KR100526678B1 - 금속 킬레이트 레진 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규의 금속 킬레이트 레진, 그것의 제조방법 및 단백질 등의 물질 정제에서 신규의 금속킬레이트 레진을 이용하는 방법에 관한 것으로 글루타사이온(Glutathione, γ-glutamyl-cysteinyl-glycine)을 기본물질로 사용하여 구조식 (CH2COOH)2-N-CH(COOH)-CH2CH2-CO-NH-CH(CH2SH)-CO-NH-CH 2(COOH)로 표현되는 금속 킬레이트 리간드를 이용하여 제조한 신규의 금속 킬레이트 레진에 관한 것으로서, 간단한 공정으로 단백질 등 분리하는 물질에 대해 충분한 흡착력과 안정성을 나타낸다.

Description

금속 킬레이트 레진{Metal chelate resin}
본 발명은 신규의 금속 킬레이트 레진, 그것의 제조방법 및 단백질 등의 물질 정제에서 신규의 금속킬레이트 레진을 이용하는 방법에 관한 것으로 글루타사이온(Glutathione, γ-glutamyl-cysteinyl-glycine)을 기본물질로 사용하여 구조식 (CH2COOH)2-N-CH(COOH)-CH2CH2-CO-NH-CH(CH2SH)-CO-NH-CH 2(COOH)로 표현되는 금속 킬레이트 리간드를 이용하여 제조한 신규의 금속 킬레이트 레진에 관한 것이다.
금속친화 크로마토그래피 기술은 친화성 크로마토그래피의 일종으로서 (Porath, J. 1975, Nature 258:598-599), 킬레이트 리간드가 부착된 레진을 이용하여 금속에 친화성이 있는 물질을 정제하는 기술이다. 아미노산 중 히스티딘의 이미다졸 그룹이 금속 이온과 배위결합하므로, 이 성질을 이용하여 히스티딘을 갖는 단백질을 정제하는 기술이 확립되었다.
여러 종류의 금속 킬레이트 리간드가 단백질 정제 크로마토그래피용으로 쓰이고 있다. 이미노다이아세틱 애시드(imminodiacetic acid), 나이트릴로트리아세틱 애시드(nitrilotriacetic acid, NTA), 카복시메틸 아스파틱 애시드 (carboxymethyl aspartic acid) 등의 리간드를 이용한 레진이 상업적으로 생산되고 있다.
하지만, 현재 사용 중인 금속 친화 크로마토그래피 레진("금속 킬레이트 레진"과 동일한 의미로 본 명세서에서 혼용함)들에는 각각 장단점이 있다. 이미노다이아세틱 애시드 레진은 금속과 리간드가 세 개의 배위 결합으로 연결되어 있어서 수화 등에 의해 쉽게 해리되므로 사용에 주의가 필요하다(Porah, J. 1983, Biochemistry 22:1621-1630).
그리고, 카복시메틸 아스파틱 애시드 레진은 리간드에 부착된 금속과 단백질과의 결합력이 약하여 시료에서 레진으로의 흡착이 쉽지 않은 단점이 있다(Chaga, G. 1999, Biothechnol. Appl. Biochem. 29:19-24).
나이트릴로트리아세틱 애시드 리간드는 강한 금속-리간드, 금속-단백질 결합을 지니고 있다. 그러나 이 리간드를 레진에 붙이기 위해 만들어야 하는 변형 리간드의 제조원료가 비싸고 시간과 장비가 추가되어야 하는 단점이 있다 (미국특허4,877,830, 미국특허5,047,513).
나이트릴로트리아세틱 애시드(NTA)를 갖고 있으면서 아미노산인 시스테인을 사용하여 제조공정을 단순화한 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich)의 WO01/81365는 금속 킬레이트 그룹을 갖는 화합물의 길이가 짧아 단백질과 결합시 입체장애 (steric hinderance)가 발생될 가능성이 높으므로 정제 효율이 낮을 것으로 예측된다.
