CN117339580A - 螯合载体、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种螯合载体、其制备方法及应用。该螯合载体如下式Ⅰ所示：式Ⅰ，其中，
Description
技术领域
本发明涉及生物蛋白分离技术领域，具体而言，涉及一种螯合载体、其制备方法及应用。
背景技术
固定化金属螯合亲和层析是将如Cu2+、Zn2+、Co2+、Ni2+等的过渡金属离子与蛋白质表面的组氨酸、色氨酸或半胱氨酸等配位结合，利用蛋白质表面的氨基酸与金属螯合物的亲和力大小不同而选择性地分离纯化蛋白质的一种技术。
金属螯合层析介质一般由基质、螯合配体和金属离子三部分组成。基质为固体用以担载金属螯合配体，基质要求表面具有大量羟基以利于间隔臂连接，同时具有良好的生物相容性，一定的耐酸碱性，目前使用最广泛的基质为6%高交联琼脂糖类微球。螯合配体常用为亚氨基二乙酸（IDA）、氮三乙酸（NTA）、N,N,N-三（羧甲基）乙烯二胺（TED）。IDA是三配位的，所以与金属离子之间的作用力较较弱，容易引起金属离子的遗漏问题；TED是五配位的，与金属离子的作用力较强，但由于其仅余一个键与蛋白质作用，所以和蛋白质的作用力又较弱：NTA与金属离子和蛋白质的作用介于前述二者之间，被广泛用于带有His标签的蛋白纯化。
金属螯合层析介质是影响金属螯合层析效果的关键材料，特别是间隔臂长度、金属离子螯合量等都直接影响最终纯化效果，采用适宜间隔臂的高载量介质显著能够提升蛋白纯化过程的处理能力，降低介质使用成本，缩短处理时间，从而大大提高纯化效率。因而，如何能够提供一种纯化效率较高的金属螯合层析介质对于该蛋白纯化方法的应用前景十分重要。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种螯合载体、其制备方法及应用，以解决现有技术中金属螯合层析介质纯化效率较低的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种螯合载体，螯合载体如下式Ⅰ所示：式Ⅰ，其中，/>代表含有羟基的基础介质去除羟基后的残留部分，n选自1-3。
进一步地，含有羟基的基础介质包括天然高分子微球；优选地，天然高分子微球包括：琼脂糖微球、葡聚糖微球或聚乳酸微球；优选地，天然高分子微球的中值粒径为20-120μm，更优选为80-100μm。
进一步地，含有氮三乙酸基团的化合物如下式Ⅱ所示：式Ⅱ，n选自1-3；优选地，含环氧基团化合物包括含环氧卤代烷类化合物或含环氧醚类化合物；优选地，含环氧基团化合物包括环氧氯丙烷、乙二醇缩水甘油醚或丁二醇缩水甘油醚；优选地，螯合载体对金属Ni2+的螯合量为30-62μmol/L。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种螯合载体的制备方法，制备方法包括：S1，将含有羟基的基础介质进行环氧修饰，得到环氧修饰的含有羟基的基础介质；S2，利用环氧修饰的含有羟基的基础介质与含有氮三乙酸基团的化合物进行接枝反应，得到螯合载体。
进一步地，S1包括：将含有羟基的基础介质与碱溶液和含环氧基团化合物混合，进行环氧修饰反应；对环氧修饰反应的产物进行洗涤，得到环氧修饰的含有羟基的基础介质。
进一步地，含有羟基的基础介质包括天然高分子微球；优选地，天然高分子微球包括：琼脂糖微球、葡聚糖微球或聚乳酸微球；优选地，天然高分子微球的中值粒径为20-120μm，更优选为80-100μm；优选地，碱溶液包括：NaOH或KOH；优选地，碱溶液的浓度为0.5-2.0M；优选地，含环氧基团化合物包括含环氧卤代烷类化合物或含环氧醚类化合物；优选地，含环氧基团化合物包括环氧氯丙烷、乙二醇缩水甘油醚或丁二醇缩水甘油醚。
进一步地，环氧修饰反应的温度为20-60℃；优选地，环氧修饰反应的时间为1-6h；优选地，含环氧基团化合物与含有羟基的基础介质的质量比为0.1-0.5。
