的GPCR的纯化、具有多个组氨酸残基的转运蛋白的纯化、用于治疗用途的蛋白的纯化、具有多个组氨酸部分的重组蛋白或多肽的纯化、磷蛋白的纯化、金属蛋白的纯化、核酸的纯化和/或用于固定化金属亲和色谱法(IMAC)。

20.一种纯化生物分子，特别是重组蛋白或多肽的方法，其包括以下步骤：

a)提供根据权利要求12或如权利要求18所述的方法制备的负载金属的固相螯合剂材料；

b)提供包含所述生物分子，特别是具有多个组氨酸部分的蛋白质或多肽的样品，

c)使所述样品与所述负载金属的固相螯合剂材料接触；

d)从溶液中分离结合的多肽或蛋白质；

e)从固相中洗脱重组蛋白或多肽。

21.根据权利要求20的方法，其中所述蛋白质选自膜蛋白质、GPCR和抗原。

22.根据权利要求20和21之一所述的方法，其中将EDTA和咪唑以至少20mM的浓度添加到所述结合缓冲液中，并且以至少10mM的浓度添加DTT，而不干扰金属结合和蛋白质产量。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中，可以用氢氧化钠溶液洗涤根据前述权利要求所述的固相固定化的氨基多元羧酸化合物，以去除污染物和粘附蛋白，从而再生该材料，用于进一步的生物分子纯化，并且仍然具有至少50mg/ml的蛋白质结合能力。