나이트릴로트리아세틱 애시드(NTA)는 현재 쓰이고 있는 금속 킬레이트 레진 중 가장 강한 리간드 친화력(ligand affinity)과 전이금속 결합을 갖는 리간드이다. 호프만 라 로슈(Hoffman la Loche)의 미국특허 제4,877,830호 및 이 특허의 분할출원의 계속출원인 미국특허 제5,047,513호는 다음의 내용을 개시하고 있다. NTA의 구조는 질소 원자에 세개의 카복시메틸기가 공유결합한 것으로, 이러한 구조의 NTA를 매트릭스에 결합시키기 위해 아래의 구조를 택하였다.
매트릭스-링커-NH-(CH2)4-CH(COOH)-N(CH2COOH)2
위의 구조를 갖는 레진을 만들기 위해서 먼저 리간드(ligand)를 만든 후 활성화된 링커가 부착된 레진에 리간드를 부착시키는 방법을 택하였다. 그러기 위해서는 다음의 11단계가 필요하다고 한다.
1. Cbz-라이신(Cbz-Lysine) 42g을 225ml의 2N NaOH에 녹인 후 냉각한다.
2. 41.7g 브로모 아세트산(bromo acetic acid)을 150ml의 2N NaOH에 녹인 후 1번 용액에 천천히 넣는다.
3. 2시간 후 상온으로 용액을 옮긴 후 오버나잇한다.
4. 50℃에서 2시간 가열 후 540ml의 1N NaOH를 가한다.
5. 냉각 후 침전물을 회수한다.
6. 침전물을 1N NaOH에 녹인 후 1N HCl을 가하여 다시 침전시킨다.
7. 침전물을 회수 후 건조시킨다.
8. 7.9g의 침전물을 49ml의 1N NaOH용액에 녹이고 5% Pd/C를 소량 가한 후 상온 상압의 수소를 가하여 하이드로제네이션(hydrogenation)한다. 반응물에서 침전을 제거한 후 건조시킨다.
9. 에피브로모하이드린(Epibromohydrin)으로 활성화한 100ml의 세파로즈 CL-6B 레진과 6.5g N-[5amino-1-carboxypentyl]-iminodiacetic acid(hydrogenation product), 50ml 증류수, 10.6g 소듐 카보네이트(sodium carbonate)를 가한 후 60℃에서 서서히 오버나잇 교반한다.
10. 레진을 500ml의 증류수, 100ml의 2% NiSO4, 200ml의 증류수, 200ml의 0.2M 아세트산(0.2M NaCl과 0.1% Tween 20을 포함함), 200ml의 증류수의 순으로 세척한다.
11. 7.1ｕM/ml로 Ni 이온이 충전(charging)된 레진을 얻는다.
그러나, 하이드로제네이션 과정은 위험하며 복잡하다. 그리고 건조 후 에탄올을 사용하여 재결정의 과정이 필요하다.
상기 로슈사의 미국특허들은 N-링크된 NTA를 금속 친화 레진으로 채택한 반면, 미국특허 제5,932,102호는 TALON 상표로 시판되는 레진으로서 활성화 매트릭스에 아스파틱 애시드의 아미노기를 결합시킨 후 카복시메틸레이션한 것이다.
COOH
I
매트릭스-링커-N-CH-CH2COOH
I
CH2COOH
이 레진은 구조적으로 로슈의 NTA와 유사하나 금속과 흡착되는 분자 (absorbant) 사이의 결합력이 매우 약하다는 문제점이 있다.
따라서, 본 발명은 나이트릴로트리아세틱 애시드(NTA) 리간드를 고분자 매트릭스와 결합시키는 새로운 변형 리간드를 고안하여 종래 금속 킬레이트 레진들의 단점을 극복하려는 것을 그 목적으로 한다. 즉, 본 발명은 간단한 공정으로 저렴한 비용을 들여 제조 가능한 금속 킬레이트 레진을 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명은 금속과 리간드가 좀더 견고한 결합을 하여 효과적으로 단백질을 정제할 수 있는 금속 킬레이트 레진을 제공하려는 것이다.
뿐만 아니라, 본 발명의 목적은 흡착시키려는 분자와 레진과의 흡착력이 강한 금속 킬레이트 레진을 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명은 연구자가 원하는 다양한 종류의 매트릭스와 링커에 부착시켜 사용 가능한 흡착 리간드를 제공하려는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자는 글루타사이온(Glutathione)의 -SH(sulfurhydril)기와 아민기 사이의 화학적 반응성의 차이를 이용하여 새로운 NTA 금속 킬레이트 레진을 얻는 것을 착안하였다.