进一步地，S2包括：利用环氧修饰的含有羟基的基础介质与碳酸盐缓冲液和含有氮三乙酸基团的化合物混合，进行接枝反应；对接枝反应后的产物进行洗涤，得到螯合载体。
进一步地，含有氮三乙酸基团的化合物如下式Ⅱ所示：式Ⅱ，n选自1-3；优选地，碳酸盐缓冲液的pH为10-14；优选地，碳酸盐缓冲液选自如下的一种或两种：Na2CO3或NaHCO3；优选地，接枝反应的温度为20-60℃；优选地，接枝反应的时间为4-20h；优选地，含有氮三乙酸基团的化合物与环氧修饰的含有羟基的基础介质的质量比为0.01-0.2。
根据本发明的第三个方面，提供了一种NTA层析介质，NTA层析介质包括：上述的螯合载体以及与螯合载体螯合的金属离子。
进一步地，金属离子选自如下的任意一种：Cu2+，Co2+，Zn2+，Ni2+，更优选金属离子为Ni2+；优选地，NTA层析介质对带有His标签蛋白的蛋白的固定量为61-88 mg/mL。
根据本发明的第四个方面，提供了一种NTA层析介质的制备方法，制备方法包括：将如上述的螯合载体与金属盐溶液进行混合搅拌，得到NTA层析介质。
进一步地，金属盐溶液的金属离子选自Cu2+，Co2+，Zn2+，Ni2+的一种，更优选金属离子为Ni2+；优选地，金属盐溶液的摩尔浓度为0.05-0.20mol/L；优选地，螯合载体与金属盐溶液的质量体积比为0.1-0.5；优选地，搅拌的温度为25-30℃；优选地，搅拌的时间为2-3h。
根据本发明的第五个方面，提供了一种上述的NTA层析介质或者利用上述的制备方法得到的NTA层析介质在纯化蛋白中的应用，蛋白为带有His标签蛋白的蛋白。
应用本发明的技术方案，本申请如式Ⅰ所示的螯合载体利用生物相容性好、含有羟基的基础介质作为基质，在其表面引入链长度不同的环氧基团，并与带有氮三乙酸基团的化合物进行接枝反应，所得到的螯合载体其螯合配体与基质的间隔臂长度能够灵活调整，可根据蛋白纯化需求进行相应的调整，能够提高金属离子在配体上的螯合量，降低介质使用成本，缩短处理时间，提高蛋白纯化效率。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，在现有技术的金属螯合层析介质中，由于其螯合配体与金属离子的螯合量较低或金属离子与目标蛋白的固定量较低的问题，导致利用现有技术的金属螯合层析介质进行纯化蛋白的效率较低。因而，本申请提供了一种能够通过控制基质与螯合配体之间的间隔长度，进而提高介质的金属离子螯合量与目标蛋白的固定量，以得到一种能够提高蛋白纯化效率的螯合载体。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种螯合载体，螯合载体如下式Ⅰ所示：式Ⅰ，其中，/>代表含有羟基的基础介质去除羟基后的残留部分，n选自1-3。
金属螯合层析介质中的基质与螯合配体之间的间隔臂长度、螯合配体对金属离子的螯合量都能够直接影响蛋白纯化的效果，本申请上述的螯合载体通过含有氮三乙酸基团的化合物（螯合配体）与含环氧基团化合物连接而成的间隔臂的长度更易控制，能够较多的螯合金属离子，更利于其形成纯化蛋白效率较高的层析介质。
天然高分子微球作为层析介质的基质具有良好的生物相容性，且耐酸碱性质稳定，任何能够进行环氧修饰的含有羟基的基础介质均适用于本申请，在一种优选的实施例中，含有羟基的基础介质包括天然高分子微球；优选地，天然高分子微球包括：琼脂糖微球、葡聚糖微球或聚乳酸微球；优选地，天然高分子微球的中值粒径为20-120μm，更优选为80-100μm。
任何能够与环氧基团发生接枝反应的含有氮三乙酸基团的化合物均适用于本申请，在一种优选的实施例中，含有氮三乙酸基团的化合物如下式Ⅱ所示：式Ⅱ，n选自1-3。根据基质与螯合配体之间所需的间隔臂的长度的不同，所选的环氧基团化合物的种类也有所不同，在一种优选的实施例中，含环氧基团化合物包括含环氧卤代烷类化合物或含环氧醚类化合物；优选地，含环氧基团化合物包括环氧氯丙烷、乙二醇缩水甘油醚或丁二醇缩水甘油醚；上述化合物含有双官能团，一端与天然高分子微球的羟基反应将分子固定在微球上，另一端的环氧能够与-SH基团反应。