본 발명은 신규의 금속 킬레이트 레진, 그것의 제조방법 및 단백질 등의 물질 정제에서 신규의 금속 킬레이트 레진을 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에서는 레진, 리간드 및 매트릭스라는 용어를 사용하였다. 본 명세서에서 "매트릭스"는 흡착시키고자 하는 물질(예컨대 단백질)과 직접 결합하는 친화 리간드 부분이 결합되기 전의 고분자 매트릭스를 의미한다. 예컨대, 크로스링크된 아가로즈, 크로스링크된 셀룰로스 등을 매트릭스라고 칭하였다.
또한, 본 명세서에서 "레진"은 매트릭스에 링커 및 친화 리간드 부분이 결합된 상태를 표현하는 용어로 사용되었다.
또한, 본 명세서에서 "리간드"는 나이트릴로트리아세틱 애시드와 같이 특정 물질에 대한 흡착력을 나타낼 수 있는 물질을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 "금속 킬레이트 레진"은 전이금속을 킬레이팅할 수 있는 레진을 말하는 것으로, 전이금속이 킬레이팅된 상태 또는 전이금속을 포함하지 아니한 상태를 의미한다.
본 발명의 금속 킬레이트 레진을 제조하는 방법은 순차적으로는 글루타사이온 -SH기를 가진 펩타이드를 화학적으로 활성화된 고분자 매트릭스에 부착시킨 후 부착된 펩타이드의 아민기를 카복시메틸레이션하여 나이트릴로 트리아세틱 애시드 리간드화하는 것이다(실시예 1∼4).
본 발명의 금속 킬레이트 레진을 제조하는 또다른 방법은 N,N 다이카복시메틸-글루타사이온과 같은 킬레이트 리간드를 먼저 제조한 후 이것을 고분자 매트릭스에 부착시키는 방법이다(실시예 5∼7).
이런 순차적인 반응에 있어서 원하는 화합물을 만들기 위해서는 pH의 조절이 중요하다. -SH기를 가진 펩타이드가 고분자 매트릭스에 결합하는 반응에 있어서 산성도가 pH 6.0-8.5 사이를 유지하여야만 -SH기만이 결합 반응에 참여하고 아민기는 반응에 참여하지 않는다. 그리고 아민기를 카복시메틸레이션시키는 반응도 pH 9-12을 유지하여야만 적절한 반응이 일어난다.
또한, 본 발명은 다음의 화학식으로 표시되는 금속 킬레이트 리간드를 연구자가 원하는 다양한 종류의 매트릭스와 다양한 링커에 부착시켜 필요한 용도로 사용할 수 있다.
(CH2COOH)2-N-CH(COOH)-CH2CH2-CO-NH-CH(CH2SH)-CO-NH-CH 2(COOH)
또한, 본 발명은 히스티딘 표지를 갖는 재조합 단백질 등 금속과 친화성을 갖는 단백질을 상기와 같이 제조한 금속 킬레이트 레진을 이용하여 크로마토그래피법 등으로 정제하는 방법에 관한 것이다. 물론 이외에도 상기 본 발명의 금속 킬레이트 레진을 이용하여 다양한 금속 친화성 물질을 정제하거나 선택적으로 흡착하는 것은 본 발명 분야의 기초적인 지식이 있는 자에게는 자명한 것이다.
구체적으로 본 발명은 다음의 화학식으로 표시되는 금속 킬레이트 레진에 관한 것이다.
(CH2COOH)2-N-CH(COOH)-CH2CH2-CO-NH-CH2(CH2 S-R1-R2)-CO-NH-CH2(COOH)
(단, 상기 식에서 R1은 크로마토그래피용 고분자 매트릭스를 활성화하고 -SH기와 결합하는 링커, R2는 크로마토그래피용 고분자 매트릭스이다.)
또한, 본 발명은 상기 크로마토그래피용 고분자 매트릭스가 크로스링크된 아가로즈, 크로스링크된 셀룰로스, 크로스링크된 덱스트란, 크로스링크된 메타크릴아마이드, 단백질, 펩타이드, 리피드, 리포좀, 핵산, 항체, 효소, 폴리에틸렌, 폴리술폰, 금(Gold), 호르몬, 형광물질, 발광물질(chromogenic dyes, fluorescent dyes, flurochrome), 실리카 및 글래스로 이루어진 그룹 중 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 R1이 -CH2CH(OH)CH2-, -CH(OH)CH2-O-(CH 2)4CH(OH)CH2-, -CH2CH2SO2CH2CH2-, -COCH2-, -CH2CH 2CH2-, -CH2CH(Br)CH2- 및 -OCO-로 이루어진 그룹 중 선택되는 1종인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 금속 킬레이트 레진에 Co, Ni, Zn, Fe, Cu 등의 전이금속 이온이 결합된 것을 특징으로 한다(화학식 5 참조).
단, 상기 식에서 M은 전이금속을 나타낸다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 화학식 4로 표시되는 금속 킬레이트 레진을 제조하는 방법에 있어서,
1) 고분자 매트릭스를 활성화하는 단계;
2) 세척하는 단계;
3) 고분자 매트릭스와 -SH기를 갖는 펩타이드를 pH 6.0∼8.5에서 반응시키는 단계;
4) 세척하는 단계;
5) pH 9∼12에서 아세트산을 아민기에 결합시키는 단계;가 순차적으로 구성되는 것을 특징으로 하는 금속 킬레이트 레진의 제조방법에 관한 것이다.
상기 제조방법의 구체적인 일례는 다음과 같다.
1) 고분자 매트릭스를 에피클로로히드린(epichlorohydrin) 등을 이용하여 활성화시킨다.
2) 그 후 증류수, 완충 용액 등으로 매트릭스를 세척한다.
3) 상기 매트릭스와 -SH기를 가지는 글루타사이온을 반응시킨다. 반응은 바람직하게는 밀봉 용기에 넣고 질소를 가한 후 상온에서 24시간 진행시킨다.
4) 상기 -SH기를 가지는 글루타사이온이 결합된 매트릭스를 세척한다. 바람직하게는 증류수, 아세트산 10%, 증류수, NaHCO3 용액의 순으로 세척한다.
5) 브로모 아세트산 등으로 카복시메틸레이션시킨다. 바람직하게는 브로모 아세트산 외에 NaOH(pH 10-11), 1M NaHCO3(pH 10.0)과 혼합한 후 상온에서 오버나잇시킨다.
6) 세척한다.
또한, 본 발명은 상기 -SH기를 갖는 글루타사이온이 N,N 다이카복시메틸 글루타사이온인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 금속 킬레이트 레진을 이용하여 단백질을 정제하거나 고정화하는 방법에 관한 것이다.
상기 본 발명의 금속 킬레이트 레진 제조 방법은 종래 미국특허들에 개시된 레진 제조방법에 비하여 공정이 현저히 간단하고, 시간 및 비용이 절감되면서도 종래 NTA 레진과 유사한 정도의 흡착 효과를 나타내는 금속 킬레이트 레진을 제공할 수 있다.
또한 본 발명에서는 리간드를 먼저 합성한 후 활성화된 매트릭스에 결합하는 제조방법을 기술하며 두 가지의 새로운 방법이 모두 동일하게 쓰일 수 있음을 예시한다.
이하, 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예의 기재에만 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
본 실시예는 고분자 매트릭스로서 크로스링크된 아가로즈인 세파로즈 CL-6B를 활성화하여 R1을 결합시키는 반응예이다.
세파로즈 CL-6B 매트릭스 100ml을 유리깔대기를 이용하여 증류수 1000ml로 세척하였다. 물을 제거한 매트릭스를 500ml 삼각 플라스크로 옮기고 4N NaOH 40ml와 에피클로로히드린(epichlorohydrin) 15ml을 넣었다. 입구를 실리콘 마개로 막은 후 28℃에서 6시간 교반하였다. 반응액을 유리 필터 깔대기로 옮긴 후 증류수 1000ml로 세척하였다.
<실시예 2>
또다른 실시예로 다른 링커 R1을 결합시키는 반응예이다.
세파로즈 CL-6B 매트릭스 100ml을 유리깔대기를 이용하여 증류수 1000ml로 세척하였다. 물을 제거한 매트릭스를 500ml 삼각 플라스크로 옮기고 0.6M NaOH에 들어 있는 NaBH4 2㎎/㎖와 0.4㎖의 BDE(butanedioldiglycidyl ether, 60% 순도)를 가하였다. 28℃에서 8시간 교반하고 반응액을 유리 필터 깔대기로 옮긴 후 증류수 1000㎖로 세척하였다.