本申请上述能够控制间隔臂长度的螯合载体具有较高的金属螯合量，这为后续得到蛋白固定量较高的层析介质提供了技术支持，在一种优选的实施例中，螯合载体对金属Ni2+的螯合量为30-62μmol/L。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种螯合载体的制备方法，该制备方法包括：S1，将含有羟基的基础介质进行环氧修饰，得到环氧修饰的含有羟基的基础介质；S2，利用环氧修饰的含有羟基的基础介质与含有氮三乙酸基团的化合物进行接枝反应，得到螯合载体。
本申请通过上述的制备方法能够得到具有较高的金属螯合量的螯合载体，能够为后续制备具有较高蛋白纯化效率的金属螯合层析介质提供技术支持。通过在含有羟基的基础介质上修饰含环氧基团化合物，作为与螯合配体连接的中间体，与含有氮三乙酸（NTA）的化合物相连，能够较为灵活的控制基质与螯合配体之间的间隔臂长度，进而得到具有较高金属离子螯合量的螯合载体，降低了后续利用该螯合载体进行层析介质的制备和使用成本，从而大大提高了利用该螯合载体制备得到的层析介质的蛋白纯化效率。
任何能够将环氧基团引入含有羟基的基础介质表面的反应均适用于本申请，在一种优选的实施例中，S1包括：将含有羟基的基础介质与碱溶液和含环氧基团化合物混合，进行环氧修饰反应；对环氧修饰反应的产物进行洗涤，得到环氧修饰的含有羟基的基础介质。通过环氧修饰含有羟基的基础介质，得到能够与螯合配体进行间隔臂可控的连接的产物，并经去离子水洗涤至中性，进行后续的制备。
天然高分子微球作为层析介质的基质具有良好的生物相容性，且耐酸碱性质稳定，任何能够进行环氧修饰的含有羟基的基础介质均适用于本申请，在一种优选的实施例中，含有羟基的基础介质包括天然高分子微球；优选地，天然高分子微球包括：琼脂糖微球、葡聚糖微球或聚乳酸微球。根据需要纯化的蛋白大小不同，基质的粒径大小也可以进行相应的调整，在一种优选的实施例中，优选地，天然高分子微球的中值粒径为20-120μm，更优选为80-100μm。
上述环氧化修饰反应在碱性环境下进行，任何能够维持反应环境为碱性的碱溶液均适用于本申请，在一种优选的实施例中，碱溶液包括：NaOH或KOH；优选地，碱溶液的浓度为0.5-2.0M。任何能够在天然高分子微球表面修饰有环氧基团的含环氧基团化合物均适用于本申请，根据基质与螯合配体的所需间隔臂的长度的不同，所选的环氧基团化合物的种类也有所不同，在一种优选的实施例中，含环氧基团化合物包括含环氧卤代烷类化合物或含环氧醚类化合物；优选地，含环氧基团化合物包括环氧氯丙烷、乙二醇缩水甘油醚或丁二醇缩水甘油醚。
为进一步提高环氧化修饰反应的效率，在一种优选的实施例中，环氧修饰反应的温度为20-60℃；优选地，环氧修饰反应的时间为1-6h；优选地，含环氧基团化合物与含有羟基的基础介质的质量比为0.1-0.5。
任何能够将螯合配体与基质进行连接的制备方法均适用与本申请，在一种优选的实施例中，S2包括：利用环氧修饰的含有羟基的基础介质与碳酸盐缓冲液和含有氮三乙酸基团的化合物混合，进行接枝反应；对接枝反应后的产物进行洗涤，得到螯合载体。通过接枝反应将氮三乙酸（NTA）与基质进行连接，得到的产物经去离子水洗涤至中性。
任何能够与环氧基团发生接枝反应的含有氮三乙酸基团的化合物均适用于本申请，在一种优选的实施例中，含有氮三乙酸基团的化合物如下式Ⅱ所示：式Ⅱ，n选自1-3。
上述接枝反应在碱性环境下进行反应，利用碳酸盐缓冲液条件环境pH值，在一种优选的实施例中，碳酸盐缓冲液的pH为10-14；优选地，碳酸盐缓冲液选自如下的一种或两种：Na2CO3或NaHCO3。为进一步提高接枝反应的效率，在一种优选的实施例中，接枝反应的温度为20-60℃；优选地，接枝反应的时间为4-20h；优选地，含有氮三乙酸基团的化合物与环氧修饰的含有羟基的基础介质的质量比为0.01-0.2。
上述利用含有羟基的基础介质制备金属螯合量较高的螯合载体的具体的反应过程如下所示：
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种NTA层析介质，NTA层析介质包括：上述的螯合载体以及与螯合载体螯合的金属离子。上述基质表面修饰的环氧基团与含有氮三乙酸的螯合配体进行连接，二者连接的间隔臂长度能够灵活控制，进而得到金属螯合量及蛋白纯化效率较高的NTA层析介质。在一种优选的实施例中，NTA层析介质对带有His标签蛋白的蛋白的固定量为61-88 mg/mL。
金属螯合层析介质能够利用螯合于表面的金属离子与蛋白质表面的氨基酸进行配位结合，进而达到蛋白纯化的目的，根据待纯化蛋白的氨基酸组成和结构的不同，在一种优选的实施例中，金属离子选自如下的任意一种：Cu2+，Co2+，Zn2+，Ni2+，更优选金属离子为Ni2+。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种NTA层析介质的制备方法，该制备方法包括：将上述的螯合载体与金属盐溶液进行混合搅拌，得到NTA层析介质。
本申请得到的金属螯合层析介质能够利用螯合于表面的金属离子与蛋白质表面的氨基酸进行配位结合，进而达到蛋白纯化的目的，根据待纯化蛋白的氨基酸组成和结构的不同，在一种优选的实施例中，金属盐溶液的金属离子选自Cu2+，Co2+，Zn2+，Ni2+中的一种，当纯化蛋白为带有His标签的蛋白，更优选金属离子为Ni2+。为了在螯合配体上进一步螯合较多的金属离子，在一种优选的实施例中，金属盐溶液的摩尔浓度为0.05-0.20mol/L；优选地，螯合载体与金属盐溶液的质量体积比为0.1-0.5。
为了能够进一步在螯合配体上螯合较多的金属离子，在一种优选的实施例中，搅拌的温度为25-30℃；优选地，搅拌的时间为2-3h。
在本申请第五种典型的实施方式中，提供了一种上述的NTA层析介质或者利用上述的制备方法得到的NTA层析介质在纯化蛋白中的应用，蛋白为带有 His标签蛋白的蛋白。利用上述的制备方法得到的层析介质的金属离子螯合量较高，且能够固定较多蛋白，在对带有His标签蛋白的蛋白进行纯化的时候大大提高其纯化效率，同时降低了纯化成本，具有良好的应用前景。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
层析介质对于His标签蛋白的固定量的检测方法如下所示：
将大肠杆菌表达的带有6个His标签的重组蛋白A表达菌离心收集，菌体用缓冲液（0.02 M磷酸二氢钠，0.5M氯化钠，pH7.4）重悬，超声破碎，离心收集蛋白上清，使用Bradford法检测蛋白浓度，记为C0；将实施例中制备的层析介质各1mL装入重力柱，水洗并用缓冲液A平衡，用10 mL蛋白上清过柱收集流穿液，使用Bradford法检测蛋白浓度，记为C1，根据浓度差计算层析介质对于His标签蛋白的固定量。其中，在一定范围内，蛋白的固定量与层析介质的金属螯合量正相关，但由于蛋白位阻效应影响，到达一定固定量后不会再随螯合量增加而显著增加。
实施例一
(1) 琼脂糖微球环氧修饰：
称取10.0g中值粒径90um的琼脂糖微球，加入1.0M 20.0 mL NaOH，加入环氧氯丙烷3.0g，控制温度30℃，反应3 h，将得到的产物使用去离子水洗涤至中性。
(2) 接枝氮三乙酸基团分子：
将10.0g上述环氧修饰的琼脂糖微球加入20mL pH 10的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中分散均匀，加0.1g的，控制温度45℃，反应16 h，产物使用去离子水洗涤至中性。
(3) NTA型层析介质制备：
将上述10.0g产物置于40mL摩尔浓度为0.10 mol/L的氯化镍溶液中，于25℃下搅拌2h，获得NTA型层析介质。经ICP方法检测，该产物Ni2+螯合量为32 umol/mL；该介质对带有6个His标签的重组蛋白A的固定量为66mg/mL。
实施例二
(1) 琼脂糖微球环氧修饰：
称取10.0g中值粒径80um的琼脂糖微球，加入0.5M 20.0 mL NaOH，加入乙二醇缩水甘油醚3.0g，控制温度20℃，反应6 h，将得到的产物使用去离子水洗涤至中性。