<실시예 3>
또 다른 실시예로 다른 링커 R1을 결합시키는 반응예이다.
브로모아세트산 1.4g을 N-하이드록시숙신이미드 1.4g, 다이옥산(dioxane) 80㎖와 함께 삼각 플라스크에 넣은 후 교반하였다. 다이사이클로헥실카보다이이미드(dicyclohexylcarbodiimide) 2.2g을 가한 후 70분간 교반하였다. 유리 깔대기로 침전물을 제거하였다. 로터리 이베포레이터로 다이옥산을 제거하여 브로모아세틱하이드록시숙신이미드를 합성하였다. AH-세파로즈 3g을 유리 깔대기에서 증류수 100㎖로 세척한 후 0.1M 인산나트륨 용액(pH 7.5)이 든 삼각 플라스크로 옮기고, 위에서 만든 브로모아세틱 하이드록시숙신이미드 2g을 가한 후 2시간동안 교반하였다. 용액을 유리 깔대기로 옮긴 후 증류수 100㎖로 세척하였다.
<실시예 4>
실시예 4는 실시예 1, 2, 3에서 제조한 활성화된 고분자 매트릭스에 킬레이트 리간드를 결합시키는 반응예이다.
실시예 1, 2 또는 3과 같은 과정으로 활성화된 매트릭스 100㎖을 삼각 플라스크에 넣었다. 25mM 인산나트륨 pH 7.5용액 100㎖를 넣었다. 글루타사이온 10g을 25mM 인산나트륨 용액 100㎖에 녹인 후 pH를 7.5로 조정하였다. 질소 가스를 반응기에 채워 넣고 24시간 교반하였다. 용액을 유리 필터 깔대기로 옮긴 후 증류수 100㎖, 10% 아세트산 1000㎖, 증류수의 순으로 세척하였다. 세척한 레진을 삼각 플라스크로 옮기고 100㎖ 1M NaHCO3, pH 10.0을 가하고 15g의 브로모아세트산을 100㎖의 4N NaOH 용액에 녹인 후 pH를 10.5로 조정한 용액을 넣었다. 상온에서 24시간 교반하였다. 용액을 유리 깔대기로 옮긴 후 증류수 1000㎖, 10% 아세트산 1000㎖, 증류수의 순으로 세척하였다.
<실시예 5>
본 실시예는 킬레이트 리간드를 매트릭스와 결합시키지 않은 상태에서 제조하는 반응예이다.
S-트리틸-글루타사이온(S-trityl-glutathion) 10g을 1N NaOH에 녹였다. 냉각시킨 용액에 브로모 아세트산 16g을 1N NaOH에 녹인 것을 천천히 가하였다. 2시간동안 교반 후 상온에서 12시간 교반하였다. 1N HCl용액을 천천히 가하여 침전을 만들었다. 침전물을 유리 필터 깔대기로 모은 후 다시 1N NaOH 20㎖에 녹이고 1N HCl을 가해 침전을 만들었다(N,N-다이카복시메틸-S-트리틸-글루타사이온). 침전을 삼각 플라스크에 넣고 증류수 100㎖을 가하고 트리플루오르아세트산 1ml를 가하고 질소 충진 후 1시간 반응시켰다. 아세톤을 3배 부피 가하고 침전을 회수하였다. 침전을 아세톤으로 세척 후 동결 건조하였다. 이렇게 하여 N,N 다이카복시메틸-글루타사이온이 얻어졌다.
<실시예 6>
또다른 실시예로서 킬레이트 리간드를 매트릭스와 결합시키지 않은 상태에서 제조하는 반응예이다.
산화 글루타사이온(oxidized Glutathione) 10g을 0.1M NaHCO3, pH 10.5 용액 50ml에 녹였다. 브로모 아세트산(bromoacetic acid) 24g을 4N NaOH 용액 40ml에 녹이고 pH 10.5로 조정한 후 산화 글루타사이온(oxidized Glutathione) 용액에 가하였다.