(2) 接枝氮三乙酸基团分子：
将10.0g上述环氧修饰的琼脂糖微球加入20mL pH 14的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中分散均匀，加0.5g的，控制温度45℃，反应12 h，产物使用去离子水洗涤至中性。
(3) NTA型层析介质制备：
将上述10.0g产物置于40 mL摩尔浓度为0.10 mol/L的氯化镍溶液中，于25℃下搅拌3 h，获得NTA型层析介质。经ICP方法检测，该产物Ni2+螯合量为38 umol/mL；该介质对带有6个His标签的重组蛋白A的固定量为70mg/mL。
实施例三
(1) 琼脂糖微球环氧修饰：
称取10.0g中值粒径90um的琼脂糖微球，加入1.5M 20.0 mL KOH，加入丁二醇缩水甘油醚2.0g，控制温度60℃，反应2 h，将得到的产物使用去离子水洗涤至中性。
(2) 接枝氮三乙酸基团分子：
将10.0g上述环氧修饰的琼脂糖微球加入20mL pH 14的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中分散均匀，加0.2g的，控制温度20℃，反应20 h，产物使用去离子水洗涤至中性。
(3) NTA型层析介质制备：
将上述10.0g产物置于40 mL摩尔浓度为0.10 mol/L的氯化镍溶液中，于28℃下搅拌2 h，获得NTA型层析介质。经ICP方法检测，该产物Ni2+螯合量为30 umol/mL；该介质对带有6个His标签的重组蛋白A的固定量为61mg/mL。
实施例四
(1) 琼脂糖微球环氧修饰：
称取10.0g中值粒径100um的琼脂糖微球，加入0.5M 20.0 mL NaOH，加入丁二醇缩水甘油醚3.0g，控制温度50℃，反应1 h，将得到的产物使用去离子水洗涤至中性。
(2) 接枝氮三乙酸基团分子：
将10.0g上述环氧修饰的琼脂糖微球加入20mL pH 14的碳酸氢钠缓冲液中分散均匀，加1.0 g的，控制温度20℃，反应20 h，产物使用去离子水洗涤至中性。
(3) NTA型层析介质制备：
将上述10.0g产物置于30 mL摩尔浓度为0.15 mol/L的氯化镍溶液中，于25℃下搅拌2 h，获得NTA型层析介质。经ICP方法检测，该产物Ni2+螯合量为54 umol/mL；该介质对带有6个His标签的重组蛋白A的固定量为82mg/mL。
实施例五
(1) 琼脂糖微球环氧修饰：
称取10.0g中值粒径90um的琼脂糖微球，加入0.5M 20.0 mL KOH，加入丁二醇缩水甘油醚4.0g，控制温度30℃，反应5 h，将得到的产物使用去离子水洗涤至中性。
(2) 接枝氮三乙酸基团分子：
将10.0g上述环氧修饰的琼脂糖微球加入20mL pH 14的碳酸氢钠缓冲液中分散均匀，加1.0 g的，控制温度50℃，反应8 h，产物使用去离子水洗涤至中性。
(3) NTA型层析介质制备：
将上述10.0g产物置于100 mL摩尔浓度为0.05 mol/L的氯化镍溶液中，于25℃下搅拌2.5h，获得NTA型层析介质。经ICP方法检测，该产物Ni2+螯合量为62 umol/mL；该介质对带有6个His标签的重组蛋白A的固定量为88mg/mL。
实施例六
(1) 琼脂糖微球环氧修饰：
称取10.0g中值粒径20um的琼脂糖微球，加入2.0M 20.0 mL NaOH，加入丁二醇缩水甘油醚1.0g，控制温度30℃，反应5 h，将得到的产物使用去离子水洗涤至中性。
(2) 接枝氮三乙酸基团分子：
将10.0g上述环氧修饰的琼脂糖微球加入20mL pH 12的碳酸钠缓冲液中分散均匀，加2.0 g的，控制温度50℃，反应6 h，产物使用去离子水洗涤至中性。
(3) NTA型层析介质制备：
将上述10.0g产物置于20 mL摩尔浓度为0.20 mol/L的氯化镍溶液中，于25℃下搅拌3h，获得NTA型层析介质。经ICP方法检测，该产物Ni2+螯合量为39 umol/mL；该介质对带有6个His标签的重组蛋白A的固定量为68mg/mL。
实施例七
(1) 琼脂糖微球环氧修饰：
称取10.0g中值粒径120um的琼脂糖微球，加入2.0M 20.0 mL KOH，加入丁二醇缩水甘油醚5.0g，控制温度30℃，反应5 h，将得到的产物使用去离子水洗涤至中性。
(2) 接枝氮三乙酸基团分子：
将10.0g上述环氧修饰的琼脂糖微球加入20mL pH 12的碳酸钠缓冲液中分散均匀，加2.0 g的，控制温度60℃，反应4 h，产物使用去离子水洗涤至中性。
(3) NTA型层析介质制备：
将上述10.0g产物置于20mL摩尔浓度为0.20 mol/L的氯化镍溶液中，于30℃下搅拌2 h，获得NTA型层析介质。经ICP方法检测，该产物Ni2+螯合量为41 umol/mL；该介质对带有6个His标签的重组蛋白A的固定量为75mg/mL。
对比例1
本对比例中关于接枝氮三乙酸基团分子和NTA型层析介质制备的步骤与实施例1相同，琼脂糖微球环氧修饰步骤不同，具体步骤如下：
琼脂糖微球环氧修饰：
称取10.0g中值粒径90um的琼脂糖微球，加入0.5M 20.0 mL NaOH，加入环氧氯丙烷0.5g，控制温度30℃，反应3 h，将得到的产物使用去离子水洗涤至中性。
最终产物经ICP方法检测，该产物Ni2+螯合量为18 umol/mL；该介质对带有6个His标签的重组蛋白A的固定量为22 mg/mL。
对比例2
本对比例中关于琼脂糖微球环氧修饰和NTA型层析介质制备的步骤与实施例1相同，接枝氮三乙酸基团分子步骤不同，具体步骤如下：
接枝氮三乙酸基团分子：
将10.0g上述环氧修饰的琼脂糖微球加入20mL pH 10的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中分散均匀，加0.05 g的，控制温度50℃，反应6 h，产物使用去离子水洗涤至中性。
最终产物经ICP方法检测，该产物Ni2+螯合量为12 umol/mL；该介质对带有6个His标签的重组蛋白A的固定量为13 mg/mL。
对比例3
本对比例中关于琼脂糖微球环氧修饰和接枝氮三乙酸基团分子的步骤与实施例1相同，NTA型层析介质制备步骤不同，具体步骤如下：
NTA型层析介质制备：
将上述10.0g产物置于40 mL摩尔浓度为0.10 mol/L的氯化镍溶液中，于25℃下搅拌0.5 h，获得NTA型层析介质。
经ICP方法检测，该产物Ni2+螯合量为25 umol/mL；该介质对带有6个His标签的重组蛋白A的固定量为28mg/mL。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过在富含羟基的琼脂糖类基球表面引入不同链长的环氧基团，随后接枝带有氮三乙酸基团的分子，制备间隔臂长度可控的NTA型层析介质。该介质的镍螯合量及对带有His标签蛋白的蛋白固定量较高，远高于市售同类产品（螯合量约12-25umol/mL，蛋白固定量约40 mg/mL），对His标签蛋白具有更优的纯化效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种螯合载体，其特征在于，所述螯合载体如下式Ⅰ所示：
式Ⅰ，
其中，代表含有羟基的基础介质去除羟基后的残留部分，n选自1-3。
2.根据权利要求1所述的螯合载体，其特征在于，所述含有羟基的基础介质包括天然高分子微球；
所述天然高分子微球包括：琼脂糖微球、葡聚糖微球或聚乳酸微球；
所述天然高分子微球的中值粒径为20-120μm。
3.根据权利要求1所述的螯合载体，其特征在于，含有氮三乙酸基团的化合物如下式Ⅱ所示：
式Ⅱ，n选自1-3；
含环氧基团化合物包括含环氧卤代烷类化合物或含环氧醚类化合物；
所述含环氧基团化合物包括环氧氯丙烷、乙二醇缩水甘油醚或丁二醇缩水甘油醚。
4.根据权利要求1所述的螯合载体，其特征在于所述螯合载体对金属Ni2+的螯合量为30-62μmol/L。