상온에서 12시간 반응 후 3배 부피의 냉각된 아세톤을 가하였다. 침전을 분리하여 다시 아세톤을 가한 후 재침전시켰다. 침전을 증류수에 녹이고 1N NaOH로 pH 8이 되도록 조정하였다. 머캅토에탄올을 5ml 가한 후 상온에서 2시간 반응시켰다. 아세톤을 3배 부피로 가하여 침전을 만들었다. 침전을 아세톤으로 세척한 후 동결 건조하였다.
N,N 다이카복시메틸-글루타사이온이 얻어졌다.
<실시예 7>
다른 실시예로서 상기 실시예 5 또는 6에서 얻어진 N, N 다이카복시메틸-글루타사이온(dicarboxymethyl-glutathion)을 고분자 매트릭스와 결합시키는 반응예이다.
실시예 1, 2 또는 3에서 만든 활성화된 고분자 매트릭스 10g을 25mM NaPi, 100ml(pH 7.5)에 녹였다. N, N 다이카복시메틸-글루타사이온 100mg을 25mM NaPi 100ml(pH 7.5)에 녹인 후 상기 활성화된 고분자 매트릭스 용액과 혼합하였다. 상온에서 24시간 교반시킨 후 유리 깔대기로 레진을 분리하고 증류수 1000ml, 1% 아세트산 1000ml, 증류수 1000ml의 순으로 세척하였다.
<실시예 8>
본 실시예는 리간드가 부착된 레진에 전이금속을 붙이는 방법 및 금속이온 농도를 측정하는 예이다.
실시예 4 또는 7에서 얻어진 금속 킬레이트 레진 100ml을 유리 필터 깔대기에 가한 후 증류수 500ml로 세척하였다. 100mM NiSO4 용액 200ml로 세척 후 증류수 500ml로 세척하였다. 100mM EDTA, pH 8.0용액 100ml을 가한 후 용출한 용액을 회수하였다.
원자흡수 분광기를 이용하여 정량한 결과 560㎍/ml 이상의 니켈 이온이 있음을 확인하였다.
<실시예 9>
본 실시예는 상기 실시예 4 또는 7에서 제조한 본 발명의 금속 킬레이트 레진을 이용하여 단백질을 정제한 예이다.
본 발명의 금속 킬레이트 레진 0.5ml을 크로마토그래피 관에 넣고 증류수 5ml로 세척하였다. 100mM NiSO4 용액 5ml로 세척 후 5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 50mM NaH2PO4, pH 8.0 용액 5ml로 세척하였다.
아미노 말단에 히스티딘을 6개 붙인 MutS 단백질을 대장균 1000ml에서 발현 후 세포를 원심 분리하여 회수하였다. 세포를 파쇄 완충용액(0.15M NaCl, 50mM NaH2PO4, pH 8.0) 50ml에 넣고 초음파 파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 용액을 10,000g로 10분간 원심분리 후 상층액 10ml을 니켈 킬레이팅시킨 금속 킬레이트 레진에 주입하였다. 5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 50mM NaH2PO4, pH 8.0 용액 5ml로 레진에 붙지 않은 단백질을 제거한 후 50mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 50mM NaH2PO4, pH 8.0 용액 5ml로 약하게 붙은 오염 단백질을 제거하였다. 200mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 50mM NaH2PO4, pH 8.0 용액 5ml로 레진에 붙은 히스티딘 표지 단백질을 분리하였다.
각 단계별 시료는 12% SDS-PAGE(Sodium dodesyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리 후 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색으로 순도를 확인하였다(도 1). 레진에 붙는 단백질의 양은 브래드포드 방법을 이용하며 소 혈청 알부민을 표준으로 정량하였다. 회수한 분획을 증류수로 100배 희석한 다음 0.1ml을 취해 동량의 브래드포드 시약을 가한 후 5분 뒤 600nm에서 흡광도를 측정하여 표준 단백질과 비교하였다.
본 발명의 신규 금속 킬레이트 레진은 1㎖당 MutS 단백질을 5.2mg 흡착하였다. 퀴아젠(QIAGEN)사의 레진은 5.1mg 흡착하였다.