5.一种螯合载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
S1，将含有羟基的基础介质进行环氧修饰，得到环氧修饰的含有羟基的基础介质；
S2，利用所述环氧修饰的含有羟基的基础介质与含有氮三乙酸基团的化合物进行接枝反应，得到所述螯合载体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述 S1包括：
将所述含有羟基的基础介质与碱溶液和含环氧基团化合物混合，进行环氧修饰反应；
对所述环氧修饰反应的产物进行洗涤，得到所述环氧修饰的含有羟基的基础介质。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述含有羟基的基础介质包括天然高分子微球；
所述天然高分子微球包括：琼脂糖微球、葡聚糖微球或聚乳酸微球；
所述天然高分子微球的中值粒径为20-120μm；
所述含环氧基团化合物包括含环氧卤代烷类化合物或含环氧醚类化合物；
所述含环氧基团化合物包括环氧氯丙烷、乙二醇缩水甘油醚或丁二醇缩水甘油醚。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述环氧修饰反应的温度为20-60℃；
所述环氧修饰反应的时间为1-6h；
所述含环氧基团化合物与所述含有羟基的基础介质的质量比为0.1-0.5。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述S2包括：
利用所述环氧修饰的含有羟基的基础介质与碳酸盐缓冲液和所述含有氮三乙酸基团的化合物混合，进行所述接枝反应；
对所述接枝反应后的产物进行洗涤，得到所述螯合载体。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述含有氮三乙酸基团的化合物如下式Ⅱ所示：
式Ⅱ，n选自1-3；
所述碳酸盐缓冲液的pH为10-14；
所述接枝反应的温度为20-60℃；
所述接枝反应的时间为4-20h；
所述含有氮三乙酸基团的化合物与所述环氧修饰的含有羟基的基础介质的质量比为0.01-0.2。
11.一种NTA层析介质，其特征在于，所述NTA层析介质包括：权利要求1至4中任一项所述的螯合载体以及与所述螯合载体螯合的金属离子。
12.根据权利要求11所述的NTA层析介质，其特征在于，所述金属离子选自如下的任意一种：Cu2+，Co2+，Zn2+，Ni2+；
所述NTA层析介质对带有His标签蛋白的蛋白的固定量为61-88 mg/mL。
13.一种NTA层析介质的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将如权利要求1至4中任一项所述的螯合载体与金属盐溶液进行混合搅拌，得到所述NTA层析介质。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述金属盐溶液的金属离子选自Cu2 +，Co2+，Zn2+，Ni2+中的一种；
所述金属盐溶液的摩尔浓度为0.05-0.20mol/L；
所述螯合载体与所述金属盐溶液的质量体积比为0.1-0.5；
所述搅拌的温度为25-30℃；
所述搅拌的时间为2-3h。
15.一种权利要求11或12所述的NTA层析介质或者利用权利要求13或14所述的制备方法得到的所述的NTA层析介质在纯化蛋白中的应用，其特征在于，所述蛋白为带有His标签蛋白的蛋白。
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Non-Patent Citations (1)
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| 金子杰: "基于琼脂糖微球的高载量金属螯合亲和层析介质制备及其性能研究", 万方数据库, pages 2 * |
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