따라서, 본 발명은 종래 미국특허에 개시된 레진 제조방법에 비하여 공정이 현저히 간단하고, 시간 및 비용이 절감되면서도 종래 NTA 레진과 유사한 정도의 흡착 효과를 나타내는 금속 킬레이트 레진 및 그 제조 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 6히스티딘을 말단에 붙인 MutS 단백질을 본 발명의 금속킬레이트 레진과 퀴아젠사의 NTA 아가로즈 레진을 이용하여 정제하는 과정의 전기이동 사진이다.
M: 사이즈 마아커(NOVEX 제품),
1 : 레진 투입 분획,
2-5 : 본 발명의 금속 킬레이트 레진,
6-9 : 기존 NTA-아가로즈 레진(Quiagen제품),
2, 6 : 비흡착 분획,
3, 7 : 세척 분획,
4, 8 : 50mM 이미다졸 분획,
5, 9 : 200mM 이미다졸 분획.

Claims (10)

  1. 다음의 화학식으로 표시되는 금속 킬레이트 레진.
    (CH2COOH)2-N-CH(COOH)-CH2CH2-CO-NH-CH2(CH2S-R1-R2)-CO-NH-CH2(COOH)
    (단, 상기 식에서 R1은 크로마토그래피용 고분자 매트릭스를 활성화하고 -SH기와 결합하는 링커로서 -CH2CH(OH)CH2-, -CH(OH)CH2-O-(CH2)4CH(OH)CH2-, -CH2CH2SO2CH2CH2-, -COCH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH(Br)CH2- 및 -OCO-로 이루어진 그룹 중 선택되는 1종이며, R2는 크로스링크된 아가로즈, 크로스링크된 셀룰로스, 크로스링크된 덱스트란, 크로스링크된 메타크릴아마이드, 단백질, 펩타이드, 리피드, 리포좀, 핵산, 항체, 효소, 폴리에틸렌, 폴리술폰, 금(Gold), 호르몬, 형광물질, 발광물질(chromogenic dyes, fluorescent dyes, flurochrome), 실리카 및 글래스로 이루어진 그룹 중 선택된 1종 이상인 크로마토그래피용 고분자 매트릭스이다.)
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 전이금속 이온이 결합된 것을 특징으로 하는 금속 킬레이트 레진.
  5. 다음의 화학식으로 표시되는 금속 킬레이트 레진을 제조하는 방법에 있어서,
    1) 고분자 매트릭스를 활성화하는 단계;
    2) 세척하는 단계;
    3) 고분자 매트릭스와 -SH기를 갖는 글루타사이온을 pH 6.0∼8.5에서 반응시키는 단계;
    4) 세척하는 단계;
    5) pH 9∼12에서 아세트산을 아민기에 결합시키는 단계;가 순차적으로 구성되는 것을 특징으로 하는 금속 킬레이트 레진의 제조방법.
    (CH2COOH)2-N-CH(COOH)-CH2CH2-CO-NH-CH2(CH2S-R1-R2)-CO-NH-CH2(COOH)
    (단, 상기 식에서 R1은 고분자 매트릭스를 활성화하고 -SH기와 결합하는 링커로서 -CH2CH(OH)CH2-, -CH(OH)CH2-O-(CH2)4CH(OH)CH2-, -CH2CH2SO2CH2CH2-, -COCH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH(Br)CH2- 및 -OCO-로 이루어진 그룹 중 선택되는 1종이며, R2는 고분자 매트릭스로서 크로스링크된 아가로즈, 크로스링크된 셀룰로스, 크로스링크된 덱스트란, 크로스링크된 메타크릴아마이드, 단백질, 펩타이드, 리피드, 리포좀, 핵산, 항체, 효소, 폴리에틸렌, 폴리술폰, 금(Gold), 호르몬, 형광물질, 발광물질(chromogenic dyes, fluorescent dyes, flurochrome), 실리카 및 글래스로 이루어진 그룹 중 선택된 1종 이상이다.)
  6. 제5항에 있어서, 상기 -SH기를 갖는 글루타사이온은 N,N 다이카복시메틸 글루타사이온인 것을 특징으로 하는 금속 킬레이트 레진의 제조방법.
  7. 제1항 또는 제4항의 금속 킬레이트 레진을 이용하여 단백질을 정제하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항 또는 제4항의 금속 킬레이트 레진을 이용하여 단백질을 고정화하는 방법.
  10. 삭제
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